信号转导与转录因子5（精选3篇）
信号转导与转录因子5 篇1
自身免疫性疾病, 医学上定义为机体免疫系统对自身细胞组织产生病理性的免疫应答, 并由自身免疫效应细胞参与致病机制过程, 最后导致组织损伤甚至功能障碍的疾病, 具有一定的遗传性, 常在外界因素如感染因子、毒性药物、生活环境、精神压力的推动下, 藉由机体内部因素以先天或变异的途径发挥作用。因此, 国际医学领域又常将该类疾病定义为“5D”疾病, 即药物中毒 (drug toxicity) 、残疾 (disability) 、经济损失 (dollar loss) 、痛苦 (discomfort) 和死亡 (death) 。目前, 该类疾病已知分类有40多种, 美国每年有大约25万例新增患者会被诊断为至少罹患其中的一种疾病。而发病率最高的几类自身免疫病, 如类风湿关节炎 (rheumatoid arthritis, RA) 、系统性红斑狼疮 (systemic lupus erythematosus, SLE) 、强直性脊柱炎 (ankylosing spondylitis, AS) 、干燥综合征 (sjogren's syndrome, SS) 等, 近年来在我国乃至全球呈逐年攀升的趋势。女性患病的可能性要比男性高2.7倍, 发病率随年龄而增高。因此自身免疫病越来越受重视。目前大量研究发现人类白细胞抗原 (human leukocyte antigen, HLA) 、整合素 (integrins) 和信号传导子及转录激活子 (signal transducer and activator of transcription, STAT) 与自身免疫性疾病发生、发展有着密切的联系。本文对HLA、整合素和STAT的分子功能及其与自身免疫病的相关性研究作一综述。
1 自身免疫病的临床特征及其治疗进展
自身免疫病是一类原因复杂、临床表现多样、严重危害人类健康的疾病, 多为慢性病, 任何年龄、性别均可发病, 以女性为多见, 常累及多器官、多系统, 反复发作、慢性迁延。患者血清中常可检出高浓度的自身抗体和/或与自身组织成分起反应的致敏淋巴细胞, 并发生免疫效应病理性应答, 病理特征常为淋巴细胞和浆细胞浸润等两方面的慢性炎症。
医学上, 自身免疫病的病因可归结为以下几种: (1) 自身抗原的出现:如隐蔽抗原的释放、自身抗原发生改变; (2) 免疫调节异常:如多克隆刺激剂的旁路活化, Th1和Th2细胞功能失衡; (3) 交叉抗原的存在:如柯萨奇病毒-糖尿病;链球菌感染-急性肾小球肾炎、风湿性心脏病; (4) 遗传因素:主要组织相容性复合体 (major histocompitibility complex, MHC) 单体型不同, 不同单体型的个体与多种自身免疫病关系密切, 如DR3个体易患重症肌无力、DR4与类风湿有关、B27与AS有关以及DR2与肺出血肺炎综合征有关等。
自身免疫病的治疗目标主要是修补特定的免疫缺陷和改变整个免疫反应, 目的是在不破坏正常的免疫防御的前提下终止自身免疫反应的破坏作用。通常采用糖皮质激素和免疫抑制剂等化学药品治疗, 虽然有一定疗效, 但长期使用都会产生严重的不良反应, 而且都只能缓解病情的发展, 并不能根治, 并增加了患者发生肿瘤和感染扩散的危险。近10年来, 基于该类疾病发病机制中不同环节的特异性生物治疗已成为研究热点, 并有可能发展为临床治疗的趋势。如针对T细胞和B细胞的生物学治疗, 抑制T细胞活化和T-B细胞间相互作用的生物制剂, 针对细胞因子的生物制剂, 自身免疫病治疗性肽疫苗, 如系统性红斑狼疮肽疫苗、类风湿关节炎肽疫苗的研究。
2 HLA、STAT、整合素的分子功能
2.1 HLA的分子功能
有研究表明, 脊椎动物的染色体内均存在一段特殊性基因组, 即MHC, 执行转录免疫应答和免疫识别直接相关蛋白质的功能[1]。在机体特异性免疫应答启动机制中, T细胞和抗原提呈细胞上的MHC-Ⅰ/Ⅱ类分子-抗原复合物结合成MHC-Ⅰ/-Ag-TCR复合体是关键性的一步。而国际医学上, 人类MHC别名为“HLA系统”, 是人类基因组中最早被认知与多种疾病呈正相关的、最复杂的和最具多态性的遗传体系, 其中的多态性决定着免疫应答敏感度的个体差异。目前研究发现HLA与自身免疫病关系密切。
2.2 STAT的分子功能
STAT蛋白家族是近年来发现的一类转录因子, 包括STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5a、STAT5b、STAT6等7个成员。主要被白细胞介素-12 (IL-12) 激活, 在Th1/Th2的分化调控及因其失调引发的各种炎症性疾病中有重要的作用。其中, STAT4对Th1细胞发育起关键作用, 其缺少可抑制T细胞介导的炎性反应, 在小鼠中其基因组位于STAT1旁的1号染色体, 在人类中其基因组位于2q32.2-32.3。它的编码序列区域 (CDS) 由连续的2247个核苷酸构成, 负责编码748个氨基酸, 分子量约为84 000。STAT家族均具有类似的蛋白质结构特点, 均由羧基末端的转录激活区、近羧基端的Src同源结构域 (SH2) 及酪氨酸位点、中部DNA结合区域, 以及氨基末端保守区域等四部分构成。值得注意的是, STAT4的组织分布相当有限, 集中分布于淋巴和髓系组织中。经研究证实[2], STAT4缺陷对主要由抗体介导的自身免疫性疾病不存在保护作用。STAT3蛋白是1994年被Zhong等首次发现的, 它和细胞的增生与分化有关, 可调节细胞转化。它分布广泛, 在脑、肝、心、睾丸、胸腺等组织中均有表达。STAT3的持续活化是导致多种细胞的异常增殖的重要原因。
