微阵列芯片技术（精选3篇）
微阵列芯片技术 篇1
微阵列芯片技术又称基因芯片技术, DNA芯片技术或生物芯片技术, 从20世纪90年代至今已成为一门应用越来越广泛的前沿技术。1995年美国斯坦福大学的Schena等[1]首次发明了生物芯片, 对现代科技的发展做出了不可磨灭的贡献, 到目前为止已取得了众多举世瞩目的成果。微阵列芯片技术是指将寡核苷酸或DNA片段排列在硅片等介质上形成微阵列, 与荧光分子标记的待检样品杂交, 通过荧光扫描和软件分析获得样本的基因表达信息, 从而高效、快速获得分析样本的所有生物遗传信息[2]。这种技术应用前景十分广泛全面, 因其可通过外显子阵列检测生物样本的全部基因组并且只需较少的样本就能够进行基因表达分析从而获得基因表达差异信息, 所以可对医学上一些疑难杂症相关基因进行筛选和分析[3]。儿童先天畸形的病因有遗传因素和非遗传因素两大类, 以下将对微阵列芯片技术在儿童畸形中的应用进行综述。
1 口腔及颌面部畸形
基因和环境是影响口腔颌面部的生长发育的两个因素, 其中基因的变异容易导致异常发育造成先天口腔及颌面部畸形。其中唇腭裂是口腔先天畸形中发生率最高的疾病之一。微阵列芯片技术在其诊断发挥了很大的作用, 2003年Brown等[4]就用微阵列芯片技术筛选到了对正常鼠腭发育起重要作用的基因序列, 同时分析了其在腭突垂直生长期、腭突水平生长期、腭突融合三个不同阶段表达的改变, 最终证明基因芯片技术能快速便捷地检测到靶基因相关的细胞表达信号。沈璐等[5]进一步研究了维甲酸诱导的与腭裂相关的wnt信号通路以及成纤维细胞生长因子 (FGF) 配体表达的异常改变, 发现应用基因芯片技术可以检测到并且筛选出wnt和FGF的经典通路配体, 确定了前者为wnt8a和wnt3, 后者为fgf9和fgf10。等胚胎发育14.5 d左右, 用基因芯片对实验组和对照组的小鼠腭突进行检测, 最终发现wnt8a和fgf9配体的表达在实验组中下调, 而wnt3和fgf10配体的表达在实验组中上调, 该结果证实了小鼠胚胎腭突的发育同时有这两个信号通路的参与, 在分子水平上进一步揭示了腭裂的发生机制。因此基因芯片技术提供了从分子水平上对唇腭裂儿童进行早期干预的可能靶标。
2 儿童先天性肾脏疾病
肾脏是人体重要的排毒器官, 儿童期是肾脏发育及功能完善至关重要的阶段。但是很多先天性肾脏疾病的发病原因不明, 而基因芯片杂交技术由于可以同时检测几千个基因的表达情况, 并可进一步绘制出病患的基因表达图谱, 因此微阵列芯片技术对于揭示先天性肾脏疾病发病的原因有很大意义, 现在很多科研单位涉及此方面的科研工作[6]。
以往有研究表明, 蛋白尿具有肾毒性, 是加速肾功能衰竭的罪魁祸首之一, 因此可作为肾脏疾病向终末期肾衰发展的最佳预测指标之一。Nagasawa等[7]对蛋白尿的动物模型的肾组织检测了基因表达情况, 最终发现有1600多个基因表达增强, 其中一个编号为AA275245的基因过去未曾报道过, 其表达变化最显著, 通过与Gen Bank中的已知基因进行配对比照, 发现这个基因与细胞骨架蛋白的表达有关, 最终得出结论该基因可能参与了肾脏的损伤及应激机制, 另有研究表达蛋白尿可使大约10%的基因表达发生改变, 这对寻找肾脏疾病的始动基因提供了线索, 有利于进一步揭示肾脏疾病的发病机制。我们知道在人类的不同组织器官中有15 000~30 000个基因, 所以把基因芯片与生理病理学进行有效地结合最终可以用来检测到那些起协同调节作用的基因组。另外, 可以将基因分析与流行病学研究结合, 这对揭示遗传及环境因素对个体的作用有着不可忽视的作用[8], 同时对揭开儿童先天性肾脏疾病的病因及治疗策略具有非常重要的意义。
3 心血管疾病
