加标回收试验（共3篇）
加标回收试验 篇1
加标回收试验是实验室常用的质量监督和内部质量控制方法之一, 可查找系统误差的某些来源, 其对质量控制和检测数据的准确性、可靠性有着十分重要的实践意义。特别是在克伦特罗及其残留检测过程中, 由于待检物资的含量处于痕量或微量水平, 加之样品中不同组分对待检物质的交叉影响等, 因此, 实施严格质量控制对保证检测数据准确可靠相当重要。
克伦特罗属于β类兴奋剂, 我国规定禁止在动物生产中添加使用, 但受经济利益的驱使, 非法添加屡禁不止, 中毒事件时有发生。当前全国市、县级以下实验室主要采用酶联免疫吸附法来检测猪尿、组织中克伦特罗的残留。笔者通过试验对猪尿、猪肝及猪血清中克伦特罗检测的回收试验分析, 判定实验室过程是否处于可控范围, 对判定检测结果准确性有一定的实际意义。
1 材料与方法
1.1 材料
1) 试验仪器。Sunrise酶标仪 (滤光片波长为450 nm/630 nm) , 离心机 (3 000~4 000 r/min) , 微量移液器 (10~300μL, 单道、多道) , 氮吹仪。
2) 试验材料。试验用6头育肥猪所采食饲料中添加5 mg/kg盐酸克伦特罗, 连续饲喂20 d后停止, 休药期满20 d时, 同时采集猪血清、猪尿及猪肝样品, 对应编号。
3) 试验试剂。酶联免疫检测试剂盒 (购自北京维德维康生物技术有限公司) 、乙酸乙酯 (分析纯) 、异丙醇 (分析纯) 等。
1.2 方法
1) 试样的制备。猪尿、猪血清:3 000 r/min离心10 min, 取上清液作为供试样品。猪肝:准确称取 (2.00±0.01) g样品, 加入6 m L 0.2 mol/L高氯酸溶液;室温 (25℃) 下, 剧烈涡动2 min, 4 000 r/min离心10 min, 将上清液转入新的离心管中, 用1 mol/L Na OH溶液调p H值至11.6左右;加入8 m L乙酸乙酯-异丙醇 (8:2) 溶液, 室温下剧烈涡动2 min, 4 000 r/min离心10 min, 取4 m L上层有机相于新的离心管中, 于60℃水浴中, 氮气吹干;加入500μL样品稀释液, 充分涡动1 min, 取上清液作为供试试料。
2) 加标回收方法。回收试验分为空白加标回收和样品加标回收。回收率是判定分析结果准确度的量化指标, 相对标准偏差是衡量结果精密度的量化指标。本试验主要研究ELISA方法测定盐酸克伦特罗时, 平行样测定结果的相对标准偏差、空白加标回收率、实际样品加标回收率、空白加标回收率相对标准偏差及样品加标回收率相对标准偏差5个质控指标的定量评价标准。
3) 加标量。加标量为检出限的2~6倍。根据农业部盐酸克伦特罗的最低检测标准1μL/L标准, 猪尿、猪血清试料空白加标和实际样品加标的加标量为分别2、4和6μL/L3个浓度, 每个加标量浓度作6个平行, 同时做6个平行的样品检测;猪肝试样分别在样品处理前和处理完成后进行加标试验。检测过程始终在相同的试验条件下进行, 减少人员、仪器、环境等条件变化对结果产生的影响。
4) 检测步骤。按ELISA试剂盒说明书操作。超出标准曲线的样品按一定的比例用蒸馏水稀释后进行检测。
5) 回收率、相对标准偏差的计算。
相对标准偏差 (RSD) 是样本标准偏差和回收率平均值间的百分比值, 相对标准偏差值越小, 检测结果精密度越高。其计算公式为:
2 结果与分析
猪尿、猪血清加标回收率见表1, 样品中克伦特罗含量见表2, 猪肝加标回收试验结果见表3, 空白加标回收试验结果见表4。
1) 由表1和表2可知, 不同样品中添加不同浓度标准品, 加标回收率为60.2%~100.5%, 在试剂盒规定的回收率范围 (60%~120%) 内;精密度均在相同的范围内, 表明检测结果在实验室内得到了有效控制。