2.3 整合素的分子功能
目前研究所知[1], 整合素是由18种α亚基和8种β亚基构成的至少24种的细胞表面受体的异源二聚体, 同时也是细胞黏附分子 (cell adhesion molecules, CAMS) 家族成员, 负责介导细胞与细胞之间、细胞内与细胞外基质 (extracellular matrix, ECM) 之间的黏附功能, 同时建有介导细胞与ECM之间的双向信号传导作用, 在机体内部细胞 (包括癌细胞) 的黏附、增殖、分化、转移、凋亡机制发挥关键的调控作用。该类物质的原型为纤维连接蛋白, 对多个ECM成分具备识别功能, 其配体结合位点为精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸 (RGD) 序列。整合素的胞内段没有酶活性, 需要借助生长因子受体胞浆区和胞内接头蛋白 (蛋白激酶共同完成信号转导) 。值得一提的是, 细胞间的相互黏附是人类机体免疫功能正常运作的基础, 黏附分子的过分表达可导致干燥综合征、风湿性疾病、系统性红斑狼疮、强直性脊柱炎等多种自身免疫病。
3 HLA、STAT、整合素与多种自身免疫病的相关性研究
3.1 HLA、STAT、整合素与类风湿关节炎的相关性
类风湿关节炎自身免疫疾病的一种, 临床上主要表现为慢性、多关节滑膜炎和关节外病变, 其发病机制暂未清楚, 目前国内外学者认为类风湿关节炎是一种遗传概率超过60%的多基因性的遗传疾病, 其在MHC领域上的研究成为近几年来分子遗传学的热点。国外多数学者认为HLA-DR4与类风湿关节炎的易感性有关, 而随着基因组技术的开发, 利用单核苷酸多态性 (single nucleotide polymorphism, SNP) 为标记物, 通过全基因测序法发现了MHC区域外存在多个与类风湿关节炎关系密切的基因。
贺桂凤等[3]发现, HLA-DR4为类风湿关节炎的重要易感基因之一, 其携带的共同表位能与共同抗原结合, 进而与致关节炎抗原肽相结合, 最终导致类风湿关节炎产生。而蒋摇真等[4]发现HLA-DR4等位基因在预测类风湿关节炎发病概率和严重程度等方面有着重要指导意义, 研究表明HLA-DR4阳性患者与侵蚀性病变呈正相关。
此外, 类风湿关节炎与MHC区域外的STAT4关系同样密切, 后者参与了多种激素和细胞生长因子的信号传导, 掌控Thl细胞炎症因子的生产生。又如IL-12经STAT4途径向胞内转导信号, 诱导γ-干扰素 (IFN-γ) 的表达, 增强效应细胞的细胞毒性。诱导活化T细胞的增殖, 并促进T细胞向Th1细胞的分化。此外, 张晓琴[5]发现STAT4与CD4+T细胞家族新成员—Thl7的分化有关, 表明Th1和Th17细胞的活化失调能降低或提升类风湿关节炎的发病概率, 且类风湿关节炎疾病活性和严重程度与STAT4高表达量呈正相关, 这对于对自身免疫疾病的早诊和防治有着重大指导意义。
STAT3能被IL-6、IL-10、IFN-γ等多种细胞因子激活, 且被认为是gpl30样受体的主要下游调节者。在T细胞, STAT3增强增殖是通过IL-6介导的凋亡抑制作用实现的。临床试验发现, 应用抗IL-6受体抗体抑制STAT3的激活可改善类风湿关节炎的炎性反应。IL-10通过STAT3转导信号以发挥作用于巨噬细胞的抗炎作用[6]。此外, 还发现STAT3结构性活化可介导成纤维细胞的转化。这些不同的影响表明, STAT3能影响炎症性关节炎发展过程:STAT3有促发慢性关节炎作用。最近报道STAT3有调控类风湿关节炎滑膜细胞异常生长和存活特性的作用。他们用逆转录病毒介导基因转移形成STAT3显性负突变体 (STAT3-YF) 的方法进行类风湿关节炎滑膜细胞培养, 发现抑制STAT3功能会使表皮生长因子对滑膜细胞的作用由生长存活因子转变为死亡抑制因子。更进一步的研究表明, STAT3发挥作用至少部分通过抑制STAT1。由此可见, STAT3可作为治疗类风湿关节炎的一个潜在靶点。因此, STATs在类风湿关节炎发生中的致病性或保护性与其作用的细胞类型、炎症发生的微环境及疾病发生的阶段密切相关。
国内研究发现[7,8], 在类风湿关节炎患者的关节中可见α9型整合素的过度表达, 提示在类风湿关节炎发展中发挥一定的作用。在炎性反应和免疫应答方面, LFA-1具有关键作用。盛慧明等[7]的研究表明, 明确的炎性信号能促进LFA-1持续的高表达, 进而激活后的T淋巴细胞未能正常凋亡, 导致类风湿关节炎的产生。李金丽等[8]认为类风湿关节炎与T淋巴细胞DNA去甲基化引起的LFA-1表达过量呈现高相关度。
