双水相萃取（共8篇）
双水相萃取 篇1
随着基因工程、蛋白质工程、细胞培养工程、代谢工程等高新生物技术研究工作的广泛展开,各种生化新产品不断涌现,但由于大部分的生物产品原液是具有低浓度和生物活性的,对分离条件以及环境要求及其苛刻,使得传统的液液萃取已不能适应分离要求,因此一种新型的液液分离技术-双水相萃取技术应运而生。双水相萃取技术是利用组分在两水相间分配的差异而进行组分的分离提纯的技术。由于双水相萃取分离过程条件温和、可调节因素多、易于放大和操作,并可借助传统溶剂萃取的相关理论和经验,不存在有机溶剂残留问题,特别适用于生物物质的分离和提纯。目前,双水相萃取技术已被广泛地应用于医药化学、细胞生物学、生物化工和食品工业等领域,被认为是生物下游工程中一种具有广阔应用前景的分离技术。
1 双水相萃取原理
双水相萃取与水-有机相萃取的原理相似,都是依据物质在两相间的选择性分配,但萃取体系的性质不同。当物质进入双水相体系后,由于表面性质、电荷作用和各种力(如憎水键、氢键和离子键等)的存在和环境的影响,使其在上、下相中的浓度不同。对于某一物质,只要选择合适的双水相体系,控制一定的条件,就可以得到合适的分配系数,从而达到分离纯化之目的。
2 双水相萃取体系的特点[1]
1)整个体系的含水量高(70%~90%),萃取是在接近生物物质生理环境的条件下进行,故而不会引起生物活性物质失活或变性;
2)单级分离提纯效率高。通过选择适当的双水相体系,一般可获得较大的分配系数,也可调节被分离组分在两相中的分配系数,使目标产物有较高的收率;
3)传质速率快,分相时间短。双水相体系中两相的含水量一般都在80%左右,界面张力远低于水-有机溶剂两相体系,故传质过程和平衡过程快速;
4)操作条件温和,所需设备简单。整个操作过程在室温下进行,相分离过程非常温和,分相时间短。大量杂质能与所有固体物质一起去掉,大大简化分离操作过程;
5)过程易于放大和进行连续化操作。双水相萃取易于放大,各种参数可以按比例放大而产物收率并不降低,易于与后续提纯工序直接相连接,无需进行特殊处理,这对于工业生产来说尤其有利;
6)不存在有机溶剂残留问题,高聚物一般是不挥发性物质,因而操作环境对人体无害;
7)双水相萃取处理容量大,能耗低。主要成本消耗在聚合物的使用上,而聚合物可以循环使用,因此生产成本较低;
3 双水相萃取相关理论的发展
虽然双水相萃取技术在应用方面取得了很大进展,但目前这些工作几乎都只是建立在实验数据的基础上,至今还没有一套比较完善的理论来解释物质在体系中的分配机理。
1955年由Albertson首先利用两水相技术分离生物分子,他主要研究了PEG/Dex系统和PEG/(NH4)2SO4系统在分离提纯中的应用。在随后的几十年中,这项技术有了长足的发展。在双水相的分离模型研究中,主要提出了两类模型[2,3],Edmond等人提出的渗透维里模型,即Edmond-bgston方程;Flory和Huggins根据热力学的基本原理提出Flory-Huggins晶格模型。前者在预测聚合物的成相行为和蛋白质的分配上有较高的准确度,后者在粒子的能量概念上可以很好地拟合实验数据。自20世纪80年代中期以来,各国学者开展了进一步的研究工作,各类用于计算生物物质在双水相系统分配系数的模型也时有报道,诸如Baskir晶体吸附模型[4]、Hayne模型、Pitzer模型[5]、Grossman自由体积模型等,但结果均难以令人满意。1989年,Diamond等[6]以Flory-Huggins理论为基础,用把相间电势表达为上下相浓度差的二次函数来关联分配系数的方法,提出了能对肽和蛋白质在聚合物/聚合物/水体系的分配系数很好关联的Diamond-Hsu模型。此后,针对用该模型计算蛋白质在聚合物/盐两水相系统中的分配系数时精确度不高的缺点,Diamond等提出了改进的Diamond-Hsu模型,进一步提高了Diamond-Hsu模型的精确度和普适性。Pessoa等[7]通过引入对聚合物水溶性和预分离物质(氨基酸、肽、蛋白质)的水化壳进行描述的因子得到了Flory-Huggins改进模型,此模型很好地模拟了73种由PEG/Dex组成的双水相体系的相平衡和分配系数。
4 双水相萃取技术的应用进展
4.1 在生物工程中的应用
双水相技术作为一种生化分离技术,由于其条件温和,易操作,可调节因素多,并可借助传统溶剂萃取的成功经验,而被认为是一种生物下游工程初步分离的单元操作。
Babu[8]等用18%的PEG1500与14%的磷酸盐组成的双水相从菠萝中萃取菠萝蛋白酶和多酚氧化酶,菠萝蛋白的纯化倍数为4.0,酶活回收率达到228%,而多酚氧化酶的纯化倍数为2.07,酶活回收率达到90%。Chethana[9]等用PEG6000与(NH4)2SO4组成的双水相从甜菜根中萃取甜菜色素,70%~75%甜菜色素被萃取到上相,90%以上的糖类被萃取到下相。Harve和Bajpai[10]利用PEG/Dex双水相系统分离纯化了假单胞杆菌胞内的立体专一性酒石酸脱氢酶。Duarte等[11]采用16%的PEG6000和8%的磷酸盐组成的双水相系统从三种不同的微生物中纯化碱性木聚糖酶。Sarote等[12]利用80%的PEG及15%的(NH4)2SO4组成的双水相体系从木瓜乳浆中萃取出高纯度的木瓜蛋白酶。Chia-Kai Su[13]在室温以及PH=10的条件下,利用16.1%的PEG和12%的硫酸盐,0.5mol/L高氯酸钠组成的双水相体系成功地从鸡蛋蛋清中分离出高纯度的溶解酵素。Louwrer[14]用乙醇/磷酸氢二钾体系萃取分离BSA,α-酪蛋白,核糖核酸酶等生物物质。张兰威等[15]运用20%的PEG1000和25%的Mg SO4组成的双水相从风干香肠中分离提取蛋白酶,最高酶活12.37U/μg,纯化倍数为4.61,回收率为85%。张佰鹏等[16]采用12.0%的PEG、13.3%的(NH4)2SO4和0.003%的Na Cl组成的双水相萃取α-淀粉酶抑制剂,分配系数为4.40,酶活回收率为71.41%。
4.2 在发酵工程中的应用
由于发酵液中成分比较复杂,目标产物含量低,而传统的分离纯化方法步骤繁琐,导致产品回收率低,成本居高不下。目前国内外已经有利用双水相休系从发酵液萃取分离目标产物的报道和研究,并取得了一些成绩。
Pan等[17]利用PEG1500/Na H2PO4体系从Trichoderma koningii发酵液中分离纯化β-木糖苷酶,该酶主要分配在下相,下相酶活回收率96.3%,纯化倍数33。Maria等[18]利用PEGl000/Na H2PO4体系从Fusarium solanipisi发酵液中分离纯化角质酶,该酶主要分配在上相,酶活回收率91%,纯化倍数4.1。Mirjana[19]利用PEG4000/Dex体系从Polyporus squamosus发酵液中分离果胶酶,该酶主要分配在上相,酶活回收率80.2%,纯化倍数2.45。Martinha[20]利用PEG8000/(NH4)2SO4体系从Kluyveromyces marxianus发酵液中分离胞外多聚半乳糖醛酸酶,该酶主要分配在上相,酶活回收率91%,纯化倍数19。冯菁等[21]采用8%的PEG4000、13%的Na2SO4和6%Na Cl组成的双水相直接从重组巴氏毕赤酵母发酵上清液中分离人溶菌酶,双水相萃取率达到96.63%,纯化因子为6.5。黄瑛等[22]采用10%的PEG 2000、15%的磷酸盐和1%的Na Cl组成的双水相系统从洋葱假单细胞G-63发酵粗酶液中提取脂肪酶,当系统的PH为8.0时,分配系数4.36,纯化因子3.98,脂肪酶的回收率达到87.25%。
4.3 在药物方面的应用
薛珺等[23]采用PEG800与吐温80组合表面活性剂、硫酸铵、水形成双水相体系萃取芦丁,芦丁在该双水相体系的平均萃取率为95.0%。谢涛等[24]利用PEG4000/K2HPO4组成的双水相体系从三七中萃取三七皂苷,三七总皂苷的分配系数为14.2,回收率为96%;赵爱丽等[25]利用26%的PEG6000与18%的K2HPO4组成的双水相体系分离纯化黄苓苷,黄苓苷的分配系数达到29.8,收率达到98.6%。石慧等[26]利用25%PEG400、12%(NH4)2SO4和3%Na Cl组成的双水相体系从加杨叶萃取液中萃取加杨叶总黄酮,萃取率达到95%以上。朱自强等[27]用8%的PEG2000与20%的(NH4)2SO4组成的双水相系统直接处理青霉素G发酵液,分配系数高达58.39,浓缩倍数为3.53,回收率为93.67%,青霉素G对糖的分离因子和对杂蛋白的分离因子分别为13.36和21.9。
4.4 在金属分离及络合物中的应用
