信号转导途径（精选9篇）
信号转导途径 篇1
1 雌激素受体 (ER) 的基本结构
1.1 A/B区 (1-149氨基酸) 位于N端, 为高度可变区
在A/B区氨基末端存在一个非配体依赖性转录激活功能区, 称AF1区, 该区有高度变异性, 其转录活性依赖于特定的启动子, 是激素非依赖性的, 还含有一个能与转录因子交互作用的反式激活区。其长度和氨基酸序列可变性较大, 通过对专一性和非专一性DNA序列的识别来进行, 可减少非专一性DNA的结合, 选择正确的雌激素应答元件 (ERE) , 达到激活调控靶基因的目的, 可参与调节配体与雌激素受体结合, 调节雌激素应答基因的转录。
1.2 C区 (180-263氨基酸) 为DNA结合区 (DBD)
DNA结合区位于受体的中部, 是核受体家族中富含碱性氨基酸和半胱氨酸的最保守的一个区域, 氨基酸序列为180-263, 该区9个位置的Cys相对固定, 形成双“锌指”结构, 每个“锌指”结构由4个Cys与中心部的锌离子络合组成α螺旋, 直接参与DNA的结合, 达到转录靶基因的目的。外显子2和3编码该区域。
1.3 D区 (263-302) 为多变的铰链区
D区的保守性只有30%, 具有在E区的帮助下结合DNA的作用, 有时还会影响受体蛋白的DNA结合位点的结构。ER构型的改变受D区结构变化的影响, 以保证受体以最佳的构型与配体结合。D区可与热休克蛋白结合, 帮助ER进行适当折叠, 以保护疏水的配基结合区并使之处于非活性状态。D区还含有核定位信号, 并具有稳定DBD与DNA结合的功能。D区包括核的定位信号, 即所谓的“桥接区”, 它并不依赖于配体结合, 具有核转位功能。
1.4 E/F区 (302-553氨基酸) 为ER高度保守的区域
E/F区称为激素结合区位于受体的C端, 是第二保守区, 该区包括外显子4到8和装配配体结合的一个疏水区。E区是ER五种基因序列最大最长的功能区, 所以E区被赋予了最多的任务。E区包含有另外一个激素依赖的转录激活区, 该区域由螺旋3、4、5和12的氨基酸组成, AF2功能区的螺旋12在识别配体的雌激素激动或拮抗作用中发挥着重要的作用。当ER结合不同的配体时, AF2会呈现出不同的构像变化, 并决定转录靶基因所需要结合的共激活因子和共抑制因子, 形成ER-配体复合物, 而后与靶基因上的雌激素反应元件结合, 通过辅助因子与蛋白相互作用启动转录, 从而影响细胞增殖和分化。AF-2的核心成分是H12, 是转录激活的必须成分, 但其不直接与配体结合。当ER与配体结合, 可使H12发生明显的构象变化, 从而使AF-2活化。
2 ER受体的分型与分布
2.1 两种亚型 (ERα和ERβ) 定位
人类ER具有不同的基因编码, 含有不同的蛋白质分子结构和c DNA, 发挥不同的生物学功能。ERα基因定位于染色体6q25-1, 基因由140 kb以上的碱基对组成, 编码由595个氨基酸残基组成的蛋白质, 有8个外显子, 分子量约为67kb, -103位置和-27位置处有类似CAAT和TATA的转录元件顺序;ERβ基因远小于ERα基因, 主要因内含子长度不同所致, ERβ基因定位于14q22-24, 由40kb碱基构成, 编码由530个氨基酸残基组成的蛋白质, 分子量为59.2kb, 在结构上, 其氨基酸序列在DBD区及LBD区与ERα的同源性分别达95%和55%, 而在N端的AF1功能区, ERα和ERβ只有30%的同源性。ERβ和ERα与17B-雌二醇结合的解离常数分别为0.4mol/L和0.1mol/L, 都能与ERE结合。
2.2 雌激素的分子功能
卵巢是合成雌激素的主要场所, 分泌入血液后与性激素可逆性结合球蛋白及白蛋白。在血液中游离的雌激素扩散到靶组织而发挥其特殊的生理生化作用。雌激素对女性的卵巢、输卵管、子宫及阴道等内外生殖器官的分化、成熟和发育, 对女性乳腺的生长发育起着关键作用。男性精子的产生、睾丸等其他附属性器官的功能同样依赖雌激素。
雌激素对非生殖系统有调节作用。雌激素对心血管系统和下丘脑-垂体轴等中枢神经系统具有保护作用;可调节“骨”这个靶器官, 促进青春期骨骼的生长和骨骺的闭合, ERα和ERβ皆存在于成骨细胞、破骨细胞、间叶干细胞以及骨细胞中, 直接对这些骨发挥作用;对维持骨矿物质含量也具有重要意义;老年痴呆症、帕金森氏病、认知、记忆以及疼痛敏感性的病因也可能与之有关。
3 雌激素作用的信号转导途径
3.1 基因组作用途径
配体依赖途径。当雌激素与核受体结合后, 形成雌激素-受体复合物, 而使受体的构象发生改变, 形成同源二聚体, 暴露出DNA结合区, 这种复合物以二聚体的形式穿过核孔进入核内。在核内, 雌激素-受体复合物作为反式作用因子与靶基因上游的DNA特异基因的雌激素反应元件ERE结合, 同时通过募集而来的辅助因子, 直接或间接的与辅激活物和转录元件作用, 启动基因的转录。
配体非依赖途径。EGF (表皮生长因子) 、IGF-1 (胰岛素样生长因子-1) 、8-溴-c AMP等多肽类激素也可以激活雌激素受体, 使靶基因得到表达。文献报道, 该过程的关键因素可能是由细胞中的激酶磷酸化雌激素受体而导致的。ERα和ERβ均可被MAPK磷酸化, 只是二者磷酸化的部位不同。ERαAF-1区的第118位丝氨酸在接受EGF后可被MAPK (有丝分裂原激活的蛋白激酶) 磷酸化, 从而导致p68 RNA螺旋酶即ERα特异性辅激活物与受体结合, 使靶基因活化。同理, MAPK也可以磷酸化ERβN末端的活化区, 使受体与p160辅激活物SRC-1结合, 且这种结合是以配体非依赖的形式结合的最后再与ERE相互作用, 削弱ERα的转录活性。
3.2 非基因途径
此为雌激素的快速效应, 由雌激素与膜受体直作用影响蛋白质的磷酸化或去磷酸化所致。MAPK信号转导通路为:
丝裂原激活的蛋白激酶家族是细胞内信号转导的重要系统, 普遍存在于多种生物, 包括酵母和哺乳动物细胞, 参与了细胞分化、增殖、凋亡以及细胞间的功能同步等生理过程, 属于一组以级联方式依次活化的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶组成, 由多种同工酶组成, 以此将细胞外信号逐级放大并传导到细胞内乃至细胞核, 把膜受体结合的胞外刺激物与细胞质和细胞核中的效应分子连接起来。它可被多种刺激所活化。
MAPK家族的信号转导通路采用高度保守的三级激酶级联传递信号。3种激酶按激活顺序依次为丝裂原激活的蛋白激酶激酶激酶, 丝裂原激活的蛋白激酶激酶及丝裂原激活的蛋白激酶, 构成一个连续的激活途径, 其中的ERK途径最为重要, 通过生长因子、细胞因子激活相应的受体酪氨酸激酶;多肽物质通过G蛋白偶联受体激活。
结束语
随着对ER蛋白分子机制认识的不断提高, 有待于深入研究ER与其他转录因子的相互作用, 以及对靶基因转录激活的机制及激素配体的作用, 同时仔细探讨雌激素的MAPK通路与其具体的生物学效应之间的关系, 将有重大的研究价值和应用前景。
信号转导途径 篇2
Akt(v-Akt Murine Thymoma Viral Oncogene)/ PKB(Protein Kinase-B)is a Serine/threonine Kinase that is involved in mediating various biological responses, such as inhibition of Apoptosis and stimulation of cell proliferation.Three mammalian isoforms are currently known: Akt1/PKB-Alpha, Akt2/PKB-Beta and Akt3/PKB-Gamma.All three isoforms of Akt share a common structure of three domains.The N-terminus of the protein is a PH(Pleckstrin Homology)domain, which interacts with membrane lipid products such as PIP2(Phosphatidylinositol-3,4-Bisphosphate)and PIP3(Phosphatidylinositol-3,4,5-Triphosphate).The PH domain is approximately 100 amino acids and plays a role in recognition by upstream kinases and membrane translocation of Akt.The center region of the protein is the Kinase domain, which has high similarity to other kinases.This domain contains a conserved threonine residue, which needs to be phosphorylated in order to activate Akt.The approximately 40 amino acids at the C-terminus of the protein form a regulatory domain that contains a proline rich region and a hydrophobic motif with a conserved sequence of FXX(F/Y)(S/T)(Y/F).In mammals, this hydrophobic motif is FPQFSY.The serine or threonine residue in this motif must also be phosphorylated to activate Kinase activity of Akt.This is also a conserved residue(Ref.1).Activation of Akt can begin with several events, mainly the binding of a Ligand to a Receptor in the cell membrane.Most common Ligands activating Akt include Growth factors, Cytokines, Mitogens and Hormones.Insulin and a variety of Growth factors bind to RTK(Receptor Tyrosine Kinase)and cause autophosphorylation of tyrosine residues on the intracellular domain of the receptor.PI3K(Phosphoinositol 3-Kinase)is recruited to the phosphotyrosine residues(consensus sequence pYXXM)via SH2 domains in the regulatory domain(p85), and is therefore targeted to the inner cell membrane.Binding of the p85 subunit of PI3K to the phosphorylated RTK leads to conformational changes in the catalytic domain of PI3K(p110)and consequent kinase activation.PI3K can be activated by Ras.Insulin can also activate PI3K via IRS1(Insulin Receptor Substrate-1).GPCR(G-Protein-Coupled Receptor)also activates PI3K through GN-Beta(Guanine Nucleotide-Binding Protein-Beta)and GN-Gamma(Guanine Nucleotide-Binding Protein-Gamma)subunits of G-proteins.Cytokines can also activate PI3K via JAK1(Janus Kinase-1).In B-Cells, PI3K is activated by BCR(B-Cell Receptor)via SYK(Spleen Tyrosine Kinase)and BCAP(B-Cell Receptor Associated Protein).PI3K then phosphorylates membrane bound PIP2 to generate PIP3.The binding of PIP3 to the PH domain anchors Akt to the plasma membrane and allows its phosphorylation and activation by PDK1(Phosphoinositide-Dependent Kinase-1).DNA-PK, CDC37(Cell Division Cycle-37), HSP90(Heat Shock Protein-90KD)and PKCƒ{Beta(Protein Kinase-C-Beta)are also reported to phosphorylate Akt.Integrins also activates Akt via FAK(Focal Adhesion Kinase), Paxillin and ILK(Integrin-Linked Kinase).Akt can also be activated in response to a variety of cellular stress, such as heat shock, administration of ultra violet light, ischemia(a decrease in blood supply), hypoxia(oxygen deficiency), hypoglycemia(abnormally low level of glucose in the blood)and oxidative stress.The activity of Akt is negatively regulated by PTEN(Phosphatase and Tensin Homolog), SHIP(SH2-Containing Inositol Phosphatase)and CTMP(Carboxyl-Terminal Modulator Protein)(Ref.2, 3 & 4).<
proliferation effects.These physiological roles of Akt include involvement in metabolism, protein synthesis, apoptosis pathways, transcription factor regulation and the cell cycle.Akt exerts its effects in the cell by phosphorylating a variety of downstream substrates.The downstream targets of Akt include BAD(BCL2 Antagonist of Cell Death), Caspase9, FKHR(Forkhead Transcriptional Factor), GLUTs(Glucose Transporters), eNOS(Nitric Oxide Synthase), PFK2(6-Phosphofructo-2-Kinase), PFK1(6-Phosphofructo-Kinase), mTOR(Mammalian Target of Rapamycin), IKK(I-KappaB Kinase), NF-KappaB(Nuclear Factor-KappaB), GSK3(Glycogen Synthase Kinase-3), WNK1(WNK Lysine deficient Protein Kinase-1), PRAS40(Proline-Rich Akt Substrate 40 kDa), p47Phox, YAP(Yes-Associated Protein-1), Htt(Huntingtin), Ataxin, AR(Androgen Receptor), ASK1(Apoptosis Signal-Regulating Kinase-1), MDM2(Mouse Double Minute-2), CREB(cAMP Response Element-Binding Protein), p21CIP1(Cyclin Dependent Kinase Inhibitor-p21), p27KIP1(Cyclin Dependent Kinase Inhibitor-p27), Chk1(Cell Cycle Checkpoint Kinase-1), XIAP(X-Linked Inhibitor of Apoptosis Protein), Raf1(v-Raf1 Murine Leukemia Viral Oncogene Homolog-1), PDE3B(Phosphodiesterase 3B cGMP-Inhibited), TSC(Tuberous Sclerosis Gene)and