对牛弹琴的道理

对牛弹琴的道理（共9篇）

对牛弹琴的道理 篇1

《对牛弹琴》是东汉学者牟融的代表作之一，选自《牟子理惑论》，讲述了战国时期公明仪为牛弹奏乐曲的故事。《对牛弹琴》文言文的道理是什么?

《对牛弹琴》

作品原文

公明仪为牛弹《清角》之操①，伏食如故。非牛不闻，不合其耳矣。

转为蚊虻之声、孤犊②之鸣，即掉尾、奋耳，蹀躞而听③。

《对牛弹琴》词句注释

①操：琴曲。

②犊(dú)：小牛。

③掉尾：牛因听到蚊、虻(牛蝇)的叫声，便摇尾驱赶。

④奋耳：竖起耳朵。牛因听到小牛的叫声，便竖耳细听。

⑤蹀躞(dié xiè)：小步徘徊。

《对牛弹琴》白话译文

有个弹琴能手叫公明仪，他对牛弹奏一首名叫《清角》的琴曲，

牛低着头吃草，就好像没听见任何声音一样。不是牛没有听见，是这美妙的曲子不适合牛的耳朵而已。

公明仪于是变换曲调，弹奏出一群蚊虻的嗡嗡声，还有一只孤独小牛的.哞哞叫声。牛听了，马上摇动尾巴，竖起耳朵，因为不安而小步来回走动。

对牛弹琴的道理 篇2

1 牛蜱的危害及其症状

牛蜱为八节肢寄生虫。牛蜱完全以吸血为主并由此传播疾病, 牛蜱对牛传染或寄生的疾病有:巴贝斯焦虫病、边虫病、泰勒斯焦虫病、Q热和蜱瘫病等。牛蜱的危害活动通常是季节性的, 一般来说, 牛蜱对牲畜的损害直接与寄生数量有关, 当数百个蜱寄生在宿主身上时, 就会引起宿主贫血、消瘦和掉膘。还有一种蜱即称作所谓“多刺”耳蜱的幼虫和若虫专门侵袭牛耳深部并在其内吸食寄生达数月之久, 使牛受到极大的骚扰刺激, 严重感染耳蜱的患牛头部下垂, 猛烈摩擦和摇动耳朵并将头扭向一侧。此外, 雌蜱还产生一种麻痹毒素。

2 牛蜱的生活习性及生命周期

雌蜱吸足牲畜血液时, 开始脱落牲畜, 在地上产卵。蜱卵在草场中的蔽荫处开始孵化, 幼蜱形成后就爬到草上 (群集在牧草尖上) 等候着过往的牲畜, 如有牲畜过往就爬到牲畜体上, 开始吮吸牲畜的血液。蜱在牲畜体上寄食大约两周后, 雌蜱和雄蜱便开始交配, 雌蜱交配后继续在牲畜体上寄食, 到产卵时才从牲畜体上脱落到草场中, 雌蜱产卵后死亡。蜱的成虫阶段为6～14天;若虫阶段为7～11天;幼虫阶段为5～10天。

3 控制牛蜱的策略

不论牲畜的抗蜱程度如何, 如果用化学药剂来扑杀牲畜体上的牛蜱常常是很有效的手段, 但要注意药浴处理必须要在预期的时期进行, 需要考虑下列各方面。

3.1 蜱的季节性变化

由于气温和湿度所引起的季节性牛蜱数量剧增, 在年终时, 余留的蜱数量有可能达到感染牲畜及危害健康的程度。在冬季, 由于干燥、寒冷的气候降低了蜱卵的活力, 在秋末至冬季 (10～1月) 期间内, 吸饱血后从牲畜体上脱落下来的雌蜱所产的卵大多数都不能孵化成蜱, 因此, 从冬季至早春季中 (1～3月) 草场内能感染牲畜的蜱数量由于蜱产卵降低和幼蜱存活率低的因素而大量减少;在初秋 (9～10月中旬) 期间中, 吸饱血后从牲畜体上脱落下来的雌蜱所产的卵是第二年引起感染的主要源头, 因为在该时期中孵化的幼蜱容易隐蔽, 不仅可越冬存活, 而且又能赶上温暖季节的开始, 所以这批幼蜱就成了第二年夏季中的第一繁殖蜱, 因此, 应注意:秋繁殖的蜱即是第二年夏季的繁殖蜱, 冬季繁殖的蜱对第二年夏季没有影响。在春末和夏初, 当气温和湿度增高时, 越冬存活的蜱便开始一代接一代地繁殖, 使夏季和初秋季节中蜱的数量爆增。

3.2 影响牲畜抗蜱能力的因素

牲畜的营养好抗蜱力就高, 反之则下降。在夏末时期中, 蜱的数量不断增加, 而牲畜的营养也在迅速增高, 足以抵抗蜱的感染, 在冬季中, 蜱的数量减少, 而饲料的质量也降低, 因而牲畜的抵抗力也随之降低。

哺犊母牛的抗蜱力比不泌乳母牛的抗蜱力低。在秋季中没断奶的哺犊母牛体上的蜱数量是最多, 这些哺犊母牛的营养不断地降低, 对蜱的自然抵抗力也随之降低。

3.3 牲畜对牛蜱传染的疾病的抵抗能力

在有牛蜱的地区中, 牲畜应当经常保持接触牛蜱, 从而可获得对蜱带来的疾病的免疫力, 如:巴贝斯焦虫病、边虫病和泰勒斯焦虫病, 这是非常必要的。

3.3.1 成熟牲畜的抵抗力

成熟的牲畜能保持较强的免疫力, 不易受到牛蜱传染疾病的感染。尽管在较长时间内不与蜱以及蜱所携带的生物体接触, 牲畜都能完全保持其免疫力。当再次和牛蜱接触时, 这种免疫力可避免蜱带来的疾病的危害。在无蜱期间, 牲畜不再和受感染的蜱接触, 在牲畜血液中也不再带有致病的生物体, 受感染的牲畜在此期间中也不会和蜱接触, 因而那些致病的生物体就不可能转移和扩散。

3.3.2 新生犊牛的抵抗力

当母牛长期不与疾病接触时, 母牛便不能产生足够的抗体来传给其犊牛使犊牛在产后的几个月中不受疾病的危害, 当牛蜱不携带致疾的生物体时, 就无法“强化”犊牛已有的母体免疫力, 因此, 犊牛在产后几个月内母体的免疫力便会逐渐消失, 而在此期间中牛蜱所带的疾病又不断出现, 犊牛便极易受到感染。在牛蜱有效地被控制的情况下, 犊牛很可能在产后的几个月内免疫力得不到发展而消失, 甚至从出生之日起便会受到感染, 一旦这些犊牛和受感染的蜱所接触就立刻感染疾病。这就是在地方性蜱疾病流行的地区中, 小牛蜱疾病周期性爆发的原因。

4 控制牛蜱的措施

4.1 战略性药浴杀虫

这种控制牛蜱的计划注重下列方面:在夏末和初秋季节中, 尽可能清除草场中的幼蜱;在初春季节中进行若干次药浴处理, 以便防止在高温、潮湿的夏季中蜱数量爆增。如果该计划实施正确, 就能减少以后所需的牛蜱控制处理, 但最好能保留一小部分数量的蜱来使牲畜保持其疾病免疫力。

总的策略性药浴计划如下图:

主要的策略性药浴在秋季和春季实施 (A和C) , 另外再做辅助性药浴 (B和D) , 当母牛由于缺乏营养或处于泌乳期中抗病力降低, 容易引起感染时, 就必须做辅助性药浴处理。策略性药浴可减少80%以上的蜱。

策略性药浴的要领:要破坏牛蜱生命的循环, 就只能在牛蜱能产卵前扑杀之, 因此, 药浴必须每隔18～21天进行, 同时还要注意不能有任何一头牲畜漏过药浴处理, 不然那些漏过处理的牲畜就会成为感染其余牲畜的感染源。

秋季药浴处理 (A) 主要是防止牛蜱在春季中的数量增大;春季药浴 (C) 的实施主要是防止越冬存活的幼蜱繁殖后代, 在春秋两季中危害牲畜。一般经过3次药浴处理后即可暂停, 以后如果在牲畜体上又发现有幼蜱附着, 即可着手做进一步的药浴处理。如果每年要减少药浴次数, 而又有效地控制牛蜱, 就必须保证只有尽可能少的牛蜱在春秋两季中能完成其生命循环过程。注意:春秋两季的药浴处理只要看到牲畜体上有附着的幼蜱, 就必须开始做第一次药浴处理。从夏末和冬末开始, 必须加强对牛蜱数量的观察, 要在吸饱血的雌蜱脱落产秋卵或春卵前扑杀之, 每年就只需对畜群做6次除蜱药浴, 或者再加一次泌乳期辅助药浴即可有效地控制牛蜱。

对牛蜱无抵抗力的牲畜, 如西门塔尔牛、荷斯坦牛等欧洲纯血统的牛品种, 在夏末和初秋期间中, 应按上述间隔做3次以上药浴处理 (药浴处理A) 。

有抗蜱力的牲畜, 如婆罗门牛、抗旱王牛等瘤牛血统的牛品种, 只需按上述间隔时期做2次药浴处理。这些有抗蜱的牲畜只是在临冬时其自然抗蜱力降低时才做药浴处理。

如果有抗蜱力的牲畜和易受感染的品种混合放牧, 那么蜱的威胁将比分群放牧更为严重, 因为大量的蜱能在没有抗蜱的牲畜体上完成其生命循环, 并繁殖大量的蜱附着在整个畜群中, 不论对具有抗蜱力或没有抗蜱力的牲畜品种都能产生影响。具有抗蜱力的牲畜不会使蜱能繁殖较高数量幼虫而污染草场, 但混群放牧中不能发挥其较强的抗蜱优势。所以, 合群放牧必须把两个品种同时作为一群来做药浴处理才能收到良好的药浴控制效果, 但药浴次数将会增加。若把两个品种分群放牧在不同的牧区内, 可以在药浴控制牛蜱方面省下一笔可观的开支。

在冬季气候较暖和的地区, 药浴应在初秋开始进行。但是, 由于冬季气候暖和, 大多数冬季蜱卵都能孵化成幼蜱, 有更多的幼蜱能越冬存活。所以秋季药浴处理不能有较地阻止幼蜱越冬存活。在这种地区, 春季的早期除蜱药浴处理是最关键的。在春季两次 (每隔18～21天一次) 关键的药浴处理后, 如果牲畜的抗蜱力由于某种原因而降低时, 还要再做辅助性药浴处理 (B和D) 。

4.2 维持牲畜对牛蜱传染疾病的抵抗力

良好的牛蜱控制取决于对牛蜱数量的仔细观察, 使蜱和牲畜之间能保持平衡, 并能让牲畜和蜱有所接触, 同时还要有效地防止由于过量的蜱所带来的危害。如果牲畜没有立刻丧失抵抗力的危险时, 可暂停在冬季药浴, 因为只有极少数蜱卵能存活到第二年春季, 可以让这极少部分的蜱存活下来。如果蜱数濒临灭绝时, 应谨慎地考虑暂时停止预计的药浴, 让蜱恢复到一定的数量以便强化牲畜的抵抗力。

4.3 草场轮休

停止放牧牲畜一段时期后, 休闲的草场可使蜱的数量降低, 当以后重新放牧时, 牲畜就不容易受到蜱的感染。幼蜱在夏季死亡很快, 如果草场休闲10～12周便能起到“净化”草场的作用, 还能缩减所需要的药浴次数。但是这就要求:不能让离群的牲畜进入休闲草场, 给休闲草场带来新的牛蜱, 也不能让幼蜱在休闲草场中完成其生命循环过程;牲畜在引入休闲草场中放牧前必须做药浴除蜱处理, 以避免污染净化了的休闲草场;在冬季中, 由于气温降低, 蜱的活动也相应降低, 由此冬季休闲草场收不到有效的净化结果, 因为休闲净化草场需要高温和强列的日照。因此, 草场实放轮牧, 应在气温较高的夏季里进行。

4.4 选育抗蜱品种

在有牛蜱的地区中饲养易感染蜱的牛是比较困难的, 有步骤地药浴和草场休闲只是短期的措施, 该措施只能够在蜱对杀蜱剂产生抵抗力之前, 将蜱的数量控制在较低的水平, 但这并非解决牛易感蜱的长远之策。从长远来看, 在强调提高牛生产力的同时, 培育具有抗蜱力基因型的牛种, 才是长久解决牛蜱问题的办法, 这样牛就可以杜绝对化学除蜱药剂的依赖, 离开杀蜱螨剂而生存下去。

抗蜱能力具有较高的遗传力, 并且从一代牲畜遗传给下一代牲畜。如果把具有抗蜱特性的牲畜集中起来作为一个育种群, 并在育种群中精心选育抗蜱特性, 那么就可以获得具有较强抗蜱能力特性的品种。据报道在澳大利亚北部有些具有抗蜱特性的牲畜就是用这种方法培育的, 目前这些牲畜都已不再需要用化学药剂来除蜱。

4.5 生产防蜱传播病的疫苗

对牛弹琴的刷墙营销 篇3

也就是说，营销不似销售，会由市场（销量）来打分，它的取悦对象，是营销团队的上级，领导听了汇报之后是否颔首，是给营销工作定性的最核心指标。于是，在某些时候，营销往往沦为自娱自乐的表演，将彩排视为仪式，把过程当作结果。

一个十分典型的例子，就是近年来愈演愈烈的刷墙活动。

在乡镇及农村的房屋外墙上用油漆刷上广告文案，给予欠缺商业头脑的户主一些小恩小惠，本是中国移动、中国电信这样的运营商一贯热衷于干的事情。向农民施以影响，同时也吸引过往车辆的注意，这种地推手段固然笨拙，但胜在性价比高，且对象精准。

不过，随着互联网行业的竞争加剧，很多公司在制定营销方案时，也将下乡刷墙列为了必要措施。而且，策划者实际上并不在乎传播的落地与跟进，比如京东就曾高调宣称它将在全国156个3-6线城市刷足8000面墙，标语也挺接地气——“发家致富靠劳动，勤俭持家靠京东”——但是当一个人均纯收入不足800元/月的农民（数据来自国家统计局2013年国民经济报告）在京东首页看到平衡车、扫地机器人以及679元低价秒杀的阿迪达斯卫衣等商品时，很难想象他会认同这是一个“勤俭持家”的选择。

