转录调控因子

转录调控因子（共7篇）

转录调控因子 篇1

卡波肉瘤病毒(Kaposis's sarcoma-associated herpesvirus,KSHV)复制转录激活因子(replication and transcription activator,RTA)是ORF50编码的一种即刻早期蛋白,是促使病毒从潜伏性感染向裂解性感染转变的关键调控因子。无论是外源性还是内源性来源引起的RTA表达增高,均可介导病毒裂解性基因的级联表达[1]。RTA主要通过两种方式激活下游靶基因:一是直接与高亲和性的RTA反应元件(RTA responsive elements,RREs)结合[2];二是间接地与细胞内的一些转录因子结合发挥调控作用,这些转录因子包括K-RBP[3]、CEBP-α[4]、Oct-1[5]和RBP-JК[6]等。RREs主要有两类,一类富含AT碱基,另一类含有CCN9GG样序列,这里N可以为任何碱基。例如,KSHV ORF57基因启动子含有这两类RREs[2]。Bcl-2蛋白是一种定位于线粒体上的膜蛋白,为Bcl-2原癌基因所编码,具有抑制细胞凋亡的功能[7,8]。本研究探讨KSHV RTA调控Bcl-2的分子机制及其在宿主细胞增殖与凋亡、病毒子的产生等方面的生物学意义。

1 材料与方法

1.1 质粒

pcDNA-RTA编码全长RTA的真核表达载体。pGL3-Bcl-2为含Bcl-2基因全长启动子的荧光素酶报告质粒。pGL3-△P1是采用PCR定点突变技术构建的突变了Bcl-2基因P1启动子的报告质粒,构建方法如下:先将启动子片段(-346～+1)插入pGL3载体MluⅠ/HindⅢ双酶切位点处(pGL3-P2),再将片段(核苷酸-2 867～-1 545)插入pGL3-P2的MluⅠ/HindⅢ双酶切位点处。pGL3-△RRE1、2是在pGL3-△P1基础上突变了第1个和第2个CCN9GG RRE的报告质粒,克隆所用引物见表1。

1.2 抗体与细胞

RTA抗体由上海巴斯德研究所蓝柯实验室惠赠。Bcl-2小鼠单克隆抗体购自Santa Cruz公司,GAPDH抗体购自Novus Biologicals公司,偶联IR Dye 800的羊抗鼠IgG二抗购自Rockland公司。HEK 293是原代人胚肾细胞转染腺病毒DNA的永生化细胞。BJAB为KSHV、EBVA均阴性的B细胞淋巴瘤细胞,BC3和BCBL1是感染KSHV的人体腔淋巴瘤细胞系。

1.3 细胞转染及KSHV的诱导

采用Bio-Rad公司的Gene Pulser电穿孔仪进行细胞转染。用20 ng/mL佛波酯、1.5 mmol/L丁酸钠诱导KSHV。所有细胞均在诱导后培养48 h收集。

注:“*”表示此栏引物序列中酶切位点以下划线标出

细胞收集后加入RIPA缓冲液裂解,用Bradford比色法测定蛋白质浓度。取相同质量的细胞裂解液上样,聚丙烯胺凝胶电泳结束后,转移蛋白样品至PVDF膜,用Bcl-2抗体、RTA抗体、GAPDH抗体及偶联IR Dye 800的羊抗鼠IgG二抗进行免疫印迹。用Odyssey红外线成像系统(LI-COR公司)观察结果。

1.5 荧光素酶报告基因试验

107个HEK 293细胞共转染10μg荧光素酶报告质粒和10μg RTA表达质粒。转染后24 h收获细胞,制备细胞裂解液。向40μL细胞裂解液中加入25μL荧光素酶试验底物,使用LMaxII384荧光光度计(Molecular Devices)检测荧光水平。结果以3次试验值的均数与标准差表示。Western blot用来验证转染的蛋白质的表达。

1.6 染色质免疫共沉淀(ChIP)

BCBL1细胞于佛波酯诱导48 h后向培养液中加入甲醛,终浓度为1%,37℃固定细胞10 min,使蛋白质和DNA发生交联。加入甘氨酸使其终浓度为0.125 mol/L,在室温下晃动孵育5 min以终止交联反应。使用预冷的PBS清洗细胞2次,加入含1%SDS的裂解液裂解细胞,超声裂解细胞悬液将DNA均一地打断成500～1 000 bp的片段。用ChIP稀释缓冲液将超声剪切后的DNA稀释10倍,取20μL稀释液保存,这时的样品标记为INPUT,作为PCR的空白对照。其余稀释液加入蛋白A琼脂糖磁珠,4℃孵2 h,分为两组,一组加入RTA抗体,4℃振荡过夜,另一组加入鼠IgG抗体作为阴性对照。将免疫复合物用磁珠沉淀,将沉淀物分别经低盐、高盐和氯化锂溶液3次系列冲洗,然后用TE缓冲液洗2次,每次冲洗时间5 min。用新配制的洗脱缓冲液将蛋白/DNA复合物从磁珠上洗脱,加氯化钠(Na+浓度为200 mmol/L)与2μL RNaseA(0.5 mg/mL),65℃过夜,松解蛋白/DNA交联;加入5μL蛋白酶K(20 mg/mL),于55℃水浴2 h。用酚/氯仿抽提DNA。以回收DNA片段为模板,进行PCR反应,DNA的数量水平可通过定量PCR来检测,引物见表1。扩增产物越过RRE1与EERE2区域,片段长度为200 bp。同时做RT-PCR,用比较ΔΔCt值的方法对DNA丰度进行相对定量。

1.7 RNA干扰慢病毒载体的构建及细胞转导

Bcl-2基因小片段发卡结构RNA(small hairpin RNA,shRNA)用shBcl-2表示;对照shRNA以shC表示。它们均由Sigma公司合成[9]。pGIPZ是一种shRNA慢病毒载体,用来表达Bcl-2小片段发卡结构RNA,购自Open Biosystems。RNA干扰慢病毒载体构建及细胞转导实验方法参见文献[10]。本研究中,笔者构建了BC3-shBcl-2、BJAB-shBcl-2细胞及其对照BC3-shC、BJAB-shC细胞。

1.8 病毒子DNA的PCR扩增

BC3-shBcl-2、BC3-shC细胞经佛波酯诱导后培养48 h,离心弃细胞,用0.45μm孔径的过滤器收集培养液上清,23 500 r/min离心20 min以沉淀病毒颗粒。加50μL 0.2×PBS重悬病毒颗粒,放置95℃下15 min,加入1μL蛋白酶K(10 mg/mL)于56℃孵育1 h,95℃30 min灭活蛋白酶K。取5μL病毒裂解液作模板,PCR扩增KSHV编码的K9。K9引物见表1。以BC3细胞中分离的KSHV基因组DNA为对照。PCR产物条带的灰度用Kodak1D3.6软件(Eastman)定量。

1.9 细胞凋亡检测

PI染色流式细胞仪检测细胞凋亡的原理是:凋亡细胞染色体降解、DNA碎片形成与可染性降低。收集细胞(106/mL)以1 000 r/min离心5 min,弃去培养液。3 mL PBS洗涤1次。离心去PBS,加入冰预冷的70%乙醇固定,4℃过夜。离心弃去固定液,PBS重悬细胞。加入终浓度50μg/mL PI(Sigma公司)、1μg/mL RNA酶于4℃下避光染色1 h。用FACSCalibur流式细胞仪(Becton Dickinson公司)检测细胞凋亡,每个样本重复测定6次。

1.1 0 统计学方法

数据分析采用FlowJo软件(Tree Star),采用方差分析进行统计学检验,以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 突变第1个与第2个CCN9GG RRE导致启动子活性显著降低

为进一步验证CCN9GG RRE的功能,笔者将pGL3-△P1报告质粒中的第1个和第2个CCN9GG RRE进行了突变,得到了pGL3-△RRE1、2这一新的报告质粒(图1A)。荧光素酶试验结果表明突变第1个与第2个CCN9GG RRE导致启动子活性显著降低(图1B)。在没有转染RTA的293细胞,报告质粒pGL3-△RRE1、2的荧光素酶活性与对照质粒pGL3-Basic都比较低;在转染了RTA的293细胞,报告质粒pGL3-△RRE1、2的荧光素酶活性约增加10倍,约为带有9个完整CCN9GG RRE的pGL3-△P1报告质粒荧光素酶活性的1/3。预留部分细胞裂解液做Western blot检测,以GAPDH作为对照,转染细胞RTA表达良好,表明转染效率佳。

2.2 RTA蛋白与CCN9GG序列存在直接相互作用

用佛波酯诱导和未经诱导的BCBL1细胞进行ChIP试验,表明RTA蛋白与CCN9GG序列存在直接的相互作用。PCR扩增证实免疫复合物中存在跨越第1个和第2个CCN9GG序列的DNA片段。在RTA抗体沉淀下来的经诱导的核DNA组目的条带清晰可见,在RTA抗体沉淀下来的未经诱导的核DNA组无阳性信号,两个IgG抗体阴性对照组亦均无阳性条带(图2A)。实时PCR用来相对定量沉淀下来的DNA的丰度,RTA抗体沉淀下来的经诱导BCBL1细胞的核DNA量比对照组高8～32倍(图2B)。

2.3 RTA介导的Bcl-2上调延缓溶解性感染的宿主细胞的凋亡,促进病毒子产生

RTA上调Bcl-2表达,Bcl-2是调节细胞凋亡的重要分子,因此笔者推测RTA介导的Bcl-2上调具有抑制宿主细胞的凋亡、促进病毒子产生的生物学功能。为验证此假设,笔者应用慢病毒介导的RNA干扰技术构建了Bcl-2抑制的稳定细胞株(BC3-shBcl-2、BJAB-shBcl-2)及对照细胞株(BC3-shC、B JAB-shC)。Western blot分析证实BC3-shBcl-2、BJAB-shBcl-2细胞的Bcl-2蛋白的表达水平很低(图3A)。BC3-shBcl-2、BC3-shC细胞经佛波酯诱导后培养48 h,分离宿主细胞裂解产生的病毒子,以PBS重悬的病毒颗粒作模板,扩增KSHV编码的K9基因。结果显示Bcl-2抑制细胞病毒子的产量约为对照组细胞的1/2(图3B)。这表明RTA介导的Bcl-2表达上调能够促进宿主细胞病毒子的产生。流式细胞仪分析显示KSHV阴性细胞BJAB-shC与BJAB-shBcl-2细胞经佛波酯诱导后细胞凋亡率分别为62.4%、64.4%,二者比较,差异无统计学意义(P>0.05);KSHV阳性细胞BC3-shC与BC3-shBcl-2细胞经佛波酯诱导后细胞凋亡率分别为58.2%、71.5%(图3C),二者比较,差异有统计学意义(P<0.05)。

