发酵培养（精选12篇）
发酵培养 篇1
随着医学、生理学、生物学的发展,人民生活水平不断提高,兴起了一种健康保健新概念——益生菌的保健概念。瑞士乳杆菌、保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌研究是益生菌,它在发酵酸乳的制作过程中能产生多种氨基酸和生物活性肽,具有增进人体新称代谢的生理功能,易消化吸收,有促进免疫、激素、酶抑制剂、抗菌、抗病毒、降血脂的作用,食用安全性高,是当今国际食品界研究的热点。为了弥补单一的瑞士乳杆菌发酵乳制品酸味重,风味欠佳等缺点,采用瑞士乳杆菌、保加利亚乳杆菌与嗜热链球菌混合作为发酵剂,来改善酸奶的风味,拓展酸奶品种新领域。
1 材料和方法
1.1 材料与试剂
瑞士乳杆菌黄河水院食品实验室;保加利亚乳杆菌黄河水院食品实验室;嗜热链球菌黄河水院食品实验室;脱脂乳粉市售;白砂糖市售;邻苯二甲酸氢钾国药集团化学试剂有限公司;无水乙醇上海化学试剂厂;氢氧化钠天津市化学试剂六厂;酚酞天津市化学试剂一厂。
1.2 仪器与设备
DGG101-1电热鼓风干燥箱天津天宇机电有限公司;AB204-N型电光分析天平梅特勒-拖利多仪器(上海)有限公司;LSY型电热恒温水浴锅北京医疗设备厂;T1000型电子天平美国双杰兄弟(集团)有限公司;PHSJ-4A型实验室pH计上海精密科学仪器有限公司;NDJ-79型旋转式黏度计同济大学机电厂;LRH-250-A型生化培养箱广东省医疗器械厂。
1.3 实验方法
1.3.1 pH值的测定
用经过标准缓冲溶液标定的实验室PHSJ-4A型pH计进行测定。
1.3.2 酸乳黏度的测定
酸乳的黏度选用NDJ79型旋转式黏度计测定,测定时选用×0.1的转子进行测定,剪切速率为2028s-1,室温下测定。
1.3.3 滴定酸度的测定[1]
吸取10mL酸乳,置于150mL三角瓶中,加入40mL去CO2水,再加入0.5mL0.5%的酚酞乙醇溶液,0.1mol/L的氢氧化钠标准溶液滴定至微红色,在一分钟内不消失为止。消耗0.1mol/L氢氧化钠标准溶液的毫升数乘以10,即得酸乳得酸度。
1.3.4 乳酸菌发酵剂活力的测定[2]
取5g发酵剂,置于150mL三角瓶中,用40mL去CO2水稀释,加入3～5滴0.5%的酚酞指示剂,0.1mol/L的氢氧化钠标准溶液滴至微红色,1min内红色不消失为止,记下消耗的氢氧化钠标准溶液的体积,发酵剂的活力按下式计算。
活力(%)=消耗氢氧化钠的体积×0.009×100/发酵乳的质量/1.032
1.3.5 正交试验因素水平选择
实验取菌种配比、接种量、加糖量和脱脂乳含量作为考察的四个因素,每个因素取3个水平,设计L9(34)正交试验如表1。
2 结果与分析
2.1 发酵乳最佳接种量的确定[3]
在11%脱脂乳中加入8%的白砂糖,分别以1%、3%、5%、7%、9%的接种量培养,测定凝乳时间、凝乳pH值、黏度、酸度,结果如图1。
由图1可以看出,酸乳的凝乳时间在5.3～7.2h,pH值在4.1～4.5,黏度在5.3～5.8 mPa!s,酸度均在84～97!T之间,试验结果表明,接种量对凝乳的黏度和pH值基本没有影响,对凝乳的酸度影响也不是很显著。接种量对凝乳时间有一定影响,由图中可以看到,随着接种量的增加,凝乳时间在不断地减少,从7.2小时降至5.3h,可见适量增加接种量可以减少发酵时间,但接种量也不宜过多,否则会造成产酸过快而使乳清分离。综合考虑,瑞士乳杆菌的接种量以3%为宜,此时pH值为4.3,酸度为90.0!T。成品酸乳为乳白色,组织状态及发酵味良好,有极少量的乳清析出。
2.2 瑞士乳杆菌、保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌混合拮抗试验