2001年哈佛大学心血管研究中心用3种统计方法确定与人类心血管系统相关的基因, 结果发现共有26 000多个, 约占人体基因的75%, 此基因库也是全世界首次建立的, 而且研究发现与心功能衰竭有关系的病态基因共有200多个。心血管系统生理病理改变机制如此复杂, 可以想象与其相关的信号转导系统该是多么复杂, 而传统的单因素研究理论和方法已不能承担如此庞大的工程, 而基因芯片技术可利用高度集成的寡核苷酸或DNA微阵列, 实现大规模、高通量同时检测成千上万种细胞或组织内的基因表达情况, 达到一定程度上的全基因表达图谱的检测[9]。
儿童病毒性心肌炎多由柯萨奇B族病毒感染后引起的, 由于缺乏有效的治疗措施, 少数患者最终出现扩张型心肌病以及充血性心衰, 很大程度上影响日后的生活质量。Taylar等[10]利用c DNA表达谱芯片研究了在病毒感染后的第3、9、30天时宿主心肌细胞基因表达图谱的改变, 结果发现有169个基因在感染后1个或多个时间点发生了显著的差异表达, 对差异表达的基因根据其功能进行分类, 评估病毒性心肌炎的病毒血症期、炎症反应期、愈合期的基因表达的变化, 为病毒性心肌炎不同进展阶段的治疗提供依据。
4 染色体畸变
据统计染色体异常引起的先天畸形约占5%。常见的有21三体综合征、18三体综合征、先天性卵巢发育不全综合征、先天性睾丸发育不全综合征等。染色体微阵列分析是在最近这段时期才出现的一种分子核型分析技术, 其方法是通过对全基因组的拷贝数变异 (copy number variants, CNVs) 进行高通量、更高分辨率的分析, 其特点是可进行快速、精确地检测基因组不平衡位点, 从而进一步预测其表型或疾病的严重情况[11]。
王华等[12]选取产前诊断G显带染色体核型为新发平衡易位或微小额外标记染色体的4名孕妇, 抽取胎儿脐带血DNA, 最终证明染色体微阵列分析能够在DNA水平上甄别胎儿新发“平衡”易位或微小额外标记染色体的致病性, 在产前诊断中不失为传统染色体核型分析的重要补充。李璃等[13]同样用染色体微阵列分析对1例染色体不平衡易位先天性缺陷胎儿进行检测, 分析胎儿基因型和表型的相关性, 得出结论:del (14) (q32.33→qter) 部分单体可能是胎儿心脏病发病的遗传学病因。廖灿等[14]应用微阵列比较基因组杂交技术探讨Dandy-Walker综合征的遗传学病因, 确定了染色体7p21.3区DNA拷贝数的异常改变是Dandy-Walker综合征的病因之一, 且其发病机制可能与NDUFA4和PHFl4基因的表达异常有关。另外符芳等[15]选取32例经产前超声检查, 发现染色体1q21.1区带DNA拷贝数改变是导致儿童先天性泌尿系统畸形的病因之一, 其致病机制可能与PDZK基因的异常表达有关。利用基因芯片技术可筛查儿童的染色体异常情况并建立档案, 为其将来生育健康的后代提供指导。
5 造血系统疾病
众所周知, 儿童阶段是急性白血病的好发时期, 所以白血病细胞准确分型对其诊断和治疗有着至关重要的作用。运用微阵列芯片技术对白血病肿瘤细胞能进行准确的分型, 可以解决白血病细胞由于其分化的高度异质性和复杂性为细胞形态学给疾病诊断带来的困难, 进一步为白血病的诊断和治疗提供有效的工具。例如Golub等[16]设计了一种用于白血病分型的基因芯片, 它包含了6817个人类基因, 这就为白血病的快捷准确诊断提供了便利。另外运用微阵列技术筛选出的靶基因可以作为评价白血病预后的指标, 从而可以用来指导患者药物的选择和后续治疗方案的选择。其中Raponi等[17]运用包含22 001条基因的Affymetirx U133A芯片对58例复发且难治的急性髓系白血病患者骨髓标本进行检测, 最终获得了8个基因标志, 它们能够准确地预测患者对法尼基转移酶抑制剂的敏感度。于此同时Winter等[18]也运用AffymetrixU133芯片对50例白血病初发患者进行了分析, 最终筛选出了116个基因, 并用这些基因把其中5例取得缓解的患者和其他6例诱导缓解治疗失败区分开。此外骨髓增生异常综合征 (MDS) 又被临床称为“前白血病”, 它与急粒细胞白血病有许多在临床表现和细胞分型上有相似。国外文献关于应用微阵列芯片对白血病进行的报道很多[19], 它们得出的结论能够指导相关学者今后在关于MDS的靶向基因科研工作以及对两者进行鉴别诊断。
