北虫草素（精选7篇）
北虫草素 篇1
摘要：目的 研究腺苷和虫草素在北虫草子实体各部位中的分布和总含量。方法 用RP-HPLC法分别测定北虫草子实体头部、中部、底部及全部子实体中腺苷和虫草素含量。结果 ①1号样腺苷和虫草素的含量顺序为头部>底部>中部;总量顺序为中部>头部>底部。2号样腺苷分布规律没有明显变化, 但各部位虫草素含量均有所改变, 顺序为底部>中部>头部, 总量顺序仍为中部>头部>底部。②两种样品的腺苷总含量没有明显差异, 但2号样虫草素含量几乎是1号样的2倍。结论 北虫草子实体各部位中腺苷和虫草素的分布以及总含量均有明显不同。
关键词：北虫草子实体,HPLC,腺苷,虫草素
北虫草又名蛹虫草[Cordyceps militaris (L.) Link], 为麦角菌科虫草属的模式种, 具有抗菌、抗肿瘤、调节机体免疫力等功能[1]。它与冬虫夏草同属不同种, 研究发现北虫草和冬虫夏草的活性成分相似, 其中腺苷和虫草素的含量比冬虫夏草还要高[2,3]。鉴于野生冬虫夏草资源短缺, 价格昂贵, 因此, 开发利用北虫草具有广阔的市场和发展前景。目前, 人工培育北虫草技术已很成熟, 其培育方法有3种:一是将北虫草菌接种在蛹体上, 长出子实体。二是将北虫草菌接种在大米、玉米、小麦等固体培养基上, 长出子实体。三是液体培养北虫草菌丝体[4]。人工培育的北虫草子实体和菌丝体已成为医药和保健品开发利用的主要原料。
北虫草含有多种生理活性物质, 其中核苷类物质如腺苷、虫草素等是研究较多的活性成分。腺苷具有很好的生理和药理作用[5]。据报道, 美国已将虫草素作为抗癌、抗病毒新药进入临床试验, 我国由虫草素合成的治疗白血病新药也已进入Ⅰ期临床阶段[6], 虫草素作为新药用于临床已为期不远。由于虫草素的合成存在一些问题[6], 因此, 从北虫草子实体或菌丝体中提取虫草素将成为药物原料的重要来源之一。为此, 我们有必要对北虫草子实体中活性成分的分布和含量有比较清楚的了解, 以便更好地开发和利用它们。本实验拟选择腺苷和虫草素为活性成分指标, 以大米培养基培育的北虫草子实体为样本, 来考察两种成分在子实体不同部位的分布和含量。
1 仪器与材料
1.1 仪器
Agilent1260型高效液相色谱仪 (美国安捷伦公司) ;K Q-400KDB型高功率数控超声波清洗器 (昆山市超声仪器有限公司) ;台式离心机 (Eppendorf, Centrifuge, Germany) ;电热恒温鼓风干燥箱 (上海跃进医疗器械厂) ;电子天平 (Sartorius, Germany) ;中药粉碎机SZJ-8100 (青岛索优电器有限公司) 65目标准样筛 (上海分样筛厂) ;冰箱 (BCD-208F, Haier) 。
1.2 样品和试剂
北虫草子实体1号样、2号样和培养基由江苏学府生物工程有限公司提供。腺苷标准品购自中国药品生物制品鉴定所, 批号:110879-200202, 虫草素标准品由江苏学府生物工程有限公司赠送。色谱试剂均为色谱纯, 甲醇购自TEDIA, USA。
2 方法
2.1 色谱条件
色谱柱ZOXBAX Eclipse XDB-C18 (4.6 mm×250 mm, 5 mm) ;二极管阵列检测器 (DAD检测器) , 柱温30℃;流动相:水-甲醇 (85∶15) , 流速1 m L/min, 检测波长260 nm, 进样量20μL。
2.2 虫草标准品的确认
虫草素标准品经过紫外和核磁共振分析, 并通过省级成果鉴定, 其标准品的含量达到98%以上 (苏科鉴字[2005]第529号) , 进一步纯化后, 经中国医科院药物鉴定所分析, 其纯度达到99.65%, 并获得科技部创新基金项目支持, 达到量产水平 (项目编号06C26213201077) , 该产品已供应到中国药品生物制品检定所。
2.3 标准曲线制备
分别配制浓度为0.5 mg/m L腺苷和虫草素标准液, 等量混合, 得标准储备液。取储备液0.1 m L、0.2 m L、0.4 m L、0.8 m L、1.6 m L、3.2 m L和4.8 m L, 以纯净水稀释定容至10 m L (浓度范围为2.5~120μg/m L) , 过0.45μm膜, 进样。记录峰面积, 分别以浓度为横坐标 (X) 、峰面积为纵坐标 (Y) 绘制标准曲线, 得出回归方程。
2.4 样品溶液制备及测定
分别取北虫草子实体1号样、2号样头部、中部、底部、全草和培养基粉。取样方法为顶端膨大的孢子头为头部, 靠近培养基的部分为根部, 其余中间部分为中部, 分别称重, 计算各部分重量百分比。将样品在80℃烘2h, 然后粉碎, 过65目筛。取样0.06 g, 精密称定, 分别加水2 m L, 48℃超声60 min, 5000 r/min离心30 min, 留上清, 在沉淀中加水2 m L, 同上超声, 如此重复3次, 合并3次提取的上清, 过膜, 进样。每种样品做3份平行样。记录峰面积, 根据标准曲线的回归方程计算样品中腺苷和虫草素的浓度。样品含量 (mg/g) =样品浓度×稀释倍数/样品重量。样品某部位活性成分总量 (%) =部位总量/全草总量×100%
2.5 加样回收率
准确称取已知腺苷或虫草素含量的北虫草子实体0.2 g, 分别加入腺苷或虫草素标准品低、中、高三个剂量, 每个剂量做3份平行样。然后按“2.4”项下制备供试品溶液的方法制备所需溶液, 进行HPLC法分析, 分别计算腺苷加样回收率以及虫草素加样回收率。
3 实验结果与讨论
本实验色谱条件参照文献[7]略加改进。我们曾对水-甲醇流动相的比例进行了考察, 结果测得在水:甲醇=85∶15及90∶10两种比例下, 分离效果并无大的差别, 考虑到对仪器和系统的保护, 选取水-甲醇 (85∶15) 为流动相。