难道热衷于对牛弹琴的京东们都是傻瓜？倒也不见得。对这些互联网公司来说，下乡刷墙只是一个跳板，即所谓的“醉翁之意不在酒”，真正意图影响的受众，其实是社交网络上的活跃人口。通过下乡刷墙制造反差性的现象，进而引起讨论和吐槽，争取形成病毒话题，才是它们的目的。

于是，刷墙这一行为，也隐隐催生出了一条隐秘的迷你产业链：农村太远，索性就在大城市的近郊物色适合刷墙的地方，刷完之后赶紧拍照，最后回到写字楼里制作传播物料，而那面刚刚刷过的墙，就已经完成了它的使命。

有人曾在匿名社交App上爆料，在不到1个月的时间里，他将同一面墙先后卖给了6家贪图省事的互联网公司，这家刷完还没过多久，下一家就接踵而至，用油漆重新覆盖一次，周而复始整个流程。

另外，还有一种更为“高大上”的刷墙形式，即出国刷墙。当然，既然到了国外，被刷的墙自然得升级换代，它们不再是萧条乡村里的断壁残垣，而是纽约时代广场上的一块块大屏幕。

时代广场被称为“世界的十字路口”，以繁盛和不夜著称。在很多中国企业眼中，将广告刷到了这座广场上，其象征意义不亚于米哈伊尔·米宁将苏联红军的旗帜插到了柏林议会大厦的屋顶。

更重要的是，时代广场有着超过数千张户外的液晶屏幕，根据地段、面积和可视度，其价格档位也层次不齐。昂贵的屏幕刷不起，找块便宜的屏幕也不是难事，买断一个星期15秒轮播的广告，然后将照片发给几个合作媒体，让后者“惊叹”自己公司的品牌竟然入侵了美国最为寸土寸金的商业广场，于是，一股油然而生的自豪感，就洋溢在了呈递给老板的汇报材料里。

对牛结核病的诊断与防治的探讨 篇4

1 病原

结核分枝杆菌是一种纤细、平直或稍弯曲的杆菌, 属于抗酸性菌。革兰氏染色阳性, 不形成芽胞, 无运动性。本菌有牛型、人型和禽型。牛型主要侵害牛, 其次是人、猪;禽型主要侵害禽、猪、牛, 人也可感染;人型主要侵害人, 牛、猪少见。本菌抵抗力很强, 但对热的抵抗力差, 60℃30分钟即可杀死。在直射日光下2小时死亡。常用消毒药4小时可杀死。

2 流行特点

本病可侵害人和多种动物。潜伏期短的10天, 长的可达数年;病人和患病畜禽是主要传染源, 其痰液、粪尿、乳汁和生殖道分泌物中都可带菌, 污染饲料、食物、饮水、空气和环境而散播传染。本病主要经呼吸道、消化道感染。该病在我区分布较广, 发病与流行不受气候、地形、地貌限制, 以散发为主。

3 临床症状

本病潜伏期长短不一, 一般为10~45天, 长的达数月。通常呈慢性经过。临床上有4种类型。

3.1 肺结核

病牛病初有短促干咳, 随着病程的进展变为湿咳, 咳嗽加重、频繁, 并有淡黄色粘液或脓性鼻液流出。呼吸次数增加, 甚至呼吸困难。病牛食欲下降, 日渐消瘦, 贫血, 产奶减少, 体表淋巴结肿大, 体温一般正常或稍升高。最后因心力衰竭而死亡。

3.2 淋巴结核

多发生于病牛的体表, 可见局部硬肿变形, 有时有破溃, 形成不易愈合的溃疡。常见于肩前、股前、腹股沟、颌下、咽及颈淋巴结等。

3.3 乳房结核

病牛乳房淋巴结肿大, 常在后方乳腺区发生结核。乳房表面呈现大小不等、凹凸不平的硬结, 乳房硬肿, 乳量减少, 乳汁稀薄, 混有脓块, 严重者泌乳停止。

3.4 肠结核

多见于犊牛, 表现消化不良, 食欲不振下痢与便秘交替。继而发展为顽固性下痢, 迅速消瘦。当波及到肝、肠系膜淋巴结等腹腔器官组织时, 直肠检查可以辨认。

4 病理变化

牛结核常见肺脏及局部淋巴结。肺脏的结核病变可分为结核结节和结核肺炎。肺内的结核结节有增生性和渗出性两种, 牛以增生性多见。

增生性结节:早期为灰白色半透明点状或粟粒大、鸡蛋大的圆形结节, 坚实。新鲜的围有红晕, 陈旧的结节失去半透明状态。结核中心出现坏死、干酪化或钙化。结节之间的肺组织充血和水肿, 少数可见细胞浸润。

结核肺炎病变:开始为渗出性细支气管炎或细支气管周围炎, 一般蔓延到肺泡形成小叶性结核, 呈灰黄色乃至灰白色, 易发生脓疱并融解、液化形成空洞。而相临的小叶连成大的肺炎病灶。切面干燥, 呈灰色或灰黄色, 由于大量纤维素渗出物和淋巴球、白血球、红血球聚集而发生干酪样坏死。病灶周围发生充血、水肿。

淋巴结核多属于器官结核周围淋巴结的感染。最常见于支气管、纵膈及肠细膜淋巴结。其它体表淋巴结也可发生。结节多为粟粒大至米粒大, 半球状隆出于切面, 结节为灰黄色、有透明感, 多数结节中心发生干酪样坏死。

5 致病机制探究

结核分枝杆菌在单核细胞中存活与许多基因在单核细胞中被激活有关, 而分枝杆菌致病力与其在宿主体内繁殖能力有关, 但这类基因发现的不多。为研究寻找这些基因, Russell J H等构建启动子检测文库, 将结核杆菌 (H37Rv) 基因片段克隆到Lac Z启动子的上游, 构建成大肠杆菌与结核杆菌之间的穿梭质粒组成文库。将其导入单核细胞中, 检测这些基因片段在单核细胞中被激活后发挥启动子功能。从而筛选到2个基因片段Rv1265 (功能不详) 和Rv2711 (编码铁依赖性抑

制蛋白Encoding the iron-de-pendent repressor protein Ide R) ;早期的研究结果证实, 结核分枝杆菌的一种称为第十八因子的蛋白复合体 (Rpo V) , 其基因发生突变后分枝杆菌致病力减弱;Adrie J C等利用Rpo V在建立的酵母双杂交系统, 筛选鉴定出一个转录调节因子Whi B3, 进一步研究推断Whi B3可通过调控转录影响机体免疫应答功能;Berthet F X等研究了分枝杆菌一种编码36 KD蛋白质的erp基因对细菌繁殖能力的影响, 将分枝杆菌erp gene突变株以及突变回复菌株分别接种到实验动物体内, 结果突变株很快被清除, 而突变回复株在机体内扩散并引起了病变。这说明erp基因对分枝杆菌致病性有决定作用。进一步研究还证实该36 KD蛋白是一膜表面蛋白。这对其作为疫苗侯选分子及研究分枝杆菌致病机制均有重要价值。