2) 由表3可知, 样品处理前加标回收率为60.2%~79.6%, 样品处理后加标回收率为85.6%~95.6%, 样品处理后加标回收率明显高于样品处理前的加标回收率。表明样品处理过程对试验结果准确性产生很大的影响, 试验时应考虑样品处理过程中对试验结果产生影响的因素。
3) 由表2和表4可知, 试样及空白加标重复测定结果相对标准偏差均小于0.5%, 说明检测操作过程对测定结果的影响相对较小, 在试验误差允许范围内。
3 讨论
1) 加标回收率反映了检测结果的准确度, 相对标准偏差反映了检测结果的精密度, 可有效的运用到克伦特罗药物残留的检测中, 对试验分析的准确度有着较好的监控作用, 能够及时发现试验过程中存在的问题是由于系统误差产生还是偶然误差产生的, 并提出改进的方法, 有效提高检测人员的技术水平。
2) 由试验结果可知, 向含有克伦特罗的猪尿、猪血清添加不同浓度标准品, 回收率和空白添加回收率基本相同, 因此, 设计回收试验时, 可直接用空白加标回收作为质量控制的手段之一。猪肝样品需进行复杂的样品前处理程序, 设计回收试验时, 最好在样品处理前添加克伦特罗, 以便能及时发现影响结果准确性的因素, 采取有效措施加以改正。
3) 在检测过程中应控制好试验条件, 避免影响试验结果的各种因素 (如人员、仪器、环境、检测方法等) 发生变化。应合理设计回收试验, 评价试验结果的可信度, 对发现结果存在较大偏移的, 应立即采取有效措施, 取得满意的结果。
4) 加标回收试验是实验室质控手段的一种, 具有简单、易操作等特点, 特别适合于样本数量大的检测, 但在实际检测工作中需要结合其他质控方法, 对实验室检测结果实施全面质量控制。
摘要：为判定用酶联免疫吸附法测定克伦特罗及其残留的结果准确性, 笔者对猪尿、猪肝及猪血清中克伦特罗进行了检测及回收试验分析。结果发现:用酶联免疫吸附法测定克伦特罗及其残留的实验室过程处于可控范围内, 检测结果准确、可靠;但猪肝样品的处理会对检测结果产生一定影响, 应加以避免。
关键词：加标回收试验,检测,克伦特罗,残留,应用
加标回收试验 篇2
由于生化需氧量的测定要通过估计其BOD5值大小确定是否稀释、接种、稀释倍数为多少等来进行测定, 因而其结果不仅受水体有机物含量、溶解氧影响, 还受稀释水、取样体积、稀释倍数等的影响, 特别是稀释倍数影响较大, 如果加入标样, 其稀释倍数就会发生很大改变, 测定过程极为复杂, 测定结果也不一定准确, 因此在日常的样品分析过程中, 一般不要求做加标测定。为配合省站“水环境常规监测项目质量控制研究”, 特作此实验。
1 实验内容及具体要求
1.1 实验内容:
全程序空白和空白加标、标准样品和标准样品加标。
1.2具体要求:
数据不少于7组, 不能一天内完成测试7组数据, 至少测试3天;做2个空白加标, 其中一个的加标参考量按检出限 (2.0mg/L) 的3~4倍加入, 另一个按加标参考量按检出限的5~6倍加入;做2个标准样品加标, 其中一个的加标参考量按检出量的0.5倍加入, 另一个按加标参考量按检出量的1倍加入。
2实验方法
采用稀释与接种法 (GB/T 7488—1987) 。
3 实验仪器及试剂
3.1 仪器
恒温培养箱 (20±1℃) 、10L细口玻璃瓶、1000L量筒、玻璃搅棒、容积约300m L并带有磨口玻璃塞及钟形口的溶解氧瓶、虹吸管。
3.2 试剂
硫酸镁溶液、氯化钙溶液、氯化铁溶液、磷酸盐缓冲溶液、接种水及接种稀释水 (临用现配) , 各溶液配制方法参照《水和废水监测分析方法 (第四版) 》生化需氧量稀释接种法中配制方法;国家有证标准物质 (107±8 mg/L) 。
4 操作步骤
4.1 不经稀释水样的测定