3.2 HLA、STAT、整合素和系统性红斑狼疮的相关性
系统性红斑狼疮为非器官特异性自身免疫病的一种, 发病机制暂未研究充分, 而国内外大多数学者认为它的产生与遗传因素紧密相关, 其中又以HLA基因与其相关性最为重要。有研究表明, 系统性红斑狼疮的产生与HLA-A9、A11、B5、B17、HLA-DRB1*15和DRB1*03等位基因呈高相关性。此外, HLA-DP基因多态性与自身免疫性疾病有关[9]。陈海凤等[9]还发现HLA-G分子、HLA-G14 bp基因多态性在系统性红斑狼疮发病中起着重要的作用。HLA-G的基因结构与序列和编码经典的HLA-Ⅰ类分子 (HLA-Ⅰa类分子) 具有高度同源性, HLA-G基因转录产物选择性剪接后, 产生7种不同的蛋白。包括4种膜结合型 (HLA-G1、-G2、-G3、-G4) 及3种可溶型 (HLA-G5、-G6、-G7) 。系统性红斑狼疮患者血清s HLA-G、IL-10水平显著高于健康人, 对系统性红斑狼疮患者HLA-G 14bp基因多态性检测, 发现+14 bp HLA-G等位基因及+14, +14 bp的频率增高, 提示在HLA-G生成不足介导的狼疮易感性中, HLA-G14 bp基因多态性起重要作用[10]。
STAT4编码的蛋白质能够被白细胞介素IL-12、IL-23及Ⅰ型干扰素激活, 产生T细胞亚群决定性细胞因子———IFN-γ, 导致自身免疫耐受平衡被打破, 引起系统性红斑狼疮的发病[11]。STAT4是系统性红斑狼疮的易感基因, STAT4的基因多态性导致有多个系统性红斑狼疮的易感基因位点, 目前研究发现有10种可能与系统性红斑狼疮发病相关。其中rs1018656、rs7582694及rs7574865三个SNP位点与系统性红斑狼疮发病的相关性最强[12]。有实验研究了rsl0181656不同基因型的病例STAT4基因m RNA的表达的差别, 结果发现CC基因型组与GG+CG基因型组的STAT4基因m RNA的表达量之间有显著差异, 这表明rsl0181656G位点突变增加了STAT4基因m RNA的表达量, 推测这些SNP可能影响基因的剪切或者调控, 从而与疾病相关[12]。
整合素VLA-4 (CD49d/CD29) 为淋巴细胞表面的黏附分子, 在多种淋巴细胞上表达, 并参与炎性反应, 对淋巴细胞再循环也有一定作用。有研究发现活动期系统性红斑狼疮患者外周淋巴细胞 (peripheral blood lymphocyte, PBLC) 上VLA-4的表达率比正常人显著下降, 可能原因:由于活动期内皮细胞的VLA-4的配体血管黏附分子-1 (VCAM-1) 的增加, 使得表达VLA-4的淋巴细胞向表达VCAM-1的内皮细胞定向迁移, 参与炎症或免疫调节反应, 从而使外周血表达VLA-4的淋巴细胞数目下降;白细胞和其他细胞表面的黏附分子可以被内吞进细胞, 也可以脱落下来进入循环。从而使得被检测出的携带该分子的淋巴细胞百分率减少[13]。
3.3 HLA、STAT、整合素与干燥综合征的相关性
整合素与干燥综合征的临床特征主要表现为口眼干涩等, 病理特征则以外分泌腺有淋巴细胞局灶性浸润为主, 从而导致外分泌腺结构破坏、功能失常, 并常与抗R0/SS-A抗体、抗L0/SS-B抗体等自身抗体的产生等现象并存, 甚至导致高丙种球蛋白血症的出现。正常情况下, 腺上皮细胞不参与HL-Ⅱ类分子的表达, 而张璐等[14]发现干燥综合征患者下颌下腺的上皮细胞发生高水平的HLA-Ⅱ类分子表达现象。腺上皮细胞并非专职抗原递呈细胞, 但在IFN-γ、TNF-α等细胞因子的刺激和诱导作用下同样表达HLA-Ⅱ类分子, 然后递呈自身抗原至淋巴细胞, 而激活后的淋巴细胞反过来使上述应答大幅增值, 造成恶性循环, 最终使得炎症延续和腺体的严重损伤[15]。
同时, 上述研究发现在干燥综合征患者中, 存在由Th1转换至Th2的倾向, 其中STAT4基因缺陷T细胞致使IL-25的分泌上调, 进而导致IL-10分泌量升高, 这表明STAT4涉及了干燥综合征发病机制有重要意义的其他基因的调节。
整合素在细胞之间的相互作用中起着重要作用, 细胞膜上的表达控制着细胞的“归巢”, 同时参与并加速慢性炎性反应的发生过程。柴克霞等[14]发现, 干燥综合征患者血清内发现s ICAM-1、s VCAM-1的浓度明显高于正常值, 且病灶部位发现浸润的单个核细胞表达ICAM-1、v CAM-1、LFA-1等多种细胞黏附分子, 更为重要的是, 腺上皮细胞也有较大量的ICAM-1表达, 提示ICAM-1等极有可能该疾病发生和发展过程。
3.4 HLA、STAT3、整合素与强直性脊柱炎的相关性