6 诊断方法探讨

6.1 抗酸染色法

病料涂片后进行抗酸染色, 显微镜检查抗酸性杆菌, 本菌的细胞壁不仅有肽聚糖, 还有特殊的糖脂, 因为糖脂的影响, 致使革兰氏染色不易着染, 但能抵抗30m L/L酸酒精的脱色作用, 抗酸染色为红色, 常用齐尼二氏 (Ziehl-Neelson) 染色法, 也可用荧光抗酸染色法。如果组织内有抗酸性微生物, 并且具有典型的组织学病变, 则可以做出初步诊断。抗酸染色法阳性率比较低, 但它作为一种传统的检测方法, 具有假阳性率低, 价格低廉, 操作简便等特点, 在牛场中就可进行, 所以仍有一定的实用价值。

6.2 细菌分离培养法

用选择性培养基分离分枝杆菌, 再通过培养和生化试验来鉴定, 也可采用核酸探针和聚合酶链式反应 (Polymerase chain reaction, PCR) 法。如果因培养物污染或其他特殊原因, 可通过豚鼠接种, 再分离鉴定来证实。常用的培养基是罗杰二氏 (Lowenstein-Jensen) 培养基、改良罗杰二氏培养基、丙酮酸培养基和小川培养基。但是, 在上述培养基中, 结核菌需14~15h分裂一次, 这使得病原学检查所需周期长, 一般需10~30d才能看到菌落, 阳性率不高, 所以在实际工作中很少被采用。

6.3 PCR法

PCR技术自1983年发明以来, 显示出了灵敏度高、特异性强、快速等特点, 已经被广泛地用于检测疑似结核病病人的临床样品 (主要是痰液) , 近年来在检测牛结核病方面也有应用。Ritelli M等报道, 将人的一个巨噬细胞系用来从临床样品中分离扩增分支杆菌, 收集培养后的细胞, 再通过半套式PCR检测培养物中牛分支杆菌的特异性插入序列IS6110, 可以确定有没有牛分支杆菌感染。刘思国等根据已经发表的牛分支杆菌的pnc A基因序列, 设计引物可扩增294bp目的片段, 建立了特异性检测牛分支杆菌的PCR方法, 该方法特异性强, 敏感度可达到50pg, 阳性样品符合率为90%, 阴性样品符合率为100%, 而且有利于结果的判定和临床样品的直接检测。

6.4 淋巴细胞转化试验

淋巴细胞转化试验 (Transformation test of lymphocytes) 是测定全血样品对结核菌素PPD抗原细胞反应性。但是这种方法需要从全血中分离淋巴细胞, 需要在复合物组织培养介质中培养这些细胞3~5d, 需要用放射核酸技术检测细胞增殖水平。因为试验耗时而且前期准备以及试验操作都比较复杂, 如需要较长的孵育期和使用放射性核苷酸, 所以在常规的牛结核病诊断中并不被采用, 而仅仅用于野生动物以及动物园动物的检测。

7 预防与控制

奶牛结核病的防治, 主要采取综合性防治措施, 防止疫病传入, 净化污染牛群。

7.1 防止结核病传入

无结核病健康牛群, 每年春秋各进行一次变态反应检疫。补充家畜时, 先就地检疫, 确认阴性方可引进, 运回隔离观察1个月以上再行检疫, 阴性者才能合群。结核病人不能饲养牲畜。加强饲养管理, 确保环境卫生。

7.2 净化污染牛群

污染牛群是指多次检疫不断出现阳性家畜的牛群。对污染牛群, 每年进行4次以上检疫, 检出的阳性牛及可疑牛立即分群隔离为阳性牛群与可疑牛群。剔除阳性牛及可疑牛后的牛群, 应间隔1~1.5个月检疫1次, 连检3次均为阴性者, 认为是健康牛的可放入假定健康牛群。对阳性牛, 一般不作治疗, 应及时扑杀, 进行无害化处理, 对发现的可疑病牛, 要加强监控, 进行隔离饲养观察, 同时复检确诊, 并严格按国家有关规程无害化处理可疑病牛在隔离饲养期间生产的乳:假定健康群为向健康群过渡的畜群, 当无阳性牛出现时, 在1~1.5年的时间内3次检疫, 全是阴性时, 即改称为健康群。

7.3 培养健康犊牛群

对牛弹琴，牛肉更香 篇5

抗生素无益于治疗感冒

很多人习惯于吃抗生素治疗感冒、咳嗽、嗓子痛，但英国政府却禁止医生为小病小灾开抗生素。

英国健康和临床医疗研究所说，消炎药在很多情况下都是没有必要的，它们不但不能有效控制感染，反而容易导致带有超强抗药性的金黄色葡萄球菌等超级病菌的蔓延。

新颁布的行医指南中规定，英国医生不得向患有耳部感染、咽喉肿痛、扁桃腺炎、支气管炎、感冒、咳嗽等轻微病症患者开抗生素。对于这部分病人，医生只能打发他们回家休息，必要时让他们服用一些止痛片。

此前，英国卫生大臣艾伦·约翰逊就曾耗资2．7亿英镑推出一系列广告和宣传活动，专门向人们宣讲服用抗生素无益于感冒和咳嗽的治疗。

对牛弹琴，牛肉更香

据英国《每日邮报》报道，英格兰坎特伯雷乡村从日本引进了一批和牛，这种牛是全世界公认的优良肉用牛品种。为了更好地喂养这些牛，农夫们制订了详细的饲养计划，其中就包括“对牛弹琴”的环节，邀请32岁的小提琴家艾米·沃斯为它们演奏小提琴。当条件不适合演奏时，农夫们就给和牛播放德国作曲家巴赫和贝多芬的CD。饲养者表示，在音乐的氛围中，牛儿显得悠然自得，身体也更加健康，这将有助于优化肉质。

饲养者还会用啤酒喂养这些牛，用特殊的技术给它们按摩，使这些牛的肉质更加鲜嫩。据了解，这种牛在日本时，就能享受类似的待遇。农夫乔纳森说：“音乐能使牛儿放松，在放松的状态下，它们会长得更快更壮，肉质也更鲜嫩。小提琴家也乐于与大自然融为一体，让牛儿享受音乐的魅力。”

常识

肥皂能使湿镜子更清晰

很多人用手或毛巾擦拭湿镜子，但那只能维持几秒钟的效果。因为湿空气很快又在较冷的镜面留下更多小水滴，导致镜中影像扭曲。解决方法是用手指蘸点肥皂或清洁剂，在镜面薄薄抹上一层。肥皂分子会破坏水滴的凝聚力，因此只形成平滑的膜面。这样，光线通过便不受扭曲，影像自然很清楚。

几何学让蛋糕分得更均匀

谁都不希望分到的比别人少。如果你曾在小朋友的派对中分切匹萨或蛋糕，一定很清楚这种心理。要分给４人或８人很容易，只要从中间对切再对切，必要时再将每一份一分为二即可。但如果是３人或６人呢？光凭肉眼可不容易分辨，这要靠几何学来帮忙：先从中心到边缘切一刀，用刀子量出半径。沿边缘，每隔半径之长就切一片，总共可切出６片；若隔两个半径之长切１次，则可切成３等份。

心理

奖牌颜色和幸福指数

美国康奈尔大学研究组调查1992年巴塞罗那奥运会时取得银牌和铜牌的选手们的幸福度，用电视转播看选手们的表情，以此调查情感状态。比赛结束的瞬间，取得银牌的选手的幸福度是满分10分中的4.8。相反，获得铜牌的选手则是7.1分。也就是说第3名比第2名幸福。在颁奖典礼上，铜牌获得者的幸福指数是5.7分，比银牌获得者的4.3分高。为什么会出现这样的情况？

因为银牌获得者的基准是金牌，而铜牌获得者的基准是没有奖牌。前者比起获得银牌的喜悦，没能获得金牌的伤感要占上风，但是后者光是拿到奖牌就已经非常高兴。对成就的满足感就是这样相对性的。这也可称作是幸福的相对原理。有句古语也说“人要看着比自己差的人，光看比自己好的人的话一生都会非常艰难和不幸”。

而事实上，世界第2名、第3名已经是非常好的成绩了，不是么？

对牛弹琴造句 篇6

1、有一次，我和妈妈逛街。突然看到一妇女对一位看起来只有5岁的小女孩派发宣传单，并向小女孩介绍产品的特点。那小女孩一脸茫然。我扯了扯妈妈的衣角，说：“妈妈，这是对牛弹琴吧?”