上述研究表明微阵列芯片技术在筛选儿童畸形疾病相关基因方面具有效率高、靶向性强和信息容量大等优点。虽然在过去的几年中微阵列芯片技术已经在各个疾病系统研究领域得到了应用, 但应用还不普遍, 其原因包括重复性不好、疾病例数难以筛选等。此外微阵列芯片技术仍有一些关键的技术问题没有得到解决, 如降低芯片成本、提高其灵敏度等。以上问题如果能够得到很好的解决, 那么把微阵列芯片技术从实验室研究推向临床应用就不再是空想[20]。
阵列处理器系统芯片的发展 篇2
数据流动的计算模式的统一
1935年的图灵抽象机定义了控制数据流动而完成计算的计算模式, 现在已形成了指令流、数据流与构令流三种控制数据流动的计算模式。现在流行的控制数据流动的计算模式主要是冯·诺依曼的指令流计算模式, 有SISD、SIMD、MISD与MIMD四种体系结构的指令流计算模式。但现在的单核/多核/众核芯片, 只实现了SISD的指令流计算模式, 以及MMX[SIMD], 流水线[MISD], VLIW[MIMD]等低并行计算度的指令流计算模式。由于SIMD的指令流计算模式最适合图像处理算法, SIMD体系结构的处理器与计算机早已得到了发展。数据流计算模式是采用电路设计的ASIC/ASSP芯片, 或者是静态重构的FPGA芯片实现的, 而构令流计算模式是通过可重构的RC Device (Re Configurable Device) 芯片实现的, 它们的计算效率高, 应用的设计门槛也高, 没有程序设计的灵活性, 芯片的品种多。因此, 我们研究并实现了MISD/MIMD的指令流计算模式, 它不仅具有数据流/构令流计算模式的计算高效性, 而且具有程序设计的灵活性, 应用的设计门槛低, 芯片的品种少等。计算模式的统一就是用MISD/MIMD的指令流计算模式, 取代没有程序设计灵活性的数据流/构令流计算模式, 使所有计算统一成指令流计算模式。
并行计算的阵列芯片的统一
从并行计算来看, 有任务级并行计算、数据级并行计算、操作级并行计算与指令级并行计算的阵列芯片。现在的MPP计算机主要是按任务级并行 (TLP, Task Level Parallel) 完成计算的;是采用单核/多核/众核芯片实现的。单核/多核/众核芯片正在向TLP计算的MP系统芯片与AP系统芯片演变[2,3], TLP计算是将任务 (进程/线程) 映射到核 (处理器) 上完成计算的, 是一种MPMD的计算。由于任务 (进程/线程) 之间存在同步与互斥问题, TLP计算的效率低、编程复杂。数据级并行 (DLP, Data Level Parallel) 计算是按SIMD模式完成的计算, 主要是采用指令流计算模式中的SIMD体系结构实现的, 已有GPU等系统芯片[4,5], 以及GPU或者是CPU+GPU的MPP计算机。操作级并行 (OLP, Operation Level Parallel) 计算是在数据流计算模式的ASIC/ASSP/FPGA阵列芯片, 与构令流计算模式的RC Device的阵列芯片上完成并行计算的, 没有程序设计 (改变) 的灵活性。科学和艺术都是用来探索4维的时空关系的, APU系统芯片是采用PE (Processing Element) 之间的邻接 (abutting) 技术, 探索4维的时空并行计算关系的, 实现DLP计算与指令级并行 (ILP, Instruction Level Parallel) 计算的。阵列芯片的统一就是SIMD的DLP计算与MISD/MIMD的ILP计算, 是采用处理元之间邻接互连 (Abutting) 的APU系统芯片统一实现的。