GABA(A)R(Gamma-Aminobutyric Acid Receptor-A)(Ref.4).Akt inhibits apoptosis by phosphorylating the BAD component of the BAD/BclXL(Bcl2 Related Protein Long Isoform)complex.Phosphorylated BAD binds to 14-3-3 causing dissociation of the BAD/BclXL complex and allowing cell survival.Akt activates IKK, which ultimately leads to NF-KappaB activation and cell survival.Other direct targets of Akt are members of the FKHRL1(Forkhead-Related Family of Mammalian Transcription Factor-1).In the presence of survival factors, Akt1 phosphorylates FKHRL1, leading to the association of FKHRL1 with 14-3-3 proteins and its retention in the cytoplasm.Survival factor withdrawal leads to FKHRL1 dephosphorylation, nuclear translocation, and target gene activation.Within the nucleus, FKHRL1 most likely triggers apoptosis by inducing the expression of genes that are critical for cell death, such as the TNFSF6(Tumor Necrosis Factor Ligand Superfamily Member-6)gene.Another notable substrate of Akt is the death protease Caspase9.Phosphorylation of Caspase9 decreases apoptosis by directly inhibiting the protease activity.Akt also activates TERT(Telomere Reverse Transcriptase), which is responsible for telomere maintenance and DNA stability.Akt has been linked to angiogenesis, through the activation of eNOS, which influences long-term blood vessel growth.Akt can regulate several levels of Glucose metabolism.It enhances Glucose-uptake in Insulin-responsive tissues by inducing the expression of GLUT1 and GLUT3 and the translocation of GLUT4 to the plasma membrane;the GLUTs transport glucose into the cell.Akt also activates Glycogen synthesis by phosphorylating and inactivating GSK3, which leads to the activation of Glycogen Synthase and CyclinD1.Akt phosphorylates PDE3B on Ser273.This activates PDE3B and results in regulation of intracellular levels of cyclic nucleotides in response to Insulin.Akt induces glycolysis through the phosphorylation and activation PFK2, which in turn activates PFK1.These enzymes convert Fructose-6-Phosphate into Fructose-1, 6-Bisphosphate, a key step in Glucose metabolism.Akt may also be involved in activation of the nutrient-dependent Thr/Ser kinase, mTOR.Activation of mTOR results in the phosphorylation of ribosomal protein S6 kinase, p70S6K.Akt also phosphorylates the two tumor suppressor genes TSC1 and TSC2, which are negative regulators of the mTOR-S6K pathway.Phosphorylation of TSC1 and TSC2 results in suppression of their inhibitory activity and may also target the proteins for degradation.Activation of mTOR also results in phosphorylation and inactivation of eIF4EBP(Eukaryotic Initiation Factor-4E Binding Protein), an inhibitor of the translation initiation factor eIF4E.Nonphosphorylated PHASI binds to eIF4E(Eukaryotic Initiation Factor-4E)and inhibits protein synthesis.Akt also phosphorylates GAB2(GRB2-Associated Binding Protein-2)on Ser159.Phosphorylation of Ser159 on Gab2 by Akt/PKB appears to negatively regulate GAB2 tyrosine phosphorylation by the ErbB receptor tyrosine kinases, although the underlying mechanism has not been solved(Ref.5 & 6).The transcription factor CREB is directly phosphorylated at Ser133 by Akt.This causes an increased affinity of CREB for its co-activator protein, CRB(Crumbs).The heterodimer, now an active transcription factor, promotes transcription of genes that contain CREs(cAMP responsive elements)in their promoter, such as the anti-apoptotic genes Bcl2 and Mcl1.Akt also phosphorylates AR at two serine residues, Ser210 and Ser270, which causes a decrease in AR activity on the p21 promoter.In addition to causing cell cycle progression, this also results in apoptosis inhibition in certain cell types, through other actions of AR.YAP is another transcription factor that is phosphorylated by Akt, and is of importance because it does not contain an Akt consensus sequence.Akt phosphorylates Ser127 on YAP, which causes association with 14-3-3 proteins, nuclear export and cytoplasmic localization.Akt has also been shown to phosphorylate p21 directly, on Thr145.p21 is a member of the Cip/Kip family of CDK inhibitors that arrest the cell cycle and therefore limit cell proliferation.p21 can also promote cell cycle progression, via mediating the assembly and activity of cyclin D1-CDK4/6 complexes.P27 is another cyclin-dependent kinase inhibitor, of the Kip family.P27 inhibits CDK2 and CDK4/6 complexes, which is located in the nuclear localization signal.NLS targets protein to nucleus via nuclear import machinery, and phosphorylation in this region of p27 results in nuclear exclusion.14-3-3 proteins bind phosphorylated p27 and cause active export from nucleus.Without p27 in the nucleus, the cyclin-CDK complexes form and promote cell cycle progression.Akt also phosphorylates MDM2.MDM2 is phosphorylated at many sites, only two of which have been identified.Ser166 is phosphorylated by Akt.Akt phosphorylation of MDM2 allows its entry into the nucleus where it targets p53 for degradation(Ref.7, 8, 9 & 10).PRAS40 is a 40 kDa substrate of AKT.Activated AKT phosphorylates PRAS40 on threonine 246, enabling PRAS40 to bind to 14-3-3.AKT and PRAS40 are components of the PI3K pathway.This pathway plays a role in glucose uptake, cell growth, and apoptosis inhibition.The precise function of PRAS40 is not yet known;however, it has been hypothesized that PRAS40 interacts with SH3 and WW domain containing proteins, and may change the function of these proteins.Akt phosphorylates, both in vitro and in vivo, the GABA(A)R, the principal receptor mediating fast inhibitory synaptic transmission in the mammalian brain.Akt-mediated phosphorylation increases the number of GABA(A)Rs on the plasma membrane surface, thereby increasing the receptor-mediated synaptic transmission in neurons.XIAP is a physiological substrate of Akt.Akt interacts with and phosphorylates XIAP at serine 87.Phosphorylation of XIAP by Akt inhibits both its autoubiquitination and cisplatin-induced ubiquitination.These effects reduce XIAP degradation and the increased levels of XIAP are associated with decreased cisplatin-stimulated Caspase3 activity and programmed cell death.Htt is also a substrate of Akt and phosphorylation of Htt by Akt is crucial to mediate the neuroprotective effects of IGF1(Insulin-Like Growth Factor-I).WNK1 is a physiologically relevant target of Insulin signaling through PI3K and Akt and functions as a negative regulator of Insulin-stimulated mitogenesis(Ref.11, 12 & 13).Akt also phosphorylates Ataxin1 and modulate neurodegeration.14-3-3 protein mediates the neurotoxicity of Ataxin1 by binding to and stabilizing Ataxin1, thereby slowing its normal degradation.Akt also decreases ASK1 kinase activity by phosphorylating a consensus Akt site at serine 83 of ASK1.Akt also interacts with the JIP1(JNK Interacting Protein-1)scaffold and inhibits the ability of JIP1 to form active JNK signaling complexes.The binding of Akt to JIP1 is isoform specific;Akt1 but not Akt2 interacts with JIP1.Thus, Akt can inhibit one or more steps within the JNK signaling pathway, depending on the complement of components that form the functional JNK signaling module.Akt mediates PI3K-dependent p47Phox phosphorylation, which contributes to respiratory burst activity in human neutrophils.AKT impair Chk1 through phosphorylation, ubiquitination, and reduced nuclear localization to promote genomic instability in tumor cells.Akt and its upstream regulators are deregulated in a wide range of solid tumors and hematologic malignancies, hence the Akt pathway is considered a key determinant of biologic aggressiveness of these tumors, and a major potential target for novel anti-cancer therapies(Ref.14 & 15).