强直性脊柱炎 (ankylosing spondylitis, AS) 是一种类风湿性因子呈阴性反应、累及中轴关节和肌腱韧带骨附着点的慢性炎症性疾病, 其发病机制尚不清楚, 初步公认其与遗传因素、慢性感染、免疫功能紊乱和内分泌失调等因素有关, 其中又以遗传因素最为可疑。强直性脊柱炎具备显著的家族聚集特征, HLA-B27与其密切相关。HLA-B27在一般人群的阳性率仅为5%~10%, 而在强直性脊柱炎患者中高达80%~95%[16]。B27家族有结构相似的抗原结合槽, 因此B27结合的抗原肽具有相似性与重叠性, 故B27自身序列与其结合肽段的结构的特性, 可能暗含B27亚型与强直性脊柱炎间的关系。B27与强直性脊柱炎发病的免疫机制有以下两方面[17,18]:第一, B27与免疫细胞的识别有关:B27分子以多种形式表达于细胞表面, 如空载的B27异源二聚体、同源二聚体、异常折叠的B27分子等, 而CD4+T细胞能识别这种异常的B27;第二, B27与内质网应激 (endop lasmic reticulumstress, ERS) :内质网是细胞内蛋白质合成折叠、Ca2+储存和脂质合成的重要部位, 而内质网稳态的破坏将导致大量错误或者未折叠蛋白质在内质网中的聚集, 通过PERK通路、ATF6通路及IRE1通路, 导致一系列炎症基因异常表达。
国内外研究表明[18,19,20,21], IL23R的下游转录因子STAT3 (rs2293152, rs1053005) 是汉族人特有的与强直性脊柱炎高度相关的易感基因, 提示汉族人的强直性脊柱炎发病机制是通过IL23R的下游转录因子STAT3这一路径, 而非直接由IL23R多态性导致而成。此途径中, STAT3作为IL-23R的下游转录因子, 显然扮演着关键的TH17细胞分化调控角色。
白细胞与内皮细胞之间的牢固黏附是依靠一种高亲和力且基本稳定的连接———通过几类被称为整合素的白细胞黏附分子和来源自免疫球蛋白家族的黏附分子来加以促进的。免疫球蛋白家族包括尤其是细胞间黏附分子 (ICAM-1、ICAM-2) 、血管间黏附分子 (VCAM-1) 、神经细胞黏附分子 (NCAM) 和各种连接黏附分子 (JAM-A、JAM-B、JAM-C) , 它们会以可溶分子的形式存在于循环中以及细胞外液中, 可溶性黏附分子的增加和某些黏附分子的细胞表面表达与强直性脊柱炎有关。
TNF和其他促炎症细胞因子还会活化细胞, 以便特别是增加细胞黏附分子 (细胞表面上的受体和配体) 的细胞表面表达以及刺激血小板活化因子的释放, 从而诱导对血管内皮细胞的促凝血活性和增加白细胞的黏附。细胞黏附分子的增加会导致增加白细胞-内皮细胞相互作用、滚动, 中性粒细胞、单核细胞、活化的T细胞毒性细胞以及记忆T细胞和B细胞的黏附和深入至受感染的组织。在该组织中, T和B细胞活化导致抗体和补体释放。TNF和其他促炎性细胞因子所诱导的细胞黏附分子包括特别是VCAM-1、ICAM-1和E-选择素。研究发现与常人相比强直性脊柱炎患者的血清与骼关节活检组织中均具有极高的TNF-αm RNA及蛋白表达水平。
4 小结
自身免疫性疾病的发生是一个非常复杂的过程。HLA、STAT、整合素与多种自身免疫性疾病发生的相关度较高, 这对于医学领域上对自身免疫性疾病的研究有着重大意义。伴随分子遗传学和分子生物学的日益高速发展, 以及国内外相关学者通过扩大相关性研究样本对其进行深入开发, HLA、STAT、整合素的功能及其对自身免疫性疾病发病机制的影响必定更为清晰, 最终为自身免疫疾病的及早诊断和基因防治等提供更为系统性的理论基础和更为开阔的解决方案。
摘要：人类白细胞抗原 (HLA) 、整合素、信号转导和转录激活因子 (STAT) 与自身免疫病发生、发展有着密切的联系。自身免疫病是一类原因复杂、临床表现多样、严重危害人类健康的疾病, 多为慢性病, 任何年龄、性别均可发病, 以女性为多见;常累及多器官、多系统, 反复发作、慢性迁延。患者血清中常可检出高浓度的自身抗体和/或与自身组织成分起反应的致敏淋巴细胞, 并发生免疫效应病理性应答, 病理特征常为淋巴细胞和浆细胞浸润等两方面的慢性炎症。基于该类疾病发病机制中不同环节的特异性生物治疗已成为研究热点, 并有可能发展为临床治疗的趋势, 如针对T细胞和B细胞的生物学治疗, 抑制T细胞活化和T-B细胞间相互作用的生物制剂, 针对细胞因子的生物制剂, 自身免疫病治疗性肽疫苗的研究等。近年来, 针对HLA、STAT和整合素的分子功能, 国内外的研究结果 发现它们三者与多种自身免疫性疾病有高度相关性。对HLA、STAT和整合素与各种自身免疫病的相关性进行归纳分析, 为该类疾病的及早诊断和基因防治提供系统性的理论基础和更为开阔的解决方案, 具有重大意义。
关键词：自身免疫病,人类白细胞抗原,整合素,信号转导和转录激活因子,类风湿性关节炎,系统性红斑狼疮,干燥综合征,强直性脊柱炎
信号转导与转录因子5 篇2