应用演变的数学技术的统一
计算科学是源于数学思维与工程思维的“数学技术”, 它改变了人们的思维方式。芯片集成度按照摩尔预言速度上升的结果, 在高性能计算、网络化计算与嵌入式计算的应用演变中, 数学技术促进了计算机的新发展。高性能计算机主要是通过模拟帮助人类了解世界与创造世界的, 有地球模拟机、蓝色风暴、宇宙计算机、密码破译机与武器模拟机等。这些计算机的名称就说明了它们的应用演变, 都需要通过数学技术建立很复杂的数学模型, 以及实验或观测的数据库。模拟的核心就是建立一个与真实或者虚拟系统相关的数学模型, 通过数学模型与数据库探讨对高性能计算机体系结构的影响。网络化计算的通信作用是非常成功的, 从根本上改变了世界的信息基础设施。现在, 随应用演变的数学技术, 使计算机网络的作用已从通信作用, 发展到资源共享的服务作用, 叫做网络计算 (Net-Centric Computing) /网格计算 (Grid Computing) 与网络存储。在高性能并行计算与大容量存储系统的支持下, 云计算与Saa S (Software as a Service, Storage as a Service, 软件即服务, 存储即服务) 或Haa S (Hardware as a Service, 硬件即服务) 等数学技术使下一代数据中心将扮演“数据电厂”与“数据银行”的服务角色。
嵌入式计算是一种计算技术与物理世界相结合的服务模式, 有人叫做具体化与物理化应用, 模拟了人类与物理世界交互的形式, 成了有传感器 (模拟人的视觉、听觉与感觉等) 与执行机构 (模拟人的四肢) 的计算机, 并通过随应用演变的数学技术, 让工业机器能像人一样自主工作。虽然现在人工智能的数学技术只使机器人有了逻辑思维能力、部分形象思维能力, 基本没有创造思维能力, 但为机器人研究带来了有创见的方法。从形状来说, 有人形机器人与非人形机器人。而美国国防部的变形机器人就是要通过随应用演变的数学技术, 使机器人具有自组装能力, 可保证机器人能成功地登上星球表面。从功能实现方法来说, 有人工方法与自然的仿生方法。人工方法的机器人有手术机器人、自动驾驶机器人等。仿生方法的机器人有气流发音的机器人、重力行走机器人、化学机器人、神经元机器人、情感机器人、模拟生物进化过程的机器人、以及分子机器人等, 仿生方法使随应用演变的数学技术的计算日益自然化。计算技术的飞速发展, 也体现在编程语言的演变上, 从最早的Basic到Algol, 再到Fortran, 以及现在的接近汇编语言的C语言。数学技术最后是通过汇编语言映射到计算机上完成计算的。汇编语言的优点是程序质量高, 缺点是可读性差, 没有兼容性, 是不统一的。因此, APU系统芯片的ISA不是用助记忆符的汇编语言描述的, 而是采用了一种面向数学技术也面向指令定义的映射语言描述ISA的, 简称M语言 (Mapping/Middle Language) 。数学技术是统一到映射语言上, 以提高程序的复用性的。
硅基芯片的制造技术的统一
量子计算与生物计算还处于探索阶段, 现在的计算机是采用硅基芯片制造技术实现的。人们预计硅基芯片的制造技术到2016年将接近其发展极限, 需要寻找新的技术突破。例如, 通过扩大芯片面积是提高芯片集成度的一种新途径, 就是圆片规模集成 (WSI, Wafer Scale Integration) 技术。又例如, 混合集成电路是一种小型化、高性能和高可靠的互连封装手段, 国内将其称为二次集成技术。1993年美国佐治亚理工学院提出了将So C芯片、MEMS芯片、以及无源元件二次集成在一起的So P (System on Package, 系统级封装) 的概念。按摩尔定律发展的IC芯片仅占一个系统的10%的体积, 而So P则解决了系统中90%的体积。特别是2007年Intel公司率先具备了45nm硅基芯片的生产能力, 使半导体产业进入了“材料推动革命”的时代。集成度高达近20亿晶体管的32nm芯片接近实用。