信号转导途径 篇3
APC基因全名为大肠腺瘤样息肉 (adenomatous polyosis coli, APC) 基因, 位于染色体5q21~22上[1]。开放读码区8535bp, 由15个外显子和14个内含子组成, 其中第15外显子最大, 长度为6571bp, 是人类已知最大的外显子[2]。APC基因编码的蛋白为胞浆蛋白, 由2843个氨基酸组成。蛋白结构包含有β-链蛋白、APC和E-钙黏附蛋白的结合位点[3]。APC蛋白是一个多功能蛋白, 是Wnt信号转导途径的一个重要组成部分, 其主要作用是与β-catenin和E-钙黏附蛋白相互作用而影响细胞黏附及细胞间信号传递[4], 并参与了一系列细胞进程, 包括细胞周期调节、凋亡、细胞黏附、Wnt信号转导和微管集合等[5]。
2 APC基因失活对Wnt信号转导途径的影响
2.1 APC在Wnt信号转导途径中的作用
在Wnt途径中, APC与Axin、Gs K-3β共同形成一种蛋白质络合物, 从而控制β-catenin在细胞内的含量[6]。APC蛋白1342-2075残基间包含七个20个氨基酸重复序列, 这些重复序列是β-catenin蛋白的结合及降解所必须的[7]。当β-catenin蛋白与APC蛋白结合后, 其NH2末端上的丝氨酸、苏氨酸位点被GSK-3β磷酸化[8], 磷酸化β-catenin成为蛋白酶体的靶蛋白而被降解。因此, 蛋白酶体介导的β-catenin的降解有赖于APC蛋白与β-catenin的直接相互作用。即APC蛋白作为构架蛋白通过促进β-catenin的降解而发挥肿瘤抑制作用[9]。
2.2 APC基因MCR区突变
APC基因突变类型主要有点突变和框架移码突变, 前者包括无义突变、错位突变和拼接错误, 后者包括缺失和插入[10]。密码子1286~1513之间是APC基因的突变密集区 (MCR) , 位于15外显子内。部分MCR区域靠近APC基因的β-catenin结合位点, 该部位突变可使下游形成提前的终止密码子, 编码产物为截短蛋白。基因突变后产生的截短蛋白缺失几乎所有的20个氨基酸重复序列, 导致APC蛋白虽能与β-catenin结合, 但却不能降解β-catenin[11]。过量的β-catenin在细胞浆内聚集并进入核内, 结合到T细胞因子 (TCF) /淋巴增强因子 (LEF) 转录因子家族[12], 从而激活相关靶癌基因c-myc、Cyclin D1和c-jun等的转录、过表达, 导致癌症的发生[13]。
2.3 APC基因启动子甲基化
APC基因是抑癌基因中的一种, 在很多组织中都有表达, 是结肠癌的"看门基因"[14]。近年来发现在结直肠癌、乳腺癌、肺癌、子宫内膜癌、食管癌、膀胱癌、胃癌、T淋巴细胞瘤等肿瘤中均有APC基因超甲基化[15]。DNA甲基化是突变失活及缺失失活之外基因失活的第三种机制。DNA甲基化即通过DNA甲基转移酶 (DNA Methyltransterase, DNMT) 的催化作用, 利用S-腺苷甲硫氨酸 (SAM) 提供甲基, 在Cp G二核苷酸中胞嘧啶嘧啶环的5号碳原子上加上甲基的共价修饰过程[16]。APC启动子区CCAAT盒附近Cp G岛的异常高甲基化, 可以抑制APC基因的表达, 主要是通过改变染色质的构象和干扰转录因子CBF结合到CCAAT盒上来实现的[17]。抑癌基因启动子的异常甲基化可以激活异常的Wnt信号转导通路及对一些重要的细胞生理功能产生影响[18]。
近年来研究表明, Wnt信号转导通路异常在细胞的癌变过程中起着重要的作用。其异常激活与肿瘤的发生密切相关。肿瘤抑制基因APC失活突变可促使该通路异常激活, 启动下游c-myc、Cyclin D1和c-jun等靶基因, 导致细胞恶化。因此, 我们应深入研究与了解APC与Wnt信号转导通路之间的相互作用与机制, 更好地认识APC基因失活突变与肿瘤的形成和发展之间的关系。
摘要：APC是Wnt信号转导通路的重要组成分子。APC蛋白可控制β-catenin在细胞内的含量, 在Wnt信号转导通路中起负向调节作用。APC基因突变或蛋白异常可使Wnt信号转导通路异常激活, 多种原癌基因持续转录而导致肿瘤发生。本文主要探讨APC基因失活的机制和对Wnt信号转导通路的影响。
信号转导途径 篇4
cAMP 参与烟草悬浮细胞的ABA信号转导
ABA诱导型启动子(rd29A)重组到报告基因(GUS)的上游构建表达载体.通过农杆菌介导转化烟草,获得转基因植株.将转基因植株诱导愈伤组织,建立稳定、均一的转rd29A-GUS融合基因的悬浮培养细胞系.用ABA处理悬浮细胞24 h后GUS活性显著升高,说明外源ABA能够诱导rd29A启动子的表达,获得了用于ABA信号转导研究的实用细胞系.在ABA激活表达的细胞介质中加入尼克酰胺(cADPR合成酶的抑制剂)或U73122(PLC抑制剂)只能部分抑制ABA的效应,但如果加入蛋白激酶抑制剂K252a,抑制效果达95%以上.用可跨膜的cAMP的`类似物8-Br-cAMP处理细胞发现,它能代替ABA的作用;当介质中加入1 mmol/L IBMX(磷酸二酯酶的抑制剂)增加cAMP的稳定性,发现低浓度的8-Br-cAMP与ABA相同的效应.以上结果表明cAMP参与了烟草悬浮细胞中ABA信号的传递.