实验选用嗜酸性益生菌与酸乳生产中常用的保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌作为酸奶发酵剂,如果发酵剂菌种之间有拮抗,将会使发酵剂失效,达不到预期的效果,所以应对发酵剂菌种进行拮抗试验。
将三种菌按1∶1∶1的比例接种于灭菌的脱脂乳培养基上,放入42℃的培养箱内培养至凝乳,进行镜检。油镜下观察凝乳中发酵剂菌状态发现,三种菌形态清晰,生长良好,并且三种菌基本保持了1∶1∶1的初始比例,这表明三种菌无拮抗,能够互利共生,可以混合作为酸乳发酵剂使用[4]。
2.3 正交试验设计及结果
记录各组的凝乳时间,将凝固后的酸乳放入4℃冰箱,熟24h后,测定凝乳的pH值、酸度和黏度,并进行感观评价,用SAS软件将评分结果作为考察的响应值进行分析,确定最佳工艺条件。
由表2可以看出,酸奶凝乳时间为3.3～4.5 h,短于单菌发酵凝乳时间;凝乳pH值4.0～4.3,酸度90.45～111.36!T,说明各组发酵剂生成酸有较大的差别,2号、3号、4号凝乳的酸度较高。经24h冷藏后,凝乳黏度差别明显,4号、7号、8号的黏度较大,几乎没有乳清析出;1号、2号、6号黏度小,凝乳较稀,有少量的乳清析出。感官评定5号得分最高,其次是7号和2号。
综合评价,5号比最佳设计组酸奶组织状态要好,并且香气更浓郁,所以酸乳的最佳发酵培养条件为
瑞士乳杆菌、保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌的配比为1∶2∶1,接种量为4%,加糖量为10%,脱脂乳浓度为9%。
3 结语
3.1采用瑞士乳杆菌、保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌混合作为发酵剂，通过拮抗试验，无拮抗作用，可混合作为酸乳发酵剂。
3.2发酵酸乳的最优工艺条件为：瑞士乳杆菌、保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌的配比为1∶2∶1，接种量为4%，加糖量为10%，脱脂乳浓度为9%。
摘要：在酸奶中加入瑞士乳杆菌、保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌混合做发酵剂,弥补单一的发酵菌发酵乳制品酸味重,风味欠佳的缺点,并对三菌混合发酵酸奶的工艺进行了优化设计。结果表明,瑞士乳杆菌、保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌混合作为发酵剂无拮抗作用,可混合作为酸乳发酵剂。发酵酸乳的最优工艺条件为:最佳配比为1∶2∶1,接种量为4%,加糖量为10%,脱脂乳浓度为9%。
关键词：酸奶,瑞士乳杆菌,保加利亚乳杆菌,嗜热链球菌研究,发酵,培养条件
参考文献
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发酵培养 篇2
利用响应面法优化红谷霉素发酵培养基
在摇瓶条件下,对链霉菌702发酵生产过程中的.主要培养基组成对产红谷霉素影响进行的研究.试验采用响应面法优化摇瓶发酵培养基,利用全因子实验设计筛选出对链霉菌702产红谷霉素重要影响因子黄豆饼粉和工业蛋白胨,应用最陡爬坡实验法接近重要因子的最优水平,然后应用中心复合设计确定重要因子的最优水平.优化后的培养基组成为:玉米淀粉20g,玉米粉20g,葡萄糖20g,磷酸二氢钾0.3g,蛋白胨9g,黄豆饼粉23g,硝酸钾2.5g,硫酸铵2.5g,豆油5mL,氯化钠3g,碳酸钙6g,定容至1L.实验结果表明,采用优化后的培养基,其发酵液红谷霉素效价达到1,500μg/mL,比优化前提高了3.08倍.