为了解决深亚微米技术的“红墙”问题与嵌入式应用的小型化问题, 硅基芯片的TSV三维集成制造技术得到了发展。IBM、Intel与Samsung等都采用了TSV (Through-Silicon-Via, 硅穿孔封装) 的三维集成技术。据IBM称, TSV技术能使芯片数据所需要的传输距离缩短1000倍, 连线数目增加100倍, 功耗低达20%。IBM将把TSV技术应用到无线通信芯片、电源处理器、Blue Gene超级计算机芯片和高带宽内存中。我国2006年全国科学大会提出的“十六专项”体现了芯片设计、制造与应用的产业链特点。在“十六专项”的战略任务的牵引下, 有望使我国的芯片技术跟上“摩尔预言”的发展步伐。制造技术的统一就是指三维集成的TSV技术的统一, 以实现嵌入式计算机小型化与解决深亚微米的Red brick Wall (红墙) 问题;也是提高我国芯片制造能力的必经之路。从设计上讲, APU系统芯片的阵列体系结构, 以及传感器、显示器与存储器等芯片都是阵列的, 是正好适合于TSV技术的应用的。
结语
APU系统芯片是基于三维集成的TSV制造技术的统一, 随应用演变的数学技术的统一、邻接互连的阵列芯片的统一、以及SIMD与MISD/MIMD的指令流计算模式的统一设计的。因为计算机的ISA是随应用演变的数学技术与硅基芯片的制造技术的发展而不断创新的, APU系统芯片设计主要体现在统一改变的并行计算ISA模型上, 即DLP计算与ILP计算统一后的双指令格式的ISA模型上。
APU系统芯片的应用需求:精度 (字长) 、速度 (主频, 阵列大小) 、存储容量、可靠性与功耗等是ISA设计的先导, 来源于随应用演变的数学技术, 因此, 需要为系统设计者提供ISA设计的平台。在APU系统芯片的统一语言的支持下, ISA设计平台也是可以统一的, 使它成为不同应用领域的系统设计者的协作工具。
参考文献
[1]Shen B.Evolution of MPP SoC architecture techniques, Sci China Ser F-lnf Sci.2008, 51 (6) :756-764
[2]Johns C R, Broken shire D A.Introduction to the Cell Broadband Engine Architecture.IBM Journal of Research and Development, 2007, 51 (5) :503-519
[3]GARA A, et al.Overview of the Blue Gene/L system architecture.IBM journal of research and development, 2005 (49) :195-212
[4]NVIDIA Corp., NVIDIA GeForce8800Architecture Technical Brief.2006
[5]Emil P, ATI Radeon HD2000programming guide.AMD Graphics Products Report[R], 2007
[6]Shen B.The AP SoC for Unification Architecture.待发表
[7]沈绪榜.嵌入式阵列处理器的发展 (J) .电子产品世界, 2008, 15 (10) :74-80
[8]沈绪榜.航天时代的嵌入式图像处理技术 (J) .电子产品世界, 2007, 14 (1) :40-42
微阵列芯片技术 篇3