双水相还可用于稀有金属/贵金属分离,传统的溶剂萃取方法存在着溶剂污染环境,对人体有害,运行成本高,工艺复杂等缺点。双水相技术萃取技术引入到该领域,无疑是金属分离的一种新技术。在聚乙二醇2000/硫酸按/偶氮肿(Ⅲ)双水相体系中,实现了Ti(Ⅳ)与Zr(IV)的分离[28];在聚乙二醇2000/硫酸钠/硫氰酸钾双水相体系中,实现了Co(Ⅱ)、Ni(Ⅱ)、Mo(Ⅵ)等金属离子的定量分离[29]。在聚乙二醇/硫酸钠双水相体系中,实现了从碱性氰化液中萃取分离金[30]。在溴化钾/乙醇/硫酸铵双水相体系中,实现了Au B与Al B、Ni A、Mn A、Cr B、Co A、Fe B、Zn A、Cu A、Mo E、UC的分离[31]。在聚乙二醇2000/邻苯二酚紫/硫酸钠体系中,实现了铍的萃取[32]。在硫酸铵/乙醇/溴化十六烷基三甲铵中,能够使Bi(Ⅲ)与常见离子Mn(Ⅱ)、Fe(Ⅲ)、Co(Ⅱ)、Ni(Ⅱ)、Zn(Ⅱ)、AI(Ⅲ)等完全分离[33]。在聚乙二醇/硫酸铵/铬天青S体系中,实现了La(Ⅲ)与T(Ⅳ)之间的分离[34]。
5 双水相技术的发展趋势
5.1 廉价新型双水相系统的开发
目前双水相萃取技术走向工业化所需解决的最大问题是构成双水相成相系统组分的价格十分昂贵。为了解决这个问题,国内外进行了大量的研究,一方面用廉价的无机盐代替以往常用的昂贵的葡聚糖。硫酸钠、硫酸镁、碳酸钾等盐与PEG形成的双水相系统现已经大量用于萃取操作;另一方面开发可替代聚乙二醇和葡聚糖的高聚物。变性淀粉PPT、阿拉伯树胶、Reppa/PES的淀粉衍生物、Pulluan的微生物多糖、糊精、麦芽糖糊精、乙基羟乙基纤维素等取代葡聚糖,乙醇、异丙醇、丙酮、四氢呋喃、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、羟基纤维素等替代PEG,均取得阶段性的成果。
此外,有利用临界胶束浓度下表面活性剂的特异自组织行为及良好的稳定性形成的ATPS,此类ATPS分相依据的是胶束的形成,包括由非离子型表面活性剂组成的ATPS和由离子型表面活性剂组成的ATPS。这些由表面活性剂组成的ATPS与传统ATPS相比有含水量更高,两相更容易分离,表面活性剂用量很少且可循环利用等独特的优点。
5.2 亲和双水相萃取技术
亲和吸附具有专一性强,分离效率高等特点。利用其特点,将亲和吸附与双水相萃取技术相结合,即对成相聚合物进行化学修饰。该体系不仅具有萃取系统处理量大、放大简单等优点,而且具有亲和吸附专一性强、分离效率高的特点。
5.3 生物转化与双水相萃取技术相结合
在生物转化过程中,随着转化的产物量的增加,常会抑制生化过程的进行。因此,及时移走产物是生化反应中的主要问题之一。将双水相系统与生物转化相结合,形成双水相生物转化,解决了生物转化过程中存在的产物抑制以及生物催化剂回收利用两方面的问题,为生物转化赋予了新的内涵。
5.4 双水相萃取与膜分离相结合
利用中空纤维膜传质面积大的特点,将膜分离与双水相萃取相结合,可以大大加快萃取传质速率。利用膜将双水相体系隔开,可解决双水相萃取的乳化和生物活性物质在界面的吸附问题。因此,将膜分离同双水相萃取技术相结合,是解决双水相体系易乳化问题及加快萃取速率的有利手段。
5.5 双水相萃取与细胞破碎过程相结合
利用高速珠磨机为设备,将细胞破碎和双水相萃取同时在珠磨机内进行。由于珠磨机内有良好的混合条件,PEG、无机盐和水得到充分混合,形成均匀的双水相分散体系。经过珠磨机加工的匀浆直接用离心机分相,细胞碎片分配在下相,胞内产物分配在上相。这种方法不仅节省了萃取设备和时间,而且由于双水相对很多蛋白质具有保持活性的特点,可以避免胞内产物的损失。
5.6 双水相电泳
双水相电泳技术就是电泳技术与萃取技术交叉藕合形成的一种新型分离技术,该技术是在多液相状态,既可以克服对流(返混)的不利影响,又有利于被分离组分的移出。
此外,国内外又相继开展了微重力双水相萃取、高速逆流双水相分配、双水相电萃取、温度诱导相分离双水相萃取等新技术的研究。
6 双水相萃取技术的局限和未来展望[1]
目前,双水相萃取技术已被研究用于众多生物产品的分离提纯,并显示出众多其他分离技术不具备的优点,是一种应用前景广阔的新型生物分离技术。但是,要将这一技术开发应用到大规模生产过程,还有许多理论和实践方面的技术问题有待解决。主要表现在如下几个方面:
1)聚合物/聚合物构成的双水相体系具有良好的分离性能,但用于构造双水相体系的成相聚合物的价格都比较昂贵,对于一般的生物产品,分离成本过高,从经济上是不合理的。
2)虽然通过选择适宜的双水相体系和操作条件,可获得被分离物质在两相间较大的分配系数和较高的纯化倍数,但目标产物与成相物质的分离比较困难。
3)双水相体系界面张力较小,虽有利于提高传质效率,但是较小的界面张力会易导致乳化现象的产生,使相分离时间延长,分离效率降低。
4)双水相体系中组分间的作用非常复杂,目前没有建立一套较为完整的理论和方法解释和预测物质在双水相体系中的相行为和被分配物质在两相中的分配行为。
5)缺乏对双水相过程的工程放大及设备方面的研究,在体系流体力学,相际间的传质,传递过程方面研究很少。研究的方法基本上还是通过实验的方法,研究的结果只是建立在实验的基础上,大部分情况下不能外延,缺乏对过程规律的认识。
6)对双水相萃取工艺整体的集成优化研究还不足,对分离过程中产生的大量含成相物质的稀溶液,还没有找到一条科学合理的利用及处理途径,大量含盐或含成相组分的废水溶液难于回收及处理。
随着生物技术的发展,必将促进双水相萃取体系的完善,包括新萃取体系的开发[35,36,37]、工艺优化、萃取剂回收、体系分相技术、萃取设备和基础理论研究等。从而更显示出双水相分离技术在生物物质分离的独特优点。
摘要：双水相萃取技术作为一项新的分离技术日益受到重视,它与传统的萃取方法相比有独特的优点。本文综述了双水相萃取技术基本原理、特点、应用及热力学模型,并对双水相萃取技术存在的问题和发展趋势作了论述。
关键词：双水相萃取,分离纯化,生物物质
参考文献
[1]王雯娟.双水相萃取菠萝蛋白酶的研究[D].广西:广西大学化学化工学院,2004.
[2]Furuya T,Iwai Y,TanakaY,et al.Measurement and corre-lation of partition coefficients of Hydrolytic enzyimes for dex-tran+poly(ethylene glycol)+water aqeueous two-PHase systems at20℃[J].Fluid PHase Equilbria,1995,110:115-128.
[3]Flory P J.Principles of Polymer Chemistry.NewYork:Comell Press,1953.
[4]Peng Q H,Li Z C,Li Y G.Experiments correlation and prediction of protein partition coeffi cient in aqueous two-phase systems containing PEG and K2HPO4-KH2PO4[J].Fluid PHase Equilibria,1995,107:303-315.
[5]Pitzer K S.Thermodynamics of electrolytes I-Theoretical basis and general equations equations[J].PHys.Chem.,1973,77:268-277.
[6]Doamond A D,Hsu J T.Fundamental studies of biomolecule partition in aqueous two-phase system[J].Biotechnology and Bioengineering,1989,34:l000-1014.
[7]Pessoa F P A,Mohamed R S.A salvation-basedthermody-namic model for aqueous two-phase systems[J].Braz.J.Chem.Eng.,2001,18(4):449-458.
[8]Babu B R,Rastogi N K,Raghavarao K S M S.Liquid–liquid extraction of bromelain and polyphenol oxidase using aqueous two-phase system[J].Chemical Engineering and Pro-cessing,2008,47:83-89.
[9]Chethana S,Nayak C A,et al.Aqueous two phase extrac-tion for purification and concentration of betalains[J].Journal of Food Engineering,2007,81:679-687.
双水相萃取 篇2
双水相体系逆流色谱技术在蛋白质分离中的应用
双水相体系逆流色谱技术结合了逆流色谱的高效率、高制备量以及双水相体系适于蛋白质分离的特点,且避免了由固体分离介质可能引起的不可逆吸附、失活和变性等问题,因此在蛋白质的分离方面具有独特的.应用价值.就双水相逆流色谱技术和相关仪器的发展,以及近年来在蛋白质分离方面的应用进行了较为详细的综述,并对在此基础上发展起来的一些新型逆流色谱分离技术进行了介绍.