3 讨论

Bcl-2家族成员调控着内源性线粒体途径的细胞凋亡[11]。其中根据其结构和功能可将Bcl-2家族成员分为两类,一类是具有抗凋亡功能,如:Bcl-2、Mcl-1、Bcl-xL等,它们含有4个高度保守的Bcl-2同源结构域(BH 1-4)[12];另一类具有促进凋亡的功能,如:Bax、Bak、Bad、Bid、Bim等,其中Bax、Bak含有BH 1-3,而Bid、Bad、Bim等仅含BH3结构[13]。BH3是与促进凋亡有关的结构域,BH4是抗凋亡蛋白所特有的结构域。Bcl-2蛋白为Bcl-2原癌基因所编码,不论在生理或病理条件下均具有抑制细胞凋亡的功能[7,8]。Bcl-2基因在许多肿瘤细胞都高表达,不仅阻止肿瘤细胞凋亡,而且是肿瘤化疗、放疗不敏感的重要原因[14,15]。

笔者前期研究[16]发现KSHV RTA能够上调宿主细胞Bcl-2表达。RTA可直接激活Bcl-2基因启动子,这种激活作用呈剂量依赖性,无细胞选择性。CCN9GG RREs和P2启动子对RTA调控Bcl-2表达具有重要作用。为进一步验证CCN9GG样RTA反应元件的功能,阐明RTA调控Bcl-2的分子机制及其生物学意义,笔者突变Bcl-2启动子第1个和第2个CCN9GG RRE,在pGL3-△P1基础上构建了pGL3-△RRE1、2这一新的报告质粒。荧光素酶试验结果显示,突变第1个与第2个CCN9GG RRE导致RTA介导的Bcl-2启动子活性显著降低。染色质免疫共沉淀实验表明RTA蛋白与Bcl-2启动子中的RREs存在直接的相互作用。上述证据再次证明CCN9GG RRE对RTA反式激活Bcl-2具有重要的作用。用RNA干扰技术抑制Bcl-2基因后,佛波酯诱导的BC3-shB-cl2细胞与对照组细胞相比凋亡率显著增加,病毒子产生减少。

综上所述,KSHV RTA介导的Bcl-2表达上调促进病毒的溶解性感染,可以延缓宿主细胞的凋亡,并增加病毒子的产生。

[志谢:衷心感谢Véronique Bourgarel-Rey(Aix-Marseille Université,Marseille Cedex 05,France)提供Bcl-2基因全长启动子荧光素酶报告质粒pGL3-Bcl-2。]

摘要：目的 研究卡泼肉瘤病毒(Kaposis′s sarcoma-associated herpesvirus,KSHV)编码的复制转录激活因子(replication and transcription activator,RTA)调控宿主细胞Bcl-2表达的分子机制及其生物学意义。方法 突变Bcl-2启动子第1个与第2个CCN9GG样序列,构建了新的报告质粒(命名为pGL3-△RRE1,2),用荧光素酶试验和染色质免疫共沉淀进一步验证CCN9GG样RTA反应元件的功能。构建RNA干扰慢病毒载体,筛选稳定感染的BC3细胞,佛波酯诱导48 h后,分别用PCR、PI(碘化吡啶)染色流式细胞术检测病毒子DNA和细胞凋亡率。结果 突变第1个与第2个CCN9GG序列导致启动子活性显著降低;染色质免疫共沉淀试验证实RTA蛋白与CCN9GG序列存在直接相互作用。用RNA干扰技术抑制Bcl-2基因后,佛波酯诱导的KSHV阳性细胞与对照组细胞相比凋亡率增加,病毒子产生减少。结论 KSHV RTA能够调控内源性细胞凋亡信号通路,延缓溶解性感染宿主细胞的凋亡,并促进病毒子产生。

关键词：复制转录激活因子,Bcl-2,表达上调,抗凋亡,溶解性感染

转录调控因子 篇2

1 资料与方法

1.1 患者资料:选取我院2012年9月至2015年9年120例糖尿病周围神经病变患者为研究对象, 其中男67例, 女53例, 年龄34~68岁, 平均 (57.16±5.83) 岁, 病程2~11年, 平均 (7.85±1.96) 年。将上述患者抽签随机分为研究组与对照组, 两组均为60例, 两组性别、年龄、病程等基线资料比较无统计学意义 (P>0.05) , 具有可比性。

1.2诊断标准:西医诊断参考2013年《中国2型糖尿病防治指南》糖尿病周围神经病变诊断标准;中医诊断参照《中医新药临床研究指导原则》, 手足麻木, 肢末时痛, 伴刺痛, 常有定处, 下肢为主, 夜间更甚, 腰酸腿软, 神疲倦怠, 舌质紫暗、紫斑, 苔薄白, 脉沉滑、沉涩, 辨证属气阴两虚夹瘀型。

1.3 纳入标准:①满足上述诊断标准;②对本次研究知情同意并签署知情同意书。

1.4 排除标准:

①妊娠、哺乳妇女;②合并严重代谢紊乱、重度感染者;③有出血倾向或其他严重内科疾病者;④药物过敏者;⑤拒绝本次治疗者。

1.5 治疗方法:

两组均进行常规干预, 包括饮食控制、抗血小板聚集、抗纤溶、抗凝。对照组采取硫辛酸胶囊 (国药准字H20100158, 生产单位:江苏万禾制药有限公司) 0.6 g治疗, 1次/天, 4周为1个疗程, 用药12周, 研究组采取消麻止痛颗粒, 由我院药剂科制备, 配方:生黄芪30 g, 白芍、络石藤、延胡索、川芎、当归尾、鸡血藤、淫羊藿、丹参、威灵仙、豨签草、熟地各10 g, 地龙、天龙各5 g, 制为15克/包, 两组均1次/天, 4周为1个疗程, 用药12周后进行疗效及相关指标观察。

1.6 疗效判定及观察指标。

显效:症状、体征恢复正常或显著改善, 温度、触觉、腱反射功能改善1级, 振动觉提高1度, 神经传导速度提高5 m/s以上。有效:症状、体征一定程度改善, 温度、触觉、腱反射功能部分改善, 振动觉提高0.5~1度, 神经传导速度提高2~5 m/s。无效:症状、体征无改善或加重, 温度、触觉、腱反射功能及神经传导速度未见明显改善或恶化。总有效率= (显效+有效) /总例数×100%。观察两组治疗前后正中神经传导速度 (MNCV) 、腓总神经传导速度 (SNCV) 及核转录因子κB (NF-κB) 浓度。同时比较两组醛糖还原酶 (AR) 、一氧化氮 (NO) 、超氧化物歧化酶 (SOD) 。

1.7 统计学方法:

选用统计学软件SPSS19.0对研究数据进行分析和处理, 计数资料采取率 (%) 表示, 计量资料 (±s) 表示, 组间对比进行χ2检验和t值检验, 以P<0.05为有显著性差异和统计学意义。

2 结果

2.1 两组治疗效果比较:研究组治疗总有效率为9 5.0 0%与对照组78.33%比较显著较高 (P<0.05) 。见表1。

2.2 两组治疗前后神经传导速度及N F-κB浓度比较:

两组治疗后MNCV、SNCV与治疗前比较显著提高 (P<0.05) , 两组NF-κB与治疗前比较显著较低 (P<0.05) , 组间比较, 研究组MNCV、SNCV与对照组比较显著较高 (P<0.05) , 研究组NF-κB与对照组比较显著较低 (P<0.05) 。见表2。

2.3 治疗前后两组AR、NO、SOD含量比较:

治疗后研究组AR与对照组比较显著较低 (P<0.05) , NO、SOD与对照组比较显著较高, 对比差异有统计学意义 (P<0.05) 。见表3。

2.4 两组安全性分析:两组治疗期间均未见肝肾功能异常, 无明显不良反应出现。

3 讨论

DPN为糖尿病常见并发症, 临床发病率60%~90%[4], 患者表现为神经内膜微血管病变, 伴有神经组织缺血缺氧, 以感觉神经障碍表现作为显著。西医尚无特异性干预方法, 主要原则是控制血糖, 同时采取综合干预, 包括改善微循环状态、纠正代谢紊乱等, 但疗效不佳, 尤其是长期治疗患者难以耐受[5]。中医学尚无糖尿病周围神经病变这一名词, 根据其病机及临床表现可纳入“血痹”、“痛症”、“痹证”等范畴。祖国医学认为消渴病病机众多, 包括先天禀赋不足、劳欲过度、情志失调、饮食不调等。长期肥甘厚味、辛辣香燥饮食可导致脾胃运化失职, 积热内蕴, 化燥伤津则演变为消渴, 情志如长期刺激, 可郁久化火, 消灼肺胃阴津也可发为消渴, 气阴两虚、肝肾阴虚、瘀血阻络等均可导致糖尿病周围神经病变发生[6,7]。中医认为对此病患者采取辨证论治具有良好的治疗效果。

本方内黄芪可补气健脾、托疮生肌、利尿消肿, 熟地可滋肾养阴补血, 补精益髓, 以上两药为方中君药, 当归尾养血活血, 鸡血藤行血补血, 舒经活络, 两组均为臣药, 可强化君药行血祛瘀之效, 豨签草祛风除湿, 通利关节, 威灵仙通络止痛, 祛风除湿, 白芍养血柔肝, 活血通络, 延胡索、川芎活血行气, 祛风止痛, 淫羊藿可益精血, 补肾阳, 地龙增强药效, 与丹参均可活血化瘀, 络石藤、威灵仙、天龙清热化瘀, 通络利尿。全方共起益气养阴、通络止痛、养血活血之效。本次研究对两组分别采取消麻止痛颗粒及硫辛酸治疗, 结果显示研究组治疗有效率为94.74%显著高于对照组, 表示与后者比较, 消麻止痛颗粒可能有更佳的临床疗效。