作 者：刘璞 孟令军 张会霞 陈珈 王学臣 LIU Pu MENG Ling-jun Zhang Hui-xia CHEN Jia WANG Xue-Chen 作者单位：中国农业大学生物学院,植物生理生化国家重点开放实验室,北京,100094刊 名：植物学报 ISTIC SCI英文刊名：ACTA BOTANICA SINICA年，卷(期)：44(12)分类号：Q945关键词：烟草 脱落酸 环腺苷一磷酸 β-葡糖醛酸酶 报告基因 信号转导 tobacco ABA cAMP β-glucuronidase (GUS) report gene signal transduction
信号转导途径 篇5
1 材料
1.1 动物
健康清洁级SD大鼠,雄性,48只,体重(330±20)克,购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司。
1.2 药品
补阳还五汤:由赤芍、川芎、当归尾、地龙、黄芪、桃仁、红花等组成,保持《医林改错》原方剂量比例不变,由湖南省中药超微工程技术研究中心提供。桂利嗪:由丽珠集团利民制药厂生产,批号:060607。
1.3 试剂
NGF免疫组化试剂盒及NGF、PI3K/AKT原位杂交试剂盒及相应的抗体:武汉博士德生物科技有限公司。
2 方法
2.1 脑缺血模型的制作
采用栓线法制作局灶性大鼠脑缺血模型[2]。
2.2 动物分组及给药
所有动物于动物清醒后按相应分组开始灌胃给药,给药剂量按动物与人体表面积折算,其中补阳还五汤组灌胃25g/kg浸膏,相当于成人每日剂量的2倍;桂利嗪灌胃0.64g/kg,相当于成人每日剂量的2倍,假手术组及模型对照组用相应剂量蒸馏水。并分别连续给药1天或7天后处死,每组每个时点处死6只大鼠并进行相应检测。
2.3 标本制作及免疫组化
将大鼠用10%的水合氯醛腹腔注射麻醉后,迅速打开胸腔,暴露心脏,经左心室插管至升主动脉,剪开右心耳,快速灌入100ml左右的生理盐水,然后用4%的多聚甲醛(0.1mol/L磷酸盐缓冲液配制,pH7.2～7.4)进行灌注,先快后慢,进液总量约250ml,灌注时间20～30分钟,然后取脑,置于相同固定液中后固定,石蜡包埋。以视交叉和其后4mm处两点冠状切片,片厚4μm,行HE染色及免疫组织化学或原位杂交测定(按试剂盒规定内容进行操作)。染色后在400倍光镜下随机取3个视野进行拍照,并用相关药理专业软件计算出阳性细胞数目(拍照及图像分析在湖南中医药大学病理教研室完成)。
2.4 统计方法
所有数据以表示,当数据满足正态性与方差齐性采用LSD-t检验,如果数据不满足上述条件,则采用秩和检验。
3 结果
3.1 NGF免疫组化染色
在光镜下,脑缺血1天后及7天均可见脑组织内出现阳性细胞。假手术组可见有少量阳性细胞表达,且染色较浅; 模型组可见阳性细胞在海马及皮质内广泛分布,颜色相对假手术组较深;补阳还五汤组及桂利嗪组深染的阳性细胞在脑组织内广泛分布,高倍镜下可见胞质及突起内充满棕黄色阳性反应颗粒,阳性细胞为星形或多角形,且分布特点以海马较多,与模型对照组及假手术组比较有明显差异。见表1。
与假手术组比较*P<0.05,**P<0.01;与模型组比较△P<0.05,△△P<0.01;与1天比较#P<0.05,##P<0.01(下同)
3.2 PI3K及AKT的免疫原位杂交检测
见表2。
4 讨论
补阳还五汤是清代著名医家王清任创立的益气活血之代表方剂,为近代医家治疗中风的常用方剂之一。经检索,近年来报道用补阳还五汤治疗缺血性中风均取得了较好的疗效,对其药理作用的报道证实了补阳还五汤具有改善脑循环、增加脑血流量、改善血液流变学、改善脑细胞能量代谢、抗氧化及抑制自由基的产生和灭活自由基、拮抗神经毒性、减轻炎症反应、促进神经干细胞增殖分化、抑制神经细胞凋亡和调节神经递质或神经肽紊乱等多方面作用[3]。
NGF作为第一个被发现的神经营养因子,是神经系统最重要的生物活性分子之一,对神经系统具有重要的神经营养和促神经突起生长的生物效应。本实验表明,在缺血后24小时模型组、补阳还五汤组及桂利嗪组的NGF表达与假手术组比较均有明显上升;至7天时各组仍有阳性细胞表达,但与1天比较均有部分回落,但补阳还五汤组及桂利嗪组与假手术组与模型组比较仍有明显差异。补阳还五汤及桂利嗪对脑缺血模型大鼠脑组织的NGF具有上调及促进作用。PI3K/AKT信号通路是重要的细胞存活信号通路。多种神经营养因子通过激活PI3K/AKT信号通路抑制细胞凋亡,发挥脑保护作用[4]。近年研究表明,PI3K/AKT信号通路与脑缺血损伤有关,参与了脑缺血的病理过程[5],并参与抗细胞凋亡作用[6]。本实验研究表明脑缺血后脑组织主要信号转导途径的PI3K、AKT/PKB的表达均明显增加,在缺血1天后即达高峰,7天时仍有明显表达。且补阳还五汤组与桂利嗪组大鼠的脑组织中信号转导主要途径的PI3K、AKT含量均比模型组及假手术组有明显增加。提示补阳还五汤对脑缺血损伤的保护作用中,激活内源性NGF的表达并相应上调其PI3K/AKT转导信号是其主要途径。
参考文献
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表皮角质分化过程中的信号转导 篇6
1 Notch信号转导通路在表皮分化中的作用
Notch信号转导通路由Notch受体、Notch配体和CSLDNA结合蛋白3部分组成。它是一条影响细胞命运的保守而重要的信号转导通路,几乎涉及所有细胞的增殖和分化活动。Notch配体与受体结合后,在肿瘤坏死因子α转换酶(tumor necrosis factoralpha converting enzyme,TACE)的作用下,Notch受体在细胞膜外被酶切,释放出和Notch配体连接的胞外部分[1]。随后在γ-分泌酶的作用下,胞内段被酶切,形成可溶性的notch胞内结构域(notch intracellular domain,NICD)转移至核内,通过激活转录因子CLS而调节基因表达[2]。一般认为,Notch信号通路活化后,通过抑制干细胞的分化来维持它的分化潜能[3]。然而,在表皮角质形成细胞中,Notch信号通路的活化却使其退出细胞周期而走向分化[4]。
人和小鼠表皮中的Notch受体蛋白主要是Notch1和Notch2[5,6],配体是Delta1、Jagged1和Jagged2[7,8,9,10,11]。其中Notch1分布在人类表皮的各层,Notch2主要表达于人类表皮的基底层,而在小鼠表皮中,无论是Notch1还是Notch2都主要分布于棘层,尽管Notch信号通路在人和小鼠的表达模式上存在差异,但它在表皮中的作用却是一致的,即抑制角质形成细胞的增殖,诱导角质形成细胞的分化[6]。Notch1信号通路能诱导小鼠角质形成细胞表达分化标志蛋白如角蛋白K1(keratin1)和编码套膜蛋白(involucrin),免疫组织化学实验显示,该实验小鼠的棘层增厚[12];反之,在Notch1信号通路缺失的小鼠表皮中,标志表皮早期分化的标志蛋白的表达下降,角质形成细胞的增殖增多[6]。抑制Notch1信号通路,可使角质形成细胞的分化受阻,细胞异常增殖,形成自发鳞状细胞癌[13]。在癌变的角化细胞系与皮肤肿瘤中,Notch1的表达与活动性是降低的,因此,未来可将Notch1作为皮肤肿瘤抑制剂[14]用于临床治疗。
Notch信号通路对表皮分化的调控常与其他信号通路发生交联。KOLEV等[15]在人原代角质细胞(primary human keratinocytes,HKCs)中加入表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)的抑制剂AG1478,发现Notch1 m RNA的表达量升高,用特异性Si RNA抑制EGFR的表达,同样也观察到了Notch1的表达增多,提示Notch1与EGFR在角质细胞中可能存在某种关系。
化学试剂或基因操作阻断表皮细胞中的EGFR信号通路,可诱导表皮分化标志物编码套膜蛋白(involucrin)和丝聚合蛋白(filaggrin)的表达,说明EGFR信号体系对表皮分化的调控表现为维持角质形成细胞的更新,抑制角质形成细胞的分化。可以说Notch和EGFR两条信号通路对表皮的分化表现为完全不同的作用,那么,它们之间是如何发生联系的呢?
表皮细胞中的EGFR结合表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)后,经过一系列的信号传递,通过细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)和c-Jun氨基端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)的激活,最后使原癌基因c-Jun的表达提高;由于c-Jun是p53基因转录的直接负调控子,使p53的表达降低。而在Notch1启动子区域有一个p53的结合位点,因此当EGFR被抑制后,Notch1基因调控区域的p53结合位点活化,Realtime显示p53 m RNA的水平也随着EGFR的抑制而上升。提示表皮中Notch信号通路与EGFR信号体系的交联可能与p53存在某种关系[15]。在HKCs中对p53进行基因敲除后发现,EGFR并不能影响Notch1基因的表达,进一步证明了表皮中EGFR/c-Jun信号体系通过对p53的调控与Notch信号通路发生关联,即EGFR信号通路通过对p53基因的负调控而对Notch1基因的表达起负调控的作用[15]。
有意思的是,Notch1与EGFR通路的整合在不同的组织中可以起联合或拮抗的作用。最近有人发现,Notch1可以同时激发与EGFR信号通路有关的激活基因和抑制基因的活性,可能的解释是Notch的靶基因包含了与分化有关的正、负调控子。Notch的活化在不同细胞中扮演着增殖、分化和凋亡等不同的角色,并且通过与其他信号通路的整合维持着细胞的正常工作,这对于维持组织细胞的平衡起着重要的作用[16]。