作 者：李挺 曹学丽 董银卯 LI Ting CAO Xue-li DONG Yin-mao 作者单位：北京工商大学化学与环境工程学院北京市植物资源研究开发重点实验室,北京,100037刊 名：中国生物工程杂志 ISTIC PKU英文刊名：CHINA BIOTECHNOLOGY年，卷(期)：26(2)分类号：Q814.1关键词：双水相体系 逆流色谱 蛋白质 分离
双水相萃取技术研究进展 篇3
1 ATPE技术的原理及特点
1.1 双水相的形成
将两种不同的水溶性聚合物的水溶液混合时,当聚合物浓度达到一定值,体系会自然的分成互不相溶的两相,这就是双水相体系。双水相体系的形成主要是由于高聚物之间的不相溶性,即高聚物分子的空间阻碍作用,相互无法渗透,不能形成均一相,从而具有分离倾向,在一定条件下即可分为二相。一般认为只要两聚合物水溶液的憎水程度有所差异,混合时就可发生相分离,且憎水程度相差越大,相分离的倾向也就越大。
与一般的水-有机溶剂体系相比较,双水相体系中两相的性质差别(如密度和折射率等)较小。由于折射率的差别甚小,有时甚至都难于发现它们的相界面。两相间的界面张力也很小,仅为106~10-4N·m-1(一般体系为10-3~10-2N·m-1)。界面与试管壁形成的接触角几乎是直角。
可形成双水相的双聚合物体系很多,如聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)/葡聚糖(dextran,Dx),聚丙二醇(polypropyleneglycol)/聚乙二醇和甲基纤维素(methylcellulose)/葡聚糖等。ATPE中常采用的双聚合物系统为PEG/Dx,该双水相的上相富含PEG,下相富含Dx。除双聚合物系统外,聚合物与无机盐的混合溶液也可形成双水相,例如,PEG/磷酸钾(KPi),PEG/磷酸铵,PEG/硫酸钠等常用于生物产物的双水相萃取,PEG/无机盐系统的上相富含PEG,下相富含无机盐。
1.2 ATPE萃取原理
ATPE与水-有机相萃取的原理相似,都是依据物质在两相间的选择性分配,但萃取体系的性质不同。当物质进入双水相体系后,由于表面性质、电荷作用和各种力(如憎水键、氢键和离子键等)的存在和环境的影响,使其在上、下相中的浓度不同。分配系数K等于物质在两相的浓度比,各种物质的K值不同(例如各种类型的细胞粒子、噬菌体等分配系数都大于100或小于0.01,酶、蛋白质等生物大分子的分配系数大致在0.1~10之间,而小分子盐的分配系数在1.0左右),因而双水相体系对生物物质的分配具有很大的选择性。水溶性两相的形成条件和定量关系常用相图来表示,以PEG/Dextran体系的相图[9]为例(图1),这两种聚合物都能与水无限混合,当它们的组成在图1曲线的上方时(用M点表示)体系就会分成两相,分别有不同的组成和密度,轻相(或称上相)组成用T点表示,重相(或称下相)组成用B表示。C为临界点,曲线TCB称为结线,直线TMB称为系线。结线上方是两相区,下方是单相区。所有组成在系统上的点,分成两相后,其上下相组成分别为T和B。M点时两相T和B的量之间的关系服从杠杆定律,即T和B相重量之比等于系线上MB与MT的线段长度之比。
1.3 ATPE技术的特点
ATPE作为一种新型的分离技术,具有以下特点[10]:
(1)系统含水量多达75%~90%,两相界面张力极低(10-7~10-4N·m-1),有助于保持生物活性和强化相际间的质量传递,但也有系统易乳化的问题,值得注意。
(2)分相时间短(特别是聚合物/盐系统),自然分相时间一般只有5~15 min。
(3)双水相分配技术易于连续化操作。若系统物性研究透彻,可运用化学工程中的萃取原理进行放大,但要加强萃取设备方面的研究。
(4)目标产物的分配系数一般大于3,大多数情况下,目标产物有较高的收率。
(5)大量杂质能够与所有固体物质一起去掉,与其它常用固液分离方法相比,双水相分配技术可省去1~2个分离步骤,使整个分离过程更经济。
(6)设备投资费用少,操作简单,不存在有机溶剂残留问题。
2 ATPE的工艺流程
ATPE技术的工艺流程[11]主要由三部分构成:目的产物的萃取,PEG的循环,无机盐的循环。原则流程如图2所示。
(1)目的产物的萃取
原料匀浆液与PEG和无机盐在萃取器中混合,然后进入分离器分相。通过选择合适的双水相组成,一般使目标蛋白质分配到上相(PEG相),而细胞碎片、核酸、多糖和杂蛋白等分配到下相(富盐相)。第二步萃取是将目标蛋白质转入富盐相,方法是在上相中加入盐,形成新的双水相体系,从而将蛋白质与PEG分离,以利于使用超滤或透析将PEG回收利用和目的产物进一步加工处理。
(2)PEG的循环
在大规模ATPE过程中,成相材料的回收和循环使用,不仅可以减少废水处理的费用,还可以节约化学试剂,降低成本。PEG的回收有两种方法:(1)加入盐使目标蛋白质转入富盐相来回收PEG;(2)将PEG相通过离子交换树脂,用洗脱剂先洗去PEG,再洗出蛋白质。
(3)无机盐的循环
将含无机盐相冷却,结晶,然后用离心机分离收集。除此之外还有电渗析法、膜分离法回收盐类或除去PEG相的盐。
3 物质分配平衡的影响因素
物质在双水相体系中的分配系数不是一个确定的量,它要受许多因素的影响(表1)。对于某一物质,只要选择合适的双水相体系,控制一定的条件,就可以得到合适的(较大的)分配系数,从而达到分离纯化之目的,包括直接从细胞破碎匀浆液中萃取蛋白质而无须将细胞碎片分离。改变体系的p H值和电解质浓度可进行反萃取。
3.1 聚合物及其分子量的影响
不同聚合物的水相系统显示出不同的疏水性,水溶液中聚合物的疏水性按下列次序递增:葡萄糖硫酸盐<甲基葡萄糖<葡萄糖<羟丙基葡聚糖<甲基纤维素<聚乙烯醇<聚乙二醇<聚丙三醇,这种疏水性的差异对目的产物与相的相互作用是重要的。
同一聚合物的疏水性随分子量增加而增加,其大小的选择依赖于萃取过程的目的和方向,若想在上相获得较高的蛋白质收率,对于PEG聚合物,应降低它的平均分子量,相反,若想在下相获得较高的蛋白质收率,则平均分子量应增加。
3.2 p H值的影响
体系的p H值对被萃取物的分配有很大影响,这是由于体系的p H值变化能明显的改变两相的电位差。如体系p H值与蛋白质的等电点相差越大,则蛋白质在两相中分配越不均匀。
3.3 离子环境对蛋白质在两相体系分配的影响
在双水相聚合物系统中,加入电解质时,其阴阳离子在两相间会有不同的分配。同时,由于电中性的约束,存在一穿过相界面的电势差(Donnan电势),它是影响荷电大分子如蛋白质和核酸等分配的主要因素。同样,对于粒子迁移也有相似的影响,粒子因迁移而在界面上积累。故只要设法改变界面电势,就能控制蛋白质等电荷大分子转入某一相。
3.4 温度的影响
分配系数对温度的变化不敏感,这是由于成相聚合物对蛋白质有稳定化作用,所以室温操作活性收率依然很高,而且室温时粘度较冷却时(4℃)低,有助于相的分离并节省了能源开支。
4 ATPE技术的应用[12]
4.1 ATPE与生命科学
通常,溶剂萃取分离时,由于使用了有机溶剂会使生物大分子(如蛋白质和酶)失活。从20世纪90年代初期,人们致力于应用ATPE技术分离提取蛋白质,避免蛋白质的变性。目前,已成功应用于蛋白质、生物酶、菌体、细胞、细胞器、亲水性生物大分子、氨基酸、抗生素以及生物小分子等的分离、纯化。特别是近年来,国内外在此方面的研究有很大的进展。
例如Ménica等[13]利用聚乙二醇(PEG)/磷酸盐双水相体系提取天然发酵物中的碱性木聚糖酶,确定最佳体系是22%PEG6000,10%K2HPO4和12%Na Cl,活性酶的产率可达98%。除此以外,在近几年的报道中ATPE已用于多种蛋白质和生物酶的分离,如牛血清蛋白(BSA)、牛酪蛋白、β-乳球蛋白、血清蛋白;α-淀粉酶和蛋白酶、胆固醇氧化酶、脂肪酶、磷酸甘油酸激酶(PGK)和磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)、葡糖淀粉酶、L-天门冬酰胺酶等都在双水相体系中得到较好的分离。