对溶解氧含量高、有机物含量较少的样品如空白及空白加标 (1) , 可直接采用虹吸法将室温下混匀的水样转移入两个溶解氧瓶内, 转移过程中应注意不使气泡产生。其中一瓶随即测定溶解氧, 另一瓶瓶口进行水封后放入培养箱, 在20℃±1℃培养5d, 测定其溶解氧, 5d前后二者溶解氧之差即为BOD5值, 以氧的mg/L表示。
4.2 需经稀释水样的测定
有机物含量较高的样品, 需用接种稀释水将其稀释后再培养测定, 以保证其中有机物得到充分的分解。稀释时应根据实践经验, 大体估计其BOD5值, 选择适宜的稀释倍数, 稀释程度应使培养过程中所消耗的溶解氧大于2 mg/L, 而剩余溶解氧在1 mg/L以上。为避免水样酸碱性及有毒物等干扰, 使测定结果真实可靠, 本实验所需水样均采用标样配制而成。
按照选定的稀释比例, 用虹吸法沿筒壁先引入部分接种稀释水于1000 m L量筒中, 加入需要量的均匀水样, 再引入接种稀释水至需要量, 用带有橡胶板的玻璃棒小心上下搅匀, 搅动过程中应防止气泡产生, 然后按不经稀释水样的测定相同的操作步骤进行装瓶、测定5d前后溶解氧。同时用接种稀释水按相同方法做空白实验。
5 数据结果及可靠性检验
5.1 数据结果
5.2 可靠性检验
5.2.1 异常值检验
为判断所得数据的可靠性, 分别将各组所测数据从小到大排列, 记为X1、X2…X7, 指定α=1%, 进行Dixon双侧检验, 找出是否有异常值。其计算公式为D/=r7/= (x2-x1) / (x6-x1) 、D=r7= (x7-x6) / (x7-x2) 。各D及D/计算值如下:
查表得D~0.99 (7) =0.680, 各D及D/均小于D~0.99 (7) , 故各组数据均未检出高低端异常值, 因而所有测得数据在进行平均值、误差等计算中无需剔除。
5.2.2 准确度检验
准确度用以度量分析结果与真值之间的符合程度, 决定着分析结果的可靠性, 用绝对误差和相对误差表示。根据水质监测实验室质量控制指标———水样测定值的准确度允许差指标, BOD5浓度在3~100 mg/l时, 室内相对误差RE%≤±20%, 将各组测得数据最低值和最高值的相对误差分别记为RE%、RE/%通过计算各组数据的RE%并与之进行比较, 以判断所测数据的准确性。计算公式为:RE%=绝对误差/真值×100%= (测定值-真值) /真值×100%, 各RE%及RE/%计算值如下:
各组数据的相对误差RE%均小于±20%, 均在允许范围内, 说明所测数据较为准确。
通过异常值和准确度检验, 说明所测数据比较可靠, 由此得出的结论也具有可信性。
5.3 加标回收率计算
在测试样品中加入一定量标准物质测定其回收率是目前实验室常用的准确度评价方法之一, 将各组测得数据最低值和最高值的回收率分别记为P、P/, 运用公式P= (加标试样测定值-试样测定值) /加标量×100%进行计算。
6 结论
6.1 空白加标量为检出限的3~4倍, 空白加标回收率在99.4%~109.9%之间, 平均加标回收率为104.3%;加标量为检出限的5~6倍, 空白加标回收率在93.4%~105.6%之间, 平均加标回收率为99.1%。
6.2 标样加标量为检出量的0.5倍加入, 加标回收率在126.2%~142.0%之间, 平均加标回收率为131.8%;加标参考量按检出量的1倍加入, 加标回收率在83.6%~114.5%之间, 平均加标回收率为101.9%。
6.3 由以上实验结果可以看出, 空白加标量为检出限的3~4或5~6倍时加标回收率变化不大, 说明空白加标回收率受加标量的影响不大;标样加标量分别为检出量的0.5倍、1倍时加标回收率变化较大, 说明标样加标回收率受加标量的影响较大, 加标量为检出量的1倍时加标回收率较为理想。
参考文献
[1]《水和废水监测分析方法》编委会.水和废水监测分析方法 (第四版) [M].北京:中国环境科学出版社, 2002.