DPN发病机制十分复杂, 近年来, 氧化应激及信号转导通路成为目前DPN发病机制研究的热点。在糖尿病及其慢性并发症的发生与发展过程中, NF-κB所介导的炎性反应损伤以及它对细胞存活与死亡的调节功能逐渐被人们所认识。NF-κB是1986年由Sen等[8]提出, 是一个与细胞存活、分化、生长及炎性反应等有关的核转录因子。NF-κB广泛存在于人体多种细胞之中, 活化的NF-κB进入细胞核内, 与特异的位点结合, 可调控上百个目标基因的转录, 产生广泛的生物学效应。通过电泳迁移率方法分析, 糖尿病患者无论合并微血管病变与否其血液淋巴细胞中的NF-κB激活率均较非糖尿病患者升高80%以上[9]。神经组织活检表明, 与健康人和其他周围神经肌肉病变患者相比, DPN患者腓肠神经中NF-κB表达明显增加[10]。本次研究亦显示研究组治疗后NF-k B下调幅度高于对照组, 但具体机制尚未明确, 考虑与本方多成分可降低炎性表达, 提高机体免疫力有关[11,12]。本研究中亦观察到, 治疗组患者神经传导速度较治疗前及常规西药干预改善更为显著, 同时AR水平降低, 而NO、SOD含量得到提高。

转录调控因子 篇3

关键词：茄子,转录因子,分子标记

茄子(S.melongena L.)在全世界都有分布，以亚洲最多[1]。我国是茄子的次生起源中心，有1 000多年的栽培历史，在长期的自然演化和栽培驯化过程中，茄子已形成丰富的形态多样性[2]。长期以来，我国科研工作者将RAPD、AFLP、ISSR等分子标记方法应用于茄子[2,3,4,5]。转录因子分子标记是新开发的一种分子标记方法，其首次应用是根据辣椒及番茄的WRKY转录因子设计引物，应用于辣椒[6]。WRKY转录因子是植物中特有的N-端含有WRKYGQK高度保守氨基酸序列的一种转录调控因子，它能够与(T)(T)TGAC(C/T)序列(W-box)发生特异性结合，从而调节启动子中含W-box元件的调节基因和/或功能基因的表达，参与植物的各种生理生化反应[7]。

转录因子分子标记在茄子上的应用至今还未有报道。本研究对影响茄子转录因子分子标记的退火温度、PCR反应循环数、dNTPs、模板浓度等重要因素进行了初步研究，建立并优化茄子转录因子分子标记体系，为从分子水平上分析茄子品种间的遗传差异和种质资源的有效利用提供新方法。

1 材料与方法

1.1 试验材料

茄子试材是由北京农学院生物技术系茄子育种课题组提供的茄子品系ETC3-02。

1.2 试验方法

1.2.1 茄子DNA提取。

取茄子幼苗新鲜叶片，用CTAB法提取基因组DNA。用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量。

1.2.2 引物的设计与合成。

为建立茄子PCR反应最适扩增条件，根据已报道的辣椒的WRKY转录因子设计引物。由上海生物工程技术有限公司合成，引物序列为：GIIF:5′-AGCA GCAGCAA-3′;WSR:5′-TGACCATACTTCCTCCAAT-3′。

1.2.3转录因子分子标记PCR反应程序的建立。

在预备实验基础上，设定PCR基本扩增程序为：94℃4min;94℃30s,60℃30s,72℃1min,7个循环;94℃30s,60℃30s(每个循环降低2.2℃)，72℃45s,5个循环;94℃30s,48℃30s,72℃1min,94℃30s,40℃30s,72℃1min,13个循环;72℃10min。优化程序梯度设置(见表1)：退火温度与循环数各设置5个梯度，其余条件则同基本程序。

1.2.4 转录因子分子标记PCR扩增反应体系的优化。

在预备实验基础上，设定PCR基本反应体系为：总体积20μL，内含1.0×buffer,1.5mmol/L MgCl2,0.4mmol/L dNTPs,1.0U Taq DNA聚合酶，2.5μmol/L GIIF上游引物，1.0μmol/L WSR下游引物，DNA模板50ng。

PCR反应的各组分浓度优化条件见表2。在保持其他因素一致的条件下，变化单一因子，筛选最优参数(每次都将上一个筛选到的某个因素的最佳值，作为固定值使用到下一个因素筛选中)。

1.2.5 PCR产物检测。

取4μl荧光染料与PCR产物充分混匀在0.8%琼脂糖凝胶上点样。用1×TBE缓冲液以100V电压电泳1.5～2.0h，在凝胶成像系统中观察并摄影记录。

2 结果与分析

2.1 PCR扩增程序的建立

2.1.1循环次数的筛选。实验设计了5个循环梯度,结果如图1～5所示,循环为11,12,13扩增的条带不是很清晰,循环为14条件下的带谱和强度有所增加，有比较清晰的条带，能够得到较多的扩增产物。15个循环又开始出现扩增条带模糊不清，因此选择14个循环作为反应的最佳循环次数。2.1.2退火温度的筛选。实验设计46～50℃5个梯度对最适退火温度进行筛选(如图6)，结果表明：1～5泳道的退火温度依次是46℃、47℃、48℃、49℃、50℃，退火温度在46～49℃时，扩增条带基本一致，条带丰富且清晰，但退火温度为50℃时，条带开始出现模糊不清。退火温度明显影响扩增谱带式样，每个物种在进行多样性分析前都必须对不同引物的退火进行筛选，在泳道1～5中，退火温度为47℃时的主条带相比更加清晰，且杂带更少，因此综合多方面因素，最适退火温度应选择47℃。

2.2 PCR反应体系的优化

2.2.1 模板DNA浓度对PCR反应的影响。

实验设计20～60ng 5个模板DNA梯度，结果如图7所示，1～5泳道的DNA浓度依次是20ng、30ng、40ng、50ng、60ng，可以看出，除60ng浓度下没有扩增出条带外，其他浓度梯度间的扩增结果有明显差异，均可获得清晰的扩增谱带。但在带的样式上发生了变化，在DNA浓度为20 ng、30ng时出现明显缺失带，在DNA浓度为40ng、50 ng时，条带清晰，且扩增趋于稳定，但DNA浓度为40ng时，扩增产物量大。故在设定的模板DNA梯度下，模板DNA用量为40 ng时效果较好。

2.2.2 dNTPs浓度对PCR反应的影响。

dNTPs浓度的变化直接影响产物的产量，浓度太高或过低都影响扩增效果。如图8所示，该试验设置了5个dNTPs浓度梯度，分别为0.2mmol/L、0.3mmol/L、0.4mmol/L、0.5 mmol/L、0.6mmol/L进行PCR扩增。结果表明，在浓度为0.2～0.6mmol/L之间均能扩增出条带，随着dNTPs浓度的增加，扩增出的条带随之变亮，数量也随之增加。dNTPs浓度为0.6 mmol/L时，扩增效率增高。因此，从产量和扩增主带条数角度分析，笔者认为dNTPs的浓度选择0.6mmol/L时较为理想。

3 讨论

WRKY是植物特有的一类转录因子家族，因含有由WRKYGQK 7个氨基酸组成的保守序列而得名[8]。在拟南芥中，WRKY家族共有74个成员，主要与植物的抗逆性和衰老等生理过程有关。病原菌、伤害和植物激素类物质等多种外界因素均能诱导WRKY基因的表达[9]。转录因子分子标记作为一种新开发的分子标记方法也是基于PCR反应，其最终结果易受模板DNA、dNTPs、退火温度以及扩增循环数等因素的影响。因此，为获得稳定清晰的扩增结果而优化以上反应参数十分必要。在对茄子转录因子分子标记技术进行优化的过程中，每个优化后的因素作为下一个因素的优化[10]，优化后茄子转录因子分子标记体系所扩增出的产物清晰，多态性丰富，试验研究表明，该体系适合茄子转录因子分子标记技术扩增反应，适应于下一步的试验研究，为该技术在茄子种质资源上的有效利用及了解茄子种质资源间的遗传差异性提供佐证。

参考文献

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[2]冉进,宋明,房超,等.茄子(S.melongena L.)种质资源遗传多样性的RAPD分析[J].西南农业学报,2007,20(4):694-697.

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转录调控因子 篇4

碱性亮氨酸拉链(basic leucine zipper motif,bZIP)转录因子家族是真核生物中分布最广泛、结构最保守,研究最多的一类转录因子家族。bZIP转录因子能够通过与位于ABA(脱落酸)诱导基因上游启动子区域的ABRE(ABA-responsive element)应答元件结合参与ABA信号转导进而响应植物逆境胁迫[6,7]。如拟南芥AtABI5转录因子,是ABA介导的种子萌发和幼苗生长过程中重要的调控因子,受ABA、干旱和高盐胁迫诱导而大量表达,对植物抗逆性起关键作用[8]。与AtABI5相似,水稻(Oryza sativa L.)OsA-BI5转录因子能抑制种子萌发和萌发后幼苗的生长,可以与G-box元件结合从而激活抗逆基因的转录表达[9]。大豆(Glycine max)中超过1/3的bZIP基因家族成员参与ABA、盐、干旱和冷害胁迫响应中的一种或多种的防御反应[10]。番茄(Lycopersicon esculintum M.)在遭受低温侵害时,LebZIP1基因响应胁迫能够被诱导表达[11]。刚毛柽柳(Tamarix hispida W.)ThbZ-IP1基因的表达受NaCl、PEG、NaHCO3和CdCl2胁迫诱导[12]。

玉米(Zea mays L.)是重要的粮饲作物。然而,干旱、土壤盐渍化和低温等逆境胁迫严重影响了玉米的产量和品质。bZIP转录因子对植物逆境基因表达调控具有重要作用,迄今为止,其在拟南芥和水稻中的抗逆性研究较为深入,但在玉米中的研究却相对较少[13,14,15,16,17,18]。因此,本研究以玉米为试材,对其中的一个bZIP转录因子进行相关的生物信息学分析,为玉米bZIP转录因子在逆境胁迫中的功能及玉米抗逆育种奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

玉米bZIP转录因子序列登录号为DAA42014.1,来自于National Center for Biotechnology Information(NCBI)中GenBank数据库。