β-内酰胺类包括青霉素和头孢菌素,是应用广泛的抗生素药物;大环内酯类抗生素如:红霉素和乙酰螺旋霉素都利用ATPE技术得到了较好的收率;在多肽类抗生素中,用双水相体系对万古霉素的提取也得到了满意的结果。
4.2 ATPE与天然药物
中药中含有大量的有机化合物且成分十分复杂,提高中草药中有效成分提取及分离技术对我国中医中药进入国际市场有很大的促进作用。天然活性成分的分离提取和质量控制将是今后重点研究课题,这类具有独特功能和生物活性的化合物,是疾病预防与治疗的基础物质。主要包括:黄酮、多酚、萜类等。目前,活性成分的提取分离技术还有待发展,ATPE技术作为一种新型的萃取技术已经成功的应用于天然产物的分离纯化。
近几年有关双水相提取天然药物中有效成分的报道也逐年增多。甘草的主要成分——甘草皂甙,又称甘草酸(Glycyrrhizic acid),采用乙醇/磷酸氢二钾双水相体系萃取,分配系数达到12.8,回收率可达98.3%。
选用PEG/磷酸盐体系在一定温度、p H条件下萃取银杏浸取液,主要药用成分黄酮类化合物进入上相,达到分离的目的,最佳条件在25℃,PEG的分子量在1500左右,一般采用较高的相比可以提高萃取率,但是过高会引起上相的体积增多,最佳萃取率可达98.2%。黄芩甙和谷胱甘肽也分别在环氧乙烷和环氧丙烷的无规则共聚物(EOPO)/混合磷酸钾(KHP)体系,以及环氧乙烷和环氧丙烷的无规则共聚物(EOPO)/羟丙基淀粉(PES)所组成的双水相体系中得到较好的分离,萃取率分别是75.8%和80%以上。
天然产物有效成分含量低,难于富集,体系复杂,大分子与小分子、生命与非生命物质共存,特别是存在结构异构体等都使分离提纯工作的难度加大。ATPE技术在天然产物的分离和纯化等方面还有待进一步研究。
4.3 ATPE与重金属
传统的溶剂萃取分离重金属常常存在溶剂污染环境、对人体有害、工艺复杂等缺点。双水相以其高效、快速、无毒、简单以及无需反萃取等优点,而被用于分离富集重金属元素。例如Ti(Ⅳ)与Zr(Ⅳ)可以在聚乙二醇PEG2000-硫酸铵-偶氮胂(Ⅲ)中分离;另外,乙醇-氯化钠-水双水相体系在氢溴酸介质中,可从贱金属中定量萃取金(Ⅲ),萃取率达99.1%;Co(Ⅱ)、Ni(Ⅱ)、Mo(Ⅳ)等金属离子也在聚乙二醇PEG2000-硫酸钠-硫氰酸钾的双水相体系中得到分离。
5 ATPE技术的发展方向
双水相萃取 篇4
1 实验
1.1 材料与仪器
槐米(购于海南源安隆药品超市连锁有限公司);芦丁标准品(中国药品生物制品检定所);TU-1810紫外分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司);DZF型真空干燥箱(上海精宏实验设备有限公司)。
1.2 实验方法
1.2.1 原料处理
槐米,放入烘箱60℃烘干至恒重,粉碎过60目筛备用。
1.2.2 双水相萃取过程
(1)将异丙醇和硫酸铵配成一定浓度的浓溶液;
(2)在30℃下,取一定的槐米粉置于烧杯中,加入一定体积的成相物质浓溶液,用磁力搅拌器萃取一定时间,静置10 min,使其分相;
(3)取样分析上下相中芦丁的含量,根据与标准样品吸光度值的对照计算上下相中芦丁的浓度,计算分配系数K。
式中:ρ上,ρ下———上、下相溶液中总黄酮的质量浓度,mg·L-1
1.2.3 总黄酮含量的测定
标准储备液的制备精确称取干燥至恒重的芦丁标准品5.0 mg置于50 m L的容量瓶中,加入异丙醇溶解并定容配成浓度为0.1 mg/L的芦丁标准溶液。
标准曲线的制作精确量取芦丁标准溶液0.0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 m L分别置于10 m L的容量瓶中,加入异丙醇溶液使各体积至5.0 m L,分别加入5%亚硝酸钠溶液0.5 m L,摇匀放置5 min,再分别加入10%硝酸铝溶液0.5 m L,摇匀放置5 min,最后分别加入10.0 mol/L的氢氧化钠溶液3 m L,用异丙醇溶液定容至刻度,摇匀,放置15 min。在510 nm波长测定其吸光度,以吸光度-浓度作图并进行回归,得回归方程为y=0.00831x+0.0006。
1.2.4 萃取条件的选择对分配系数的影响
异丙醇的质量、硫酸铵的质量、水的质量和槐米的加入量进行了考察研究,确定萃取条件。
2 结果与讨论
2.1 异丙醇质量对分配系数的影响
分配系数K随异丙醇质量的变化关系如图1所示。
从图1可知,对于同一初始值都相同的条件下,分配系数K和随异丙醇质量的增加而先增大后减小。这是因为初始值相同时,异丙醇的质量增大,分相能力增大,芦丁在异丙醇中的溶解量增大,故分配系数K增大。随着异丙醇质量的进一步增大,高浓度的异丙醇会引起槐米中多糖、蛋白质等大分子物质的沉淀,从而使芦丁产生沉淀,导致分配系数减小。故最佳的异丙醇质量为18 g。
2.2 硫酸铵质量对分配系数的影响
分配系数K随硫酸铵质量的变化关系如图2所示。
从图2可知,对于同一初始质量的异丙醇,分配系数K都随硫酸铵质量的增大而增大。这是因为异丙醇的初始质量相同时,硫酸铵质量增大,分相能力也就增大,但当硫酸铵质量超过11.5 g后,分相困难,分相时间延长。故硫酸铵的最佳质量为11.5 g[4]。
2.3 水的质量对分配系数的影响
水的变化会使体系的成相行为改变,进而影响两相中的分配。实验结果见图3所示。
从图3可知,对于同一初始质量的异丙醇和硫酸铵的条件下,分配系数K随水的质量的增加而先增大后减小。这是因为初始值相同时,水的质量增大,分相能力也增大,随着水质量的进一步增大,溶于水中的芦丁含量增加从而使芦丁溶于醇中含量相对减少,导致上下相中芦丁的含量反而降低。故确定最佳的水质量为27 g。
2.4 槐米质量对分配系数的影响
分配系数K随槐米质量的变化关系如图4所示。
由图4可以看出,对于同一初始质量的异丙醇、硫酸铵、水和槐米,分配系数K都随槐米质量的增大而增大。这是因为其他条件初始质量相同时,槐米质量增大,芦丁浓度增大,两相可萃取出芦丁越多,但当槐米质量超过1 g后,异丙醇相达到萃取饱和,K减小。故槐米的最佳质量为1 g。
3 结论
实验表明利用异丙醇/硫酸铵双水相体系萃取槐米中的芦丁,最大分配系数可达5.75,说明在异丙醇/硫酸铵双水相体系中芦丁大部分被分配在异丙醇相(上相)。另外,通过单因素单水平实验,考察了异丙醇质量、硫酸铵质量、水质量和槐米质量对分配系数的影响,实验结果表明,萃取条件为异丙醇质量分数为18 g,硫酸铵质量为11.5 g,水质量27 g,槐米质量为1 g时,提取率为21.7%,含量为94.8%。
双水相萃取技术[5]是一种新开发的提取分离方法,通过以上研究分析可以看出,与传统的有机溶剂萃取法相比,双水相体系具有分相速度快,使用温度低,易于操作等特点,且所使用的异丙醇及盐类对人体及环境无毒害,萃取率高,溶剂可以循环利用,这不仅可以降低成本,而且有利于环保,为槐米中芦丁分离纯化的一种有效方法。
参考文献
[1]罗亚东,胡吉卓,杨银月,等.丙酮/(NH4)2SO4双水相体系提取芦丁影响因素研究[J].广西科学院学报,2014,30(3):185-189.
[2]池汝安,詹斯维,张越非,等.葛根总黄酮在乙醇-无机盐双水相体系中的萃取[J].武汉工程大学学报,2014,36(3):1-7.
[3]陈丛瑾,屈丽娟,陈东.双水相萃取法分离纯化黄酮类化合物的研究进展[J].应用化工,2010,39(10):1587-1596.
[4]陈丽华.东北山樱桃核总黄酮成分双水相萃取条件的优化[J].西北农业科技大学学,2013(10):137-142.