2、周末我跑到小区去找小朋友做游戏。游戏前我认真地给她们讲游戏规则，可她们怎么也听不明白。我生气地说：“简直就是对牛弹琴!”说完我气冲冲地回家了，这个周末真郁闷!

3、爷爷看到弟弟很挑食，就给他讲过去他过着多么悲惨的生活。弟弟听了不但没有受到启发，反而哈哈大笑，我觉得爷爷简直是在对牛弹琴。

4、一天，妹妹问我一道数学题，我发现可以用比例知识解，于是就跟她说怎么做。过了一会，我才想到：妹妹才读二年级，根本不懂什么叫比例，看来我是对牛弹琴了。

5、我在电话里用英语跟爷爷奶奶问好，爸爸走过来说：“你这不是对牛弹琴吗?爷爷奶奶根本不懂!”

6、放长假的前一天，老师对我们说的任何一句话，都是对牛弹琴，同学们的心思早就放在了玩上了。

7、妹妹说她想听我念一首诗，我才念到一半妹妹就走人了。唉，我真是对牛弹琴啊。

8、校长经常对我们说不能去网吧，可对一些沉迷网吧的人来说，简直是对牛弹琴。

9、星期天，酷爱篮球的我早早坐在了电视机旁，等着观看NBA，其间我不禁对妹妹津津有味地讲起了姚明、科比，可妹妹瞪着一双茫然的眼睛看着我。哎，真是对牛弹琴!

10、我实在气不过，所以明知是对牛弹琴，白费唇舌，我还是说了。

11、每当妈妈骂我家的那只大花猫偷吃东西的时候，猫总是东摇摇，西晃晃，根本听不进去。看着妈妈骂得那么起劲，我心想，这不是对牛弹琴嘛!

12、今天阿姨有事出去了，让我照顾两岁的小表妹。刚开始，小表妹还很乖，后来又哭又闹，我使出千方百计逗她笑，唱歌跳舞，弹琴讲故事，连小丑也做了，可最后我不得不承认，我所做的一切，都是在对牛弹琴。

13、上个星期，我让爸爸带我去吃牛扒。我怎么恳求，怎么央求，他根本听不进去，我简直是对牛弹琴。

14、你这场演讲内容应很精采，遗憾的是对牛弹琴，我们都听不懂。

15、为什么我那么生气……我讲的话根本就是在对牛弹琴嘛。

16、说了一大堆，结果对方什么都没听懂，真是对牛弹琴，浪费热情。

17、同桌江贤军叫我给他讲故事，我滔滔不绝地给他讲，可等我讲完后问他时，他却连什么内容也不知道，真是对牛弹琴。

18、如果我识就好噜老师唔使对牛弹琴。

19、妈妈让我给一岁多的小表妹曼姿讲故事，可曼姿却什么也不懂，这不是对牛弹琴吗?

20、我很喜欢唱歌，生日那天，我决定为朋友们献上一曲，可她们却在商量买什么吃，真是对牛弹琴。

21、我们班的李阳同学很不讲卫生。为此，我多次写信劝说他注意保护环境，可是他依然我行我素。我真是在对牛弹琴啊。

22、你的有情人在哪里?最可怕的对牛弹琴!没有共同的价值标准!

23、有时看到儿女回应的冷漠，为人父母的真以为在对牛弹琴。

24、爸爸对我说有关公司人事配制问题，我听了半天都不懂，他觉得是在对牛弹琴。

25、对这些人讲道理，无异对牛弹琴，得另想办法才行。

26、唉!我跟他谈贝多芬，他跟我谈微积分，无非对牛弹琴而已。

27、我根本不懂抽象画，害你浪费这么多时间来对牛弹琴，真正抱歉。

28、邻居阿姨家的孩子不吃饭，阿姨哄他也不吃，喂他也不吃，阿姨说多了，那“调皮鬼”干脆转过头去，让阿姨在那上演“对牛弹琴”，你说气死人不?

29、你未免太木G了吧!难怪你老婆会说跟你说话像对牛弹琴。

30、擅长下象棋的叔叔突然心血来潮要教我下棋，当他给我讲完下棋的乐趣和道理后，便问我：“你明白了吗?”我摇了摇头，叔叔叹了一口气说：“哎，真是对牛弹琴啊!”

31、你这话诚然有理，()但待我回去向他们转述，可得对牛弹琴了。

32、周末，我给阿姨三岁的女儿讲解超声波是什么，结果搞了半天，她还是一头雾水，真是对牛弹琴。

33、敢情当初我在鸡同鸭讲，对牛弹琴?

34、我白花了一下午时间跟他谈电影艺术，简直是对牛弹琴。

35、看完《钢铁是怎样炼成的》这本书之后，我心潮澎湃，有好多话想找个人倾诉。可一看旁边，只有一个家伙-正在上一年级的弟弟。跟他讲?那不是对牛弹琴吗。

36、我是个电脑迷。每当我上网时，老爸老妈想把我叫下网，那简直是对牛弹琴。

37、放暑假的前一天，老师对我们说，放假要注意安全呀，要多看书呀，不要到处玩呀……可这时对我们来说，都已是对牛弹琴了，因为同学们早已心不在焉了。

38、爸爸又给我请了个钢琴老师，每天晚上教我弹一个小时的钢琴，其实，对于我这个爱好篮球的人来说，这不是对牛弹琴吗?

39、跟这种人讲道理，就好像对牛弹琴，别再浪费口舌了。

哲理故事：对牛弹琴 篇7

战国时期，有一个大音乐家名叫公明仪，弹得一手好琴。他无论走到哪里，总是琴不离身，闲下来时，弹奏一曲，便觉得心神舒畅。有一天，他独自一个人在郊外散步。他走着走着，看见一头牛在那里吃草。他觉得这头牛很寂寞，他就开口对牛说道：老黄牛啊老黄牛，你真可怜啊，一个人在这里，也没人理你，不过，你不用怕，我给你弹一首曲子，给你解解闷儿。

于是他就放下琴，先弹了一支《清角之操》。牛只是低着头只管吃草，一点也不理会。公明仪失败了，他想了想明白了：那支曲调太高深了，不是牛听不到琴声，而是琴声不适合它的耳朵啊！于是他又另外弹了几支曲调，一会儿好像蚊子嗡嗡地叫，一会儿又好像小牛哞哞地叫。这样一弹，那头牛就摇着尾巴，竖起耳朵，草也不吃了，回转身子踱着小步，慢慢地走来，留心地倾听。

【大道理】：

弹琴的姑娘 篇8

主持人：小博士

[开开心心——阅读]

不论清早、夜晚，我在这条长长的胡同里，有时往东，有时往西，走着，走着的时候，老是听到寓所斜对面高楼的窗口里，传出一阵阵好听的琴声——叮咚!叮咚!叮叮咚咚……

那楼窗口挂着的橘红色的窗帘，倒很凑趣，不时地飘出窗口，仿佛是它把好听的琴声像恭送尊贵的客人似的送了出来。

春天的日子多雨，常常淅沥淅沥地下着，只要琴声一响，雨点就轻松活泼起来，轻轻细细地洒在树叶上，洒在马路上，洒在行人的雨伞上，也洒在人家关着的玻璃窗上……洒得长长的胡同里稀湿稀湿，耀出一片亮光来。它们多么淘气啊，跳着快乐的集体舞，跟着琴声的节拍——叮咚!叮咚!叮叮咚咚……

我老是在想，这个弹琴的人是谁呢?