信号转导及转录激活因子 (signal transducer and activator of transcription, STAT) 是细胞因子/生长因子信号传导中重要的胞质转录因子[2]。其家族成员STAT1和STAT3可在多种恶性肿瘤中激活, 包括头颈癌[3,4,5]。STAT1能够抑制肿瘤生长, 调节肿瘤细胞凋亡。而激活的STAT3可通过凋亡调节蛋白Bax和BclXL来抑制肿瘤细胞凋亡[6]。我们推测, SFN可能通过影响PCI-13细胞中STAT1、STAT3的表达, 从而诱导PCI-13细胞凋亡。
1 材料与方法
1.1 材料
头颈癌细胞系PCI-13由美国匹兹堡大学医学中心耳鼻喉科Robert L Ferris教授惠赠。D'L-莱菔硫烷 (纯度≥99%) 购自LKT实验室, 用二甲亚砜 (DMSO) 配置成100 mmol/L的储存液, 储存于-20℃冰箱中, 使用前用培养液稀释。DMEM, AIM-V培养液购自Gibco公司。p-STAT1 (Tyr701) , p-STAT3 (Tyr705) 抗体及其同型Ig G (Isotype) 购自DB公司。
1.2 方法
将3×105个细胞接种于60 mm培养皿中。经血清饥饿48 h后, 加入SFN终浓度为10、20、40μmol/L的AIM-V培养液, 以培养液中加入DMSO作为阴性对照。继续培养3、6、12、24 h。以50 U/ml的干扰素-γ (interferon-γ, IFN-γ) 处理15 min作为p-STAT1的阳性对照, 以50 ng/ml的白介素-6 (interleukin-6, IL-6) 处理15 min作为p-STAT3的阳性对照。为检测IL-6诱导的STAT3激活情况, 首先加入SFN终浓度为0 (DMSO 0.04%) 、10、20、40μmol/L的AIM-V培养液培养24 h, 终止SFN处理, 加入50 ng/ml的IL-6处理15 min。胰酶消化获取细胞后, 经破壁, 透明, 固定, 分别用p-STAT1、p-STAT3及Isotype染色, 上机进行流式细胞检测。实验重复3次, 所得数据进行统计学处理。
1.3 统计分析
使用SPSS 10.0统计学软件, 采用单因素方差分析, 对p-STAT1, p-STAT3表达进行统计分析。
2 结果
经过10、20、40μmol/L的SFN处理3、6、12、24h后, 各实验组中p-STAT1阳性细胞百分率与阴性对照组相比, 无明显变化, P>0.05 (图1, 表1) 。
注:经单因素方差分析 (Dunnett多重比较) , 各实验组与阴性对照组相比, 统计学差异, P>0.05
经过10、20、40μmol/L的SFN处理3、6、12、24h后, 各实验组中p-STAT3阳性细胞百分率与对照组相比明显降低, 并且随着浓度增高, 时间增长, 阳性细胞数显著下降。各组间有统计学差异, P<0.01 (图2, 表2) 。PCI-13细胞经20、40μmol/L的SFN处理24h后, 可显著抑制IL-6诱导的STAT3的磷酸化, 与对照组相比, p-STAT3阳性细胞百分率明显降低, 并且随着浓度增高, 阳性细胞显著下降。经单因素方差分析 (Dunnett多重比较) , 各实验组与对照组相比, 各组间有统计学差异, P<0.01 (图3) 。
注:经单因素方差分析 (Dunnett多重比较) , 各实验组与阴性或阳性对照组相比, 有统计学差异, (1) P<0.01
A:p-STAT3阳性细胞数 (流式细胞术) ;B:统计学分析, *P<0.01
3 讨论
SFN天然存在于十字花科蔬菜中, 因其出色的抗肿瘤效果受到了极大关注。SFN对前列腺癌、乳腺癌、白血病、结肠癌、口腔癌等多种人类癌症都有化学预防和治疗作用[1,7]。SFN抗肿瘤机制包括[7]:在癌变起始阶段, SFN可以通过抑制I阶段酶和诱导II阶段酶来减弱致癌物的作用, 并可抑制基因毒性, 保护DNA免受化学损害。在癌变促进阶段, SFN可以引起肿瘤的细胞周期停滞, 抑制增殖, 诱导凋亡以及引起自嗜作用。在癌变的发展阶段, SFN可抑制血管生成, 并抑制肿瘤的转移和侵袭。因此, SFN对肿瘤的抑制贯穿于癌变的整个过程, 作用明显, 安全可靠, 是一种很有希望的抗癌药物。
我们最近的研究也发现, SFN能够抑制头颈癌细胞系PCI-13的增殖, 诱导其凋亡, 而且发现SFN诱导的PCI-13细胞凋亡由Caspase途径介导。经SFN处理后, 抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl XL表达下降, 促凋亡的Bax表达增高, 说明Bcl-2家族蛋白在SFN诱导的凋亡中起重要作用。Bcl-2家族的转录受到其上游的STAT蛋白的调控[6]。已经发现, 在前列腺癌中, SFN有抑制STAT3激活的作用[8]。我们推测, SFN可能影响PCI-13细胞中STAT蛋白的表达, 通过调控Bcl-2家族蛋白诱导细胞凋亡。