双水相萃取 篇5
双水相萃取技术(aqueous two-phase extraction,ATPE)是将两种化学结构不同的亲水性聚合物或聚合物和无机盐在水中形成互不相溶的两相,依据物质在两相间的选择性分配达到分离目标物质的目的[9]。作为一种新型的生物化工分离技术,与一般的溶剂萃取相比,双水相萃取技术有如下优点:两相的溶剂都是水,萃取产品中没有有机溶剂的残留,能够在常温常压下进行操作;两相分相时间短,特别是聚合物-盐系统,自然分相时间一般只需要10min左右;对目标产物具有较高的萃取率;体系具有生物适应性,双水相中的高聚物及某些无机盐不会引起原料中的生物活性物质失活或变性,有时还能够保护这些生物活性物质。该技术已被广泛应用于生物化学、细胞生物学和生物化工等领域[10,11]。
本文研究应用聚乙二醇与硫酸铵形成的双水相体系,从竹叶水提液中提取分离竹叶黄酮,并使用曲面响应法对双水相萃取法提取竹叶黄酮的工艺进行优化。
1 实验部分
1.1 试剂与仪器
试剂:竹叶采自安吉;竹叶黄酮水提溶液中竹叶总黄酮纯度为16.6%(晒干竹叶加入9倍质量的水,热回流提取1h,过滤取滤液浓缩至3倍干叶质量)。硝酸铝、亚硝酸钠、硫酸铵、氯化钠、盐酸、无水乙醇、PEG 400、PEG 600、PEG 1000、PEG 1500、PEG 4000等均为分析纯试剂。
仪器:755B型紫外可见分光光度计(上海精科实业有限公司)。
1.2 实验方法
1.2.1 分光光度法测定竹叶黄酮的浓度
采用药典中的“NaNO2-Al(NO3)3-NaOH”体系来测定黄酮浓度。分别移取0.202 mg·mL-1芦丁标准液3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0 mL于25mL的容量瓶中,依次加入0.7 mL的5%亚硝酸钠,0.7mL的10%硝酸铝,以及5 mL的4.3%氢氧化钠溶液,用30%乙醇稀释至刻度,于510nm处测定吸光度,绘制芦丁的标准曲线。
竹叶黄酮的萃取率(%)按以下公式计算
式中:m1为产品中黄酮质量(g),m2为原液中黄酮质量(g)。
1.2.2 PEG/(NH4)2SO4双水相体系相图的绘制
在20℃下,根据Albertsson浊点法[12]绘制由不同平均相对分子质量的PEG和(NH4)2SO4形成的各体系相图。取2.0g 20%PEG400溶液,定量滴加20%(NH4)2SO4溶液直至混合溶液出现浑浊状态,此时溶液体系形成不溶的两相。根据公式(2)和(3)计算PEG400和(NH4)2SO4在体系中的质量分数,即为相图中的一个相点。
式中:a(g)为某单相点时硫酸铵在系统中的总质量;b(g)为某单相点时PEG400在系统中的总质量;c(g)为某单相点时水在系统中的总质量;X(%)为某单相点时硫酸铵的质量分数;Y(%)为某单相点时PEG400的质量分数。在此基础上,加入适量蒸馏水,使体系重新恢复为单相状态,继续加入(NH4)2SO4原液,使溶液再次变混浊,计算并绘制此时的相点。如此反复操作,能够得到PEG400和(NH4)2SO4的双节线相图[13,14]。
其他相对分子质量的PEG和(NH4)2SO4组成的双水相体系相图的绘制方法相同。
1.2.3 竹叶黄酮的提取工艺确定
1.2.3. 1 单因素实验
通过单因素实验考察了PEG平均相对分子质量、PEG和(NH4)2SO4的质量分数、体系pH值、NaCl质量分数、原液质量分数、萃取温度对竹叶黄酮的萃取率的影响。
1.2.3. 2 Box-Behnken法优化实验
在单因素实验的基础上选择pH值、NaCl质量分数以及原液质量分数这3个因素作为自变量,使用Box-Behnken响应面法对萃取条件进行优化。实验设计方案如表1所示。
2 结果与讨论
2.1 PEG/(NH4)2SO4双水相体系相图
图1为20℃下5种不同平均相对分子质量的PEG和(NH4)2SO4组成的双水相系统的相图。相图中的曲线为临界区,曲线上方的区域为两相区,曲线的下方为均相区[13,14]。如图1所示在PEG质量分数(ρ)确定的条件下,其平均相对分子质量越大,水溶性越差,形成双水相体系时所需的硫酸铵质量分数越低。
2.2 PEG/(NH4)2SO4双水相体系的建立
2.2.1 PEG平均相对分子质量的选择
根据图1,分别选择质量分数均为20%的PEG400、PEG600、PEG1000、PEG1500、PEG4000和质量分数为20%的(NH4)2SO4组成双水相体系萃取竹叶黄酮。实验结果表明竹叶黄酮萃取率随着PEG平均相对分子质量增大而下降。这可能是因为平均相对分子质量大的PEG能够引起双水相体系粘度增大,从而影响传质导致竹叶黄酮萃取率下降。而且平均相对分子质量越低的PEG,水溶性越好,有利于两相体系的稳定。因此选用PEG400进行下一步实验。
2.2.2 PEG和(NH4)2SO4的质量分数的选择
在(NH4)2SO4质量分数固定为20%的条件下,选择不同质量分数的PEG 400和(NH4)2SO4组成双水相体系,考察PEG400质量分数对竹叶黄酮萃取率的影响。结果显示,随着PEG 400质量分数增大,竹叶黄酮萃取率随之升高,在31%PEG 400时达到最大值。当PEG 400质量分数超过31%时,两相体系出现(NH4)2SO4不能完全溶解的现象。所以PEG 400质量分数选择为31%。
在PEG400的质量分数确定为31%的条件下,考察不同质量分数的(NH4)2SO4对双水相萃取竹叶黄酮的影响。由于在(NH4)2SO4质量分数小于11%时,溶剂体系不能形成两相,所以选择11%作为(NH4)2SO4质量分数的临界点。结果显示:(NH4)2SO4质量分数为11%时,竹叶黄酮的萃取率最高,(NH4)2SO4质量分数增加时,竹叶黄酮萃取率反而下降。因此,(NH4)2SO4的质量分数选择为11%。
2.3 单因素考察
2.3.1 pH值对萃取率的影响
在20℃,31%PEG 400和11%(NH4)2SO4组成双水相体系条件下,调节体系pH值,考察体系酸度对竹叶黄酮萃取率的影响。在pH<1.5时,溶液体系为单相,pH>7.0时,(NH4)2SO4易水解,释放出氨气[15],所以选择pH 2.0~7.0范围内考察溶液酸度对双水相体系萃取竹叶黄酮的影响。结果表明:pH值为4.0时,竹叶黄酮的萃取率最高,所以双水相体系的最适pH选择为4.0。
2.3.2 NaCl质量分数对萃取率的影响
双水相系统中的盐浓度对竹叶黄酮萃取率有很大的影响,无机盐的加入能够缩短分相时间从而影响萃取过程,而且盐能够影响双水相两相间的电位差、相体积比和两相中成相物质的组成。在PEG400质量分数选择为31%,(NH4)2SO4质量分数选择为11%,体系pH值为4.0,温度20℃条件下,考察NaCl质量分数对双水相体系萃取竹叶黄酮的影响。实验结果显示:当NaCl添加量达到0.7%时,竹叶黄酮萃取率最高;NaCl质量分数超过0.7%时,竹叶黄酮萃取率下降。这可能是由于加入的NaCl过多导致盐析现象的出现,竹叶黄酮随着盐从两相体系中一齐沉淀出来。因此,NaCl质量分数选择为0.7%。
2.3.3 原液质量分数对萃取率的影响
在双水相体系萃取竹叶黄酮时,原液质量分数是影响萃取结果的重要因素。在以上获得的最优条件下,研究原液质量分数对双水相体系萃取竹叶黄酮的影响。结果显示:原液质量分数为50%时,竹叶黄酮萃取率达到最高,当原液质量分数超过50%时萃取率变化不大。因此从萃取时的成本核算考虑,确定最佳粗提液质量分数为50%。
2.3.4 萃取温度对萃取率的影响
温度对PEG在水中的溶解度影响较大,因此萃取温度也是影响双水相体系萃取竹叶黄酮的因素。在获得的优化条件下,研究了萃取温度对萃取结果的影响。结果显示:随着温度的升高,相分离速度加快,竹叶黄酮萃取率随之逐渐降低。而且常温下竹叶黄酮不会发生失活或变性,体系两相容易分离。所以选择在常温20℃时对竹叶黄酮进行萃取。
2.4 曲面响应法对双水相萃取法提取竹叶黄酮工艺的优化
实验设计及结果见表2。萃取温度为20℃,PEG400质量分数为31%,(NH4)2SO4的质量分数选择为11%。
根据表2的实验结果,得到竹叶黄酮纯度对编码自变量pH值、NaCl质量分数和原液质量分数的二次多元回归方程式:
从表3可见,PModel<0.000 1,同时变异率CV很低(6.8%),说明本实验有较高的精确度和稳定性,且信噪比很高。校正决定系数R2Adj很高,亦表示该模型具有很高的显著性和精确度。因此,该模型能够预测各因素对竹叶黄酮萃取率的影响。由表3还可以看出,各因素中x1、x3、x1x2、x2x3、x12、x22、x32都是显著的。回归方程相关系数R2=0.9991,说明响应值(此处为萃取率)的变化有99.91%来源于所选变量。因此,回归方程可以较好地描述各因素与响应值之间的真实关系。
图2为直观反映各因子交互作用的响应面的3D分析图,等高线为近圆形表示两因素交互作用不显著,而椭圆形则表示交互作用显著。图2(a)中显示pH值和NaCl质量分数过小或过大都可能导致竹叶黄酮萃取率的下降。图2(b)中显示随着原液质量分数的提高,竹叶黄酮的萃取率在上升,而pH值过小或过大都可能导致竹叶黄酮萃取率的下降。图2(c)随着原液质量分数的提高,竹叶黄酮的萃取率在上升,而NaCl质量分数过小或过大都可能导致竹叶黄酮萃取率的下降。