3.1 标准曲线的绘制
在本色谱条件下, 测得腺苷的保留时间为6.9 min;虫草素为8.9 min (图1) 。在2.5~120μg/m L浓度范围内, 标准曲线呈线性关系, 计算得腺苷回归方程:y=30962x+1.4829 (R2=0.9998) ;虫草素回归方程:Y=63637X+68.271 (R2=0.9996) 。
3.2 样品提取方法的考察
刘小莉等[7]研究发现以纯水作为提取剂, 60℃超声50 min时提取效率最高, 重复3次可完全提取。考虑到本实验所用的北虫草是以大米作为培养基的, 培养基粉在温度超过50℃时容易变稠, 故选择48℃超声。通过对超声时间 (50 min、60 min、70 min) 的考察, 发现超声60 min时提取效率最好。
3.3 加样回收率
3.3.1 腺苷加样回收率
分别加入样品中腺苷含量一半的80%、100%和120%低、中、高3个加入量, 结果见表1。3个腺苷加样量的平均加样回收率 (n=3) 分别为98.0% (RSD=0.66%) 、102.5% (RSD=1.9%) 、99.9% (RSD=1.3%) , 平均加样回收率 (n=9) 为100.1% (RSD=2.3%) 。
3.3.2 虫草素加样回收率
分别加入样品中虫草素含量一半的80%、100%和120%低、中、高3个加入量, 结果见表2。3个虫草素加样量的平均加样回收率 (n=3) 分别为100.8% (RSD=0.9%) 、98.3% (RSD=0.3%) 、101.1% (RSD=1.5%) , 平均加样回收率 (n=9) 为100.0% (RSD=1.6%) 。
3.4 腺苷和虫草素在北虫草子实体中的分布
分别测定1号样、2号样头部、中部和底部腺苷和虫草素的量, 计算每克样品的含量和每个部位的总量占全草总量的百分比, 由此考察含量分布和总量分布, 结果见表3。从表中可知, 1号样头部腺苷和虫草素的含量均高于中部和底部, 含量顺序为头部>底部>中部。然而, 由于中部在全草中所占的重量比最大, 因此中部腺苷和虫草素总量最多, 总量顺序为中部>头部>底部。2号样头、中、底部腺苷的含量和总量分布规律与1号样的相似;但虫草素的分布发生了很大变化, 各部位含量均升高, 底部升高最多, 为头部的2倍多, 含量顺序变为底部>中部>头部。但各部位虫草素总量与储存一年的趋势仍然是一致的, 即总量顺序仍然为中部>头部>底部。
注:与头部比较, *P<0.05, ***P<0.001
张倩等[8]报道人工培育北虫草在不同生长时期各部分虫草素含量顺序是在不断变化的, 即上部的含量随培养时间延长而增加, 下部的含量则在下降, 60 d时含量高低顺序是上部、中部、下部。而腺苷含量培养初期上部最高, 下部最低, 60 d时, 各部位间没有差异了。因此采收时期不同, 可能分布不同。另外, 与该文报道的相比, 我们取的底部比例很小, 中部很大, 因此取样方法不同也可能有影响。
3.5 北虫草子实体中腺苷和虫草素的总含量
测定全草中腺苷和虫草素的总含量。结果显示两种样品中腺苷含量虽有差异, 但无显著性 (表4) 。虫草素含量差异较大, 2号样几乎是1号样的2倍, 差异有极显著性 (P<0.001) (表4) 。这两种样品从外观上看, 1号样呈橘色, 头部膨大数量较多, 中部呈细柱状, 底部微白;2号样呈褐色, 头部膨大数量较少, 中部呈粗扁状, 底部略黑。显然是不同品种的北虫草。其活性成分的含量差异可能与菌种来源、培养方法[9]、培养条件[9]、生长时间[8]、保存时间[10]等有关。
注:与1号样比较, ***P<0.001
3.6 北虫草培养基中腺苷和虫草素的含量
本实验还对培养基中腺苷和虫草素含量进行了测定, 结果为腺苷 (6.242±0.129) mg/g, 虫草素 (1.238±0.042) mg/g, 表明培养基中含有腺苷和虫草素。我们早在1995年就从培养基中提取虫草素获得成功, 并通过省级成品鉴定[11,12]。从培养基中提取虫草素将是北虫草开发利用的重要途径之一。
4 结论
本实验结果表明北虫草子实体不同部位的腺苷和虫草素的分布是不同的;不同品种或不同来源的北虫草子实体中上述成分的总含量亦存在差异。上述结果对开发利用北虫草子实体具有重要的指导意义。
辽宁北虫草的发现与发展 篇2
北虫草的发现
1986年8月。沈阳市农业科学研究所食用菌研究室在沈阳野生食用菌资源调查中, 于沈阳棋盘山水库北岸林地中发现9枚野生的北冬虫夏草, 并对采集的子实体进行分离、驯化, 经过多年的研究, 北冬虫夏草的人工栽培、工厂化生产获得成功。
北虫草的发展历程
1992年辽宁省食用菌专业协会二位副会长李春艳、李鸿相和高级农艺师陈国卿三位专家抱着远大理想, 下决心要把这一新的营养源和药源推向世界、造福人类。为开发虫草事业他们从原来的岗位上下海, 来到沈阳军区后勤部的沈阳古德凯特生物技术有限公司。同年8月2日, 在沈阳举办第一期“北虫草人工栽培技术培训班”。从此拉开了人工栽培北虫草的序幕!四年之后, 1996年中国食用菌协会、辽宁省食用菌专业协会在沈阳召开了“中国香菇北冬虫夏草研讨会”。北冬虫夏草人工栽培在中国部分省市地区逐步展开。
为了更好的利用棋盘山野生虫草资源、应用现代生物工程技术对北虫草进行驯化和培植;发挥人工北虫草在医药和保健方面的作用。1994年4月沈阳棋盘山生物工程研究所成立。主要负责虫草菌种的选育、栽培技术研究。同时在人工北虫草药效成分的稳定性方面、在努力提高人工虫草的营养和药用成分含量方面做了大量的工作