夏天的黄昏，屋子里还滞留着一股热气。人们都到街头、湖滨、广场、公园里去乘凉，然而在那摇曳着荷绿色窗帘的窗口里，仍然不断地传出好听的琴声——叮咚!叮咚!叮叮咚咚……

我在长长的胡同里走着，听着，想着，钦佩着这个弹琴的人，“拳不离手，曲不离口”啊!

秋天天高气爽。晴朗的夜里，月牙儿分外清明。它悄悄地挂在树梢头，静静地倾听着悠扬的琴声。顽皮的星孩子们，一刻不停地眨着眼睛，逗着那个弹琴的人。可是像夜莺般的、流水般的琴声，却一直从荡动着橘黄色的窗帘的窗口里传出来——叮咚!叮咚!叮叮咚咚……

我赞美着这个弹琴的人，“锲(qiè)而不舍”啊!

冬天的寒夜，有时刮风，有时飘雪。我夜深回来，走进这条长长的胡同，没遇见过一个人，可是一阵熟悉的、使人感到安慰的琴声，却来迎接我这个风雪夜归人——叮咚!叮咚!叮叮咚咚……

我感谢这个弹琴的人。

日子过得飞快，不是几天、几星期、几个月，而是整整的一年了吧，这“叮咚!叮咚!叮叮咚咚……”的琴声，仿佛一直在耳朵旁边响着，它从来没有缺席过。

“谁在弹琴呢?弹琴的又是谁呢?”我非常非常地想知道，并且想见一见弹琴的人。

一天，音乐界的一位朋友，给我捎来了一张入场券。那晚上所有歌唱的、弹奏的都是好手，每一节目演完，鼓掌声都像春天的春雷，夏天的阵雨。到了最后一个节目了，那是第三次的钢琴独奏。一个年纪小小的、脖子上还系着红领巾的小姑娘，每支曲弹完，谢幕总是欲罢不能地一次又一次。

我疑惑，这琴声那样的优美、轻松，有甜味儿，却又是那样的亲切、熟悉，如逢故友。“难道弹琴的就是她?”

事情真凑巧，隔了半个月，有一个黄昏，我刚从街东口进来，又听到了琴声，就踏着“叮咚!叮咚!叮叮咚咚……”的拍子，走得真轻快。忽然琴声陡地停住了，我不知不觉地快走到自己家门口了，猛抬头一看，在那窗口挂着紫色窗帘的楼下，一个脸蛋儿俊秀的、似曾见过一面的、脖子上系着红领巾的小姑娘，她扶着一个头发已经全白、臂弯里挟着一叠琴谱的老教师走了出来。

我愣住了。“原来就是她!”

我才回到家里，刚在书桌旁坐下来，“叮咚!叮咚!叮叮咚咚……”的琴声，又响了起来，传进我的耳朵里，灌注到我的心里。

“好好学习，天天向上!”我禁不住虔诚地、默默地祝福这个勤学苦练的弹琴的好姑娘。

[一丝不苟——答问]

1.读一读，写一写。

拳不离手 曲不离口

_______. _______.

勤学苦练 锲而不舍

_______. _______.

2.按原文内容填空。

春天的日子多雨，常常()地下着，只要琴声一响，雨点就 ()起来，()地洒在树叶上，洒在()，洒在 ()上，也洒在人家关着的()……

3.文章对窗帘、雨点、月亮和星星进行了人格化的描写，选择你喜欢的几句抄写下来，再体会其表达效果。

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4.请你仔细阅读文章，并体会其在表达顺序上有什么特点。

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5.“叮咚!叮咚!叮叮咚咚……”这样的描写在文章中多次出现，请你体会作者为什么这样写。

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6.用波浪线画出描写小姑娘外貌的句子，再说一说为什么这些句子在文章的最后出现?

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7．如果这个“勤学苦练的弹琴的好姑娘”就站在你面前，你想对她说什么?

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对牛弹琴的道理 篇9

1 材料

DMEM、Opti-MEM、胎牛血清和马血清,购自Gibco公司;p MD18-T、XhoⅠ、NotⅠ、Bam HⅠ、HindⅢ、LA Taq DNA聚合酶、T4 DNA连接酶、SYBRPrime ScriptTMRT-PCR KitⅡ,购自宝生物工程(大连)有限公司;Dual-Luciferase Reporter Assay System,购自Promega公司;TRIzol试剂、Lipofectamine 2000 Reagent,购自Invitrogen公司;Endo-Free Plasmid Mini kitⅡ,购自Omega公司;Plasmid Mini kitⅠ、Gel Extraction KitⅠ,购自北京Trans Gen生物技术有限公司;EDU试剂盒,购自广州锐博公司。

2 方法

2.1 牛骨骼肌卫星细胞的分离、培养、鉴定及分化

分离培养的牛骨骼肌卫星细胞取自双城牛场荷斯坦牛后腿,用PBS冲洗后将其剪成肌糜(约1 mm3),用PBS反复吹打,静置1 min;去掉漂浮组织,1 000 r/min离心10 min;取肌糜沉淀物,添加0.2%胶原酶Ⅺ30 m L,37℃水浴摇床(110 r/min)消化1 h;向消化液中加入40 m L PBS对胶原酶进行稀释,吹匀后移入离心管,1 000 r/min离心10 min;弃上清液,向沉淀中加入PBS反复吹打,1 000 r/min离心10 min,重复3次;弃上清液,向沉淀中加入0.25%胰蛋白酶30 m L,37℃水浴摇床(110 r/min)消化30 min;向消化液中加入40 m L PBS对胰酶进行稀释,吹匀后移入离心管,1 000 r/min离心10 min;弃上清液,向沉淀中加入PBS反复吹打,1 000 r/min离心10 min,重复3次;弃上清液,取沉淀用PBS重悬,取悬液经400目筛网过滤后移至离心管中,1 000 r/min离心10 min;弃上清液,向沉淀中加入PBS反复漂洗,1 000 r/min离心10 min,重复3次;弃上清液,用生长培养液(高糖DMEM培养基+20%胎牛血清+10%马血清+5%青/链霉素+1%两性霉素B)重悬细胞,接种并置于37℃、5%CO2的培养箱中培养1 h,贴壁细胞为pp1。未贴壁细胞悬液加入同等体积PBS吹打混匀,1 000 r/min离心10 min;弃上清液,加生长培养液重悬,将悬液移入新培养瓶中继续培养2 h,贴壁细胞为pp2。从pp2开始连续4 d每隔24 h都向未贴壁的细胞悬液加入同等体积PBS,吹匀,1 000 r/min离心10 min;弃上清液,加生长培养液重悬,分别记为pp3~pp6,pp1~pp5弃掉不用,pp6培养5 d后换液,以后每隔36 h更换细胞培养液并在倒置显微镜下观察细胞生长情况。待细胞汇合度为90%时进行传代培养。待培养瓶中的细胞生长密度为80%~90%时,弃去培养液,用37℃预热的PBS温和清洗3遍,加入适量0.25%胰酶消化。显微镜下观察绝大多数细胞变圆时,加入含有血清的培养液终止消化,按比例进行传代培养[5]。