目前, DES的检测方法有色谱法[3,4]、酶联接免疫吸附剂测定 (ELISA) [5,6]等。但这些方法操作复杂, 检测时间长, 难以实施对动物性产品的大规模监控, 因此建立一个快速简便的方法检测DES是非常必要的。微阵列技术是近几年发展起来的快速、高通量的检测方法, 它在载体上以微阵列方式固定配体, 基于特异性反应, 通过特定的装置扫描并由计算机分析结果。
试验以己烯雌酚为分子识别物质, 对微阵列技术检测化学小分子的方法进行条件优化, 探索小分子微阵列技术检测雌激素类物质的可行性, 为在芯片上实现更多有害物质的检测奠定基础。
1 材料与方法
1.1 试剂与仪器
丁二酸酐 (国药集团化学试剂有限公司) , 牛血清白蛋白 (BSA, 华美生物工程公司) , 碳化二亚胺 (EDC) , 己烯雌酚标准品 (美国Sigma公司) , 己烯雌酚单克隆抗体 (北京望尔) , Cy3标记羊抗鼠IgG (美国Rockland公司) , 其他化学试剂均为国产分析纯。
Cartisian prosys 5510点样仪 (美国Cartisian公司) , 激光共聚焦扫描仪 (美国PE公司) 。
1.2 试验方法
1.2.1 己烯雌酚半琥珀酸酐 (DES-HS) 的合成。
称量14mg DES, 8mg琥珀酸酐和8mg 4-二甲基吡啶 (DMAP) , 溶于1mL吡啶, 室温振荡反应2h后用酸水重复洗涤5次, 以二氯甲烷重新溶解, 以硅胶柱层析纯化, 洗脱液为石油醚∶异丙醇=15∶1, 经薄层色谱鉴定后收集产物。
1.2.2 DES-HS-BSA合成。
(1) 碳化二亚胺法:将6mg DES-HS溶于200μL 1, 4-二氧六环∶水 (2∶1) 溶剂中得到溶液A, 3mg EDC溶于200μL 1, 4-二氧六环∶水 (2∶1) 的溶剂中得到溶液B, 取B液缓慢滴入A中冰浴40min得溶液C, 配制相同的B液后加入C液中并搅拌18h得溶液D;取10mg BSA溶于磷酸缓冲液 (PBS) (pH值7.2, 0.01mol/L) 得溶液E, 将D液加入E液, 室温搅拌2h, 以PBS (pH值7.2, 0.1mol/L含1%二氧六环) 透析72h后离心取上清液置于-20℃冰箱保存。 (2) 混合酸酐法:5mg DES-HS溶于100μL二氧六环后, 加入20μL 4℃预冷的三乙胺, 在4℃放置10min后, 再加入20μL氯甲酸异丁酯在4℃放置20min, 10mg BSA溶于二氧六环 (加入适量的NaOH调节pH值为10) , 然后将上述预冷活化的DES倒入BSA中, 4℃振荡过夜以0.01mol/L PBS透析72h。
1.2.3 芯片制备及反应。
(1) 琼脂糖玻片的制备:1%琼脂糖溶液平铺在玻璃片上, 待凝固后烘干, 用0.02mol/L的NaIO4溶液在室温下氧化30min, 清水洗涤甩干备用。 (2) 探针固定:将合成的DES-BSA配制成含20%甘油的探针, 用芯片点样仪点在琼脂糖玻片上, 在湿盒 (37℃, 下同) 中进行温育过夜。 (3) 封闭:采用1%BSA在37℃下对芯片封闭30 min, 然后以抗体稀释液 (PBST) 和PBS分别洗涤1min, 甩干待用。 (4) 抗体抗原反应:加入DES单克隆抗体, 37℃反应30min后分别用PBST和PBS洗涤, 甩干待用。 (5) 二抗反应:加入Cy3标记的羊抗鼠IgG二抗, 37℃反应30min后分别用PBST和PBS洗涤, 甩干。 (6) 荧光信号检测:用激光共聚焦扫描仪对芯片进行扫描, 并采用定量分析软件对数据进行处理和分析。
2 结果与分析
2.1 DES-HS的合成
通过薄层色谱法证明, 琥珀酸酐法可以对DES进行衍生, 在其一端连接带羧基 (-COOH) 的末端, 生成的产物极性大于DES。实验证明, 加入DMAP后, 反应时间明显缩短, 如40h以上缩短为2h[7]。