[2]云南省环境监测总站.“水环境常规监测项目质量控制研究”实验室分析注意事项.
加标回收试验 篇3
我国合成洗涤剂的年产量在100万t以上, 主要成分LAS, 使用后绝大部分LAS随着生活污水进入天然水体。洗涤剂中作为助洗剂磷酸盐与水体中的氮素联合作用, 是引起水质富营养化的一个重要原因, 严重时会导致鱼类大批死亡。水体中的洗涤剂还能增强对硫磷等有机磷农药以及石油产品对鱼类的毒性。 由于LAS含有苯核, 在环境中不易被完全降解。LAS在河水中15d的消失百分率为100%, 在海水中14d为97%。经研究, LAS生物降解的机理是烷基链的甲基的氧化、β-氧化、芳香环的氧化降解和脱磺化, 摄入生物体内的LAS可以逐步蓄积, 当蓄积量超过一定程度时, 就会影响生物的健康, 因此, 它对水生生态系统的危害及人类健康影响已经成为人们普遍关注的问题, 现阴离子表面活性剂是我国水体生活污染物污染的重要监测指标。
然而, 国标GB/T7494-1987阴离子表面活性的测定亚甲蓝分光光度是采用手工分析方法, 由于手工分析时萃取两次操作过于繁杂因而重现性较差, 阴离子表面活性LAS的加标回收率问题一直未受到关注, 特别是国标GB/T7494-1987在“干扰与消除”中提到“主要被测物以外的有机硫酸盐、磺酸盐、羧酸盐、酚类及无机的硫氰酸盐、氰酸盐、硝酸盐、氯化物等, 它们或多或少的与亚甲蓝作用, 生成可溶于氯仿的蓝色化物, 使结果偏高;通过水洗可消除这些干扰, 其中硝酸盐和氯离子干扰大部分消除”, 起了误导作用, 致使多数监测人员以为常见无机离子是对LAS的测量产生正干扰。LA-CHAT公司生产的流动注射仪QC 8500采用在线微膜双萃取法, 实现了连续自动萃取, 重现性和精度大为改进, 从而使查找LAS的加标回收率偏低的原因有了可能。但是有些流动注射分析仪的使用者仍然未发现LAS加标回收率偏低的问题, 如2011年由江苏省环境监测中心编制的《水质阴离子表面活性的测定流动注射-分光光度法》 (征求意见稿) 5.6“干扰和消除”仍然认为干扰因素仅限于GB/T7494-1987提到的且未提出新的消除方法, 6.3“方法验证结论”中加标回收率为88.5%~112%, 未提到系统性偏低。又例如, 王丽平等在《岩矿测试》2009年6期《在线萃取流动注射法测定水体中阴离子表面活性剂》一文中提到, 北京地下水实际水样LAS加标回收率97.8%~112.6%, 马琳、王涛在工程科技2007年6期《流动注射法测定水中阴离子表面活性剂及条件改进》“各类水质进行实际样品的加标回收率为90.6%~108.1%”。
笔者根据系列实验, 得出与之不同新的结论, 证实LAS加标回收率系统性偏低且与样品中阴离子表面活性剂的离子活度有关。
2 实验部分
2.1 方法原理
本实验采用流动注射分析仪 (FIA) 测定水样中阴离子表面活性剂, 该仪器将一定体积的样品注射到一个流动的、无空气间隔的试剂溶液连续载流 (20%的甲醇) 中, 样品中阴离子表面活性剂与子染料亚甲蓝反应, 生成蓝色的亚基蓝活性物质 (MBAS) 被氯仿萃取, 通过微孔分离膜实现水相和有机相分离, 在650nm处进行比色。
2.2 试剂与仪器
2.2.1 试剂