2.2 mir-133b过表达载体的构建及转染

根据mir Base数据库中牛的mir-133b前体序列,设计引物扩增含前体及两端侧翼序列共203 bp的片段。引物由上海生工生物技术服务有限公司合成。引物序列:Sense primer 5'-CCCAAGCTTGGA-CACACCAAGAATCCTCGC-3'(下画线部分为HindⅢ酶切位点和保护碱基);Antisense primer 5'-CGCGGATCCACAGCCCATCCTAAAATCCCTAC-3'(下画线部分为Bam HⅠ酶切位点和保护碱基)。

将PCR产物克隆到p MD18-T载体上,双酶切鉴定测序,将测序正确的重组质粒p MD18-T-mir-133b和pc DNA3.1(+)用Bam HⅠ和HindⅢ双酶切,胶回收后将上述203 bp的片段和pc DNA3.1(+)酶切片段连接、转化。挑取阳性克隆提取质粒,PCR和双酶切鉴定重组质粒,鉴定结果正确的重组质粒命名为pc DNA3.1(+)-mir-133b,构建图谱见图1。

用Omega去内毒素质粒提取试剂盒提取验证正确的重组质粒pc DNA3.1(+)和pc DNA3.1(+)-mir-133b,用Lipofectamine 2000 Reagent转染接种在6孔板里细胞汇合度为70%的牛骨骼肌卫星细胞,48 h以后用TRIzol试剂提取总RNA,用超微量分光光度计进行RNA定性和定量检测,-80℃冰箱保存,备用。

2.3 茎环Q-PCR检测mir-133b的表达

pc DNA3.1(+)和pc DNA3.1(+)-mir-133b转染牛骨骼肌卫星细胞48 h后,用TRIzol试剂提取总RNA,用Bio Te Ke super RT kit试剂盒反转录c D-NA。以反转录c DNA为模板合成第2条链。mir-133b茎环逆转录引物:5'-CTCAACTGGTGTCGTG-GAGTCGGCAATTCAGTTGAGTAGCTGGT-3'。反转录过程:取Total RNA或Poly(A)5μL,50μmol/L Oligo d T或Random Primer 1μL,d NTP Mixture(10 mmol/L each),20μmol/L mir-133b Stem-loop Primer 1μL,加Rnase Free H2O至14μL;65℃5 min,冰上急冷。在上述PCR管中加入5×firststrand Buffer 4μL,200 U/μL M-Mu L V Reverse Transcriptase 1μL,Rnase Inhibitor 1μL,50℃50 min,70℃10 min,冰上冷却,得到c DNA。取反转录好的c DNA为模板进行PCR扩增,mir-133b引物序列为:上游引物5'-TTTGGTCCCCTTCAACCA-3',下游引物5'-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3'。内参β-actin引物序列为:上游引物5'-GAACGGT-GAAGGTGACAGCAGT-3',下游引物5'-TTATTA-GAGAGAAGCGGGGTGG-3'。PCR反应条件:95℃2 min;95℃15 s,60℃40 s,共45个循环;95℃15 s;60℃1 min;95℃15 s,收集荧光强度。数据采用2-ΔΔCt法进行分析,ΔCt=CtRNA-133b-Ctβ-acti,比较miRNA-133b在2株细胞间的表达差异时,按ΔΔCt=ΔCtpc DNA3.1(+)-mir-133b-ΔCtpc DNA3.1(+)计算;反映转染后mirRNA-133b表达变化时,用ΔΔCt=ΔCtmRNA-133b-ΔCtControl计算[6]。

2.4 EDU检测转染mir-133b后对细胞增殖的影响

用Omega去内毒素质粒提取试剂盒提取验证正确的重组质粒pc DNA3.1(+)和pc DNA3.1(+)-mir-133b,用Lipofectamine 2000 Reagent转染接种在12孔板里细胞汇合度为70%的牛骨骼肌卫星细胞,48 h以后EDU试剂盒进行检细胞测增殖。

2.5 mir-133b的靶基因预测及双荧光素酶报告基因试验验证

利用Miranda和Target Scan算法预测mir-133b的靶基因为sp1(转录因子),设计并合成靶基因sp13'-UTR区域含mir-133b作用位点及突变的一段序列,分别在5'加XhoⅠ的酶切位点和保护碱基,3'加NotⅠ的酶切位点和保护碱基,引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。具体序列如下:上游引物5'-CCGCTCGAGATTCTGTGACCAAAATACCTT-3',突变上游引物5'-CCGCTCGAGATTCTGTCTG-GTAAATACCTT-3',下游引物5'-ATAAGAATGCG-GCCGCGTGCAAGAAGCTGATCCC-3'(单下画线部分为酶切位点和保护碱基,双下画线部分为靶位点突变碱基)。

上述PCR产物经过纯化连接到p MD18-T载体,转入DH5α感受态细胞,摇菌扩增,提取质粒进行NotⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定,回收纯化目的基因片段。用NotⅠ和XhoⅠ双酶切psi CHECKTM载体,将回收目的基因连接入上述酶切后的载体,转入大肠杆菌,挑取单克隆,进行PCR扩增,同时提取质粒进行NotⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定。提取酶切鉴定正确的克隆送上海生工生物工程技术服务有限公司测序,测序正确的质粒命名为psi CHECKTM-2-211-UTR和psiCHECKTM-2-211-T-UTR,构建过程见图2。

将处于对数生长期的He La细胞接种于96孔细胞培养板,24 h后贴壁细胞达70%汇合率时用Lipofectamine 2000 Reagent转染:1)pc DNA3.1(+)-mir-133b;2)pc DNA3.1(+)-mir-133b和psiCHECKTM-2-211-T-UTR进行共转染;3)pc D-NA3.1(+)-mir-133b和psi CHECKTM-2-211-UTR进行共转染。对照组为1)pc DNA3.1(+)-mir-133b。测定细胞荧光素酶表达量,所有试验均重复3次。

2.6 Q-PCR检测mir-133b过表达后靶基因的表达变化

引物合成通过NCBI等网站找到sp1的3'UTR区域扩增出跨1个或者多个内含子的片段,片段长度在80~150 bp之间。引物序列:Sense primer 5'-TCGTCAGCGTCCGCGTTTT-3',Antisense primer 5'-AGGCACCACTACCATTTCCATT-3'。内参用β-acti引物。取对数生长期细胞转染pc DNA3.1(+)和pc DNA3.1(+)-mir-133b 48 h,提取总RNA进行反转录,然后进行实时定量PCR检测。