Notch信号通路与其他信号体系的复杂关系以及不同的Notch受体与不同配体的特异性结合后对细胞产生差异性的影响仍有待进一步探究。
2转化生长因子β(tra ns forming growth fa ctorβ,TGF-β)–Smad2/3-IKKα信号通路在表皮分化中的作用
TGF-β家族由一类结构和功能相关的多肽生长因子亚家族组成,TGF-β相关的信号通路调节细胞的增殖和分化,而在表皮中,它主要促进角质形成细胞退出细胞周期走向分化。
TGF-β配体与受体结合后,通过受体丝氨酸/酪氨酸激酶激活细胞内的Smad效应器(receptor-activated smads,R-Smads),低聚化的R-Smads进入细胞核,直接或间接结合DNA,调控与表皮分化有关的基因(如丝聚合蛋白和兜甲蛋白)的转录[17]。
近来研究[18]发现,IkB激酶α(IkB kinaseα,IKKα)是TGF-β-Smad2/3信号通路调节表皮分化中的一个关键的调控子,对角质形成细胞的分化有重要作用。IKKα是IKK复合物的催化亚单位之一,参与核因子κB(nuclear factorκB,NF-κB)的活化。近来研究表明,此激酶还可以作为调节表皮分化的分子开关。DESCARGUES等[19]发现:IKKα-/-老鼠呈现一种高度增殖而不分化的上皮,完全缺少角质层和颗粒层,甚至用高浓度的钙刺激IKKα缺陷型老鼠也不表达终末分化的标志物;而这并不依赖其激酶性质,与NF-κB信号转导无关。IKKα通过其激酶结构域与Smad3的C端MH2结合,在TGF-β的刺激下,IKKα与Smad3(很少情况与Smad2)形成转录复合物,依靠IKKα激酶结构域上的核定位信号进入细胞核,从而促进抗Myc基因———mad1和ovol1的转录。mad1和ovol1基因的表达可抑制原癌基因c-Myc的表达与活化,从而促使角质形成细胞退出细胞周期而走向终末分化。
IKKα最近被作为鳞状细胞癌(squamous cell carcinoma,SCC)的抑制剂[20],在SCC细胞中,原癌基因Ras和Myc、表皮生长因子受体EGFR以及细胞周期蛋白CyclinD1被激活,而抑癌基因P53和P63的表达受抑制,IKKα可能通过TGF-β途径抑制原癌基因c-Myc的表达,其具体机理还有待进一步研究。
3 钙离子诱导的信号体系在表皮分化中的作用
在正常的表皮内存在严格的钙离子浓度梯度,自基底细胞层到颗粒层,细胞内、外钙离子浓度由低到高[21]。从超微结构观察发现,细胞的分化程度与钙离子的浓度有关[22],维持钙离子浓度的动态平衡对表皮的分化起着至关重要的作用。在小鼠3T3和人WI-38成纤维细胞中,当钙离子浓度降到0.05~0.10 m M的范围内时,上皮角质细胞就停止分化。在低钙离子浓度条件下培养的单层上皮细胞,当钙离子浓度增加到1.20 m M时,可诱导表皮终末分化标志物的表达,促使上皮细胞发生终末分化[23]。YUSPA等[24]培养角质形成细胞时发现,细胞外低浓度钙促进角质形成细胞的增生,高浓度钙促进角质形成细胞的分化和分层。并促进谷氨酰胺转移酶的表达和角质细胞包壳的形成,以及细胞分化指标如角蛋白1、角蛋白10和丝聚蛋白的表达。钙离子螯合剂能阻止由钙离子所诱导的角质形成细胞的分化。
细胞外的钙离子通过蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)信号途径调节表皮分化相关基因的转录。具体的信号转导途径如下:细胞外钙离子与细胞外钙离子敏感受体(extracellular calcium sensing receptor,ECSR)结合,诱导质膜内E-钙粘连蛋白-β-连环蛋白-P-120-连环蛋白复合物的形成,此复合物通过β-连环蛋白聚集活化的磷脂酰肌醇(-3)激酶(phosphatidylinositol 3-kinases,PI3K),活化的PI3K将磷酯酰肌醇二磷酸(phosphatidylinositol4,5-biphosphate,PIP2)转化成磷酯酰肌醇三磷酸(phosphatidykinositol 3,4,5-trisphosphate,PIP3),PIP3通过与磷脂酶Cγ-1(phospholipase Cγ-1,PLCγ-1)N端的PH结构域和C端的SH2结构域结合活化PLCγ-1,活化的PLCγ-1将PIP3水解为三磷酸肌醇(trisphosphate inositol,IP3)与甘油二酯(1,3-diglyceride,DAG),IP3与IP3受体结合,使钙离子从内质网和高尔基体中释放出来,质膜内钙离子浓度升高,激活PKC信号途径,同时DAG也可激活PKC。活化的PKC信号通路加速转录因子AP1/jun的表达,而许多表皮分化标志蛋白的基因启动子区域都含有AP1结合位点。因此,钙离子通过PKC信号途径加速AP1/jun的表达,诱导与表皮分化相关基因的表达[25]。
此外,表皮终末分化标志物———谷氨酰胺转移酶(transglutaminase,TG),是一种Ca2+依赖性酶,表皮细胞最终分化形成角质层,需要在一定浓度钙离子条件下活化TG,催化角质层中富含脯氨酸的蛋白质形成类似分子桥的赖氨酸键,进而与脂质交联构成角质化的套膜(cornified evenlop)[26],行使其对机体的保护作用。
表皮中钙离子梯度的维持,除了上述PKC传导途径以外,间隙连接蛋白也起了很重要的作用。不同的间隙连接蛋白表达在表皮的不同层次,形成间隙连接[23],介导细胞间的信息和小分子物质的传递[27]。应用间隙连接蛋白阻遏剂,发现钙离子的传播明显减少。间隙连接蛋白的突变常与许多遗传性皮肤病相关[28,29,30],也许是使一些小分子物质在细胞间的传递受阻,细胞间信号的传递发生障碍而使表皮分化失控。
4 小结
表皮细胞的增殖和分化维持着一种动态的平衡,一旦这种平衡被打破,便会导致疾病。机体是如何通过复杂的信号转导通路来维持这种平衡的,仍是尚待解决的关键问题。对表皮分化过程中信号转导通路的研究,有助于进一步探究皮肤病的发病机理,为烧伤后皮肤的移植甚至皮肤癌变的治疗提供帮助。
摘要：表皮是人体的第一道防护屏障,对维持机体内环境的稳定起到了巨大的作用。表皮是新陈代谢频率较快的组织,正常机体中表皮的增殖、分化和凋亡处于一种动态的平衡中,一旦这种平衡失调,将会导致严重的皮肤病,因此,机体内应有一套精密的调控系统来调控这一过程。Notch、TGF-β和钙离子等信号通路可能参与了表皮的分化。
信号转导途径 篇7
脂毒性的发生主要与高水平的FFA相关。高水平的FFA短期内可以刺激胰岛素分泌, 长期则再脂化异位沉积于非脂肪器官, 致使周围组织对胰岛素的敏感性降低, 肝脏糖异生增加, 肌糖原生成降低, 并使胰岛B细胞功能受损, 最终导致胰岛素分泌障碍和胰岛素抵抗, 从而对非脂肪组织产生损伤。本文就脂质及其毒性对胰腺细胞信号转导系统的影响研究新进展作一综述。
1 转录因子途径
FFA主要通过环磷酸腺苷 (c AMP) 反应元件调控因子阻遏物 (CREM-17X及ICER-1) 和甾醇调节因子结合蛋白-1c (SREBP-1c) 来影响胰腺B细胞功能。CREM是转录因子ATF/CREB家族中的一员, 它控制着神经内分泌细胞多基因表达, 也是治疗肥胖症、降低动物体脂沉积的关键。固醇调控元件结合蛋白 (sterol regulatory element binding proteins, SREBPs) 是膜结合转录因子, 属于转录调控因子b HLH (helix-loop-helix) 家族。大量研究已证实:SREBPs是调控胆固醇、脂肪酸和三酰甘油及脂肪细胞分化过程的关键转录调控因子。在人和动物中, 存在3种形式的SREBP同分异构体, 即SREBP-1a, SREBP-1c和SREBP-2。SREBP存在于内质网, 主要功能是介导脂肪酸的合成, 并可通过影响碳水化合物代谢、脂质生物合成、细胞生长及凋亡多个靶基因改变而导致胰岛B细胞功能障碍[2]。SREBPs的组成结构包括480个氨基酸组成的N端、590个氨基酸组成的C端和中间的80个氨基酸的发夹结构, 后者被亲水环状结构分割。其中, N端的功能是启动转录, C端则负责转录的调控。SREBP的调控主要发生在3个水平:SREBP前体蛋白裂解过程、转录及SREB的翻译后调控。SREBP-1a和SREBP-2的调控主要发生在前体裂解阶段, SREBP-1c的调控主要发生在转录水平。
SREBP对脂质合成的调控与SREBP裂解激活蛋白 (SCAP) 和胰岛素诱导基因产物 (insulin-induced gene, Insig) 有关。当细胞内脂质水平下降时, SREBP与SCAP结合, 转入高尔基体, 在1位蛋白酶作用下清除SREBP的C端, 保留N端在细胞膜, 剩余部分返回内质网被2位蛋白酶清除。当细胞内脂质过量时, SCAP/SREBP复合体不能形成, 则SREBP介导的转录不能进行。另一方面, Insig可以与SCAP的转感结构域 (SSD) 结合, 当脂质浓度升高, Insig与SCAP结合而阻断SCAP-SREBP复合体的形成, 从而使脂质合成减少[3];相反, 当脂质浓度降低则这种结合降低, 而使SREBP有效地从内质网运输到高尔基体实现活化, 从而促进脂质的合成[4]。