为了开发具有中国特色的功能食品、保健品和药品, 老一代从事虫草的科技工作者先后与辽宁中医学院、留美博士国凤荣, 德国波恩大学药学院博士、博士生导师刘珂教授等单位及专家, 自1993年开始对面虫草免疫功能尤其是对肿瘤免疫方面的药理研究和临床经验, 从“扶正祛邪、增效减毒”等方面对人工培养的子实体进行了系统的化学、药理、毒理研究。分别参与了国家863计划《新药—药材》北虫草的课题研究和国家1035重点科技攻关项目《创新药物》“一类抗癌新药”的研究。
北虫草的医疗保健作用
据《本草从新》和《药性考》对冬虫夏草“保肺益肾、止血化痰”“秘精益气、专补命门”及《新华本草纲要》对蛹虫草“益肺肾、补精髓”等功效记载, 研究表明, 虫草含有虫草素、虫草多糖、虫草酸、腺苷、尿苷和SOD (超氧化物歧化酶) 等多种活性成分。经过对北虫草的化学、药理、药效及临床应用等方面的研究, 结果表明人工驯培的北虫草其药用成分中虫草多糖、虫草酸的含量比野冬虫夏草高, SOD和虫草素的含量分别高出冬虫夏草的3倍和5倍;各种维生素含量均比野生的冬虫夏草高出几倍至几十倍。其中维生素E、维生素B1、维生素B6的含量高出百倍。氨基酸总量高出冬虫夏草4.7倍。这为在营养滋补和药用的开发利用上提供了重要的科学信息。从而解决了虫草资源匮乏的问题, 为我国开辟了一个新的营养源和药源。
虫草素是一种具有抗菌活性的核苷类物质, 对核多聚腺苷酸聚合酶有很强的抑制作用。抑制癌细胞的生长, 并有降血糖的作用, 对人体的内分泌系统、神经系统也有调节作用。
虫草多糖是一种高度分枝的半乳甘露聚糖, 它能促进淋巴细胞转化, 提高机体的免疫功能, 增强机体自身抗癌、抑癌的能力。
虫草酸 (D-甘露醇) 可以显著地降低颅压, 促进机体新陈代谢, 因而使脑溢血和脑血栓病症得到缓解, 能改善人体微循环系统, 促进毛细血管的扩张及软化, 具有明显的降血脂作用, 还具有镇咳、祛痰、平喘的功效。
SOD (超氧化物歧化酶) 可以消除机体内超氧自由基, 具有抗衰老、抗癌抑癌的作用。
虫草含有丰富的蛋白蛋和18种氨基酸, 其中包括人体必需的8种氨基酸, 种类齐全, 数量充足, 具有维持正常发育和保健功能。
沈阳人要在虫草产业上为人类再做贡献
沈阳是北冬虫夏草栽培技术的发源地。是世界范围内最先开展北冬虫夏草人工栽培的。这是沈阳人对人类健康产业的伟大贡献!近年来, 虫草产业已成为某些地区发展经济, 脱贫致富的主要支柱产业, 使部分农民摆脱了贫困, 达到小康, 有些甚至正在迈向富裕。虫草产业对农村经济发展具有重要的经济意义和社会意义, 同时也具有广阔的应用前景。2009年3月16日中华人民共和国卫生部根据《中华人民共和国食品卫生法》和《新资源食品管理办法》的规定, 批准蛹虫草为新资源食品, 更进一步鼓舞了广大生产者的积极性。
蛹虫草中虫草素的研究与开发进展 篇3
1 虫草素的药理作用
Cunningham等[2,3]于1951年发现昆虫组织如被蛹虫草寄生则不易腐烂,经研究从中分离出虫草素。之后,众多学者对虫草素进行了研究,证实虫草素具有抗肿瘤、抗菌、抗病毒、抗炎、免疫调节、改善新陈代谢、清除自由基等作用[4,5]。Kodama等[6]研发的以虫草素为主要成分的新药已在临床上试用于白血病的治疗,具有良好的临床应用前景。目前虫草素的研究正成为药物化学、抗衰老、美容、保健品等领域中极其热门的一部分。
2 虫草素的开发
2.1 虫草素的生产
2.1.1 虫草素的固体发酵法。
虫草素虽然可以经生物合成获得,但由于反应时间长、产量低、排放大量对人体有害的有机溶剂而不常用,通过虫草菌丝体人工培养一直是国内外的研究热点。万涛等[7]通过正交旋转组合试验,确定蛹虫草固体发酵虫草素的最佳培养基配方为水料比1.1 m L/g,营养水中酵母膏的用量为22.6 g/L、蛋白胨的用量为6.0 g/L、葡萄糖的用量为25.4 g/L,KH2PO4的用量为2 g/L,Mg SO4的用量为0.5 g/L,营养水p H值6.6。通过正交试验,确定蛹虫草固体发酵虫草素的最佳环境条件为:光照强度4 400 lx,每日光照时间18 h,温度18~22℃。按照上述优化的培养基配方和环境条件进行固体发酵生产虫草素,经过大约13 d的培养,培养基中虫草素的含量可达到0.60%以上。与传统液体发酵方法相比,利用蛹虫草固体发酵虫草素的最高产量比普通液体发酵的最高产量高近2倍,并且生产周期缩短2 d。
2.1.2 虫草素的液体发酵法。
国内外虫草素的制备主要通过液体发酵法获取。MAO XB等主要从培养基质方面对利用液体发酵获取不同含量虫草素进行研究,发现以葡萄糖为碳源时虫草素产量最高,当葡萄糖的浓度为40 g/L时虫草素的产量可达到262.7 mg/L,当葡萄糖的浓度超过55 g/L时对虫草素的合成反而不利;以酵母提取物和蛋白胨的混合物为氮源,其比例为3∶1时虫草素产量可以达到最大;在培养基中添加铵离子的浓度为40 mmol/L时虫草素含量最大,当浓度超过160 mmol/L后虫草素的含量明显下降。万涛等[7]主要从培养条件方面对蛹虫草液体培养生产虫草素进行相关研究,发现p H值为4,培养方式为振荡培养8 d和静置培养16 d相结合,摇床转速为150 r/min,温度为25℃时虫草素的产量最高。DAS等[8]主要从菌种方面对虫草素的液体发酵进行相关研究,发现虫草素的分泌与菌株特性有很大关系,G81-3高产突变菌株在合适的培养基中虫草素的产量比传统野生型产量提高72%,达到8.6 g/L。
2.2 虫草素的分离及纯化