十二烷基苯磺酸钠500mg/L (国家标准物质研究中心) ;氯仿, G.R.;硫酸镁, G.R.;硫酸铜, A.R.;硫酸亚铁, A.R.;十二水硫酸铝钾, A.R.;铁锰铜锌混标 (5%硝酸固定) , 美国O2SI公司, 1000mg/L。
2.2.2 仪器
流动注射分析仪 (型号8500, LACHAT公司) ;纯水机 (millipore公司) 。
2.3 实验部分
2.3.1 高离子浓度状态下LAS的加标回收率实验
分别取MgSO4、CuSO4、FeSO4、KAl (SO4) 、美国O2SI公司的铁锰铜锌混标 (编号为CFGG-161984-02-01) 五种试剂, 用纯水机制备的去离子水配制成表1中的浓度并分别编号为 (1) 、 (2) 、 (3) 、 (4) 、 (5) 。另取1.00mL 10mg/L LAS标准溶液, 用上述溶液分别定容至10mL, 使用流动注射分析仪 (LACHAT QC8500) 测量溶液的LAS浓度 (理论浓度为1.00 mg/L) , 同步把这5种溶液作为样品测量LAS的浓度, 重复测量3次并计算加标回收率。
结果表明:地表水、地下水中常见的无机阴离子和阳离子均影响LAS的加标回收率。流动注射分析法因在萃取时使用强酸和强碱来保证萃取效率的统一, 手工萃取时需调样品至中性, 因此, 本次实验首先可排除H+和OH-的干扰。通过比较阴离子的摩尔浓度, (1) 、 (3) 、 (4) 溶液硫酸根浓度相接近, 而加标回收率差异超过18%, 说明SO42-不是影响加标回收率的主要原因。 (1) 、 (3) 溶液中阳离子浓度相近, 而加标回收率超过18%, (1) 、 (2) 阳离子浓度差异较大, 但加标回收率反而相接近, 说明阳离子也不是影响加标回收率的主因。Cu、Fe、Mg、Al、K络合能力依次降低, (1) ~ (5) 种溶液的LAS加标回收率未按照此规律排列;Cu2+有氧性, Mg、Al、K无氧化性, 而Fe2+有较强还原性, (1) ~ (5) 种溶液的LAS加标回收率也未按照氧化能力的规律排列, 因此, 可排除氧化反应和络合反应对最终结果的影响。在样品中加入EDTA, 进行同样的加标回收率实验, 亦可验证本点结论。 (5) 溶液中含有Fe、Mn、Cu、Zn共4 种阳离子, 但都低于 (1) 、 (2) 、 (3) 、 (4) 溶液, 只有NO3-浓度高于其它溶液中SO42-的浓度, 说明NO3-浓度也影响加标回收率, 结果见表2。
2.3.2 中等离子浓度状态下LAS的加标回收率实验
将编号 (1) 、 (2) 、 (3) 、 (4) 、 (5) 的溶液准确稀释5倍, 再次分别编号为 (6) 、 (7) 、 (8) 、 (9) 、 (10) , 另取1.00 mL 10 mg/L LAS标准溶液, 用上述溶液分别定容到10mL, 使用流动注射分析仪测量溶液的LAS浓度 (理论浓度为1.00mg/L) , 同步把这五种溶液作为样品测量LAS的浓度, 重复测量3次并计算加标回收率。