双水相萃取法提取竹叶黄酮的最优3个提取条件为:pH 3.88,NaCl质量分数0.72%,原液质量分数为51.54%,在此条件下的最佳理论竹叶黄酮纯度的萃取率为98.24%。为了验证响应面法的可行性,采用优化后得到的最优提取条件进行3次验证实验,实际竹叶黄酮平均萃取率为97.8%,与理论值相差0.44%。因此,响应面法对提取条件进行优化是可行的,得到的竹叶黄酮萃取条件具有实际应用价值。
3 结论
双水相萃取 篇6
练萍[3]等报道了运用聚乙二醇( PEG 1000)-聚乙烯吡咯烷酮(PVP 30000)组合表面活性剂-硫酸铵双水相体系萃取分离桑叶中的芦丁;李蕾等[4]建立了PEG-(NH4)2SO4-水-双水相体系萃取方法测定银杏叶中的芦丁;薛珺等[5]运用聚乙二醇-吐温组成的表面活性剂-硫酸铵双水相体系萃取分离银杏叶中的芦丁;姜忠丽[6]等采用超临界萃取苦荞麦中的芦丁。为探讨离子液体在芦丁分离应用中的可能,本文利用亲水性离子液体四氟硼酸N-丁基吡啶[BPy]BF4和(NH4)2SO4形成的双水相体系,并用其对芦丁进行萃取分离实验研究,萃取率大于90%,结果令人满意。
1 实验部分
1.1 主要仪器和试剂
PHS-3TC型精密酸度计(上海天达仪器有限公司),752紫外光栅分光光度计(上海第三分析仪器厂),UV-2100双光束紫外可见分光光度计(日本岛津制作所)等;
四氟硼酸N-丁基吡啶[BPy]BF4按文献方法[7]实验室合成,真空干燥过夜;芦丁标准品(购于Sigma公司,芦丁含量0.248mg/mL);Britton-Robinson缓冲溶液:pH2.0~10.0;所用试剂均为分析纯,实验用水为去离子水。
1.2实验方法
在10mL刻度比色管中加1.00mL芦丁溶液,2.00mL离子液体,1.5g(NH4)2SO4,用去离子水稀释至5.00mL(在考查酸度的影响时用不同pH的B-R缓冲溶液和去离子水稀释);小心振摇,成相后取离子液体相用去离子水稀释至5.00mL,测定吸收光谱和吸光度,通过标准工作曲线求算芦丁萃取率(E%)。
2 结果与讨论
2.1 离子液体标准曲线
实验表明,芦丁标准溶液质量浓度在0.01~0.06mg/ml范围之间,其吸光度和浓度之间线性关系良好,回归方程为y = 18.131x + 0.0041,R2 = 0.9998。
2.2 硫酸铵用量对萃取率的影响
按照实验方法,保持离子液体2.00mL和芦丁溶液1.00mL用量不变,改变(NH4)2SO4的用量,结果如图1,当(NH4)2SO4 低于0.5g时不成相,在0.7~2.0g之间,随着硫酸铵用量的增加萃取率先增大后减少。可能是硫酸铵浓度过大,产生盐效应的原因;在1.5g时萃取率最大为94.0%;硫酸铵用量超过2.0g后溶解不完全,萃取率有所下降。实验中选择用量为1.5g。
2.3 离子液体用量对萃取率的影响
固定芦丁溶液加入量为1.00mL,(NH4)2SO4为1.5g,改变离子液体的用量,结果如图2,当离子液体低于1.00mL时不成相,在1.30-2.00mL之间,萃取率开始增加较快,当加到2.20mL后萃取率开始减小。综合考虑,选取加2.0mL离子液体较理想。
2.4 芦丁溶液加入量对萃取率的影响
取2.00mL离子液体,1.5g(NH4)2SO4,改变芦丁的加入量,结果如图3。在芦丁用量少于1.00mL时萃取率随芦丁浓度增加而迅速增大,大于1.00mL之后萃取率变化平稳,说明在实验条件下,已达到最大萃取容量。实验中选择芦丁加入量为1.00mL。
2.5 pH值对萃取率的影响
固定芦丁、离子液体、(NH4)2SO4加入量,分别加入不同pH值的B-R缓冲溶液,结果如图4。
由图可知,pH值在4.0~6.0范围时萃取率最大,当pH值增加到8.0时萃取率变小。由此可以看出[BPy]BF4/(NH4)2SO4双水相体系萃取分离芦丁的酸度范围较宽,考虑到[BPy]BF4/(NH4)2SO4体系的pH值就在4.0~6.0之间,因此,在用该双水相萃取分离芦丁时不需另外加入缓冲溶液。
3 结论
1)离子液体双水相体系可以用来萃取分离芦丁,且萃取率较高。在本实验中,萃取的最佳条件是(NH4)2SO4用量1.5g,离子液体2.0mL,芦丁溶液的加入体积为1.0~1.5mL,溶液酸度在pH4~6。
2)离子液体双水相体系萃取分离芦丁溶液酸度范围较宽,分相迅速,界面清晰,萃取过程不发生乳化现象。
参考文献
[1]石家华,孙逊,杨春和,等.离子液体研究进展[J].化学通报,2002(4):243-250.
[2]邓凡政,郭东方.离子液体双水相萃取分离苋菜红的研究[J].分析试验室,2007,26(7),15-17.
[3]练萍,李蕾,赖闻玲,等.双水相体系萃取分离-紫外分光光度法测定桑叶中芦丁[J].理化检验,2006,42,821-823.
[4]李蕾,范小娜,戚琦,等.聚乙二醇-硫酸按-水双水相体系萃取测定银杏叶中芦丁的含量[J].南昌大学学报(理科版),2004,28(3):243-245.
[5]薛?,李蕾,练萍.PEG 800-Tween 80-(NH4)2SO4-H2O双水相萃取紫外分光光度法测定银杏叶中的芦丁[J].化学计量分析,2004,13(5):34-36.
[6]姜忠丽,纪淑娟.超临界CO2萃取苦荞麦了定的工艺研究[J].粮油加工,2007,4:88-90.
双水相萃取 篇7
目前已报道的测定镍含量的方法主要有原子吸收光谱法[4]、分光光度法[5]、电化学分析方法[6]、流动注射法[7]、高效液相色谱法[8]、荧光法[9]等。在这些方法中,分光光度法是最常用的方法。本文利用小分子双水相体系与分光光度法相结合,以丁二酮肟为显色剂,碘为氧化剂,对痕量镍进行测定。它能在常温常压下进行,条件温和,能有效地降低检测成本,实验结果令人满意。
1 实验部分
1.1 仪器与试剂
UV-2450紫外可见分光光度计,马弗炉。
镍(Ⅱ)标准贮备液(1000μg·mL-1)的配制:将硫酸镍在120℃条件下烘2h。准确称量2.6384g硫酸镍,用少量的超纯水使其溶解,转入1000m L容量瓶中并定容至刻度,摇匀,作为储备液,用时稀释制得10μg·mL-1的标准溶液。
丁二酮肟(5g·L-1)的配制:称取丁二酮肟0.5g,加入50mL氨水溶解,加水稀释至100mL,摇匀。
碘溶液(12.7g·L-1)的配制:称取单质碘12.7g溶于含有25g碘化钾的少量水中,并用水稀释至100mL,摇匀。
1.2 实验方法
在10mL比色管中依次加入一定浓度的Ni2+标准溶液2m L,12.7g·L-1碘溶液0.5mL,5g·L-1丁二酮肟溶液0.6m L和分析纯的丙酮溶液4.5m L。用去离子水定容至10mL。分别向比色管中加入1.1g固体盐硫酸铵,振荡3~4min,使固体盐完全溶解。吸取上层相溶液,以空白试剂作为参比,在449nm处测定其吸光度。
2 结果与讨论
2.1 无机盐的成相能力
无机盐与小分子有机溶剂的成相原理:盐相与有机相对水分子的缔合竞争在一定温度压力条件下,对于组分固定的双水相体系,体系的一些参数都是固定不变的,因此可以通过固定有机相来考察不同盐的成相能力的差别[10]。通过实验比较,发现硫酸铵加入双水相体系中的效果最佳。因此本实验选择硫酸铵为无机盐。
2.2 吸收曲线
根据实验方法配制参比溶液和待测溶液,使用UV-2450紫外分光光度计测定Ni2+与丁二酮肟显色后的吸收曲线,结果如图1所示。由图1可以看出,Ni2+与丁二酮肟的最大吸收波长为449nm。因此,本实验选用449nm作为测定波长。
2.3 固体盐的使用量的影响
在选定硫酸铵作为双水相体系的无机盐的条件下,按照1.2的实验方法进行实验,研究固体盐硫酸铵在0.4~1.4g内,吸光度A的变化。实验结果如图2所示。从图2中可以看出,盐的加入量对双水相萃取效果影响较大。当盐的质量小于0.5g时体系无法实现分相;当质量大于0.5g时吸光度明显提高。当盐质量达到1.1g时,吸光度达到最大,萃取效果最佳。当盐质量超过1.1g时,吸光度逐渐减小,并逐渐出现没有溶解的硫酸铵固体盐。综合考虑,盐的使用量为1.1g。
2.4 丙酮用量的影响
按照1.2的实验方法进行实验,研究丙酮体积在3.9~5.4mL范围内,丙酮对双水相体系的影响,实验的结果如图3所示。从图3中可以看出,在3.9~4.8mL范围内,随着丙酮的体积增大,吸光度也逐渐增加,在丙酮的体积为4.5mL时,吸光度出现了最大值。接下来随着丙酮体积的增加,它的富集效果却降低了,因而吸光度逐渐减小。故选择丙酮的最佳用量为4.5mL。
2.5 显色剂用量的影响
按照1.2的实验方法进行实验测定,实验结果如图4。结果表明,随着显色剂用量的增加,体系的吸光度也随之增加;当显色剂体积增加到0.6mL时,体系的吸光度达到最大,萃取效果最好。因此显色剂的使用量应该选择0.6mL。
2.6 碘的加入量的影响