虫草素的分离纯化方法主要有离子交换树脂法、超临界萃取技术和活性炭吸附法。毛宁等[9]对利用离子交换树脂分离纯化虫草素的工艺条件进行了研究,发现选择合适的离子交换树脂对虫草素的分离纯化过程非常重要,选择吸附能力较强及吸附量较多的树脂可以有效提高蛹虫草中虫草素分离纯化的效率和产率。超临界萃取法是以CO2作为超临界流体对虫草素进行分离纯化,超临界技术具有操作温度低、分离效率高、无毒、无溶剂残留、无二次污染、不损害活性天然成分的结构等优点,但是这种方法所得虫草素的含量较低,成本较高[10]。Cuuningham等[2,3]采用活性炭对经过过滤的蛹虫草培养液进行吸附,再将培养液进行洗脱和浓缩,得到虫草素晶体。此种方法适用于分离水溶性物质,操作简单,成本低,但吸附选择性差,产率较低。
2.3 虫草素的分析检验
目前,主要采用薄层色谱法(TLCS)、高效液相色谱法(HPLC)、TLCS-HPLC联用法以及高效毛细管电泳技术(HPCE)对蛹虫草质量指标(甘露醇、虫草多糖和虫草核苷)进行测定。1994年刘静明等[11]采用薄层色谱扫描法(TLCS)分离和测定蛹虫草和冬虫夏草中的虫草素含量,发现冬虫夏草中尿苷、腺苷、腺嘌呤、虫草素、尿嘧啶含量分别为0.045%、0.031%、0.008%、0.007%、0.006%;蛹虫草菌丝中平均含量分别为0.048%、0.027%、0.009%、0.025%、0.009%,经过对比发现蛹虫草菌丝中虫草素含量和冬虫夏草中虫草素的含量相近。1994年解军等[12]采用高效液相色谱法(HPLC)定性定量测定天然冬虫夏草中虫草素含量,发现HPLC具有灵敏度高、重复性好,对流量和温度变化不敏感等优点,但其成本高。与之相比,TLCS灵敏度虽不及HPLC,却具有展开时间短,显色方便,价格较便宜等特点。因此,许多学者开始采用TLCS-HPLC联用法来获取虫草素,如贡成良等[13]采用薄层扫描分析和HPLC定量分析来测得蛹虫草子实体中虫草素含量,根据HPLC定量分析得知:冬虫夏草中虫草素的含量为1.036%±0.042%,人工蚕蛹虫草中虫草素的含量为3.059%±0.046%,蚕蛹虫草中虫草素的含量明显高于天然冬虫夏草[14,15,16]。
2.4 虫草素及其衍生物研发现状与前景
目前,美国已将虫草素作为抗癌、抗病毒新药尽心临床试用,我国也将其用于白血病的临床治疗中。当前以虫草素及其衍生物为原料的产品开发均是以蛹虫草子实体或菌丝体为原料的开发,主要在茶、酒、膨化食品、中药、口香糖、调味品等市场,以纯虫草素为原料的产品开发较少。因此虫草素及其衍生物有巨大的开发价值和广阔的市场前景[17,18,19]。
摘要：虫草素是冬虫夏草和蛹虫草中主要活性成分之一,具有抗菌消炎、抗肿瘤、降血脂、清除体内自由基等方面的药理作用。该文介绍虫草素的药理作用,并总结其开发研究进展。
沈阳市北虫草产业现状与发展 篇4
一、北虫草产业的发展现状
北虫草是北冬虫夏草的简称, 也叫蛹虫草或蛹草, 是虫与菌结合的药用真菌, 主要生长在我国北方海拔1200米的丘陵地区。经现代医学研究证实, 北虫草含有丰富蛋白质和氨基酸, 富含30多种人体所需微量元素, 是上等的滋补佳品。自1986年8月沈阳市农科院师生进行野外科学考察在棋盘山发现北虫草以来, 沈阳市农科院、沈阳农业大学以及辽宁省食用菌协会的专家学者进行多年研究和努力, 成功探索出一套先进的北虫草产业化人工栽培技术。1992年8月, 沈阳市举办首届“北冬虫夏草人工栽培技术培训班”, 拉开人工栽培北虫草的序幕, 并以沈阳为中心逐渐推向全国, 打破了冬虫夏草垄断市场的局面。经过中国科学院沈阳应用生态研究所对北虫草产品进行的毒理学、药理和药效检验, 证明沈阳市人工栽培的北虫草营养成分和药用成分可与天然虫草媲美, 属于食药兼用产品。2009年国家卫生部发布3号公告, 批准北虫草为新资源产品。
近年来, 沈阳市北虫草产业发展态势良好, 目前全市已拥有沈阳中天生物有限公司、沈阳聚鑫北虫草菌业有限公司等生产、研制和开发北虫草产品的企业20余家, 研制和开发出北虫草冲剂、虫草茶等10余种高中低档系列产品, 栽培农户由当初几户发展到现在近2000户, 年产北虫草干品4000余吨, 占全国总量的64%, 年产值8亿元左右, 产品现已出口到美国、日本等十几个国家和地区, 初步形成“协会+基地+栽培户+生产加工企业”的发展模式, 逐步向产业化、标准化、规模化方向发展, 已经具备了做大做强的良好基础。
二、存在问题
虽然北虫草人工栽培的开发和利用前景十分看好, 产业发展也具规模, 并取得良好的经济效益和社会效益, 但让“小虫草”成为大产业, 仍然存在着一些亟待解决的困难和问题。
1. 行业管理松散, 生产经营不规范
目前沈阳市北虫草产业的发展主要是由农户自发形成的, 栽培基地遍布各涉农区、县 (市) , 其中除于洪、浑南、大东等几个地区发展较快、已形成一定规模外, 其他地区基本还属于零星发展, 栽培户彼此间联系松散、各自为战, 没有形成拳头。尽管沈阳市于2011年1月成立北虫草产业协会, 但缺少运作资金, 会员也仅占全市栽培户的50%, 并且缺乏科学规范的管理机制和统一协调的质量监督机制, 还没有发挥出引导行业依法竞争、维护正常市场秩序等作用, 导致农户间竞相压价销售、以次充好等无序竞争现象屡见不鲜, 个别农户甚至把栽培用过的营养基、塑料膜等随意堆放, 既造成环境污染, 又滋生有害细菌, 给产业链恶性循环埋下极大隐患。
2. 企业实力较弱, 辐射能力不强
据调查, 在沈阳市北虫草产业链条中, 企业与农户尚未形成“利益共享, 风险共担”联结机制, 70%以上的企业存在产品粗加工多、科技含量低、市场竞争力不强等问题, 还不具备开拓市场、引导生产、加工销售、提供服务等综合功能, 特别是有些企业仍扮演着原料生产者和成品加工者的“双重”角色, 与栽培农户间的产销衔接不够紧密, 导致北虫草产品始终不能实现订单生产, 其价格也只能随行就市, 无法获得较高和稳定的经济收入。目前, 沈阳市北虫草产品价格一直徘徊在每公斤150元左右, 而被收购到南方市场经分级分检、小袋包装等简单工序后, 售价则高达每公斤3000元。