SREBP-1c是胰腺重要的转录调控因子, 直接激活脂肪酸、三酰甘油合成和代谢的30多个基因, 同时SREBP-1c也是合成这些分子所必需的NADPH的协同因子。因此, SREBP-1c被称为“脂毒性的门卫”, 能调控脂肪酸和三酰甘油合成的多种基因, 如脂肪酸合成酶 (FAS) 。胰岛素能上调SREBP-1c的mRNA表达和脂肪酸合成基因的表达, 同时反应产物丙二酰Co A能抑制CPT1和线粒体FA氧化[5]。SREBP-1c对三酰甘油和脂肪酸的调节具有靶向性, 通过基因工程小鼠模型建立可以发现, SREBP-1c缺乏的脂肪组织不能有效储存三酰甘油, 从而使脂肪酸增加并储存在周围组织, 最终导致显性脂毒性和代谢综合征。不过, SREBP-1c是促进还是抑制生脂基因的表达, 目前还存有争议。有研究发现, 过度表达的SREBP-1c引起胰腺细胞内脂滴大量沉积, 并使葡萄糖刺激的胰岛B细胞胰岛素分泌 (GSIS) 受损[6], 而这一表现可能是通过FFA引发的内质网受损和内质网应激产生的[7]。
2 过氧化物酶增殖物活化受体 (PPARs) 系统
研究显示, PPARs作为一重要的细胞调节因子, 是脂肪酸代谢转录途径的主要决定因子[8,9]。PPARs属于配体介导的激素核内受体家族, 由PPARα、δ (β) 、γ组成。α受体主要分布在肝脏、心脏、肾脏和褐色脂肪组织, 与脂代谢有关;δ受体在各种组织均有丰富的表达, 可能与细胞的基础脂质代谢有关, 也可能协助PPARα、PPARγ的作用;γ受体主要在脂肪组织和大肠中表达, 具有多种生物效应, 在脂肪细胞分化、糖脂代谢、炎性反应中起重要作用。PPARs由保守的结构区组成功能结构区, 与其配体形成复合物后, PPARs在DNA结合区发生变构, 通过与视黄酸类受体α (RXRα) 形成异二聚体, 再和目的基因启动子上游的过氧化物酶增殖物反应元件 (PPRE) 结合而对靶基因进行调控。
PPAR由多不饱和脂肪酸、类花生酸类脂质和不同种的合成配基激活[10]。PPARα可以调控肝脏编码过氧化物酶体、线粒体和微粒体细胞色素P450中某些脂肪酸代谢酶的基因转录;PPARα还能诱导乙酰辅酶A合成酶, 促进肝脏提取脂肪酸并转化为乙酰辅酶A, 提高脂肪酸经β氧化途径的代谢分解率[11]。当脂肪酸摄入增加和β氧化增加时, PPARα通过增加肝脏脂蛋白脂酶的表达而降低Apo C-Ⅲ的产生, 逐渐降低三酰甘油的水平, 同时促进高密度脂肪酸 (HDL) 的主要载脂蛋白Apo A-Ⅰ和Apo A-Ⅱ在肝脏的表达, 以升高血浆HDL的水平。而PPARγ在脂肪酸增高时, 往往通过加强脂肪酸转运蛋白和酰基Co A合成而促进脂肪细胞摄取脂肪酸, 并增加脂肪细胞中脂质的存储, 刺激脂肪组织中参与脂肪酸代谢的多种基因的表达而降低血脂水平。而PPARγ的激活可以增加新分化的小脂肪细胞而减少肥大的脂肪细胞, 这样可增加细胞膜上胰岛素受体的数量, 同时促进脂蛋白脂酶、脂肪酸结合蛋白、脂肪酸合成酶表达增加, 从而减少FFA, 增加胰岛素敏感性[12]。
此外, PPAR对于脂肪细胞的信号传导作用还表现在对其分泌的多种激素和细胞因子的调节功能。肿瘤坏死因子 (TNF-α) 能抑制前脂肪细胞的分化以及胰岛素刺激的葡萄糖转运, 加速脂肪细胞脂肪分解, 增加血FFA水平。当脂肪酸摄入增加时, PPAR激活后减缓脂解速度, 从而降低FFA[13]。这种抗脂肪分解的作用可能由TNF-α水平及活性改变而介导。肥胖常伴有胰岛素抵抗和慢性炎症反应, 而慢性炎症反应是导致胰岛素抵抗的关键原因[14,15]。TNF-α是主要的致炎因子, TNF-α刺激可以引起PPARγ下降, 另外已证实PPARγ配体具有抗炎效应, 激活PPARγ可减轻炎症反应, 炎症因子表达减少[16]。体外实验证明, 噻唑烷二酮 (TZD) 类药物可以降低TNF-α基因表达, 抑制TNF-α刺激的脂肪分解[17]。PPAR激活可能阻断了TNF-α在信号传导途径中对胰岛素受体及胰岛素受体底物磷酸化的抑制作用。研究显示, 用脂肪酸或TNF-α处理内皮细胞, 可见细胞内氧化应激增强, IL-8增多, 细胞核因子κB (NF-κB) 活性增强和细胞黏附分子-1含量增加[18];若同时使用脂肪酸和TNF-α处理, 则细胞内氧化应激进一步增强, 推测TNF-α在脂肪酸对内皮细胞的凋亡中起作用。另外, 大量试验已证明, TZD类药物通过激活PPAR可以降低leptin mRNA及蛋白水平, 提示PPAR在高脂状态下亦可能通过调控脂质水平表达来降低FFA[19]。
3 Toll受体途径
Toll受体 (Toll-like receptors, TLRs) 是免疫细胞表面识别病原相关分子模式的一个模式识别受体家族, 最新研究显示其在自身免疫疾病和慢性炎症的相互作用方面起着重要的桥梁作用。TLRs是近年来发现的跨膜信号传递受体蛋白。迄今为止, 在哺乳动物体内已经发现12个TLRs家族的成员, 分别命名为TLR1~12。Toll属Ⅰ型跨膜蛋白, 其家族成员的结构非常相似, 由胞外区、跨膜区和胞内区3部分组成。胞外区富含亮氨酸重复基序 (leucine-rich repeats, LRR) , 有利于对病原体或其产物的识别;胞内区与IL-1受体的胞内区相似, 因而被称为Toll IL-1受体同源区 (toll IL-1 receptor homologous region, TIR) , 在信号转导中具有重要作用[20]。有研究显示TLR4、TLR1、TLR2和TLR5在巨噬细胞和内皮细胞高表达, 从而在高脂血症引起的动脉粥样硬化中发挥作用。其中, TLR4在低密度脂蛋白胆固醇 (LDL) 作用下在巨噬细胞表达上调。TLR4受饱和脂肪酸激活, 细胞内炎症通路均被上调, 如JNK、KKB/LKBα/NF-κB, 进而诱导胰岛素抵抗[21,22], 因而TLR4是炎症与脂质代谢信号通路的交叉点。胰腺B细胞可对脂肪酸反应, 主要经由TLR4/My D88信号通路并产生一系列趋化因子, 最终引起CD11b+Ly-6C+M1型促炎单核巨噬细胞向胰岛聚集, 引起炎症反应进而损伤B细胞[23,24,25]。
4 蛋白激酶C (PKC) 信号转导通路
PKC信号转导通路是FFA作用的经典途径, 目前已发现12种PKC同工酶, 并根据作用机制分为3类:传统型, Ca2+和二脂酰甘油 (diacylglycerol, DAG) 依赖;非传统型, 仅依赖DAG;非典型型, 非Ca2+和非DAG依赖。FFA通过PKC途径能介导下列反应: (1) 促进升高的Ca2+和DAG进一步刺激胰岛素的释放; (2) 激活腺苷酸环化酶, 继而提高胞内c AMP浓度, 升高的c AMP和PKA反馈抑制磷脂酰肌醇和PKC通路[26,27]。
血浆FFA提高导致细胞脂酰辅酶A和DAG的增多, 二者是PKC强有力的激活剂, PKC能使胰岛素受体和胰岛素受体底物-1 (insulin receptor substrate, IRS-1) 的丝氨酸和苏氨酸残基磷酸化, 而IRS-1的酪氨酸磷酸化受抑, 从而使胰腺组织中磷脂酰肌醇3激酶 (phosphatidylinositol 3 kinase, PI3K) 的活性降低, 导致葡萄糖转运载体-4 (glucose transporter-4, Glut-4) 向细胞表面转位减少, 胰岛素介导的葡萄糖摄取减少;同时抑制糖原合成酶活性, 使糖原储备能力下降[28,29]。
另外, FFA引起的氧化应激也可激活PKC, 有证据表明FFA引起的氧化应激对PKC的作用可能由NF-κB抑制物激酶 (IKK) 介导。IKK是NF-κB抑制物 (IκB) 激酶, 而NF-κB是炎症启动、调节的关键核因子。NF-κB与抑制物IκB结合, 以无活性的形式存在于细胞浆内。经氧化应激激活后, IKK使IκB磷酸化并与NF-κB解离。解除抑制的活性NF-κB进入细胞核内, 调节一系列炎症因子及相关物质的基因转录和蛋白合成, 即IKK是激活NF-κB调节炎症的重要因素。IKK又是胰岛素受体和IRS-1丝氨酸磷酸化激酶, 可使IRS307位的丝氨酸磷酸化, 导致正常的酪氨酸磷酸化受抑制, 减弱胰岛素受体与IRS的结合、妨碍胰岛素信号向PI3K传递[30]。
5 脂毒性靶向治疗
随着对脂质毒性对信号传导途径影响机制的深入认识, 通过信号传导途径靶向治疗也日益成为热点, 主要集中于以下2方面。
5.1 PPAR途径的调节
包括PPARγ激动剂、维甲酸受体 (RXR) 激动剂、β3肾上腺素能受体激动剂、PPARα/γ双重激动剂等。TZDs是一类直接针对胰岛素抵抗的药物, Rosiglitazone和Pioglitazone已用于临床, 其作用机制是通过结合和活化PPARγ, 促进脂肪细胞的分化, 减少FFA、TNF-α和resistin的生成。PPARγ在脂肪组织中与RXR组成杂合二聚体, 所以RXR激动剂也可激活PPARγ而发挥作用。RXR激动剂LG100268在动物实验中已经显示了良好的降低食欲和体质量的作用, 有望用于肥胖相关的胰岛素抵抗患者[31]。另外, 目前研制出的几种化合物均具有PPARα/γ的共激活作用, 如Wy-1464、Ragaglitazar、KBP297等。
5.2 PKC抑制剂
PKC抑制剂有多种。Inoguchi等[32]研究发现FFA水平升高时, PKC依赖的NADPH氧化酶激活, 增加反应性氧化产物 (ROS) 的产生, 从而可加速胰岛素抵抗综合征患者动脉粥样硬化的发生。选择性PKC抑制剂GF109203X可抑制ROS的产生。维生素E可激活DAG激酶使DAG转化为磷脂酸, 从而降低DAG浓度, 减少PKC的活化。但是维生素E对已激活的PKC没有影响。选择性PKCβ抑制剂LY333531可阻断PKCβ, 目前主要用于糖尿病患者视网膜血流动力学异常的改善。
信号转导途径 篇8
一、赤霉素的生物合成与代谢
近年来, 人们获得了各种突变体, 已经基本弄清楚了赤霉素的合成和代谢过程, 除GA13羟化酶以外, 研究人员克隆了所有编码赤霉素合成酶的基因。