2.2 DES-HS-BSA的合成
碳化二亚胺法和混合酸酐法是目前常用的2种抗原合成方法, 试验对这2种方法进行了比较。
2.2.1 缓冲液pH值对结果的影响 (EDC法) 。
结果如图1所示, 由于EDC的最佳作用条件为弱酸性 (pH值4~6) , 通常以2- (N-吗啉基) 乙磺酸 (MES) 作为反应缓冲液, 而此时DES-HS逐渐加入后有白色颗粒沉淀析出, 反应过夜后, 该沉淀仍然没有溶解;以PBS (pH值7.2) 为反应缓冲液时, 此时仍有少量白色颗粒状沉淀析出;而卵清蛋白 (OVA) 溶于碳酸盐 (DB, pH值10) 缓冲液作为偶联蛋白时, EDC的反应体系可能不太适合, 偶联效率可能很低。因此, 试验结果以PBS缓冲体系为最佳。
2.2.2 DES-HS-BSA蛋白电泳鉴定。
如图2所示, EDC法合成的偶联物与BSA分子量相差不大, 因此判断该偶联物中连接至BSA的小分子可能很少或几乎没有, 从而使得其信号值较低;而3号偶联物较BSA有了迁移, 分子量有所增加, 初步可以判断偶联成功。因此, 以下的研究 (蛋白浓度, 偶联比例的测定以及芯片反应的一系列优化) 主要以混合酸酐法合成的DES-HS-BSA为研究对象。
2.2.3 DES-HS-BSA浓度以及偶联比例的计算。
以Bradford方法测得蛋白浓度为4.07mg/mL。参照文献[7]后测得其蛋白与小分子的偶联比例为1∶28。
2.3 芯片体系的参数优化
2.3.1 探针浓度的确定。
当探针浓度为0.5mg/mL和0.2mg/mL时, 荧光信噪比较好 (见图3) , 因此对0.5mg/mL和0.2mg/mL的探针浓度进行了进一步的优化以使其在免疫竞争体系中得到较好的结果。
2.3.2 探针在免疫竞争趋势中的优化。
探针浓度为0.2mg/mL时, 其竞争趋势较0.5mg/mL明显, 且竞争性较强, 这对于提高芯片体系的检测限有很大作用, 因此在以下的优化体系中确定探针浓度为0.2mg/mL (见图4) 。
2.3.3 一抗浓度的优化。
当一抗浓度变化时 (见图5) , 标准曲线都表现出了趋势, 但是一抗浓度为130ng/mL和100ng/mL时的荧光值信号相对比200ng/mL的低, 因此导致信噪比增加, 同时对于检测限会有一定的影响, 最终从检测限和灵敏度考虑选择一抗浓度为20μg/mL, 二抗浓度为2.5μg/mL。
2.3.4 标准品浓度的优化。
在芯片反应中主要利用竞争反应原理, 即由标准品和探针竞争一抗, 引起信号值的变化。因此, 实验中调整标准品和一抗之间的比例关系对于标准曲线的优化很有意义。由于栅栏最多能承受30μL的体系, 否则易产生漏液等现象, 使结果不准确, 因此试验中标准品和一抗的总体系为30μL, 通过控制两者之间的比例来进行优化, 以期得到检测限低、稳定性好的曲线。试验表明 (见图6) , 当调整一抗和标准品两者的比例时, 信号值随着标准品浓度的增加而明显降低, 当一抗∶标准品=1∶2时, 出现趋势的浓度从1ng/mL降低到0.1ng/mL, 扩大了线性检测区间, 因此最终选择一抗∶标准品=1∶2的添加量, 总体系为30μL。
2.4 回收率的测定
上述优化体系内, 在1~100ng/mL之间做线性拟合, 得到其定量检测区间的拟合方程, 以5ng/mL和50ng/mL 2个添加水平进行加标回收试验, 其平均回收率为97.1%和102.9%。
2.5 重复性研究
按照芯片反应流程, 测试了芯片系统的点间相对偏差 (CV) , 矩阵间相对偏差和片间相对偏差。根据芯片信号强度的数据, 点间CV 3.24%, 矩阵间CV6.78%, 片间CV 10.62%。
3 结论