3. 宣传推广滞后, 销售渠道不宽
调查中发现, 沈阳市一些地区对北虫草产业发展前景认识不足, 政策扶持力度不大, 特别是宣传推广工作比较滞后, 市民对北虫草食药用价值的认知度普遍不高, 产品也鲜有人问津, 没有形成稳定的本地消费群体, 也未能建立起自己的产地市场, 造成北虫草产品销售渠道过于狭窄, 80%以上的北虫草产品只能通过中间商运往南方的批发市场进行销售。虽然沈阳是当前全国最大的北虫草产品生产地区, 但始终摆脱不了“出大力, 流大汗, 挣小钱”的尴尬境地, 无法形成真正的竞争优势, 严重制约了产业发展壮大。
4. 品牌意识淡薄, 产品保护不力
沈阳是北虫草的发现地, 自然条件和技术条件非常适合北虫草的人工栽培, 北虫草产品在国内也一直享有较高的声誉。然而由于品牌意识淡薄、缺乏有效的品牌保护机制, 特别是国家地理标志产品认证滞后, 近年来沈阳市北虫草产品的市场地位每况愈下, 不仅经常被冠以其它地区产品出售, 甚至被一些不法商贩用劣质产品假冒沈阳市北虫草牟取暴利。尤其值得关注的是, 目前省外一些城市和鞍山、铁岭等省内一些地区都在积极发展北虫草产业, 不但发展势头迅猛, 而且有些地方正加紧运作北虫草地理标志产品认证, 一旦认证成功, 必将给沈阳市北虫草产业发展带来无法估量的损失。
三、发展建议
1. 加快地理标志认证, 提升产业竞争实力
地理标志产品被喻为城市的“经济名片”, 有利于提高农产品竞争力。沈阳是北虫草的发现地, 也是北虫草人工栽培技术的发源地, 申请北虫草地理标识产品认证既是情理之中, 也当之无愧。目前, 沈阳市已拥有辽中鲫鱼、永乐葡萄等6个以产地命名的国家地理标志农产品, 但还没有以“沈阳”命名的国家地理标志产品, 如果“沈阳北虫草”能正式获得国家质检总局认证, 将会及时填补这一空白。建议政府有关部门充分认识北虫草品牌保护的重要性和紧迫性, 尽快将北虫草国家地理标识产品认证工作纳入重要议事日程, 立争早日获得国家认证。通过地理标志保护, 不断扩大沈阳市北虫草产品的影响力, 努力提升北虫草产业的整体竞争力。
2. 发挥行业协会作用, 促进产业健康发展
实践证明, 行业协会对推动产业整体进步、营造良好外部环境以及促进产业长远健康发展, 都具有不可替代作用。市有关部门要切实增强责任感和使命感, 深入调查研究, 创新工作思路, 加大对北虫草产业协会扶持力度, 积极引导协会规范运作程序, 统一产品质量标准, 提升产业服务功能, 提高农户组织化程度, 不断完善农户、企业和市场之间的产业化链条, 切实维护正常市场秩序, 推动产业安全生产、守法经营和依法竞争, 促进北虫草产业健康有序发展。
3. 大力培植龙头企业, 实现企业农户双赢
没有龙头企业对众多农户的有效带动, 产业链条就可能会中断, 产业发展就可能受阻, 无法实现企业与农户共赢。为此, 一方面全市各级部门要不断加大龙头企业的扶持力度, 完善产业、财政、金融、税收等方面的优惠政策, 积极指导企业制定科学的发展规划, 明确发展方向和重点, 加强科技研发和自主创新, 努力培育知名品牌, 切实提升精深加工能力, 不断提高市场占有率, 加快推进龙头企业做大做强, 另一方面要正确引导龙头企业与农户建立更加紧密的利益联结机制, 通过合同联结、服务联络等形式, 建立和完善互惠互利、利益共享、风险共担和共同发展的运行机制, 最终实现龙头企业和农户“双赢”。
4. 切实加强宣传推广, 扩大产品知名度
北虫草素 篇5
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验材料
蛹虫草子实体由大连生物技术研究所生产,自然干燥后60℃恒温干燥4h,用粉碎机粉成60目备用。大孔树脂(ML-7)购于上海摩速科学器材有限公司。
1.1.2 试剂
虫草素、腺苷标准品购于Sigma公司。无水乙醇、甲醇、盐酸、氢氧化钠等均为国产分析纯,购于沈阳市联邦试剂厂。
1.1.3 仪器
紫外分光光度计(上海天美科学仪器有限公司UV1102);高效液相色谱仪(Agilent1100型);红外光谱仪(美国PE spectrum-400型);离心机(上海安亭科学仪器厂);超声波破碎仪(宁波新芝生物科技有限公司JY92-2D);微波炉(格兰仕MI-2270M型);多功能提取罐(上海顺仪科技EX-TE103型);旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂RE-52AA型);真空冷冻干燥机(日本大川原制作所SF-02型)。
1.2 方法
1.2.1 色谱条件
色谱柱C184.6×250mm;Agilent 1100紫外可变波长检测器;波长259nm;流动相:水:乙腈=95:5;流速:1.2ml/min;柱温:30℃。
1.2.2 不同温度不同乙醇浓度提取虫草素和腺甘含量比较
分别取蛹虫草子实体粉末3g,按1:20的料液比加入到水、20%、40%、60%、80%、90%浓度的乙醇溶液中,分别在30℃、45℃、60℃、75℃四个不同温度下水浴搅拌提取2h,过滤,重复提取2次,合并滤液,65℃减压浓缩至10ml左右,离心,取上清液用HPLC测定虫草素和腺甘含量。
1.2.3 不同提取方法虫草素含量比较
1.2.3. 1 恒温水浴提取法:
分别取蛹虫草子实体粉末3g,按1:20的料液比加入到水、20%、40%、60%、80%、90%浓度的乙醇溶液中,在45℃恒温条件下水浴搅拌提取2h,过滤,重复提取2次,合并滤液,65℃减压浓缩至10ml左右,离心,取上清液用HPLC测定虫草素含量。
1.2.3. 2 超声波提取法:
分别取蛹虫草子实体粉末3g,,按1:20的料液比加入到水、20%、40%、60%、80%、90%浓度的乙醇溶液中,用超声波(超声功率200W)提取30min,过滤,重复提取2次,合并滤液,以下同上。
1.2.3. 3 微波提取法:
分别取蛹虫草子实体粉末3g,,按1:20的料液比加入到水、20%、40%、60%、80%浓度的乙醇溶液中,用微波(低档)提取1min,过滤,重复提取2次,合并滤液,以下同上。
1.2.4 大孔树脂处理方法
参照刘红锦等方法[5]进行处理。
1.2.5 虫草素纯化方法
1.2.5. 1 虫草素提取:
将蛹虫草子实体粉200g(过60目筛),放入5L的多功能提取罐中加入4 000ml 80%的乙醇溶液,在45℃的恒温条件下搅拌加热2h,过滤、沉淀部分重复提取2次,分批次浓缩提取液至无乙醇,离心除杂,水定溶至200ml溶液。
1.2.5. 2 加样、洗脱
在25℃条件下,将树脂柱底部的阀门打开流速调至1滴/s,树脂柱上层水滴至1㎝高度时,用滴管顺管臂慢慢地加入温度20~25℃的样品,做到不冲床,上样量视柱体吸附情况,当样品流到树脂柱底部2㎝左右时,用纯净水洗柱除去杂质,然后利用甲醇梯度(浓度在5%~20%之间,每5%为一个基点)洗脱溶液逐级洗脱,洗脱液2~3倍,收集甲醇洗脱液。
1.2.5. 3 收集、结晶
洗脱液用20ml试管收集,每管12~15ml,检测、收集有虫草素的部分,减压浓缩,4℃静止析出晶体,经无水乙醇重结晶及低温冷冻干燥,得虫草素晶体。
1.2.6 纯化虫草素样品和虫草素标准品的比较
1.2.6. 1 紫外光谱比较法:
分别称取5mg纯化虫草素晶体和虫草素标准品,用50%乙醇溶解,利用紫外分光光度计扫描二者的紫外吸收光谱,扫描范围为200~400nm,扫描精度为1nm,比较二者的紫外吸收光谱。
1.2.6. 2 红外光谱比较法:
分别取1mg纯化虫草素晶体和虫草素标准品,与100mg干燥溴化钾混匀、研细、压片,然后在波数为4 000~400cm-1下扫描,比较二者的红外光谱。
2 结果与分析
2.1 不同温度不同乙醇浓度提取虫草素含量比较
分别取北冬虫夏草粉3g,按1:20的料液比在不同温度、不同乙醇浓度条件下水浴提取,采用HPLC法测定其虫草素含量,结果见图1。
从图1结果可以看出,采取同一温度、不同乙醇浓度提取,对虫草素的含量影响较大,在0(水)到80%乙醇范围内,随着乙醇浓度的提高,虫草素的含量逐渐增大,乙醇浓度在80%时虫草素的含量最高,当乙醇浓度达到90%时虫草素的含量反而降低;而在乙醇浓度一定时,采取不同温度提取对虫草素的含量也有一定影响,但各试验组均以45℃提取的虫草素含量为最高。
2.2 不同温度不同乙醇浓度提取腺苷含量比较
不同温度不同乙醇浓度条件下水浴法提取腺苷含量比较,结果见图2。
从图2结果可以看到,采取同一温度、不同乙醇浓度提取,对腺苷的含量影响较大。其中,以水提取腺苷的含量为最高,随着乙醇浓度的提高(0~60%),腺苷的含量显著降低,45℃水提取的腺苷含量约为80%乙醇的36倍,而在60%至90%乙醇浓度提取的腺苷含量差别很小,由此可以看出腺苷易溶于水不易溶于高浓度乙醇。同时,从试验结果还可以看出,同一乙醇浓度(0~60%)不同提取温度(30℃、45℃、60℃、75℃)对腺苷的提取也有一定的影响,其中,在30~60℃时差别较小,而在75℃时则显著下降,说明高温(75℃)不利于腺苷的提取。
通过2.1和2.2的试验结果发现,在45℃、80%乙醇条件下提取,虫草素含量最高而腺苷含量很低,这样可以最大限度地除去与虫草素结构相近的核苷类成分如腺苷等的干扰有利于后期虫草素的纯化。所以,通过本试验确定了以45℃80%乙醇为虫草素最佳提取条件。
2.3 不同提取方法虫草素含量比较
分别采用恒温水浴(45℃)、超声波及微波提取法比较了不同浓度乙醇提取虫草素的含量差别,结果见图3。
图3结果表明,在相同乙醇浓度条件下,采取三种提取方法,以超声波法提取的虫草素含量最高,水浴提取法次之,微波提取法最差;而在不同乙醇浓度条件下,三种提取方法均以80%乙醇提取的虫草素含量为最高。虽然从本实验的结果看超声波法提取法的效果最好,但基于水浴和超声波提取法的虫草素含量差别很小,而且,从提取工艺的难易程度考虑,笔者认为还是以水浴提取法比较适合虫草素的规模化生产。
2.4 虫草素的纯化工艺研究
将45℃、80%乙醇提取的虫草素样品上样中极性ML-7大孔树脂,当样品流到树脂柱底部2㎝左右时,用纯净水洗柱除去杂质,然后再用5%~20%(每5%为一个基点)甲醇溶液进行梯度洗脱,流速控制在1滴/s,收集10%和15%洗脱液进行浓缩,置4℃静止析出晶体,晶体在适温条件下用无水乙醇溶解、低温重结晶,最后冷冻干燥成干粉。通过本工艺纯化出的虫草素样品与虫草素标准品比较,纯度达92%以上(见图4)。
2.5 纯化虫草素样品和虫草素标准品谱图比较
2.5.1 紫外扫描谱图比较:
将纯化样品和虫草素标准品分别用50%乙醇溶解,利用紫外分光光度计扫描二者在200~400nm的紫外吸收光谱,结果见图5。从扫描结果看,纯化样品和虫草素标准品的紫外扫描谱图一致,且均在259nm处出现最大吸收峰,这于文献报道的相同[6],说明纯化样品确为虫草素。
2.5.2 红外扫描谱图比较:
将纯化样品和虫草素标准品用溴化钾处理压片后,分别在4 000~400cm-1红外光谱区扫描,结果见图6。从扫描结果看,纯化样品和虫草素标准品的红外谱图的谱线特征一致,特征光谱规律相同,说明二者结构相同,为同一物质。
Note:Data of microwave extraction with 90%ethanol were invalid.