2.7 统计分析

采用SPSS14.0软件对所得表达数据进行单因素方差分析,并进行统计分析,数据以±s表示,两样本均数间的比较采用t检验,P<0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 重组质粒pc DNA3.1(+)-mir-133b的构建及鉴定结果

在重组质粒pc DNA3.1(+)-mir-133b的构建过程中,pc DNA3.1(+)空载体为5 428 bp,重组质粒pc DNA3.1(+)-mir-133b通过Bam HⅠ和HindⅢ限制性内切酶双酶切被切成2个片段:大片段约为5 428 bp,小片段约为203 bp,外源序列插入成功(见图3)。pc DNA3.1(+)-mir-133b过表达载体测序结果证明目的片段序列与预期大小一致,成功地克隆到pc DNA3.1(+)表达载体中。

3.2 茎环Q-PCR检测mir-133b的表达

待牛骨骼肌卫星细胞在6孔板里汇合度为70%左右时,转染pc DNA3.1(+)-mir-133b过表达载体组和对照组pc DNA3.1,48 h以后收集细胞,Q-PCR结果表明,mir-133b的表达水平显著升高,与对照组相比增加了470倍,差异显著(P<0.05),见图4。

3.3 EDU检测转染mir-133b后对细胞增殖的影响(见228页彩图5)

过表达载体pc DNA3.1(+)-mir-133b和对照组pc DNA3.1(+)转染牛骨骼肌卫星细胞48 h后进行EDU检测增殖变化,经计算,转染pc DNA3.1(+)有21.3%的细胞增殖(见228页彩图5 A,B,C),转染pc DNA3.1(+)-mir-133b有39.3%的细胞增殖(见228页彩图5 D,E,F)。pc DNA3.1(+)-mir-133b与对照组相比增殖率为45.8%。

3.4 mir-133b的双荧光素酶报告基因试验验证

重组质粒psi CHECKTM-2-211-UTR和psiCHECKTM-2-211-T-UTR的鉴定结果表明:psiCHECKTM-2空质粒为6 273 bp,重组质粒psiCHECKTM-2-211-UTR和psi CHECKTM-2-211-T-UTR(突变靶位点)通过XhoⅠ和NotⅠ限制性内切酶双酶切,被切成2个片段,大片段约为6 273 bp,小片段约为211 bp,外源序列插入成功。psi CHECK-TM-2-211-UTR和psi CHECKTM-2-211-T-UTR靶基因载体测序结果证明目的片段序列与预期一致,成功地克隆到psi CHECKTM-2表达载体中(见图6)。

将牛骨骼肌卫星细胞接种在12孔板,汇合度为70%时,分别转染过表达载体pc DNA3.1(+)-mir-133b,pc DNA3.1(+)-mir-133b和psi CHECKTM-2-211-UTR进行共转染,pc DNA3.1(+)-mir-133b和psi CHECKTM-2-211-T-UTR进行共转染。每个试验组分别独立重复3次,检测荧光素酶活性,结果表明,pc DNA3.1(+)-mir-133b和psi CHECKTM-2-211-UTR这组荧光素酶活性明显下降,见图7。

3.5 Q-PCR检测mir-133b过表达后靶基因的表达变化

在牛骨骼肌卫星细胞中过表达mir-133b 48 h以后,用Q-RT-PCR检测sp1(转录因子的表达水平),结果表明,sp1表达量显著显著下降,进一步说明sp1是mir-133b的靶基因,见图8。

4 讨论

研究表明,miRNA对肌肉发育过程起着重要的调节作用。mir-1和mir-133最初于2003年从人和小鼠肌肉组织中克隆鉴定[7,8,9],是肌肉特异性的miRNA[10,11]。J.F.Chen等[12]2006年研究发现mir-1和mir-133在骨骼肌细胞分化成熟过程中呈现一定的时空特异性表达,其中mir-1促进骨骼肌分化,而mir-133则抑制分化而促进成肌细胞增殖,结果显示了两者与骨骼肌的发育存在显著的调节作用。

miRNA mimic是针对成熟miRNA序列特殊设计的,是用化学方法合成制备的双链RNA模拟物,仅需将mimic直接转染到细胞中,模拟内源性成熟miRNA的表达,继而增强其调控靶基因的作用,进行功能获得性(gain-of-function)研究。该方法具有快速、简便的特点,但是不能长期稳定发挥作用,价格较贵。pre-miRNA是最先运用的miRNA过表达技术,化学合成的pre-miRNA制备快捷,可以标记荧光等。但是缺点是制备的RNA稳定性较差,容易降解。而且由于制备的RNA较长,合成时难以避免错误(当合成RNA超过60 bp时,出现一个碱基错误率约30%),转录制备的pre-miRNA稳定性较好,但无侧翼序列的结构,现在很少应用。以质粒载体形式的pre-miRNA也因为发现miRNA两侧的flank对于miRNA表达产生重要作用,现在已经开始被primiRNA取代。人工pri-miRNA效果较pre-miRNA好,但这种人工miRNA采用小鼠固定的mir-155的flank,其产生成熟miRNA的表达效率不及原始天然的miRNA,现已较少使用。pri-miRNA的克隆来自miRNA基因本身的文库,由于保留了每个miRNA独自的原始天然双臂结构,效果更好,成为近些年首选方法。因为成熟的miRNA序列只有22 bp左右,但是转录产物pri-miRNA序列上、下游会有一定数目的碱基参与形成pre-miRNA的茎环结构,所以在构建miRNA表达载体时,应保留pre-miRNA序列两侧各100~400 bp的碱基侧翼序列,通常为200 bp左右。典型的miRNA表达载体应包括启动子、premiRNA、侧翼序列及转录终止信号[13]。本试验构建的真核表达载体以100 bp多为侧翼序列进行克隆mir-133b,pc DNA3.1(+)-mir-133b转染牛骨骼肌卫星细胞24 h后,成熟mir-206的表达与pc D-NA3.1(+)空载体相比差异极显著。

5 结论

研究结果表明,mir-133b在牛骨骼肌卫星细胞中,的确具有促进牛骨骼肌卫星细胞增殖的作用,通过双荧光素酶报告试验验证了在牛骨骼肌卫星细胞中,sp1为mir-133b的直接靶基因,本试验证明了在物种牛中,mir-133b有促进细胞增殖的作用,为进一步研究mir-133b在牛体内的作用提供了依据。sp1为mir-133b的直接靶基因,而sp1下游控制基因还有待进一步研究。

A.转染pc DNA3.1(+),EDU增殖;B.转染pc DNA3.1(+),DAPI染细胞核;C.A、B叠加;D.转染pc DNA3.1(+)-mir-133b,EDU增殖;E.转染pc DNA3.1(+)-mir-133b,DAPI染细胞核。F.D、E叠加。

摘要：为了探讨mir-133b对牛骨骼肌卫星细胞增殖的影响,试验将分离培养的牛骨骼肌卫星细胞接种在6孔板中,待细胞汇合度为70%时,用Lipofectamine 2000转染mir-133b的过表达载体进入牛骨骼肌卫星细胞,48 h后实时定量检测RNA表达水平,并用EDU试剂盒检测细胞增殖状况,实时定量PCR检测mir-133b的靶基因sp1的RNA表达情况。结果表明:在牛骨骼肌卫星细胞中,作EDU增殖过表达mir-133b以后细胞增殖数量显著增多。说明mir-133b对牛骨骼肌卫星细胞增殖具有促进作用。