在药物残留检测领域, 免疫竞争法具有灵敏、快速、特异等优点, 而大部分药物都属于半抗原, 因此合成药物半抗原为人工抗原是建立免疫竞争法的关键。小分子半抗原不具有免疫原性, 其必须通过与具有免疫原性的载体蛋白偶联后才能成为免疫原, 连接到每个载体分子上的半抗原的性质、偶联数目、连接桥、连接方法和偶联后的结构等对抗原抗体之间的特异性都有显著的影响。试验对己烯雌酚的酚羟基进行一端琥珀酸酐衍生化后, 选择了目前常用的2种抗原合成方法进行全抗原的偶联, 结果显示琥珀酸酐法适合己烯雌酚的抗原合成, 合成的全抗原能够与其相应抗体发生特异性的结合。
试验还建立了以该合成的抗原对己烯雌酚进行蛋白芯片检测方法, 该方法能够实现对己烯雌酚的定性和定量检测, 从而为多种药物残留的小分子微阵列技术检测提供一定的基础。
摘要：研究和比较了混合酸酐法和碳化二亚胺 (EDC) 法合成己烯雌酚 (DES) 全抗原的2种方法, 分析了溶剂在全抗原偶联过程中的影响。以混合酸酐法合成的DES-BSA为探针制作小分子芯片, 确定了最佳反应体系, 并对体系稳定性做了研究, 可实现对己烯雌酚残留的高通量检测。
关键词：己烯雌酚,抗原,微阵列
参考文献
[1]PFAFFL M W, RECK B, DREHER R, et al.Production of clenbu-terol, diethylstilbestrol and trenbolone mass standards in lyophilizedbovine urine[J].Analytica chimica acta, 2003, 483 (1-2) :401-412.
[2]YANG L H, LUAN T G, LAN C Y.Solid-phase microectraction withon-fiber silylation for simultaneous determinations of endocrine disru-pting chemicals and steroid hormones by gas chromatography-mass sp-ectrometry[J].Journal of Chromatography A, 2006, 1104 (1-2) :23-32.
[3]KOOTSTRA R, ZOONTJES P W, TRICHT E F, et al.Multi-residuescreening of a minimum package of anabolic steroids in urine with GC-MS[J].Analytica chimica acta, 2007, 5 (86) :82-92.
[4]SHI Y Q, YAO J, LIU F, et al.Establishment of an HPLC identificationsystem for detection of counterfeit steroidal drugs[J].Journal of Pharma-ceutical and Biomedical Analysis, 2008, 46 (4) :663-669.
[5]SAWAYA A N, LONE K P, HUSAIN A, et al.Screening for estrogenicsteroids in sheep and chicken by the application of enzyme-linkedimmunosorbent assay and a comparison with analysis by gas chromat-ography-mass spectrometry[J].Food Chemistry, 1998, 63 (4) :563-569.
[6]古艳丽, 曲志娜, 陈德坤, 等.己烯雌酚人工抗原的合成和酶联免疫方法的建立[J].中国农学通报, 2006, 22 (9) :39-42.