3 讨论
3.1 本研究通过对虫草素不同提取方法的比较,以超声波提取法的提取效果最好,这与张嘉等[7]的报道相似。但从工作难易程度考虑,笔者认为虫草素规模化提取工艺还是以恒温水浴法较为合适。
3.2 大孔树脂是一种兼具吸附性及分子筛作用的分离材料,根据其化学结构分为非极性、中极性和极性三大类。在大孔树脂的选择上,即要求对目的成分有较高的吸附性,还要保证吸附之后目的成分容易被洗脱下来。所以,大孔树脂和目的成分极性不能过于相似[8]。由于虫草素属于强极性的有机弱碱,而本实验选择的ML-7大孔树脂属于中极性,纯化的虫草素纯度达92%以上,这与上述报道有些相符。据陈淘报道,采用非极性H103大孔树脂纯化的虫草素纯度达44.5%以上[9]。所以,大孔树脂的极性以及树脂类型与虫草素的纯化效果究竟有怎样的关系,尚有待于进一步研究分析。
3.3 在利用大孔树脂纯化虫草素过程中,笔者发现有些树脂不吸附虫草素,因此,可以考虑将几种树脂联用,从而尽可能去除杂质,来提高虫草素纯度。
摘要：目的:优化从蛹虫草中提取、纯化虫草素的方法并鉴定其纯度。方法和结果:通过3种提取方法的比较,确定了以恒温水浴法作为虫草素规模化提取方法,最佳提取条件为45℃、80%乙醇;同时,确定了ML-7大孔树脂纯化虫草素的工艺,采用该工艺虫草素纯度可达到92%以上,并对纯化虫草素和标准品进行了比较鉴定。结论:该方法提取、纯化的虫草素纯度高,适于虫草素的规模化生产。
关键词：蛹虫草,虫草素,提取,大孔树脂,纯化
参考文献
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[6]杨杰,陈顺志.虫草素研究进展[J].中国生化药物杂志,2008,29(6):414-417.
[7]张嘉,李多伟,任静.正交试验提取虫草素的工艺研究[J].中国新医药,2004,3(2):34-35.
[8]张慧芳,李嬛.大孔吸附树脂在生物碱纯化方面的应用[J].中国药业,2011,20(6):15-16.
北安市发展北虫草可行性分析 篇6
高寒区栽培的北虫草养分含量高, 药效显著。北虫草在我国乃至世界上其他国家已成为名贵的药材, 年干虫草用量在1万t以上。北虫草主要的化学成分、药理、药效与野生冬虫夏草极为相似, 经中国医学科学院药物研究分析室、中国科学院沈阳分院理化测试中心等权威部门的检测表明, 北虫草的一些主要营养及药物成分如虫草素、虫草多糖、蛋白质等高于冬虫夏草, 而北虫草相对野生冬虫夏草价格要低, 被各个中成药企业看好, 市场前景广阔。
1 北安市发展北虫草的必要性
1.1 是增加农民收入、解决三农问题的需要
三农问题是政府各项工作的重中之重, 如何增加农民收入是解决三农问题的一项重要工作内容。北虫草项目投资回报率达50%左右, 是一项农民致富增收的好项目。
1.2 是促进现代农业发展的需要
北安市组建了17个大型现代农机合作社, 实施连片规模经营面积达6.67万hm2, 解放出大量劳动力, 北虫草项目可安置大量剩余劳动力。
1.3 是延伸产业链条的需要
北虫草产业可以为北安市“三九”医药厂提供优质的原材料, 使企业节约外购虫草的各项费用, 可实现更大的效益。发展虫草药酒可打造地方品牌, 拉动相关产业快速发展, 可为在建的万头猪场提供优质饲料。因此, 发展北虫草产业经济上合理, 生态及社会效益显著, 符合科学发展观的要求, 符合国家加快现代农业建设的产业政策。
2 北安市发展北虫草的优势
2.1 地理位置和气候条件优势
北安市是黑龙江省正北部区域性中心城市, 地理位置东经126°16′~127°53′, 北纬47°35′~48°33′, 东与逊克、绥棱县相连, 南以通肯河为界与海伦市相望, 西与拜泉、克东县毗邻, 北与五大连池市接壤。全市总面积7 194 km2, 总人口48万人。北安市是传统的商品集散地, 辐射半径可达100 km, 辐射人口500万人以上。未来北安市区将打造成为承载200万人口的大中型城市。北安市为寒温带大陆性季风气候, 冬季严寒而漫长, 夏季短促而炎热, 春季多风、秋霜较早。年平均气温4.2℃, 平均无霜期100~113 d;多年平均降水量529 mm, 6—8月降水量占年降水量的70%, 多年平均蒸发量647 mm, 年平均≥10℃的有效积温2 250℃, 良好的地理位置和气候条件适于北虫草生产。生产地在生长期内多为寒冷干燥、多风的气候, 非常利于生产栽培和烘干、贮存。区域内有吉黑高速、前嫩高速、绥北高速路穿行, 交通运输方便快捷。
2.2 资源和技术优势
北安市的农业生产格局多元化, 主要栽培作物为大豆、小麦、玉米、蔬菜、马铃薯和药材, 能为北虫草栽培提供丰富的栽培原料。
北安市为黑龙江省现代农业示范区的核心区, 农民有着不怕苦、不怕累和勇于开拓创新的优良作风, 对发展现代农业的认识高, 善于应用先进的科学技术, 产业发展观念强, 增产增收愿望强烈。北安市现有在市域内和沈阳市从事北虫草栽培的农民达131人, 特别是在沈阳市的103名从事北虫草的技师, 技术水平高, 经验丰富, 回乡创业的愿望强烈。北安市现代农业示范区内有1所职业教育学院, 师资力量强大, 教学实验设备齐全, 能经常培训电气焊、车刨、电子数控、计算机操作、农作物栽培、食用菌栽培等各类专业技术人才。因此, 北安市发展北虫草的资源和技术优势突显, 为发展北虫草产业奠定了坚实的基础。
3 北安市北虫草生产运营方案
建高效节能日光温室, 规格为500 m2/栋, 跨度为8 m, 长度为63 m。每年安排4茬次生产。主要包括以下七方面技术:一是配料。将北虫草培养料按比例混拌均匀, 装入培养盆中。二是高温灭菌。将培养盆放到高温蒸炉内, 高温灭菌10 h以上, 停火自然冷却。三是接种。在无菌条件下, 将北虫草菌种接到培养盆中密封。四是上架培养。将培养盆放到15~20℃的培养室内培养。五是采收。经60~70 d的培养, 人工采收。六是培养菌种。在成熟的北虫草中筛选优良品种进行提纯培养。七是烘干。采收后的北虫草及时放入烘干箱内烘干。
参考文献
[1]高士友, 王发宗.北虫草商品化栽培技术的研究[J].北方园艺, 2008 (9) :212-215.