碘溶液在本实验中作为镍的氧化剂,将镍从+2价氧化到+4价,再与丁二酮肟发生显色反应。此时生成的红色配合物具有较强的稳定性,便于实验中的检测。按照1.2的实验方法,研究碘溶液用量在0.2~0.7mL范围内,对吸光度的影响。实验的结果如图5所示。从图中可以看出,在实验范围内,随着碘溶液用量的增大,吸光度也逐渐增加。当用量达到0.4mL时吸光度达到最大。而随着碘溶液体积的增加,吸光度的变化不大。综上所述,碘溶液用量在0.4mL时最佳。
2.7 酸度的影响
按照1.2的实验方法,研究pH值在8~12范围内,对配合物的稳定性和体系对配合物萃取能力的影响,结果如图6所示。结果表明,在一定条件下,pH值在8~12范围内呈现上升趋势。当pH值为10时,被萃取到丙酮相中的配合物的吸光度最大。因此,本体系选择pH值为10。
2.8 标准曲线
在最佳实验条件下,取10μg·mL-1的镍标准液配成一系列工作溶液,测其吸光度。镍的质量浓度在0.5~3.5μg·(10m L)-1的范围内其线性回归方程为A=0.2233ρ(Ni2+)+0.0201,其相关系数R2=0.9996。
2.9 共存离子的影响
以相对误差≤5%为限,实验发现大量的Cl-、NO3-、Na+、K+、Mg2+、Pb3+、Ba2+、Cr6+对镍(Ⅱ)的测定基本无干扰,500倍的Al3+,50倍的Zn2+、Mn2+不干扰测定。当1倍以上的Cu2+存在时,需要加入硫脲作为铜(Ⅱ)离子的掩蔽剂[11]。在比色管中加入2.50g·L-1的硫脲溶液1mL,可以将铜离子的干扰倍数提高到10倍,从而提高了测定结果的准确度。
2.10 分析特性
在0.50~25μg·(10mL)-1范围内对其进行标准曲线的测定。镍(Ⅱ)的标准曲线的线性方程为:A=0.2233ρ(Ni2+)+0.0201(R2=0.9996)。
平行测定11次空白溶液,求得其标准偏差为0.21%,按CL=3S/k求得本方法的检出限为0.028μg·(10mL)-1。以0.5μg·(10mL)-1的镍标液为低浓度,3.5μg·(10mL)-1为高浓度,分别平行测定6次,测得该方法的精密度为2.1%~3.0%。
2.11 样品中镍(Ⅱ)的检测
2.11.1 样品预处理
准确称取干燥的铁观音和绿茶各5g于2个干燥的坩埚中,在马弗炉中800~900℃下灼烧,灰化1.5h后取出冷却至室温。各加入6mol·L-1的硝酸19mL,用电炉加热煮沸至近干,再加入6mol·L-1硝酸19mL。将溶解液分别转移至2个50m L的容量瓶中,用二次蒸馏水定容至刻度,待用[12]。
准确称取2种大豆、玉米粉各9g于3个坩埚中,在电炉上低温碳化至无烟,移入马弗炉中550℃下灼烧,灰化完全。取出冷却至室温后,滴加1∶1的HNO3 10mL,置于电炉上加热,使之溶解。移入50mL容量瓶中,加水定容至刻度,摇匀待用[13]。
2.11.2 样品的检验
在2支比色管中,分别加入5g·L-1的丁二酮肟0.6mL,分析纯的丙酮溶液4.5mL和碘溶液0.4mL。其中1支比色管中加入1.00mL样品,并加入1.00mL硫脲,用去离子水定容至刻度并充分振荡。分别向比色管中加入1.1g固体盐(NH4)2SO4摇匀,pH控制在10左右。用胶头滴管吸取上层相溶液移入比色管中,以空白试剂作为参比,在449nm处测定其吸光度,结果见表1。
从表中数据可以看出,铁观音样品镍含量为0.44μg·g-1,加标后回收率为93.1%~102.4%;绿茶样品镍含量为0.41μg·g-1,加标后回收率为91.4%~100.3%;大豆样品镍含量为0.33μg·g-1,加标后回收率为92.6%~96.7%;玉米粉样品镍含量为0.24μg·g-1,加标后回收率为92.0%~103.1%。表明该方法测定结果令人满意。
摘要：利用双水相的分相原理对痕量镍(Ⅱ)进行分相萃取,建立了丙酮-硫酸铵的新型小分子双水相体系,同时选取丁二酮肟作为镍的显色剂,建立了测定痕量镍(Ⅱ)的新方法。并通过单因素实验,确定最佳分析条件,在0.53.5μg.(10mL)-1范围内,镍(Ⅱ)的浓度与吸光度呈线性关系,其线性回归方程为:A=0.2233ρ(Ni2+)+0.0201,相关系数R2=0.9996,检出限为0.0281μg.(10mL)-1,相对标准偏差RSD为2.1%3.0%。将建立的分析方法应用于实际样品中镍(Ⅱ)离子的测定,同时对样品进行加标回收试验。实验的回收率为91.1%103.1%,结果令人满意。
双水相萃取 篇8
关键词：[Bmim]Cl离子液体,猪皮皮粉,回收[Bmim]Cl,再生膜
1 前言
传统的胶原提取方法以酸、碱、酶处理。在酸处理中,设备腐蚀严重,产生二次污染,皮胶原收率低;碱处理中皮胶原的三股螺旋结构遭破坏,最终产物一般是明胶,而且胶原上的天门冬氨酸和谷氨酸在碱的作用下发生了脱氨反应,从而导致了整体酸度增高,作用时间长,污染较严重;而在酶处理中,很难保证胶原的结构不被破坏。因此,传统的胶原提取方法,如果不考虑结构的必然变化对研究的影响外,对其结构的影响是难以避免的;换句话讲,这些提取方法获得的胶原,及对其的研究,往往是不能够全真的反映 “原生态”的胶原化学结构具备的性质。
可以说,研究分离提取的皮胶原、又不破坏其结构的方法,然后深入的再研究胶原的构效关系,一直是人们的追求。所以探索新的提取胶原的方法,尤其是用具有绿色化学特性的溶剂溶解提取胶原就更具研究意义了。
双水相离子溶液萃取是纯化和提取活性物质的新方法[1,2,3]。它是用聚合物与盐的水溶液混合,在水中适当溶解,然后形成互不相容的两相。与传统的有机溶剂萃取相比,双水相萃取常在常温或者低温下反应,条件较温和;反应快,回收率高,且能耗小;体系中相与相间的张力小于有机溶剂,可以较大程度保持生物活性;离子液体难挥发,不易产生环境污染[4]。
离子液体双水相体系可以很好的溶解猪皮胶原蛋白,在溶解过程中不仅能保持蛋白质不变性,还能避免传统溶剂带来的环境污染,为开发利用制革废弃物中的胶原蛋白打下基础。本文采用[Bmim]Cl/ K2H2PO4双水相体系溶解猪皮皮粉,萃取提纯猪皮胶原。通过实验具体探讨 [Bmim]Cl/盐双水相离子液体体系对猪皮皮粉溶解的影响,然后运用傅里叶红外扫描仪对猪皮皮粉及其再生膜进行表征,分析猪皮胶原溶解前后官能团、构象等的变化[5,6,7]。
2 实验部分
2.1 实验试剂及仪器
2.1.1 实验试剂
除N-甲基咪唑(C4H6N2),色谱纯;丙酮(CH3COCH3)、氯化正丁烷(C4H9Cl)、乙酸乙酯(C4H8O2)、碳酸钠(Na2CO3)、硫酸钠(Na2SO4)、氯化钾(KCl)、碳酸氢钠(NaHCO3)、硫酸氢钠(NaHSO4),磷酸钠(Na3PO4)、磷酸氢二钾(K2HPO4)等,均为分析纯,购至成都科龙试剂有限公司;氮气(N2),分析纯;未经任何化学处理的猪皮皮粉,由南京中国林业科学研究院提供。
2.1.2 实验器材
LSS-1循环水式多用途真空泵,成都兰格林科技仪器公司;FA2004电子天平,上海舜宇恒平科学仪器有限公司,DZF-6020真空干燥箱,上海一恒科技有限公司;旋转蒸发仪,成都万科实业有限公司;OCAH200高速视频光学接触角测定仪,Dataphysics公司;傅里叶红外光谱仪,美国PE公司;恒温磁力搅拌器,郑州汇成科工贸有限公司。
2.2 [Bmim]Cl的合成[8]
将28.7 g(0.31 mol)氯化正丁烷和24.6 g(0.3 mol)N-甲基咪唑放入250 mL三口烧瓶中混合,再加入50 g丙酮作为溶剂。置于恒温磁力搅拌器中进行磁力搅拌,加热至70 ℃,保温24 h后,得到黄色液体。用旋转蒸发仪除去产物中残留的丙酮及未全部反应的药品。最后将合成的[Bmim]Cl放入真空干燥箱中,在100 ℃、真空0.01 MPa,干燥6 h,然后置于冰箱中冷却保存备用。反应方程式如下:
2.3 性能表征
2.3.1 溶解猪皮胶原离子液体固含量的测定
用滤纸过滤溶解猪皮胶原的双水相离子液体溶液,过滤后反复用去离子水洗涤滤纸上的杂质。洗好后将其放入60 ℃的烘箱24 h。冷却后在室温下称重,再放入烘箱中干燥,直至两次称量的误差不超过0.01 g,计算得到固含量,计算式如下:
固含量undefined
式中:m—杂质的质量
m1—猪皮粉的质量
ma—盐的质量
mb—去离子水的质量
mc—离子液体的质量
2.3.2 猪皮胶原离子液体表面张力的测定
用Dataphysics公司生产的OCAH200高速视频光学接触角测定仪在25 ℃下测定猪皮胶原/[Bmim]Cl溶液的表面张力。测量时,每个样测三次,取其平均值。
2.3.3 猪皮胶原及离子液体的红外表征
在研钵中将待测的物质研磨成细粉末与干燥的溴化钾粉末混合均匀,装入模具,在压片机上压制成片测试,用傅里叶红外光谱仪进行红外测定,得出红外光谱,分析峰值。
2.3.4 提取出的猪皮胶原膜的DSC分析
用上海耐驰仪器有限公司生产的DSC200PC量热仪对胶原膜进行热分析。升温速率为5 ℃/min,气氛为氮气,升温范围30～180 ℃。
3 结果与讨论
3.1 不同种类盐对双水相离子液体溶解猪皮胶原的影响