STAT蛋白家族包括7个成员, 分别由不同的基因编码, 它们是:STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT6, 和非常接近的STAT5A和STAT5B[9]。STAT蛋白最显著的特征是具有双重作用, 它们既可通过细胞质转导信号, 又可在细胞核中行使转录因子的功能。STAT能介导来自IFN和IL-6受体的信号, 然后与其同源的细胞因子结合。细胞因子受体通常不具备固有的酪氨酸激酶活性, 相反, 它们结合会激活受体相关的酪氨酸激酶, 最主要的是双面神激酶 (janus kinase, JAK) 家族的激酶。接着, STAT蛋白特异性的酪氨酸残端磷酸化, 与其他的STAT蛋白通过相互的磷酸酪氨酸-SRC同源2 (SH2) 区域反应, 形成稳固的同二聚体或异二聚体[10]。STAT1和STAT3具有相似蛋白序列和结构, 但功能相反。为了通过GP130 (也称IL6ST) -JAK, 应答IL-6, STAT3形成同二聚体移位到细胞核中。在细胞核中, STAT3-STAT3同二聚体调节编码IL-6自身和其他在经典的生理急性过程应答和促癌炎症情况中至关重要的介质基因的表达, 即促进癌症的发展。相反, STAT1-STAT1同二聚体或STAT1-STAT2异二聚体, 在I型干扰素刺激下, 聚集在细胞核中, 调节促进生长停滞和凋亡的基因的表达, 即抑制癌细胞的增殖。
STAT1在癌症中的作用尚不明确, 除了潜在的肿瘤抑制作用, 还有调节细胞凋亡的作用。STAT1能够与肿瘤坏死因子 (tumor necrosis factor, TNF) 受体复合物结合, 抑制核因子κB, 并能够通过蛋白-蛋白反应与P53结合[11]。STAT1的过表达可提高头颈癌的化疗敏感[12], 而STAT1缺乏细胞可以抵抗TNF-α诱导的凋亡。另外, STAT1抑制肿瘤的作用可能只限于肿瘤发生阶段, 而不是进展阶段[11]。我们的数据显示, SFN处理并不能增加STAT1的磷酸化, 提示SFN抗肿瘤作用可能不是通过STAT1调节的。
STAT3是其家族中最活跃的成员之一, 是表皮生长因子受体、IL-6/JAK、Scr等多个致癌性酪氨酸激酶信号通道的汇聚的焦点。STAT3无论在恶变的初期还是癌症过程中, 均能选择性的诱导和保护促进癌症形成的炎症微环境。其在肿瘤中的作用包括:抑制肿瘤细胞凋亡, 促进肿瘤细胞增殖, 促进血管形成和转移[13]。STAT3在Tyr705端的磷酸化导致其激活, 从而行使其功能。在正常细胞中, STAT3的激活是一个瞬时过程, 持续数分钟到数小时。而在癌细胞中, 生长因子失调, STAT3则出现持续激活[6]。在头颈癌中, STAT3的激活是鳞状细胞癌发生的早期事件, 并在头颈癌的发生发展中起重要作用[4,5,6]。理论上如果能够拮抗STAT3信号通路就可以引发其编码的相关基因“级联式”组合阻断, 从而抑制肿瘤的增殖[2]。本文结果显示, SFN可以下调PCI-13中STAT3的磷酸化水平, 减少STAT3的构成性和IL-6诱导的激活, 从而减弱STAT3的上述促肿瘤生长作用。激活的STAT3可通过调节其下游的Bax和Bcl XL蛋白来抑制肿瘤细胞凋亡[5]。我们前期的研究结果中SFN引起PCI-13细胞Bcl-2、Bcl XL下调和Bax的上调是否与SFN抑制STAT3有关, 值得进一步研究。本研究显示, SFN还可以抑制IL-6诱导的STAT3激活。IL-6介导的STAT3激活是JAK通过IL-6受体胞质中GP130区域调节的[8], SFN是否能够影响JAK的表达或激活, 值得关注。
摘要：目的:研究莱菔硫烷 (SFN) 对头颈癌细胞系PCI-13中信号转导和转录激活因子1和3 (STAT1, STAT3) 的影响, 探讨STAT/JAK途径在SFN抗肿瘤中的作用。方法:体外培养PCI-13细胞, 经血清饥饿后, 分别用0、10、20、40μmol/L的SFN处理3、6、12、24 h。为检测IL-6诱导的STAT3激活情况, 用20、40μmol/L的SFN处理24 h, 再用50 ng/ml的IL-6处理15min。设阴性和阳性对照组。分别获取细胞后, 采用流式细胞术检测磷酸化-STAT (p-STAT) 1和3的表达。结果:SFN对pSTAT1表达无影响, 但可以显著抑制p-STAT3的表达, 还可以抑制IL-6诱导的p-STAT3的升高, 这种抑制存在浓度和时间依赖性。结论:SFN能够抑制PCI-13细胞中的STAT3的磷酸化水平, 减少其构成性激活和IL-6诱导的激活, 提示SFN诱导PCI-13细胞凋亡可能由STAT/JAK途径介导。
信号转导与转录因子5 篇3
1 实验材料
1.1 实验动物
雄性SD大鼠, 清洁级, 体重 (200±10) g, 购自上海实验动物中心, 由浙江中医药大学动物实验中心饲养 (环境温度25℃, 湿度70%) 。
1.2 实验用药
虎杖流浸膏 (浓度1g/ml) :由浙江省中医院制剂室提供。地塞米松:5mg/支, 浙江仙居制药股份有限公司生产, 批号:070509。
1.3 主要试剂