表2的结果表明:将溶液中稀释后, 相比2.3.1节的加标加收率均有所提高, 但仍然偏低较多。 (6) ~ (10) 五种溶液的加标回收率大小规律与2.3.1相同, 仍为以MgSO4溶液为基体的加标回收率最高, 而KAl (SO4) 2溶液最低。从表1和表2的测量结果可以推出结论, 溶液中的总离子浓度和离子的种类数是影响LAS加标回收率的关键, 说明这些离子并非与直链烷基苯磺酸钠 (即LAS标准物质) 发生化学反应, 而是由于溶液中这些常见离子的存在, 使直链烷基苯磺酸钠的活度系数变小, 最终表现为加标后浓度偏低, 造成加标回收率系统性偏低。假定电导率为1μS/cm氯化钾溶液 (近似于纯水) 中十二烷基苯磺酸钠的活度系数为1, 按照活度系数的极限公式计算出在 (6) ~ (10) 溶液中直链烷基苯磺酸钠的活度系数均值应为0.642, 说明实验结果与德拜-休克尔公式基本相符。
2.3.3 人工海水中LAS加标回收率实验
(1) 准确称量30.000g纯度为GR的氯化钠, 定容于1000 mL超纯水中, 配制成3% 氯化钠溶液, 另取1.00mL 10mg/L LAS标准溶液, 用上述溶液定容至10mL, 使用流动注射分析仪 (LACHAT QC 8500) 测量溶液的LAS浓度 (理论浓度为1mg/L) , 同步把3%氯化钠溶液作为样品测量LAS的浓度, 重复测量5次的平均加标回收率55.2%。
(2) 通过调查多个沿海实验室发现, 过程按照GB/T17378.4-2007配制人工海水测得的标准曲线的b值在0.00154~0.00171 (L/μg) 区间, 而按照GB/T7494-1987测得的标准曲线的b值在0.00320~0.00391 (L/μg) 区间。两者差别仅为人工海水与纯水的区别, 其余操作步骤完全相同, 而斜率测得值相差近一倍, 说明人工海水即3%氯化钠溶液是导致斜率相差一倍的唯一原因。
结果表明:实验结果表明氯离子或钠离子达到一定浓度时会使阴离子表面活性剂的活度降低, 无法与亚甲蓝发生反应, 更加不能萃取至氯仿相, 最终导致结果为LAS的加标回收率偏低。
2.4 实验结论
(1) 阴离子表面活性剂的加标回收率因受到常见离子影响普遍偏低, 偏低原因不是与某种离子的发生反应;而是由于这些常见离子的存在, 使直链烷基苯磺酸钠的活度系数变小, 最终表现为加标后浓度偏低, 造成加标回收率系统性偏低。
(2) 在实际水样监测中, 一般性水体如河流、地下水、海水及处理过的废水因其总离子强度较高, 测量过程中必须考虑待测物活度受总离子强度的影响而测量偏低。这些常见离子如钾、钠、镁、氯化物、硝酸根等无法通过正常化学段消除其干扰, 最可行的消除干扰的方法就是测量加标回收率, 用加标回收率计算其实际浓度。
摘要：探讨了阴离子表面活性剂 (LAS) 在测量过程中加标回收率偏低的问题:不同基体的加标回收率在30.0%90.0%之间, 未达到环境监测质控要求, 且各种水样的加标回收率均不一样。通过实验, 初步判断出了偏低的原因与萃取效率和LAS的活度系数有关。
关键词：LAS,阴离子表面活性剂,加标回收率,流动注射
参考文献
[1]陈习娟, 何双, 许丹梅.连续流动注射分析仪测定水体中阴离子表面活性剂[J].江西化工, 2011 (2) .
[2]田永斌, 柳淼, 罗志华.亚甲蓝分光光度法测定水体阴离子表面活性剂方法的探讨[J].北方环境, 2011 (8) .