1.2 玉米bZIP转录因子的生物信息学分析

选择相应的生物信息学数据库及生物学软件对玉米bZIP转录因子进行详细的生物信息学分析:利用Protparam分析理化性质(http://www.expasy.org/tools/protparam.html);运行TM-HMM Server v.2.0在线分析软件寻找该玉米bZIP转录因子中的跨膜结构域(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/);进入Protscale数据库完成亲水性/疏水性分析(http://www.expasy.org/tools/protscale.html);采用SOPMA服务器对其二级结构进行预测(http://npsapbil.ibcp.fr/cgibin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_sopma.html);使用PSORT对该玉米bZIP转录因子的亚细胞定位进行预测(http://psort.hgc.jp/form.html);通过SignalP4.1预测其可能存在的信号肽位置(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/);利用NCBI中的CD-search功能搜索该玉米bZIP转录因子的保守结构域(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/docs/cdd_search.html);操作NetPhos 2.0Serve在线分析工具预测其磷酸化位点(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/);运用Protfun 2.0Server软件分类蛋白质功能(http://www.cbs.dtu.dk/services/ProtFun/)。

2 结果与分析

2.1 玉米bZIP转录因子理化性质预测

采用Protparam对玉米bZIP转录因子进行基本的理化性质的预测和分析。结果表明:该玉米bZIP转录因子分子式为C2931H4600N830O942S31,相对分子质量为67.531 6kDa;理论等电点(pI)为5.93;带负电残基(Asp+Glu)总数为62,正电残基(Arg+Lys)为51,为酸性蛋白;亲水性系数为-0.380,说明该蛋白是亲水性蛋白;不稳定系数为68.17,属于不稳定蛋白,这可能是其功能不明确的原因之一。说明该玉米bZIP转录因子为具有一定亲水能力,不稳定的酸性蛋白,其氨基酸组成详见表1。

由表1可知,该玉米bZIP转录因子含Ser(S)最多,占15.4%;其次为Ala(A),占10.2%;不含Pyl(O)、Sec(U)、Asx(B)、Glx(Z)和Xaa(X)氨基酸。

2.2 玉米bZIP转录因子跨膜结构域分析

跨膜结构域是一般由20个左右疏水氨基酸残基形成的α螺旋,它位于细胞膜上起着“锚定”作用。跨膜结构域的分析对于解析蛋白质的结构、功能、分类以及作用部位均有重要的意义。运行TMHMM Server分析玉米bZIP转录因子中可能存在的跨膜结构域,参数设置为默认值,结果表明该转录因子不存在跨膜结构域,并不进行跨膜转运,属于非跨膜类蛋白,位于膜外区的可能性最大(可能性=1.1)。

2.3 玉米bZIP转录因子疏水性/亲水性预测和分析

蛋白质的疏水性/亲水性预测目的在于通过分析不同肽段的亲/疏水区域,为蛋白的二级结构、结构域及功能域的划分提供理论参考。进入Protscale数据库采用Kyte&Doolittle算法对玉米bZIP转录因子的疏水性/亲水进行预测。结果如图1所示,该蛋白的亲水性最高值为-3.500,疏水性最高值为1.578,且亲水性氨基酸残基均匀的分布在整条肽链上,并明显多于疏水性氨基酸残基,因此推测玉米bZIP转录因子是亲水性蛋白质,这一结论与由一级结构分析得出的结果相吻合。

2.4 玉米bZIP转录因子的二级结构预测

蛋白质的二级结构是指多肽链借助于氢键排列成有规律的、重复的构象,主要包括有α-螺旋、β-折叠、β-转角等。研究二级结构对于认识蛋白质的空间构象具有重大的生物学意义。利用SOPMA服务器对玉米bZIP转录因子的二级结构进行预测分析,结果如图2所示,该二级结构由4种形式组成,即由无规则卷曲(Random coil),占50.71%;α-螺旋(Alpha helix),占34.07%;延伸链(Extended strand),占9.89%;β-折叠构成的β-片层(Beta turn),占1.90%。该结果表明玉米bZIP转录因子的二级结构以随机卷曲和α-螺旋为主,同时在随机卷曲之间包含有部分延伸链,而β-转角和β-折叠则相对较少,并不均匀地分布

于整个多肽链上。N-末端以无规则卷曲的形式存在,C-末端以延伸链的形式存在。

2.5 玉米bZIP转录因子的亚细胞定位

蛋白亚细胞定位是研究蛋白质功能很重要的方面,本研究应用Psort数据库对玉米bZIP转录因子的亚细胞定位进行预测。由表2可知,该转录因子分布于细胞核上的可能性较大(可信度为0.88),并在细胞核上行使功能,可能为核蛋白。

2.6 玉米bZIP转录因子的信号肽预测与分析

信号肽一般由15~25个氨基酸所组成,它能够指导新合成的蛋白进行跨膜转移。采用SignalP 4.1软件分析该玉米bZIP转录因子的信号肽部分(见图3)。由图3可知,C值(剪切位点值)为0.108,说明在该转录因子中未发现可能的信号肽序列,可见,该玉米bZIP转录因子并不是分泌型蛋白,不可能在细胞中发生迁移。结合之前的亚细胞定位以及跨膜结构域分析结果,说明该玉米bZIP转录因子极有可能是一种核蛋白,在细胞核上合成后,直接在细胞核上行使功能。

2.7 玉米bZIP转录因子保守结构域分析

保守结构域是指在生物进化过程中结构和功能均高度保守的一类结构域。使用NCBI-CDD数据库分析该玉米bZIP转录因子中的保守结构域。结果如图4所示,该转录因子含有一个bZIP超级家族(bZIP super family)和Zein-binding超级家族(Zein-binding super family),这些结构域从植物到人类均高度保守(拟南芥、水稻、线虫、斑马鱼),主要参与包括植物生长、花发育、种子成熟、衰老、光信号、损伤、病菌防御以及对各种环境胁迫的响应在内的多种生物学过程。

2.8 玉米bZIP转录因子磷酸化位点预测

利用NetPhos 2.0预测该玉米bZIP转录因子的磷酸化位点,结果如图5所示,整条肽链共有57个氨基酸磷酸化位点(>0.5),其中有45处丝氨酸(Ser)磷酸化位点,在该转录因子中占主导地位,9处苏氨酸(Thr)磷酸化位点和3处酪氨酸(Tyr)磷酸化位点。可以推测,该玉米bZIP转录因子可能是通过可逆的磷酸化反应对逆境胁迫进行感知和应答的。

2.9 玉米bZIP转录因子功能分类预测

用CBS的ProtFun软件预测玉米bZIP转录因子的功能,结果如图6所示,该转录因子为酶蛋白,具有信号转导功能的概率最高为0.227,可能参与信号转导(Signal_transducer),根据酶的分类,很可能属于裂解酶。因此可以做推断:该蛋白是一个与信号转导有关的裂解酶蛋白。

3 结论与讨论

玉米是一种重要的粮饲作物,总产量居全球第一。我国是世界第二大玉米生产国,确保我国玉米生产持续稳定发展事关国家粮食安全战略部署。然而,干旱、高盐和低温等逆境胁迫严重影响了玉米的分布和产量。因此,作为植物中最大、最保守的转录因子之一的bZIP转录因子在玉米中的研究就显得尤为重要。

近年来,随着生物信息学的迅猛发展,各种分子生物学数据库提供了大量的核苷酸和氨基酸序列,利用生物信息学方法通过对这些已有的核苷酸和氨基酸序列的数据库进行分析和计算,搜索目标序列独特的结构特征(如保守结构域、功能修饰位点、亚细胞的定位信号等),对目标基因的功能进行初步的预测,已成为发现新基因和预测蛋白质结构最快捷有效的方法。

转录调控因子 篇5

在分子生物学领域,理解转录调控机制是后基因组时代重大挑战之一。达到这一目标的重要步骤是转录因子结合位点TFBS(Transcription Factor Binding Sites)的识别。转录因子结合位点是基因上游启动子区域长度为5～15bp的短序列片段,被转录因子结合以调控下游基因。通过生物学试验检测TFBS的方法由于开销大、耗时长等缺点,不适合处理海量数据。因此,越来越多的计算识别方法被提出用于初选待测位点。通常一个转录因子结合位点可以被一个或多个转录因子结合,而相关研究表明这种结合具有较高的特异性。因此,在计算分子生物学领域,TFBS的识别问题可视为一个多类别模式分类问题,即给定一个未知样本,判定它可能被那一类或哪几类转录因子结合。

目前,基于核方法和正则化理论的机器学习分类算法是最常用的方法之一,也是统计学习理论SLT(Statistical learning theory)的核心内容[1,2]。SVM作为经典的分类算法,基于VC维理论和结构风险最小化原理,克服了传统机器学习分类算法维数灾难、陷入局部最优解、过拟合等缺陷,对未知样本具有良好的泛化性能,因此被广泛应用于模式识别、文本分类、生物信息学、信息安全等诸多领域。

传统SVM主要用于解决二分类问题。近年来提出的多分类SVM作为原始SVM的扩展,是将多分类问题分解为多个两分类问题,忽略了类别间的联系。其中,“一对多”策略采用了一个正负类不平衡的训练集,建立的每个二分类器负样本数远大于正样本。另外,现有的多分类SVM不适用于只包含正样本集的情况,而TFBS负样本集无法构造。因此,利用现有的多分类SVM处理TFBS识别问题并不恰当,需要设计一个能直接用于多类样本集的多分类器。

基于正则化理论建立的分类器的结构风险通常由两部分控制:经验风险(训练误差)和置信界。以二分类问题为例,一个规范超平面构成的指示函数集:

h(x)=sgn[(w·x)+b] (1)

的VC维h满足:

h≤min([R2A2],n)+1 (2)

其中,sgn[·]为符号函数,n为向量空间的维数,R为覆盖样本向量的超球半径,‖w‖≤A。通过式(2)不难发现,一定程度上减小R2,能使VC维的上界h减小,从而降低学习机的复杂性,以提高预测函数的泛化能力。这正是数据域描述模型的基本思想。数据域描述是对数据集所在的类别进行描述,拒绝可能来自其他类的数据[9,10]。本文在最新的多任务学习理论基础上将数据域描述问题拓展到多类的情况,并用于解决TFBS识别问题,从整体上对来自所有类别的样本同时学习,同时捕获类别之间的联系。

SVM采用的hinge损失函数对孤立点和噪声都是较敏感的,即对离群点不具有鲁棒性。本文根据训练样本的置信度不同,在惩罚项中引入模糊成员函数以区别对待,对置信度大的样本给予充分重视,相反(很可能是噪声点)则限制其作用。

基于核方法的机器学习算法的核心问题是核函数的选择,因其很大程度上影响分类器的性能。先前基于核方法的生物实体识别算法通常采用0-1编码的多项式核,显然不适合长度不规则的生物序列。本文采用基于编辑距离的字符串核来度量TFBS之间的相似性,以更好地比较序列间的相似性。