[2]图力古尔, 朝克图.北虫草在大青沟的发现[J].内蒙古农业科技, 1997 (2) :37.
[3]尹萍, 涂艳丽, 王飞, 等.北虫草液体发酵培养基优化研究[J].江西农业学报, 2006 (4) :102-103.
北虫草素 篇7
1 材料与方法
1.1 实验仪器与材料
北虫草 (由沈阳虫林密宝食品科技有限公司提供) 、肺腺癌细胞A549 (购自博士德生物)
DMEM;胎牛血清;二甲基亚砜 (DMSO) 胰蛋白酶, MTT (均来自于博士德生物) 超纯水、96孔板 (Fisher) 高压蒸汽灭菌锅、二氧化碳培养箱、倒置显微镜、离心机、酶标仪、电磁炉。
1.2 北虫草水提物的制备
取北虫草粉碎, 100目过滤, 取北虫草粉末5g, 加入200m L超纯水, 电磁炉700W提取30min, 4000r/min离心两次, 取上清液定容至100m L, 制得终浓度为30mg/m L的北虫草提取液, 经0.22μm无菌滤器过滤除菌, 备用。使用前用DMEM基本培养基稀释成实验所需的浓度。
(注:P<0.05表示具有显著性差异;P<0.01表示具有极显著性差异)
1.3 肺腺癌细胞A549的培养及生长观察
将A549细胞置于含10%胎牛血清的DMEM基本培养基, 在37℃、5%CO2培养箱中进行传代培养, 用0.25%的胰酶细胞消化液进行消化传代, 且3天传代1次, 并观察细胞的生长状况。实验所用的细胞均为对数生长期细胞。
1.4 MTT法检测A549细胞的抑制率
在96孔板的每孔中, 加入200μL含1×104个细胞的细胞悬液, 待其贴壁后加入不同质量浓度的北虫草提取液 (3mg/m L、2 mg/m L、1 mg/m L、0.5 mg/m L、0.25 mg/m L) 分别作用于细胞, 每组三个重复, 置于CO2培养箱中培养24h后去上清液, 每孔加入2mg/m L的MTT 20μL于培养箱内避光反应4小时, 然后加入150μLDMSO, 用酶标仪在490nm处测定OD值, 计算细胞抑制率。实验设置阴性对照组和空白对照组。
1.5 统计分析
采用SPSS 20.0软件进行统计学分析。计量数据均以 表示, 组间比较采用单因素方差分析法, P<0.05表示具有显著性差异, P<0.01, 表示具有极显著性差异, 数据具有统计学意义
2 结果与分析
2.1 A549细胞形态观察:如图1所示
2.2 A549细胞抑制率
从图2中可以看出, 北虫草提取液对肺癌细胞株A549存在抑制作用, 随着北虫草提取物浓度的增加, 肺癌细胞A549的形态发生明显的变化, 出现皱缩、膜泡甚至破裂等现象, 经吉姆萨染色发现细胞出现凋亡小体, 北虫草提取液对肺癌细胞A549的作用为凋亡。
从表1中可以得出:随着北虫草提取物浓度的增加, 对肺癌细胞A549的抑制率随之增加, 且存在显著地剂量依赖。当北虫草提取物浓度为3mg/m L时, 抑制率达到最大为74.14±4.49。浓度为0.25mg/m L和0.5mg/m L两组之间无显著性差异 (P>0.05) , 但与其他三组之间存在显著性差异, 其中当北虫草提取物浓度为1mg/m L时, 与其他四组之间存在极显著性差异 (P<0.01) 。
3 讨论
MTT法简单易操作, 本实验采用MTT法反映出北虫草提取物对体外培养的肺癌细胞株A549具有明显的抑制作用, 为临床治疗肺癌提供了有力的依据。同时本文采用了市售北虫草为研究对象, 为大众消费北虫草提供了科学保障。目前对于北虫草抗癌的研究较多, 其中颜晶晶、孟泽彬等人对北冬虫夏草的提取物抗癌做了研究[4,5,6], 李灿、卢丽丽、张丽艳对虫草各组分的体外抗肿瘤效果进行了深入研究[7,8]李万芳、杜秀菊等人对不同提取方法所获得的虫草各组分进行深入探讨[9,10]。以前期的研究为基础我们还将对该虫草提取液对肺癌细胞A549进行时效的研究, 同时进行更精细的研究, 为北虫草临床治疗肺癌提供进一步的理论支撑。
摘要：本文采用MTT法进行北虫草水提取物对肺腺癌细胞A549体外抑制的研究。结果表明:北虫草水提取物可抑制肺腺癌细胞A549的生长, 细胞形态发生明显变化。随着北虫草水提物浓度的增加, 抑制率显著增大, 呈明显的剂量依赖。当北虫草水提物浓度为3mg/m L时, 抑制率最大为74.14%±4.49 (P<0.05) , 为北虫草临床治疗肺癌提供理论依据。.
关键词：北虫草,MTT法,肺腺癌细胞,抑制率
参考文献
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