3.1.1 猪皮皮粉在不同种类盐的双水相体系中的溶解
向7支试管中分别加入0.25 g KCl、Na2SO4、Na2CO3、NaHCO3、NaHSO4、Na3PO4和K2HPO4;0.42 g猪皮皮粉;2 g[Bmim]Cl离子液体和1.5 g去离子水混合,配成质量分数为10%的溶液。在65 ℃溶解猪皮皮粉30 h,溶解情况如表1所示。
由表1可知,盐为Na2CO3、NaHCO3、NaHSO4、Na3PO4和K2H2PO4时,猪皮胶原基本溶解,盐为K2HPO4的时候,离子液体溶液的固含量最大,离子液体的表面张力最大。物质不同其表面张力不同,其大小受分子间作用力的影响。一般情况下,表面张力与分子间作用力成正比,即分子间作用力小,物质的表面张力也小。分子间作用力主要包括色散力、氢键、金属键等,故离子液体溶液的表面张力的形成是因为离子液体表面的的胶原纤维与离子液体中更多的胶原纤维结合成氢键,所以才形成表面张力。离子液体表面的胶原纤维与离子液体中的胶原纤维形成最多的氢键,猪皮皮粉溶解情况最好。当盐为Na2SO4和KCl时,双水相离子液体基本不分相,猪皮皮粉溶解的很少,因为这两种盐溶液的pH值接近猪皮胶原的等电点,猪皮胶原和离子液体之间的作用力主要为离子键和氢键,当溶液pH值接近猪皮胶原的等电点时,胶原显中性,故胶原与离子液体之间的离子键作用力非常小,所以猪皮皮粉的溶解度小。Na2CO3、NaHCO3和Na3PO4这三种盐溶液显弱碱性,NaHSO4的盐溶液显中强酸性,这五种离子液体的pH值较远离猪皮胶原的等电点,猪皮皮粉的溶解度也就较大[9]。
3.1.2 不同K2HPO4盐浓度对猪皮胶原溶解的影响
分别配制含K2HPO475.0、62.5、50.0、37.5、25.0和0 mg/mL的猪皮皮粉,质量分数为10%的[Bmim]Cl/皮粉溶液,其他物质的质量不变,测得其固含量如图1所示。
由图1知,随着K2HPO4质量浓度在一定范围内的增加,使胶原蛋白的疏水缔合作用增强,离子强度越大,这种作用越大,对猪皮胶原的溶解增强,[Bmim]Cl/猪皮皮粉溶液的固含量逐渐增加,当K2HPO4达到62.5 mg/mL时,溶液的固含量达到最大。而后,随着K2HPO4质量的增加,离子强度增强,对蛋白质侧基电荷的屏蔽作用增强,引起分子链卷曲,从而降低溶液的固含量。
3.2 双水相离子液体对猪皮皮粉的溶解性
向5支试管中分别加入不同质量的猪皮皮粉,2 g[Bmim]Cl离子液体,0.25 g磷酸氢二钾,1.5 g去离子水,配制猪皮皮粉质量分数为4%～12%的离子液体溶液。在65 ℃溶解猪皮皮粉30 h后,溶解情况如表2所示。
从表2中可以看出,随着猪皮皮粉质量分数的增加,双水相离子液体中猪皮胶原溶解后的固含量随着增加,表面张力也随着增加。但是,当质量分数达到10%时,固含量达到最高。当猪皮皮粉的质量分数超过10%时,离子液体的固含量基本不变。溶液的表面张力随着猪皮胶原质量分数的增加而增加,因为离子液体表面的胶原纤维与离子液体形成更多的氢键。当质量分数达到10%时,表面张力就不再增加,说明双水相离子液体溶解的猪皮皮粉已经达到饱和,固含量最大为9.18%。
3.3 再生膜的表征
3.3.1 再生膜的制备[10]
将溶解猪皮皮粉的离子液体溶液均匀涂抹在干净的载玻片上,用无水乙醇在溶液上,使皮胶原从双水相离子液体中析出。再用镊子小心将析出的猪皮胶原取出放在另一个干净的载玻片上,再放入60 ℃的烘箱中干燥24 h。最后成膜取出备用。
3.3.2 再生膜的红外表征
分别对猪皮皮粉和再生膜进行红外从测定,得到其红外峰值如图2。
由红外图谱得到两种图谱得知在波数为1650 cm-1 时,显示的是酰胺Ⅰ带υC=O伸缩振动,波数为1540 cm-1时,显示的是酰胺Ⅱ带υN-H弯曲振动。可见样品都具有多肽特征,含有酰胺键,属于蛋白质。所以表明了析出的再生膜为胶原,及猪皮胶原未变性,证明了猪皮胶原在离子液体中的稳定性。
3.3.3 再生膜的DSC表征
胶原蛋白的热变性温度是反映其天然螺旋结构的一项重要指标(同时也反映胶原蛋白的生物活性)。当体系温度达到大于或等于胶原的变性温度时,胶原分子从伸展的纤维态转变为无规卷曲状,胶原发生变性。
从图3可以看出,胶原的变性温度为68.1 ℃,这是胶原的热变性过程。当胶原在第二次升温过程中,没有出现吸收峰,从而证明胶原的三股螺旋在升温过程中发生了变性。在图4中,所提取的胶原的热变性温度为67.3 ℃,二者相差0.8 ℃。造成此现象的原因是:一方面,胶原样品之间在用量,粒度和几何形状存在差异,造成了变性温度的细微差异;另一方面,考虑到离子液体双水相溶解过程也是胶原的极性基与离子液体的亲和过程,对胶原肽链间的非纤维质溶解分离,以及肽链间氢键的恢复可能有某种微小程度的影响。但是从根本上讲,对胶原的三股螺旋没有破坏,即胶原没有发生热变性。
3.4 离子液体的回收
取4.3504 g质量分数为10%的猪皮胶原/[Bmim]Cl溶液(其中2.015 g[Bmim]Cl),经去离子水冲洗后,收集冲洗液干燥,最后得到离子液体1.8103 g[Bmim]Cl。离子液体回收率的公式如下:
离子液体的回收率=
undefined
经计算,离子液体的回收率为89.84%。且对回收的离子液体进行红外表征,得到的红外图谱与刚开始合成的离子液体红外图谱相比较如图5。
由图5可知: 3143、3090处为咪唑环上不饱和C-H伸缩振动吸收峰;2959、2872处为脂肪链饱和链C-H伸缩振动吸收峰;1632为咪唑环C=C伸缩振动的吸收峰;1569处为C=N的伸缩振动吸收峰;1465,1337为MeC-H变形振动峰;1165为饱和C-H键的面内弯曲吸收峰;718为咪唑环上的C—H面外摇摆弯曲振动峰。由于离子液体极易吸水,图中3431 cm-1处为离子液体吸水后水中O-H伸缩振动吸收峰;谱图中在 753、616 cm-1波数范围有吸收峰,这被认为是 C…Cl 键存在的反映[11]。在图中合成的与回收的[Bmim]Cl红外图谱基本相同,这就表明了[Bmim]Cl离子液体中的成分未变,离子液体可以循环使用,可较彻底地消除传统的溶剂所带来的环境污染。
4 结论
(1) 未经过任何处理的猪皮皮粉,可在[Bmim]Cl/盐双水相体系溶解,且采用傅里叶红外扫描仪与DSC对猪皮皮粉及其再生膜进行表征,分析表明猪皮胶原再生后其蛋白质的二级结构不改变。
(2)当猪皮皮粉质量分数为10%,[Bmim]Cl/盐双水相体系溶解的猪皮皮粉已经达到饱和,固含量为9.18%;K2HPO4的浓度为62.5 mg/mL时,[Bmim]Cl/盐双水相体系溶解的猪皮皮粉的质量最大。
(3)[Bmim]Cl离子液体可以用回收循环使用,回收率为89.84%。
参考文献
[1]Shibukawa Masami,chikawa Ryoichi,Baba Takayuki.Separation selectivity of aqueous polyethylene glycolbased separation systems:DSC,LC and aqueous twophase extraction studies[J].Polymer,2008,49(19):
[2]徐晓冬,丹媛媛,李欣欣,等.离子液体双水相体系及其在生物分离中的应用[J].生物技术通报,2008,(5):88-91.
[3]夏寒松,余江,胡雪生,等.离子液体相行为(II)双水相的成相规律[J].化工学报,2006,57(9):2149-2151.
[4]Keith E Gutowski,Grant A Broker,Heather D Willauer.Controlling the Aqueous Miscibility of Ionic Liquids:A-queous Biphasic Systems of Water-Miscible Ionic Liquids and Water-Structuring Salts for Recycle,Metathesis,and Separations[J].J Am Chem Soc,2003,125(22):6632-6633.
[5]王斌,王靖.FT-Raman光谱对蛋白质二级结构的定量分析[J].光谱学与光谱分析,1999,19(5):674-676.
[6]乔秀丽.离子液体双水相体系在生物分离中的应用[J].绥化学院学报.2008,28(3):162-164.
[7]邓凡政,郭东方.离子液体双水相体系萃取分离牛血清白蛋白[J].分析化学(FENXIHUAXUE)研究简报,2006,34(10):1451-1453.
[8]余晓皎,王娜.1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐的合成研究[J].纺织高校基础科学学报,2010,23(3):341-344.
[9]王延华,邹晓莉.蛋白质理论与技术[M].北京:科学出版社,2005:38-39.
[10]翟蔚,陈洪章.离子液体中纤维素的溶解及再生特性[J].北京化工大学学报,2007,4(2):138-141.