在很多植物的花和营养组织中, GA含量非常低, 同时, 花和营养组织的GA合成酶也很少。但是, 当种子发育的时候, GA合成速率较高, GA合成酶含量比较高。因此, 对GA合成酶基因进行克隆和功能研究的时候, 一般选用正在发育的种子作为材料。通过筛选突变体和表达文库, 研究人员克隆了一系列的GA合成酶基因, 包括内根—贝壳杉烯氧化酶 (KO) 、柯巴基二磷酸合成酶 (CPS) 、内根—贝壳杉烯合成酶 (KS) 、内根—贝壳杉烯酮酸氧化酶 (KAO) 等。催化拟南芥赤霉素早期生成的KO、CPS和KS酶各由一个基因编码合成, 其酶的合成不受GA的反馈抑制。由两个基因表达生成KAO, 这两个基因皆无组织特异性的表达。另外, 催化赤霉素后期生成的双加氧酶 (GA20ox、GA2ox和GA3ox) , 其编码基因通常由一个小的基因家族组成。拟南芥的GA20ox和GA3ox至少都有4个编码基因, 而GA2ox的编码基因有6个。与植物中具有生物学活性的GAs类型一致, GA20—氧化酶对底物的专一性不强, 与底物的亲和力跟C213位的羟基化有关。在西方刺瓜Marah macrocarpus、南瓜Cucurbitamoschata和拟南芥中, GA20—氧化酶对C213位非羟基化底物的亲和力低于羟基化的底物。因此, 拟南芥茎中赤霉素的主要存在形式是C213位非羟基化的GA5。GA20—氧化酶既受光周期调控, 又受反馈调节, 属于调控严格的酶, 如当菠菜Spinacia oleracea和拟南芥从短日照变为长日照时, 体内GA20—氧化酶活性增强。
二、赤霉素生物合成与代谢的调节
赤霉素与植物的生长发育密切, 所以, 植物必须严格地调节体内的赤霉素合成, 主要方式是控制赤霉素合成及分解相关的基因表达。总的来说, 主要的控制点是后期阶段催化GA代谢的3个双加氧酶 (GA20ox、GA2ox和GA3ox) 。GA合成及反应的突变体和外源施加GA研究都表明, GA20ox和GA3ox是催化GA合成的最后两步, GA20ox和GA3ox的表达受GA的反馈抑制, 而促使GA失活的GA2ox表达受GA的反馈激活。其他激素的存在也会影响GA合成酶的表达, 外源油菜素内酯 (BR) 促进GA20ox的表达。与GA处理相同, 低温处理同样能刺激植物的生殖生长和发育。Yamauchi等发现, 4℃低温刺激可极大提高拟南芥发育种子的GA3ox含量。光照会影响植物的块根膨大、发芽和开花等生理过程。Reid等发现, 蓝光和红光处理能快速下调黄化菜豆茎尖的GA3ox基因表达, 以及上调GA2ox基因表达。另外, 光照强度也会影响植物器官对赤霉素的反应。研究已证实, 通过光敏色素 (Phytochome) , 光参与赤霉素的生成及代谢调节。
三、赤霉素的信号传导
总体上, GA信号传导可分为上游识别赤霉素、中游信号转导和下游赤霉素反应基因。近年通过研究GA信号转导过程, 取得了很大的进展, 找到了很多GA信号转导过程的成分, 基本上弄清楚了赤霉素合成的调控机理。利用寻找突变体, 研究人员从大麦、水稻和花生等作物中找到了多个GA信号转导基因。利用作物糊粉层表达系统工具和突变分析找到了某些组分的功能及相互之间的联系。由不同的表型, 可将赤霉素信号转导突变体分为正调控和负调控突变体。正调控成分突变体一般呈现出叶色浓绿、矮化等GA缺乏的表型, 而负调控的突变体则呈现出叶色变淡、植株变高等GA过量的表型。两种突变体皆表现为对GA敏感性降低或不敏感。
利用GFP融合基因和原位杂交技术, 发现DELLA蛋白定位于细胞核, GA的诱导可将其降解。该蛋白对GA诱导的反应非常敏感, 其蛋白含量在GA处理后显著减少。这表明对DELLA蛋白的调控是通过翻译后加工进行而不是由转录调控的, 同时结果也显示, DEL-LA蛋白作为早期赤霉素反应基因的调节蛋白, 其蛋白含量调控赤霉素反应基因的水平。从SLY1和GID2等F-box蛋白调控DELLA蛋白的分解过程, 表明在赤霉素基因信号转导途径中, Ubiquitin参与的蛋白酶体途径发挥了重要的功能。
当无赤霉素信号时, 早期赤霉素反应基因的翻译被DELLA蛋白所抑制。当有赤霉素信号时, DELLA蛋白首先被磷酸化, 接着F-box蛋白鉴别出DELLA蛋白并连接到酶复合体上, 磷酸化的DELLA蛋白与U-biqutin蛋白结合, 最终被26S蛋白酶复合体鉴别并分解。GA早期反应基因因DELLA蛋白的降解而解除抑制, 表现为GA促进植株的生长和发育。除了F-box蛋白和DELLA蛋白, 目前的研究表明, 多种组分参与了GA信号传导, 其中对PHOR1、D1、PKL、SPY、SHI等的研究较深入。综合来说, 除F-box蛋白和DELLA蛋白外, 人们较少研究其他赤霉素信号转导成分, 成分之间的相互关系缺少有效的依据, 难以明确GA信号转导过程中各个成分之间的关系。对GA反应的各个组分间的相互作用进行深入研究, 将各个组分整合成一个完整的网络, 将是未来GA信号传导研究的一个热点。
四、赤霉素的反应基因
通过GA反应基因的表达, GA调节植物的生长发育, 最终实现各种生理机能。有别于GA信号转导成分, 定义赤霉素反应基因为识别赤霉素信号并改变其表达能力的基因。依据表达接受的时间, 赤霉素反应基因分为两种:早期和晚期。GA信号传导中转录因子组分直接调控早期反应基因的表达, 早期反应基因表达的产物也许是转录因子, 可控制晚期反应基因的翻译。研究发现, GAMYB作为一种转录因子, 受赤霉素调节, 可促进大麦糊粉层a-淀粉酶的生成, 外源GA处理后, 在大麦糊粉层中发现GAMYB蛋白含量上升。Woodger等利用酵母双杂交系统寻找到激酶KGM (kinase-associated with GAMYB) , 可与GAMYB互作。KGM作为蛋白激酶的一种, 在大麦糊粉层中可减少GAMYB的作用。目前不能明确的是, 在体内KGM能否使GAMYB磷酸化, 其详细作用还需深入研究。
GLABROUSI (GLI) 作为拟南芥的一个MYB基因, 在表皮毛的开始和分化形成中起着关键作用。GA水平影响拟南芥的表皮毛。在GA缺乏的gal-3中, 叶子不着生表皮毛, 而外源施加GA, 表皮毛的数目又回复。在拟南芥中, 赤霉素同样诱导LFY花芽决定基因的翻译, 由LFY启动子的GOF9元件完成其赤霉素响应。Gocal等的研究表明, 3个拟南芥MYB基因可替换大麦糊粉层中GAMYB蛋白的功能。其中GA可诱导AtMYB33基因在成花过程中表达。研究进一步证实, GOF9元件能与At MYB33结合。研究结果显示, GA可诱导At MYB33的生成, GOF9元件与At MYB33整合引起LFY蛋白的生成, 最终是花芽生成的关键。除此之外, 利用基因芯片、Ogawa等测定了拟南芥gal-3突变体种子萌发中的GA反应基因, 在8200个基因中, 确定了127个GA下调基因和230个上调基因。在GA响应早期, GA上调基因明显超过下调基因数目。
通过对赤霉素的分子生物学研究, 我们已深入理解了植物赤霉素生物合成的过程, 同时利用GA合成与代谢相关的基因控制植物体内的GA水平。通过控制GA合成和代谢基因, 可得到具有不同内源GA水平的转基因植物, 这不仅为阐明GA的反应基因及GA诱导生理反应的分子机制奠定了材料基础, 也为植物育种提供了新的材料和方法。
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信号转导途径 篇9
关键词：当归多糖,K562,信号转导,JAK,STAT
当归是祖国传统医学的“补血”要药,当归多糖(Angelica polysaccharide,APS)是其主要有效成分之一[1]。近年来课题组较为系统的研究了APS对造血系统及恶性肿瘤的作用,发现APS既能促进正常造血,又能抑制白血病细胞增殖并诱导其向红系、粒系等方向分化[2,3],提示APS具有双向调控作用,但其作用机制尚不清楚。在红系血细胞发生中,红细胞生成素(erythropoietin,Epo)刺激造血细胞膜上相应受体起着关键性的作用,研究表明JAK2激酶(janus activated kinase 2)及其下游信号蛋白分子-信号转导和转录激活因子5(signal transducer and activator of transcription 5,STAT5)在EpoR介导的信号转导中起着重要作用[4]。实验应用研究造血生长因子信号转导途径的方法,选择JAKs/STATs通路这一当前细胞因子研究领域的热点,探讨APS参与造血调控的分子机制,为祖国医药的传统理论提供更多的现代生物学实验依据。
1 材料与方法
1.1 当归多糖(APS):
重庆医科大学药学院从甘肃岷县当归中分离、提取与鉴定,纯度>90%,以RPMI-1640培养液配制成所需浓度,过滤除菌备用。
1.2 K562细胞:
K562细胞由重庆医科大学基础医学研究所提供,在含10%小牛血清的RPMI-1640培养液中常规培养,每2～3d换液传代。
1.3 药品与试剂:
RPMI-1640培养基(美国GIBGO公司),小牛血清(杭州四季清公司),抗JAK2(Anti-JAK2)为相对分子质量130kD的抗体;抗STAT5包含STAT5α(Anti-STAT5α)和STAT5b(Anti-STAT5b),相对分子质量分别为94kD和96kD。JAK2、STAT5抗体(CELL SIGNAL公司),PTyr抗体(Santa Cruz公司),β-actin抗体(博士德生物公司),FITC标记山羊抗兔IgG (Santa Cruz公司),IgG抗体(Santa Cruz公司),Epo(Amgen公司),DAB显色试剂盒(中山生物试剂公司),ABC试剂盒(中山生物试剂公司),PVDF膜(美国DUPONT公司),核/浆蛋白提取试剂盒(BioVision公司)。
1.4 Western blot法:
实验分为未加APS常规培养的阴性对照组和加入APS终浓度为200mg/L的APS组,各组K562细胞调节浓度为2×106个/ml培养24h,加入5×103IU/L Epo继续刺激0、2、5、30min,终止反应,离心去上清,用核浆蛋白提取试剂盒裂解细胞,分别提取核、浆蛋白,取每组样品20μl与20μl上样缓冲液充分混匀,100℃煮5min,趁热上样进行SDS-PAGE,恒流15mA,电泳结束后转移到聚偏二氟乙烯印迹膜(PVDF)上,电转2h,恒流250mA。用5%脱脂奶粉37℃封闭PVDF膜1h,加入兔抗人JAK2一抗、STAT5一抗、或β-actin抗体1:500,室温1h后4℃过夜,TTBS漂洗后加入辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG二抗1:500,37℃ 1h。TBS充分洗膜3次,DAB显色。晾干、拍照并采用Quantity One-4.4.0图象分析软件进行图像分析。
1.5 免疫细胞化学技术:
取对数生长的K562细胞分别加入APS终浓度为0mg/L、200mg/L分别作用K562细胞24h,加入5×103IU/L Epo继续刺激5min,终止反应,PBS洗涤3次,每次10min,调节细胞浓度为1×106个/ml,滴片备用。采用ABC免疫细胞化学法检测JAK2、STAT5的分布,DAB显色,步骤参见试剂盒方法进行。每组随机采集8张图片,分析每张图片中未重叠且完整的所有细胞,金盘多媒体病理分析系统(成都电子科技大学金盘公司多媒体图像研究所研制)分析细胞浆和细胞核的阳性灰度值,结果进行t检验。
1.6 免疫荧光显微镜观察:
取对数生长的K562细胞分别加入APS终浓度为0mg/L、200mg/L分别作用K562细胞24h,加入5×103IU/L Epo继续刺激5min,终止反应,4%多聚甲醛固定,3‰ Triton PBS洗涤3次,每次10min,调节细胞浓度为1×106个/ml,滴片。加入兔抗人JAK2一抗、STAT5一抗1:200,室温1h后4℃过夜,3‰Triton PBS漂洗后加入FITC标记山羊抗兔IgG二抗1:200,室温40min,3‰Triton PBS漂洗后甘油封片,立即用荧光显微镜观察并拍照。
1.7 免疫沉淀:
实验分为未加APS常规培养的阴性对照组和加入APS终浓度为200mg/L的APS组,两组K562细胞调节细胞浓度为2×106个/ml培养24h,加入5×103IU/L Epo继续刺激0、2、5及30min,终止反应,离心去上清,PBS洗涤3次,每次10min,用核浆蛋白提取试剂盒裂解细胞,分别提取核、浆蛋白。将裂解产物用抗JAK2、STAT5抗体免疫沉淀后,再用抗p-Tyr抗体做Western blot,方法同上,以检测JAK2、STAT5蛋白的酪氨酸磷酸化。
1.8 统计学分析
所有数据以χ±s表示,采用SPSS 13.0统计软件对APS组和阴性对照组进行t检验。P<0.05为差别有显著性意义;P<0.01为差别具有极显著意义。
2 结果
2.1 Western blot法
APS协同Epo对JAK2的表达影响不大。Epo刺激0min时STAT5两组间未见明显差异,Epo刺激2、5、30min时,APS组细胞核蛋白里的STAT5表达比阴性对照组显著增强,细胞浆蛋白中正好相反(图1、图2,表1)。
从右侧至左:对照组加Epo刺激0min、2min、5min、30min,APS组加Epo刺激0min、2min、5min、30min。From right to left:control group with Epo for 0,2,5,30min,APS with Epo for 0,2,5,30min.
2.2 免疫细胞化学
加入Epo刺激后,JAK2的表达两组差别不明显,但APS组的STAT5明显集中表达于细胞核(图3、图4,表2)。
2.3 免疫荧光显微镜观察结果
加入Epo刺激后,JAK2的表达两组荧光差别不明显,但APS组的STAT5细胞核荧光强于阴性对照组,阴性对照组细胞浆中可见较强的绿色荧光(图5、图6)。
注:各时间点APS组与阴性对照组比较,*P<0.05,**P<0.01。
从右侧至左:APS组加Epo刺激0min、2min、5min、30min,对照组加Epo刺激0min、2min、5min、30min。From right to left: APS with Epo for 0,2,5,30min,control group with Epo for 0,2,5,30min.
A 阴性对照组加入Epo刺激5min;B APS组加入Epo刺激5min。A.24h control group with Epo;B.24h APS group with Epo.
A 阴性对照组加入Epo刺激5min;B APS组加入Epo刺激5min。A.24h control group with Epo;B.24h APS group with Epo.
注:APS组与阴性对照组比较,*P<0.05,**P<0.01。
2.4 免疫沉淀法
用抗JAK2、STAT5免疫沉淀后再行Western blot法,一抗为抗PTyr。可见APS协同Epo刺激的4条酪氨酸磷酸化蛋白带均强于阴性对照组,且APS组Epo刺激2min时JAK2酪氨酸磷酸化明显增强。细胞核中APS组用Epo刺激2min时STAT5酪氨酸磷酸化明显增强,30min时更强。但细胞浆中STAT5却未见酪氨酸磷酸化蛋白带出现(图7,表3)。
从右至左:APS组加Epo刺激0min、2min、5min、30min,对照组加Epo刺激0min、2min、5min、30min。From right to left:APS with Epo for 0,2,5,30min,control group with Epo for0,2,5,30min.
3 讨论
当归作为祖国传统医药的“补血活血”要药,已有数千年的临床应用历史。中医学的气血理论认为“当归能治一切血症,无论是血虚、血滞皆多为主药[5]”。既往研究证实:APS是当归中“补血”或促进血细胞发生的有效成分,APS对小鼠造血干细胞(CFU-S)、小鼠与人髓系造血祖细胞(BFU-E、CFU-E、CFU-GM、CFU-MK、CFU-Mix)的增殖分化有显著作用[2,6],并从细胞生物学水平探讨其机理。迄今为止,APS对血细胞发生调控的分子生物学机理尚不清楚。
细胞信号转导研究已经引起国内外生物学界极为广泛的关注,信号转导的概念已深入到生命科学的各个领域,成为解决许多重要理论及实践问题的基本思路。细胞信号转导通路是细胞对外界刺激产生反应并最终引发特异性生物学效应的有效方式,造血生长因子介导的JAKs/STATs通路是当前信号转导研究领域的热点,多数造血生长因子通过此通路转导信号,调节血细胞的增殖与分化[7]。
在血细胞发生中,Epo介导的JAK2/STAT5信号转导通路起着重要作用。Epo激活EpoR使其形成同源二聚体后,使JAK2蛋白酪氨酸激酶活化,进一步使受体自身的酪氨酸残基发生磷酸化,从而为具有SH(Src homology)结构域的蛋白质提供结合位点,这些锚定位点的蛋白质磷酸化可以激活不同的底物,介导多条信号转导途径:同时活化后的JAK2还可诱导其他蛋白酪氨酸残基磷酸化,如She、SH-PTP1、STAT5等[8],因此,JAK2酪氨酸磷酸化在Epo介导的信号转导通路中是关键环节。实验采用抗JAK2免疫沉淀后,再用抗PTyr行Western blot,以检测APS对Epo诱导的JAK2酪氨酸磷酸化的影响。结果表明:APS作用K562细胞24h,未加入Epo即可看到JAK2酪氨酸磷酸化,当再加入Epo刺激2、5、30min后,可见JAK2酪氨酸磷酸化增强,并且各个时相比对照组均增强。提示APS可能在Epo介导的信号转导过程中增强JAK2的酪氨酸磷酸化发挥重要作用。对于APS作用造血细胞24h,未加入Epo也可看到JAK2酪氨酸磷酸化这一现象的解释,尚不能肯定APS单独应用即能启动JAK2酪氨酸磷酸化,因为实验在用Epo刺激前未使细胞处于饥饿状态,血清中的少量细胞因子可能对细胞增殖有影响。
STAT家族是JAK家族的重要底物,两者构成重要的JAK/STAT信号转导通路。研究证实,EpoR与Epo结合后,通过非受体酪氨酸激酶JAK2激活STAT5诱导血细胞的增殖分化。因此,实验采用抗STAT5免疫沉淀后,再用抗PTyr行Western blot,以检测APS对Epo诱导的STAT5酪氨酸磷酸化的影响。结果表明:APS作用K562细胞24h,未加入Epo在细胞核蛋白中即可看到STAT5酪氨酸磷酸化,当再加入Epo刺激后,可见STAT5酪氨酸磷酸化比对照组相应时相进一步增强。但在细胞浆蛋白中却未见STAT5酪氨酸磷酸化的蛋白条带,这说明在细胞浆中虽然也有STAT5蛋白的表达,却是没有活性的蛋白,起作用的主要是来自于转位入细胞核的发生了酪氨酸磷酸化的STAT5蛋白。
对于APS作用造血细胞24h后,未加入Epo也可看到STAT5酪氨酸磷酸化这一现象的解释,我们认为,虽然尚不能肯定APS单独应用即能启动STAT5酪氨酸磷酸化,因为本实验在用Epo刺激前未使细胞处于饥饿状态,血清中的少量细胞因子可能对细胞增殖有影响,但由于它与对照组相比,STAT5酪氨酸磷酸化程度明显加强,说明即使未加入Epo,在含有血清的培养条件下,APS也能启动STAT5酪氨酸磷酸化。
Epo协同APS使JAK2活性增强,STAT5核转位增多,且核中有活性的STAT5增多这一结果,提示是否持续加入Epo协同APS刺激K562细胞,会出现K562细胞分化至成熟细胞的结果呢?尚需进一步深入细致的研究。这为从天然药物中寻找毒副作用小的肿瘤细胞的诱导分化剂提供了实验依据,也为进一步探明当归多糖促进正常造血的分子机制奠定了基础。
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