1相关工作

在计算分子生物学领域,常见的TFBS识别方法是通过从海量基因序列中寻找超频词(over-represented N-mers)来发现特定模式。代表性的算法有MEME[27]、Gibbs sampling[28]。实验表明对于位点进化较保守的物种(如酵母、果蝇等)有很好的识别效果,而对于位点进化相对不保守的脊椎动物(如人、大鼠、小鼠等),效果通常不尽人意[29]。另一种是采用支持向量机、人工神经网络等机器学习分类算法。文献[11]提出了基于数据域描述的一类SVM (One-Class SVM:OSVM)用于高维分布区域估计。文献[12]采用OSVM用于顺势调控元件判别。该方法分别对每类数据进行建模,没有从整个数据集出发,考虑不同类转录因子之间的联系。另外,采用0-1编码的核函数不适合长度不规则的TFBS序列。文献[3]结合SVM和ECOC算法实现了转录因子的四分类问题。通过构建4个二分类SVM对各个类别的转录因子独立地进行训练和分类,然后对分类结果进行综合判别,好处是能够直接利用现有的二分类SVM,缺点是不能对整个数据集同时学习,未考虑类间联系。近年来,多任务学习已成为机器学习领域的一个研究热点。文献[16,17]中提出了一个基于统计学习和函数正则化的多任务学习理论框架,通过新的正则化因子对不同的任务同时学习,捕获类间联系。本文在此基础上建立多数据域描述模型并用于解决TFBS识别问题。

最近几年研究者相继提出了一系列核函数用于生物实体分类[21,22,23,24,25],其共同的目标是寻找一种有效的相似性度量。本文采用基于编辑距离的字符串核以更好度量TFBS序列的相似性。

2多任务学习模糊样本集

本节首先简要回顾在Hilbert空间中利用核函数和正则化进行多任务的学习方法,更多细节请参见文献[1,13,14,15,16]。然后定义多任务学习模糊样本集。

在标准的单任务学习中,给定包含n个样本的样本集X={(xi,yi):i∈ℕn}⊂X×Y,假设这些样本是独立同分布的,来自同一个X×Y上的未知概率分布P。学习的目标是获得一个有较小的期望风险E[L(y,f(x))]预测函数f。设L为预定义的损失函数,如标准二分类SVM的hinge损失函数:(1-yif(xi))+。一个常见解法是基于SLT和Tikhonov正则化,即最小化下列风险泛函:

$R{}_{{\rm T}}(f)=\frac{1}{n}{\displaystyle \sum _{i\in \mathbb{N}{}_n}L}(y{}_i,f(x{}_i))+\gamma \parallel f\parallel {}_{{\rm K}}^2$ (3)

其中‖f‖${}_{{\rm K}}^2$对应f在Hilbert空间某一子空间HK中的范数,用来度量假设空间的复杂度。参数γ为正则化参数,用来权衡训练误差和假设空间的复杂度。可以证明,式(3) 的解可表示为:

$f(x)={\displaystyle \sum _{i\in \mathbb{N}{}_n}c}{}_{i}k(x{}_i,x)$ (4)

其中{ci}是一个实值参数集,k(·,·)是核函数,在Hilbert空间中具有再生性。

Evgeniou和Micchelli在Tikhonov正则化的基础上将单任务学习拓展到多任务的情况,提出了基于SLT和正则化的多任务学习正则化泛函[16]。假设一共有m个任务,第l个任务包含nl个样本点,输入空间Xl=ℝd,l∈ℕm。 为估计参数向量u=(ul:l∈ℕm)∈ℝmd,通过最小化下列泛函:

R(u):$=\frac{1}{mn}{\displaystyle \sum _{l\in \mathbb{N}{}_m}{\displaystyle \sum _{i\in \mathbb{N}{}_{n{}_l}}L}}(y{}_{il},u^{\prime }x{}_{il})+\gamma J(u)$ (5)

其中,L为预定义的损失函数,γ为一参数,用于控制两个指标的权衡。J(u)是正则化因子。多任务学习的目标是从这些样本中同时学习所有m个任务的预测函数fl(x)=u${}_l^{{\rm T}}$x。针对TFBS识别问题,本文仅讨论各任务输入空间相同的情况,即X1=X2=…=Xm。在后续工作中,我们将讨论输入空间不一致的情况。下面引入Zadeh提出模糊子集的概念[17,18],定义多任务学习模糊样本集。

定义1 模糊子集 设X是一个论域,给出映射μ:X→[0,1],xμA(x)则μ确定X的一个模糊子集$\tilde{A}$。μ(x)称为X对$\tilde{A}$的隶属度。全体X的模糊子集组成的集合记为F (X),称为X的模糊幂集。

定义2 多任务学习模糊样本集 假设共有m个任务(或m个类),第l个任务包含nl个样本,用Al$\in \mathcal{F}$(X)表示。为第l个任务的每个样本点xil赋予一个隶属度,记为$\stackrel{⌢}{s{}_{il}}$。这样,第l个任务的模糊样本集可表示为$\stackrel{⌢}{A{}_l}=\{(x{}_{1l},\stackrel{⌢}{s{}_{1l}}),\cdots ,(x{}_{n{}_{l}l},\stackrel{⌢}{s{}_{n{}_{l}l}})\}\subset ℝ{}^d\times [0,1]$,其中$\stackrel{⌢}{s{}_{il}}\in [0,1]$。若规定$\stackrel{⌢}{s{}_{il}}\in \{0,1\}$,则不允许样本带有不确定信息。

需要指出引入模糊样本的主要目的是利用样本点的先验不确定信息增强损失函数对离群点的鲁棒性,原则上并不违背统计学习理论。

3基于多数据域描述的TFBS识别

本节讨论在多任务学习理论的基础上建立一个多数据域描述模型MDMH(Multiple Data Domain Description by Multiple Hyperspheres),并结合核方法用于转录因子结合位点识别问题。

3.1多数据域描述模型

借助定义2,引入被赋予隶属度的模糊样本集。对于一个m类数据域描述问题,试图用m个超球覆盖来自m类的训练数据,每个超球包含来自训练数据的一类子集。训练的目标是同时寻找所有m个超球面的球心c和半径R,并且最小化R。一种常见的做法是分别对每类样本数据分别建立相应的数据域描述[20],缺点是没有从样本集整体上考虑,忽略了类间联系,不能充分地利用样本集。为此,本文建立的多数据域描述对所有类别的样本同时学习并获得所有类的域描述,这样既能充分利用所有类别的已知样本,同时又一定程度上考虑了类别之间的联系。

定义3 多数据域描述模型 假设有m类数据样本,第l类包含nl个样本点,样本总数记为$n={\displaystyle \sum _{l\in \mathbb{N}{}_m}n}{}_l$。第l类模糊样本集记为$\stackrel{⌢}{A{}_l}=\{(x{}_{1l},\stackrel{⌢}{s{}_{1l}}),\cdots ,(x{}_{n{}_{l}l},\stackrel{⌢}{s{}_{n{}_{l}l}})\}$,其中$\stackrel{⌢}{s{}_{il}}\in [0,1]$。假设这些样本独立同分布,来自Xl×Yl上的一个联合概率分布P。则MDMH 模型表示为:

fl=g(x|Rl,cl) (6)

其中,g(·)是模型,定义一个超球假设类。覆盖第l类(l∈ℕm)样本的超球可用一般距离空间中的一个闭球描述,即BRl(xcl)={x∈Xl:d(x,cl)≤Rl}。其中x是输入,Rl和cl是第l类的参数,示例了假设类中的一个假设。下面的定义给出求解MDMH模型的最优化问题。

定义4 MDMH优化问题 假设有m类数据样本,所有样本点构成的全体记作$X={\displaystyle \underset{l\in \mathbb{N}{}_m}{\cup }}X{}_l$,代表原始输入对象的全空间。设H为Hilbert空间,(·,·)是其上的内积。‖·‖为Hilbert空间H的一个范数,$\forall x\in {\rm H}‚\parallel x\parallel =\sqrt{(x,x)}$。通过适当的特征映射φ:XlH,将原始空间中的样本点映射到Hilbert空间H。这样,MDMH模型的优化过程定义为求解下列具有不等式约束的优化问题:

min1m∑l∈ℕmR2l+1nv∑l∈ℕm∑i∈ℕnlsilξil

s.t. ‖ϕ(xil)-cl‖2≤R2l+ξil

ξil≥0 Rl≥0 (7)

其中Rl、cl分别为第l个超球的半径和球心,ξil为松弛变量,v为惩罚因子, 其作用为平衡超球面的大小和落于超球外异常点的数量。显然,这是一个具有不等式约束的非线性规划问题,其目标函数和不等式约束条件都是二次的。下面的定理给出原始最优化问题式(7)的对偶问题,将非线性不等式约束转化为线性等式约束,将原问题转化为一个二次凸规划问题求解。

定理1 MDMH的原始最优化问题式(7)的对偶问题是求解下列二次规划问题:

$\begin{array}{l}max\left\{{\displaystyle \sum _{l\in \mathbb{N}{}_m}{\displaystyle \sum _{i\in \mathbb{N}{}_{n{}_l}}\alpha }}{}_{il}\parallel \text{ϕ}(x{}_{il})\parallel {}^2-m{\displaystyle \sum _{l\in \mathbb{N}{}_m}}{\displaystyle \sum _{i\in \mathbb{N}{}_{n{}_l}}}{\displaystyle \sum _{j\in \mathbb{N}{}_{n{}_l}}\alpha }{}_{il}\alpha {}_{jl}(\text{ϕ}(x{}_{il}),\text{ϕ}(x{}_{jl}))\right\}\\ \text{s}.\text{t}.{\displaystyle \sum _{i\in \mathbb{N}{}_{n{}_l}}\alpha }{}_{il}=\frac{1}{m}0\le \alpha {}_{il}\le \frac{\stackrel{⌢}{s{}_{il}}}{nv}(i\in \mathbb{N}{}_{n{}_l},l\in \mathbb{N}{}_m)(8)\end{array}$

显然,式(7)的最优解应满库恩-塔克必要条件,即:

αil(R2l+ξil-‖ϕ(xil)-cl‖2)=0

βilξil=0 αil≥0 βil≥0 (9)

证明 首先引入式(7)的Lagrange函数:

$\begin{array}{l}L(R{}_l,c{}_l,\xi ;\alpha ,\beta )=\frac{1}{m}{\displaystyle \sum _{l\in \mathbb{N}{}_m}R}{}_l^2+\frac{1}{nv}{\displaystyle \sum _{l\in \mathbb{N}{}_m}{\displaystyle \sum _{i\in \mathbb{N}{}_{n{}_l}}\stackrel{⌢}{s{}_{il}}}}\xi {}_{il}-\\ {\displaystyle \sum _{l\in \mathbb{N}{}_m}{\displaystyle \sum _{i\in \mathbb{N}{}_{n{}_l}}\alpha }}{}_{il}(R{}_l^2+\xi {}_{il}-\parallel \text{ϕ}(x{}_{il})-c{}_l\parallel {}^2)-\\ {\displaystyle \sum _{l\in \mathbb{N}{}_m}{\displaystyle \sum _{i\in \mathbb{N}{}_{n{}_l}}\beta }}{}_{il}\xi {}_{il}(10)\end{array}$

其中α=(α11,…,αil,…,αnmm)T,β=(β11,…,βil,…,βnmm)T为Lagrange乘子。根据Wolfe对偶的定义,分别求Lagrange函数式(10)关于Rl,cl,ξil的极小点。由极值条件得:

∂L∂Rl=2

mRl-2Rl∑i∈ℕnαil=0

∂L∂cl=∑i∈ℕnlαil(ϕ(xil)-cl)=0

∂L∂ξil=sil

nv-αil-βil=0 (11)

即

${\displaystyle \sum _{i\in \mathbb{N}{}_{n{}_l}}\alpha }{}_{il}=\frac{1}{m}$ (12)

$c{}_l=m{\displaystyle \sum _{i\in \mathbb{N}{}_{n{}_l}}\alpha }{}_{il}\text{ϕ}(x{}_{il})$ (13)

$\beta {}_{il}=\frac{\stackrel{⌢}{s{}_{il}}}{nv}-\alpha {}_{il}$ (14)

将式(12-14)代入Lagrange函数式(10),得证。

第l个超球的半径Rl可通过位于其球面上的样本点(记yl)求解,满足:

R${}_l^2$=‖ϕ(yl)-cl‖2(l∈ℕm) (15)

下面说明如何寻找位于超球面上的点。

定理2 设式(8)是MDMH原始优化问题(7)的对偶问题,定义$x{}_{surf}^{(l)}=\left\{x{}_{il}:0<\alpha {}_{il}<\frac{\stackrel{⌢}{s{}_{il}}}{nv};x{}_{il}\in X{}_l,i\in \mathbb{N}{}_{nj}\right\}$,则对任意x∈x${}_{surf}^{(l)}$是位于第l个超球面上的点,成立R${}_l^2$=‖ϕ(xil-cl‖2。

证明 当$0<\alpha {}_{il}<\frac{\stackrel{⌢}{s{}_{il}}}{nv}$时,有$\beta {}_{il}=\frac{\stackrel{⌢}{s{}_{il}}}{nv}-\alpha {}_{il}>0$。由库恩—塔克必要条件式(9)的αil(R${}_l^2$+ξil-‖ϕ(xil)-cl‖2)=0知:R${}_l^2$+ξil-‖ϕ(xil)-cl‖2=0。再由βilξil=0和βil>0,得ξil=0,从而R${}_l^2$=‖ϕ(xil)-cl‖2。

设yl为满足定理2的位于第l个超球面上的任意一点,l∈ℕm,将式(13)代入式(15),得到:

$\begin{array}{l}R{}_l^2=\parallel \text{ϕ}(y{}_l)\parallel {}^2-2m{\displaystyle \sum _{i\in \mathbb{N}{}_{n{}_l}}\alpha }{}_{il}(\text{ϕ}(y{}_l),\phi (x{}_{il}))+\\ m{}^2{\displaystyle \sum _{i\in \mathbb{N}{}_{n{}_l}}{\displaystyle \sum _{j\in \mathbb{N}{}_{n{}_l}}\alpha }}{}_{il}\alpha {}_{jl}(\text{ϕ}(x{}_{il}),\text{ϕ}(x{}_{jl}))(16)\end{array}$

对于测试数据x,MDMH的第l类判别式为:

$f{}_l=\frac{R{}_l^2-\parallel \text{ϕ}(x)-c{}_l\parallel {}^2}{R{}_l^2}=1-\frac{\parallel \text{ϕ}(x)-c{}_l\parallel {}^2}{R{}_l^2}(17)$

其中,

$\begin{array}{l}\parallel \text{ϕ}(x)-c{}_l\parallel {}^2=\parallel \text{ϕ}(x)\parallel {}^2-2m{\displaystyle \sum _{i\in \mathbb{N}{}_{n{}_l}}\alpha }{}_{il}(\text{ϕ}(x),\text{ϕ}(x{}_{il}))+\\ m{}^2{\displaystyle \sum _{i\in \mathbb{N}{}_{n{}_l}}{\displaystyle \sum _{j\in \mathbb{N}{}_{n{}_l}}\alpha }}{}_{il}\alpha {}_{jl}(\text{ϕ}(x{}_{il}),\text{ϕ}(x{}_{jl}))(18)\end{array}$

通过引入核函数k(x,y)=(ϕ(x),ϕ(y)),MDMH的最优化问题式(8)变为:

max∑l∈ℕm∑i∈ℕnlαilk(xil,xil)-m∑l∈ℕm∑i∈ℕnl∑j∈ℕnlαilαjlk(xil,xjl)

s.t. ∑i∈ℕnlαil=1m 0≤αil≤silnv(i∈ℕnl,l∈ℕm) (19)

对于测试数据x,MDMH的第l类判别式(17)变为:

$\begin{array}{l}f{}_l=\frac{R{}_l^2-\parallel \text{ϕ}(x)-c{}_l\parallel {}^2}{R{}_l^2}=1-\frac{\parallel \text{ϕ}(x)-c{}_l\parallel {}^2}{R{}_l^2}\\ =1-\frac{k(x,x)-2m{\displaystyle \sum _{i\in \mathbb{N}{}_{n{}_l}}\alpha }{}_{il}k(x,x{}_{il})+m{}^2{\displaystyle \sum _{i\in \mathbb{N}{}_{n{}_l}}{\displaystyle \sum _{j\in \mathbb{N}{}_{n{}_l}}\alpha }}{}_{il}\alpha {}_{jl}k(x{}_{il},x{}_{jl})}{k(y{}_l,y{}_l)-2m{\displaystyle \sum _{i\in \mathbb{N}{}_{n{}_l}}\alpha }{}_{il}k(y{}_l,x{}_{il})+m{}^2{\displaystyle \sum _{i\in \mathbb{N}{}_{n{}_l}}{\displaystyle \sum _{j\in \mathbb{N}{}_{n{}_l}}\alpha }}{}_{il}\alpha {}_{jl}k(x{}_{il},x{}_{jl})}(20)\end{array}$

对于多分类问题,最常见的情形是判别测试样本x最可能所属的类别,通过求:

$f(x)=\arg \underset{l}{{\displaystyle \max }}f{}_l(x$;Rl,cl) (21)

另一种情形是预先设定一个阈值λ,大于这个阈值的判别为样本所属的类,可通过求下面的截集得到:

fλ={l: fl(x)>λ,l∈ℕm} (22)

还有一种情形是希望将测试样本x判为最有可能的N(N∈ℕm)个类别。记$f{}_{\min }=\underset{l\in \mathbb{N}{}_m}{{\displaystyle \inf }}\{f{}_l\}‚f{}_{\max }=\underset{l\in \mathbb{N}{}_m}{{\displaystyle \sup }}\{f{}_l\}$,则x所属的N个类别为:

fN={l:#{fl(x)≥μ}=N,∃μ∈[fmin,fmax],l∈ℕm} (23)

3.2基于多数据域描述的TFBS识别

如前所述,TFBS的识别问题可看作是一个多分类问题。根据定义,TFBS在计算机中可表示为由字母表Σ={A,G,C,T}构成的一定长度的字符串。设x,y分别为两个待比较的TFBS序列片段,记x=x1x2…xm,y=y1y2…yn(xi,yi∈Σ),长度分别为|x|=m,|y|=n,(m,n∈ℕ+)。令ε代表空串,由Σ组成的所有字符串的全体记为:$X=\{\epsilon \}{\displaystyle \cup {\displaystyle \underset{n=1}{\overset{\infty }{\cup }}\Sigma }}{}^n$,构成TFBS序列的输入空间。

定义如下基于编辑距离的字符串核作为学习机的核函数:

k(x,y)=exp{-β·Edit(x,y)} (24)

其中Edit(x,y)代表x和y的编辑距离。β为一参数,为避免Gram矩阵强对角占优,需根据具体的应用选取β值,本文实验中取β=0.2。显然,x与y越相似,k(x,y)的值越大。

通过以上输入空间和核函数的定义,利用式(19)对数据库中的TFBS样本进行学习获得多数据域描述,根据式(21-23)对测试样本进行分类。下面在真实数据集上验证方法的有效性。

4实验方法与结果讨论

4.1实验数据

本文从最新的TRANSFAC数据库(Release 9.4)[26]中取出50组脊椎动物转录因子结合位点作为样本集,均为权威机构通过生物学实验验证获得的真实数据。选取的原则是尽可能使位点的长度和每组位点数分布均匀,忽略长度在5～15bp以外的位点(很可能是噪声)。该数据集的一般性描述统计如表1所示。

4.2实验结果

本实验的具体环境为一台运行Windows XP的PC机,具有Pentium Centrino Duo 1.83G 双核CPU和2G内存。所有代码用MATLAB实现。

实验分5组进行,第1组的训练样本来自前10类,记为M-10;第2组来自前20类(M-20);第3组前30类(M-30);第4组则包含所有50个类的样本(M-50)。以上第1～4组实验的测试样本均来自前10个类。 第5组实验的训练样本和测试样本均来自前10个类,采用One-class SVM(即模型中取m=1的情况,不考虑类间联系),并同前4组实验进行比较。我们采用交叉验证来测试算法的性能:每次取第l(l∈ℕm)类的一个样本作为测试样本,剩余的nl-1个样本和其他m-1类的所有样本作为训练样本,反复进行直到所有类别的样本测试完毕。算法的性能度量采用生物信息学中常用的三个指标:敏感性(Sensitivity)、特异性(Specificity)和F-measure,其中F-measure通过下式计算:

$F-measure=\frac{2\times Sensitivity\times Specificity}{Sensitivity+Specificity}$ (25)

以上5组实验独立进行,对每组实验分别得出上述3个性能指标。表2给出了5组实验的性能指标均值。

实验结果表明,MDMH模型能有效地应用于TFBS识别问题。当样本包含的类别数较少时(如:m=10),基于MDMH的TFBS识别方法性能略低于One-class SVM方法。但随着训练集包含的类别数的增加,MDMH方法的预测准确率有不断提高的趋势,当m=50时,预测准确率达到88%,明显高于One-class SVM。这表明当训练集包含足够多类别的样本时,MDMH能充分利用来自所有类别的训练样本,有效地捕获多类别间的联系,提高预测准确率。

5结语

本文建立了一个基于多任务学习理论的多数据域描述模型:MDMH,并在此基础上设计了一个转录因子结合位点识别算法,从整体上对所有类别的样本同时学习,充分地利用了数量有限的已知样本,同时考虑了类别间的联系。针对生物序列的特点,采用基于编辑距离的字符串核来度量TFBS之间的相似性。实验获得了较高的预测准确率。

在后续工作中,我们将对多任务学习理论进行完善,考虑不同任务可能对应异构输入空间的情形。另外,本文假设数据样本是独立同分布的,对解决一些实际问题有局限性,因此需要考虑如何解除这个限制条件。其次,我们将从计算学习理论的角度出发,给出一般多数据域描述模型泛化错误的界。对于不同种类的多任务联系,考虑如何定义多任务核函数和改进正则化因子以更好地捕获类间联系。再者,需要从计算代价上降低多任务学习求解过程的复杂度或设计并行算法以适应大数据量或实时系统。最后,针对TFBS识别问题,我们将引入更多有效的生物学先验知识以提高预测效果,设计增量学习算法以适应生物数据库快速增长的需求。

转录调控因子 篇6

然而, 由于耐冷性状是属于数量性状, 是多基因作用的结果, 单纯的一个抗冷基因并不能明显改善植物的抗冷性状。近年来的研究表明, CBF-DREB (C-repeat/DRE Binding Factor) 转录因子能够激活很多冷响应基因, 转录出相应的蛋白质, 加强植株的耐冷性[1]。DREB转录因子对一系列抗逆功能基因的转录以及对脯氨酸和糖含量的促进作用, 说明DREB因子在植物抗逆反应中起着重要作用[2]。与导入或改良个别功能基因来提高某种抗性的传统方法相比, 在提高作物对环境胁迫抗性的分子育种中, 改良或增加一个关键的转录因子的调控能力可以提高植株多方面的抗逆性 (抗旱、抗冻及抗盐) [3]。

根据拟南芥中已经报道的对冷害起作用的转录因子, 借助拟南芥和芸薹属亲缘关系较近的优势, 针对拟南芥中抗冷转录因子的保守区设计简并引物, 利用RACE法 (Rapid Amplification of cDNA Ends, cDNA末端迅速扩增) 从大白菜中克隆编码抗冷相关的转录因子BrDREB基因, 然后设计合适的酶切位点, 以pGreen0229-RD29A-CBF4-DHA为框架, 构建成具有携带抗冷转录因子并且具有除草剂抗性的植物表达载体pGreen0229-CaMV35S-BrDREB-DHA。本试验先从若干东北早粳稻品种中筛选出适合进行遗传转化的品种, 然后将该表达载体用农杆菌介导法转入这些品种的愈伤组织中, 以期获得带有Bar基因选择标记的转BrDREB基因的早粳稻转化株。

1 材料与方法

1.1 供试材料

进行遗传转化的早粳稻品种由黑龙江省农业科学院耕作栽培研究所提供, 包括松粳3号、松粳98-122、松粳98-133、龙稻99-88、龙稻99-85、垦鉴稻7号、合江19、普优17、龙粳14和龙育390等品种 (系) 。

农杆菌菌株GV3101和表达载体pGreen0229-CaMV35S-BrDREB-DHA均由北京市农林科学院提供。

培养基配方参见全东兴的方法[4]。

1.2 试验方法

1.2.1 农杆菌介导的水稻愈伤组织的转化

取水稻成熟种子, 脱壳, 挑选饱满光洁无菌斑的种子消毒, 将种子放在无菌滤纸上吸干, 置入诱导培养基中, 每瓶30颗, 在28℃培养箱培养21 d后, 挑取自然分裂的胚性愈伤组织 (淡黄色, 致密呈球状) , 去掉芽和盾片, 置入继代培养基中, 在28℃培养箱, 继代培养。将载有表达载体pGreen0229-CaMV35S-BrDREB-DHA的农杆菌GV3101菌液1 mL于20 mL YEP (含50 mg· L-1 Kan) 培养液中, 28℃, 200 r·min-1振荡培养过夜, 再取1 mL菌液于20 mLYEP培养液中, 28℃, 200 r·min-1振荡培养4～6 h至菌液OD600为0.6～0.8。将培养好的菌液于30 mL离心管中, 4℃, 5 000 r·min-1, 离心8 min, 去上清。用含200 μmol· L-1 As (乙酰丁香酮) 的100 mL AAM菌液制成悬浮液, 使菌液OD600的终浓度为0.1;将长到一定大小的水稻愈伤组织挑出, 放入农杆菌悬浮液侵染15 min;将愈伤组织取出, 置于无菌的滤纸上沥干30～40 min;将愈伤组织置于共培养基 (覆盖一层滤纸) 上, 25℃暗培养2.5 d。将愈伤组织取出, 用无菌水清洗5～6次, 其间需不停的振荡, 直至水清澈不见杂物。再用含500 mg· L-1头孢噻肟钠的无菌水清洗1～2遍。最后置于无菌滤纸上沥干2 h;将晾干的愈伤转入含500 mg· L-1头孢噻肟钠和2 mg· L-1 PPT的选择培养基上进行第一轮选择, 28℃, 暗培养14 d;将长有抗性愈伤的初始愈伤转到含300 mg· L-1或头孢噻肟钠和2 mg· L-1的培养基上进行第二轮选择, 28℃, 暗培养, 直到颗粒性的抗性愈伤组织长出 (见图1) 。

1.2.2 抗性愈伤组织的预分化和分化

将新长出的抗性愈伤组织转入预分化培养基中, 25℃, 光照培养7 d。挑取从同一愈伤来的颜色鲜黄的抗性愈伤, 移入装有分化培养基的培养皿中, 放入恒温培养室中, 等待分化成苗 (15～30 d) 。待苗长至1 cm左右, 放入生根培养基中壮苗 (见图2, 图3) 。

1.2.3 再生植株的分子检测

(1) PCR检测:引物是根据BrDREB的序列设计的特异性引物。序列为5’-TCTAGAACTCTACATTCCCAGACTCG-3’和5’-GAGCTCTAAAACACACCACCATTC-3’, 扩增产物大小为489 bp。PCR扩增体系30 μL, 含3 μL 10×Buffer (含MgCl2) , dNTPs 3 μL (2.5 mM) , Taq 0.2 μL (5U·μL-1) , 引物各1 μL, 总DNA1 μg。反应程序为94℃ 5 min, (94℃ 1 min, 60℃ 1 min, 72℃ 1 min) 35循环, 72℃ 10 min, 4℃保存。 (2) 转BrDREB水稻转化株Southern斑点杂交检测:将质粒DNA进行PCR扩增, 电泳后回收DNA片段做探针, 与转BrDREB的阳性植株DNA进行杂交。按照Roche DIG High Prime DNA Detection Starter KitⅡ试剂盒上的方法进行Southern斑点杂交。

2 结果与分析

2.1 同种培养基上不同水稻品种的诱导率

采用MS培养基作为基本培养基, 以10个水稻品种作为供试材料, 进行水稻愈伤组织的诱导, 得到水稻愈伤组织的出愈率和愈伤状态 (见图4) 。由图4可见, 在10个供试的黑龙江栽培水稻品种 (系) 中, 出愈率由高到低依次是龙育390、龙粳14、合江19、普优17、龙稻99-85、龙稻99-88、松粳98-133、松粳3号、垦鉴稻7号和松粳98-122;愈伤组织的致密率由高到低次序为合江19、龙育390、龙粳14、普优17、松粳98-133、龙稻99-88、龙稻99-85、松粳3号、垦鉴稻7号和松粳98-122。品种间出愈率和致密率相关系数r=0.947 (r0.01=0.765) , 达极显著水平, 出愈率越高的品种, 其愈伤也越好。出愈率最高的品种 (系) 龙育390、龙粳14、普优17和合江19的愈伤状态比较好, 生长速度快, 结构致密, 色泽嫩黄, 质地脆硬, 继代培养几次后仍能保持旺盛的生命力, 并形成具有分化能力的胚性愈伤。而松粳98-122和垦鉴稻7号出愈率最低, 愈伤组织颜色发白, 结构松软, 水分大, 生长缓慢, 愈伤状态最差, 继代培养几次后数量越来越少, 愈伤组织不能形成胚性愈伤, 而且褐化比较严重。这表明, 不同水稻基因型组织培养效果不同。使用合江19、龙育390、普优17和龙粳14在组织培养中表现较好的品种 (系) 进行遗传转化比较有利。

2.2 PCR检测结果

利用优化的农杆菌介导的粳稻遗传转化体系, 以合江19和龙粳14为受体品种, 从20个独立的PPT抗性愈伤中获得了24株转BrDREB基因的植株。提取转基因水稻植株叶片的DNA, PCR鉴定外源基因BrDREB是否转入水稻中 (见图5) 。由图5看出, pGreen0229-CaMV35S-BrDREB-DHA质粒DNA和BrDREB基因遗传转化株DNA为模板PCR产物均在529 bp左右有特异扩增条带, 而以合江19 DNA为模板的PCR反应体系中未发现这一特异扩增条带。说明所有的24株转BrDREB基因的水稻PCR鉴定均为阳性, BrDREB基因已经整合进合江19的染色体组中。

a～j为合江19转化株, k～o为龙粳14转化株, p为阳性对照, q为阴性对照, r为100bpMarker

2.3 Southern斑点杂交结果

选择在PCR检测中信号较强的10个植株进行Southern斑点杂交 (见图6) 。

a为探针对照;b～k为转基因水稻植株;l为质粒DNA

b、c、d、g、h、i、j和k可见免疫检测信号, 而对于植株e和f杂交信号为阴性。根据Southern斑点杂交结果, PCR检测阳性转基因水稻中仍然有20%左右是未转化植株。这说明农杆菌介导水稻遗传转化体系产生的转化植株, 在用PCR初步检测外源基因整合后, 有必要进一步利用Southern杂交进行整合检测。