胎牛血清:美国invitrogen公司。1640培养基:美国invitrogen公司。兔来源的多克隆STAT1抗体:ABCAMAB31369。羊抗兔IgG抗体-HRP多聚体:深圳晶美。DAB显色液:DAKO公司。
2 实验方法
2.1 动物造模
参考文献报道方法[6]。
2.2 分组及给药
SD雄性大鼠145只, 随机分成7组:正常对照组25只、模型组25只、地塞米松组25、虎杖预防组25只、3天治疗组20只、7天治疗组15只、14天治疗组10只。正常对照组和模型组于造模后当天开始每天灌胃生理盐水 (4ml/kg) , 阳性对照组于造模后当天开始每天灌胃地塞米松4ml/kg (即1mg/kg) , 预防组于造模前2天开始每天灌胃中药4ml/kg (相当于生药量1g/ml) , 3天治疗组于造模3天后开始给予中药虎杖灌胃, 7天治疗组于造模7天后开始给予中药虎杖灌胃, 14天治疗组于造模14天后开始给予中药虎杖灌胃。每周复查体重, 正常对照组、模型组、阳性对照组及预防组分别于3、7、14、28、42天各处死5只, 3天治疗组于7、14、28、42天各处死5只, 7天治疗组于14、28、42天各处死5只, 14天治疗组于28、42天各处死5只。
2.3 标本收集与检测
2.3.1 肺泡灌洗液的采集与处理
3%戊巴比妥钠腹腔麻醉, 放血毕后在无菌条件下左肺行支气管肺泡灌洗。具体方法:在超净工作台内无菌条件下, 仰卧固定, 颈部正中切开皮肤, 钝性分离并暴露气管, 右主支气管结扎后, 在环甲软骨处剪一“V”形小口, 将塑料套管 (管径约1.5mm) 插入气管, 沿气管向肺部推进约1.5cm到左主支气管, 用线结扎固定。大鼠处于头低脚高位 (放于冰块上) , 用无菌注射器吸取4℃生理盐水 (NS) 3ml, 将注射器与塑料套管相连, 在30秒～1分内将NS缓慢注入肺内, 使NS液在肺内停留约30秒, 轻揉胸廓缓慢回抽灌洗液, 再将所得液体缓慢注回肺内, 如此反复3次, 盛入15ml的离心管中, 此为第一次灌洗, 然后重复共5次上述操作, 将灌洗液集于同一离心管中总量约15ml (回收率均>85%) , 显微镜下计数细胞。
2.3.2 巨噬细胞的采集与处理
将细胞稀释成1×106个/ml的细胞悬液和含10%胎牛血清的RPMI1640培养液, 置于预先放置了无菌小玻片9mm×9mm无菌盖玻片的12孔培养板中, 每孔1ml, 经37℃、5%CO2、100%饱和水蒸气的细胞培养箱内孵育纯化2～6小时, 使细胞贴壁, 弃培养液, 用无菌PBS冲洗未贴壁的细胞后, 收集贴壁纯化的AM。将AM贴壁的小玻片取出, 用PBS冲洗2遍, 用质量分数为4%的多聚甲醛固定15分钟, 滤纸吸干孔内液体, 4℃冰箱保存备用待测。
2.3.3 肺组织的采集与处理
右肺分离, 用10%中性缓冲福尔马林 (pH7.4) 固定, 常规脱水, 石蜡包埋, 切片, 待用。
2.4 指标检测
2.4.1 肺组织STAT1表达检测
采用免疫组织化学法。
2.4.2 AM的STAT1表达测定
采用免疫细胞化学法。
2.4.3 判定方法
2.4.3.1 结果判定
细胞核呈蓝色, 黄色或黄棕色为阳性。
2.4.3.2 肺组织STAT1表达计分标准
a) 阳性染色细胞数占视野细胞总数的计分:没有阳性染色细胞记为 (-) , 阳性细胞百分数<25%为 (+) , 25%～50%为 (++) , >50%为 (+++) 。b) 着色细胞染色强度计分:细胞呈阴性染色为 (-) , 染色弱, 阳性细胞呈淡黄色为 (+) ;染色中等, 阳性细胞呈棕黄色为 (++) , 染色强, 阳性细胞呈棕褐色为 (+++) 。阳性细胞数与染色强度计分相加作为判断的结果。
2.4.3.3 细胞爬片STAT1染色的测量
每张爬片在200倍视野下计数5个以上视野, 共计数500个以上组织细胞 (巨噬细胞) 中的阳性细胞数, 换算成阳性细胞百分率, 阳性细胞百分率=视野内的的阳性细胞数/视野内总的细胞数×100%, 然后进行整理及统计分析。
2.5 统计学分析
实验结果采用SPSS13.0统计软件包进行方差分析, 以P<0.05或P<0.01为差异有统计学意义。
3 结果
3.1 各组大鼠肺组织STAT1蛋白的表达
见表1。
正常对照组大鼠肺组织STAT1在支气管黏膜上皮未见表达, 部分炎性细胞呈弱表达。模型组在BLM气管内灌注后大鼠炎性细胞、支气管黏膜上皮细胞、肺血管内皮细胞STAT1蛋白表达增强, 各组表达测定见表1。
与同期正常组比较*P<0.05, **P<0.01;与同期模型组比较△P<0.05, △△P<0.01
3.2 各组大鼠AM中STAT1蛋白的表达
见表2。
与同期正常组比较*P<0.05, **P<0.01;与同期模型组比较△P<0.05, △△P<0.01
4 讨论