3 尚待研究的问题

本研究已经获得了转耐冷相关基因BrDREB的早粳稻植株, 但还有很多工作需要进一步深入开展。首先, 对于得到的转基因植株的外源基因整合情况有待于进一步验证, 如进行Southern印迹杂交。其次, 对外源基因在转基因植株的表达情况加以检测, 包括RNA水平和蛋白质水平的检测。还有, BrDREB基因的具体功能和转基因水稻的耐冷性需要验证。

植物耐冷性是一种涉及众多微效基因的数量性状, 因此, 对于水稻的耐冷性育种工作也必须从多方面入手[5]。可以考虑将多个耐冷相关基因同时转入水稻中, 并开展分子标记辅助选择育种工作, 以提高水稻耐冷性育种的效率。

摘要：低温冷害是造成水稻减产的主要因素之一。CBF-DREB转录因子家族是近年来发现的对植物抗逆反应起重要作用的一类基因。将来源于大白菜中的抗冷相关的转录因子BrDREB基因与Bar基因选择标记构建于pGreen0229表达载体上, 用农杆菌介导法将其转入东北早粳稻的几个品种中, 获得带有Bar基因选择标记的转BrDREB基因的早粳稻植株。通过PCR扩增、Southern杂交检测分析表明, BrDREB基因已被转入水稻中。

关键词：水稻,农杆菌介导,BrDREB基因

参考文献

[1]刘强, 赵南明.DREB转录因子在提高植物抗逆性中的作用[J].科学通报, 2000, 4 (1) :10-16.

[2]李杰, 朱延明, 吴迪, 等.DREB2A基因的克隆、序列分析及其植物表达载体的构建[J].东北农业大学学报, 2005, 36 (1) :36-40.

[3]Thomashow M F.Plant cold tolerance-freezing tolerance genesand regulatory mechanisms[J].Annu Rev Plant Physiol PlantMolBiol, 1999, 50:571-599.

[4]全东兴.吉林省主栽水稻品种组织培养体系的优化及抗除草剂基因转化研究[D].哈尔滨:东北农业大学硕士论文, 2002.

转录调控因子 篇7

1 NF-κB的生物学特性

1.1 NF-κB的结构

NF-κB几乎存在所有的细胞中, 它首次发现于成熟B细胞核的提取物中, 因其能与B细胞免疫球蛋白的κ轻链基因增强子κB序列特异性结合而被命名。NF-κB家族中包括Rel A (p65) 、NF-κB1 (p50) 、NF-κB2 (p52) 、C-Rel和Rel B, 它们以同源性二聚体或者异源性二聚体的形式存在, 其中Rel A/NF-κB1是主要存在形式。这些蛋白亚型的N端共有一个由300个氨基酸组成的肽链, 称为Rel同源结构域, 包括二聚体化结构域、DNA结合结构域[1]、核定位序列 (HLS) 和IкB结合位点[2], 可使NF-κB从细胞质向细胞核转移, 调节靶基因的转录[3], 但是它们的C端存在差异。

1.2 NF-κB的功能

基于NF-κB的结构特点, 其主要功能是可以和DNA结合, 调节转录。但是各亚型之间略有不同。NF-κB1和NF-κB2的主要功能是结合DNA, 而Rel A、C-Rel和Rel B没有前体, 含有转录活性区, 可调节转录激活作用。NF-κB激活可调节趋化因子、细胞因子、血管生成因子的表达, 广泛参与细胞分化和凋亡、免疫反应[3]、炎性反应、肿瘤生成及转移等病理生理过程。在高尿酸血症的小鼠模型中发现, NF-κB信号通路被激活, TNF-α、MCP-1和趋化因子的表达上调[4]。肿瘤的生成与细胞凋亡和抗凋亡水平失衡有关, NF-κB一方面可以促进细胞凋亡, 通过上调p53和Ikappa B表达[5、6], 另一方面可以抑制细胞凋亡, 促进抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-XL的表达[7]。

1.3 NF-κB的活化

静息状态时, NF-κB与其抑制物IκB结合形成复合物, 从而掩盖NF-κB的核定位序列, 以无活性状态停留于细胞质内[8]。在受到细胞因子、氧自由基、病毒等外来因素的刺激, 抑制剂激活酶 (IKK) 被激活而引发IκB磷酸化被降解, 释放NF-κB, NF-κB进入细胞核与靶基因κB序列结合调控其表达[9]。

2 NF-κB与肾细胞癌

2.1 NF-κB与肾细胞癌的发生

肾细胞癌的发病率仅次于膀胱肿瘤, 2008年全球癌症数据统计显示肾细胞癌的发病率为每年约271000例[10], 且呈逐年上升趋势。肾细胞癌的病因尚不清楚, 但是相关危险因素已经明确, 肥胖、吸烟、高血压、肾脏疾病及病毒性肝炎均可增加其发病机会[11]。NF-κB是体内抗凋亡途径的关键因子, 持续激活该信号通路可使细胞恶性增值, 致使肿瘤的发生。香烟中存在大量的致癌物质, 其具体的致癌信号通路仍不清楚, 但是可以激活NF-κB, 而且活化的强度与烟雾的接触时间和剂量呈相关性[12]。有报道, 在用NF-κB的超级抑制物IκB处理的已致病为高血压的小鼠模型中, 肿瘤坏死因子 (TNF-α) 水平降低, 出现蛋白尿的小鼠减少到一半, 血管周围管状纤维化和肾脏的炎性细胞渗出物明显减少[13]。说明抑制NF-κB信号通路可以降低高血压肾病的发病率, 同时也减少了肾细胞癌发病的危险因素。肿瘤的形成也和特定的基因的异常表达有关。P53抑癌基因是生物体内一种抑制细胞转变癌细胞的基因, 其编码的P53蛋白可以修复损伤的DNA, 如果修复失败, P53蛋白即启动程序性死亡 (凋亡) 过程诱导细胞自杀, 阻止有癌变倾向的突变细胞的生成, 从而防止细胞恶变。肾癌细胞中通常保留野生型而功能不活跃的p53, 而且被抑制。动物实验发现, 在肿瘤移植的裸鼠模型中, 9-氨基吖啶和抗疟药奎纳克林形成的混合药物可以激活P53基因而抑制NF-κB, 起到抗肿瘤的作用[14]。c-myc基因可以易位、可调节多种物质, 也可以促进细胞分裂, 使细胞无限增殖, 参与多种肿瘤的发生发展。基因的扩增、重排或者启动子的插入均可导致c-myc致瘤性转化。研究发现在早期和转移的肾细胞癌中c-myc均表达, 且与细胞核多形性的级别有关, 级别越高所含有的增殖细胞越多[15], 烟雾中的镉盐能激活细胞中的NF-κB, 通过NF-κB进一步促进癌基因c-myc的表达[16]。

2.2 NF-κB与肾细胞癌的增殖

肾细胞癌的发展与NF-κB的促进细胞增殖和抗凋亡作用密切相关。且许多研究表明NF-κB通路活化可以促进肾细胞癌和其他肿瘤的生长。如前述, c-myc基因可促进肾细胞癌的发生, 也可调节癌细胞分裂, 使细胞增殖[17]。该基因的上游启动子序列中含有κB反应元件, 所以NF-κB的活化必然激活c-myc基因[18]。实验研究发现, 单纯的肾细胞癌组和用吡咯烷二硫基甲酸盐 (pyrrolidine dithiocarbamate, PDTC) 处理的肾细胞癌组相比较, 后者的NF-κB的活性受到抑制, 抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-XL的表达较前者增多, 而前者的促凋亡蛋白明显增加[7], 显示PDTC的抗肿瘤作用。实验研究显示在用TNF-α诱导的肾癌细胞中, NF-κB的表达水平明显升高, 而且NF-κB靶向作用的抗凋亡基因c-FLIP, Survivin, c-IAP-1和c IAP-2的表达水平也明显升高[19]。

2.3 NF-κB与肾细胞癌的转移

NF-κB的活化与肿瘤的转移密切相关, 其可以促进血管生成相关的因子转录表达, 如血管内皮生长因子 (VEGF) 、纤溶酶原激活物尿激酶 (u-PA) 、基质金属蛋白酶 (MMP) 及细胞间黏附因子 (ICAM-I) 等。实验发现用致瘤性蛋白CD74处理人胚胎肾脏293细胞后, 检测发现CD74可以通过Ras/Raf/MEK/ERK和Ras/PI3K/AKT激活NF-κB信号通路, 使VEGF的表达上调[20]。受NF-κB调控的金属蛋白酶 (MMP) 尤其是MMP2和MMP9因可以降解细胞外基质而促进癌细胞转移。有文献报道, 长期低剂量的TNF-α刺激可导致肿瘤的发生, 并且促使肿瘤细胞的增殖和转移。它不仅可以活化NF-κB和MMP9, 还能够表达促侵袭性蛋白E钙黏蛋白诱导肾癌细胞的上皮间质转化。在肾细胞癌中NF-κB p65过表达使E钙黏蛋白减少, 而应用NF-κB抑制剂后, TNF-α诱导的MMP9和E钙黏蛋白并未降低, 说明NF-κB与肿瘤细胞侵袭呈相关性但并非决定性[21]。骨调素是一种磷糖蛋白, 也参与肿瘤的发生和转移。研究发现骨调素在调节透明型肾细胞癌发展过程中, p65 NF-κB亚型与OPNmRNA的表达呈相关性, 阻止肿瘤细胞凋亡[22]。

3 讨论

特定的靶向治疗是继传统手术治疗和术后免疫治疗的最具有发展前景的治疗方法。NF-κB信号通路与肾细胞癌的发生发展密切相关, 特异性的阻断该信号通路将有一定的抗癌作用, 因此我们可以假设NF-κB信号通路为治疗肾细胞癌的一个靶点。但是, NF-κB几乎存在所有细胞中, 并且存在多种亚型, 非特异性的阻断该信号通路将会对机体造成严重损伤, 所以关于癌细胞中NF-κB特异性的研究以及仅作用于肿瘤细胞中的NF-κB的特异性抑制剂值得我们期待。