JAK/STAT途径, 是指非受体性蛋白质酪氨酸激酶超家族中Janus激酶家族 (JAK) 及信号转导子和转录活化子家族 (STAT) , 是细胞对INF等细胞因子反应的一些基本蛋白质分子, 构成INF及白介素等细胞因子信号传导的经典途径。其中, Janus激酶家族是连接在膜受体上的蛋白质酪氨酸激酶, STAT是细胞胞浆内潜在的信号转导子和转录活化子, 被蛋白质酪氨酸激酶活化, STAT对细胞因子的应答、细胞活化、细胞分裂、细胞增殖中起重要的作用[7]。STAT1是STAT家族中最早被发现并被克隆的成员, 分子量为91KD, 其编码基因在1号染色体上, 活化的STAT1广泛参与多种细胞因子的应答, 与炎症性疾病的发生、发展密切相关。
肺间质纤维化是以肺泡及间质性炎症起病、继以肺泡结构进行性损害、细胞外基质蛋白胶原沉积为特征的慢性炎症性疾病[8]。肺泡巨噬细胞来源于血液单核细胞, 是肺内最多的炎性细胞, 作为肺脏免疫系统的前哨, 具有多种功能, 如吞噬功能、游走功能、产生活性氧和活性氮代谢产物、分泌活性物质等, 在肺纤维化形成过程中起重要作用。由于细胞因子通常依赖转录因子STAT发挥其炎症和免疫效应, 因此STAT1信号传导途径很可能与特发性肺纤维化 (IPF) 的发生、发展密切相关[9]。
本实验研究显示, STAT1的表达主要在肺泡内的组织细胞或吞噬细胞及成纤维细胞, 在部分标本的细支气管的黏膜上皮可见表达, 但很低。在正常的肺组织内相对表达的程度低, 而在模型组表达增加。AM和肺组织中STAT的表达表现出类似的规律。模型组气管内注入BLM后AM和肺组织STAT1蛋白表达第3天就开始升高, 第7天达高峰, 以后逐渐下降, 第42天仍高于对照组, 表明STAT1的异常表达和活化参与了肺纤维化的形成, 与文献报道一致[10]。地塞米松组在第3、7、14天表达较模型组明显降低, 提示地塞米松能抑制肺纤维化早中期的STAT1的异常表达, 发挥一定的抗炎作用。虎杖预防组在第3、7、14天表达较模型组明显降低, 3天治疗组在第7、14天表达较模型组明显降低, 7天治疗组在第14天表达较模型组明显降低, 而对于14天治疗组, 在第28、42天表达较模型组均未见明显差异。表明虎杖可抑制早、中期的细胞因子或其它剌激所诱导STAT1的异常活化, 阻断正反馈效应所致的严重肺泡炎, 从而抑制或延缓肺纤维化的形成。虎杖各治疗组与地塞米松组比较, STAT1的表达未见显著性差异, 说明虎杖对肺纤维化的干预效果与地塞米松相近。
综上所述, 虎杖在预防和治疗肺泡炎发生、发展及肺纤维化形成过程中对致/抗炎细胞因子有较好的调节作用, 能够防治早期肺泡炎的发生, 并能延缓肺泡炎的发展及肺纤维化的形成。由此我们推断以虎杖为代表的同时具有清热解毒和活血化瘀功效的这类中药可能在肺纤维化形成早期具有预防和治疗作用, 其作用机理可能是通过促进肺组织匀浆中IFN-α的分泌及抑制TGF-β1的分泌来调节肺纤维化中致/抗炎细胞因子失衡, 而在肺纤维化后期的干预效果不理想, 其作用效果与地塞米松相近。综上所述, 早期应用虎杖能够调整博莱霉素诱导的肺纤维化大鼠早、中期时AM和肺组织中STAT1的表达和活化, 阻断正反馈效应所致的细胞因子风暴所引起严重的肺泡炎, 从而达到抑制或延缓肺纤维化的形成。其作用效果与地塞米松相近, 但副作用较之甚少。
参考文献
[1]卫张蕊, 周国锋.炎症细胞和细胞因子在肺纤维化中作用的研究进展.细胞与分子免疫学杂志, 2005, 21 (1) :85.
[2]Demell JE.STATs and gene regulation.Science, 1997, 280 (5370) :277.
[3]O, shea JJ.Jaks, STATs, cytokine signal transduction and immunoregula-tion:are we there yet.Immunity, 1997, 7:1.
[4]范贤明, 范运斌, 邓述恺, 等.特发性肺纤维化肺组织STAT1的表达及其临床意义.泸州医学院学报, 2002, 25 (5) :375.
[5]宋康, 骆仙芳, 杨超, 等.虎杖对肺纤维化大鼠MMP-2和TIMP-2表达影响的实验研究, 中国中医药科技, 2008, 15 (3) :184.
[6]宋康, 骆仙芳, 杨超, 等.虎杖对肺纤维化大鼠肺组织中TGF-β1表达的影响.中华中医药杂志, 2007, 22 (12) :888.
[7]Hebenstreit D, Horejs-Hoeck J, Duschl A.JAK/STAT-dependent gene regulation by cytokines.Drug News Perspect, 2005, 18 (4) :243.
[8]Marrero MB, Banes-Berceli AK, StemDM, et al.Role of the JAK/STAT signaling pathway in diabetic nephropathy.AmJ Physiol Renal Physiol, 2006, 290 (4) :762.
[9]翟乃亮, 王荣丽, 范贤明.JAKs/STAT1信号途径及其在肺部病变中的研究进展.国际呼吸杂志, 2006, 26 (3) :232.