作 者：熊智强 徐平涂国全 XIONG Zhi-Qiang XU Ping TU Guo-Quan 作者单位：江西农业大学生物工程系,南昌,330045 刊 名：微生物学通报 ISTIC PKU英文刊名：MICROBIOLOGY 年，卷(期)： 33(4) 分类号：Q939 关键词：链霉菌702 红谷霉素 发酵 响应面法发酵培养 篇3
关键词：酵母培养物；牦牛；青藏高原；瘤胃；体外产气；牧草；发酵参数；甲烷
中图分类号： S858.236.9 文献标志码： A
文章编号：1002-1302（2015）03-0177-06
酵母培养物（yeast culture，YC）是一种将酵母菌经特定厌氧发酵培养后形成的微生态制品，主要活性成分是酵母菌的各类代谢产物、发酵变异的培养基及少量酵母细胞，包括肽、有机酸、寡糖、氨基酸和一些芳香烃类物质[1]。YC作为反刍动物日粮添加剂的趋势已越来越明显，它有改善动物对饲料的消化率、增加瘤胃微生物蛋白（MCP）[2]、增加泌乳生产性能、提高动物免疫力的优势[3]，是继抗生素类添加剂之后作为绿色健康标签而倍受瞩目的新型饲料添加物。基于这些优势，目前很多研究集中在YC对于动物瘤胃发酵、生产性能和饲料消化率的影响方面，而涉及对动物甲烷生成量影响的报道较少，在牦牛研究领域上也是一个空缺。因此，本试验旨在探讨YC对牦牛甲烷生成量的影响和对瘤胃发酵的作用。
1 材料与方法
1.1 试验地点
青海省高原放牧家畜营养与生态国家重点实验室培育基地、青海省高原放牧家畜动物营养与饲料科学重点实验室和青海省高原牦牛研究中心进行牧草营养成分测定和体外产气培养及相关指标评定。
1.2 试验材料
根据青藏高原高寒草地实际情况采集4期牧草样品，在三江源区核心区设置采样样地，采用1.0 m×1.0 m样方，齐地面刈割，挑出不可食部分，称质量并记录，风干称质量带回实验室，粉碎，过40目筛备用[4]。YC为市售商品。
1.3 试验动物管理及日粮
选择3头健康、体质量接近、装有永久性瘤胃瘘管的4岁牦牛作为瘤胃液供体，单独饲喂。试验日粮为燕麦青干草和小麦秸秆组成，全天自由采食，自由饮水，预饲15 d后开始正试期，晨饲前采集瘤胃液，采集至保温瓶中迅速带到实验室。
1.4 牧草常规养分分析法
牧草的干物质（DM）、有机物质（OM）、粗蛋白质（CP）、粗脂肪（EE）、酸性洗涤纤维（ADF）、中性洗涤纤维（NDF）、非结构性碳水化合物（NFC）、灰分（Ash）、钙（Ca）、磷（P）含量的测定均参照文献[5]中的推荐方法。
1.5 体外产气法
分别以全年4期天然混合牧草作为发酵底物，4期牧草培养为4个单因素独立试验，底物为220 mg，另外设置空白组（仅瘤胃液和培养液），作为产气量校正。YC添加水平为0、1%、2%、3%、4%，每个水平设3个重复。通过瘤胃瘘管在晨饲前抽取牦牛瘤胃液混合后立即放入保温瓶中备用，防止微生物区系发生变化。采用Menke 等的方法[6]准备缓冲液，并将缓冲液与瘤胃液以2 ∶1的比例混合，将混合好的培养液在发酵前通入CO2保证厌氧环境后，分液至对应编号的培养管内（30 mL），放入水浴（39±0.5） ℃的摇床上开始培养。
1.6 产气量的记录
从培养管放入培养箱中开始计时，在0、2、4、6、8、12、14、16、24、36、48 h快速读数记录。当读数超过80 mL时，为了防止气体超过刻度而无法读数，需要排气，收集气体到对应编号集气袋中，记录排气后的刻度值。
1.7 发酵参数测定
体外培养48 h后，将培养管取出放入冰水混合物中停止发酵。将发酵液排到50 mL玻璃管内，测定pH值；取部分发酵液经离心（4 000 r/30 min），取上清液进行氨态氮（NH3-N）浓度测定，测定方法参照改进的比色法[7]进行。
产气量（mL）=该时间段内培养管产气量（mL）-对应时间段内空白管平均产气量（mL）；短链脂肪酸含量SCFA（mmol/L）=0.022 2×GP-0.004 25（r2=0.94）[8]；有机物质消化率OMD（%）=0.904 2×GP+0.049 2×CP+0038 7×CA+16.49（n=85，r2=0.93）；代谢能ME（MJ/kg，干物质）=0136×GP+0.005 7×CP+0.000 286×CP2+220（n=200，r2=0.94）；泌乳净能NEL（MJ/kg，干物质）=0.096×GP+0003 8×CP+0.000 173×CP2+0.54（n=200，r2=0.93）[6]。其中：GP为24 h净产气量，mL；CP为粗蛋白含量，%；CA为灰分含量，%。
发酵气体甲烷含量的测定委托兰州中科安泰分析科技有限公司进行，分析条件[9]为仪器GC 3420 （北分瑞利气相色谱仪）；检测器FID（氢火焰检测器）；柱长30 m，内径 0.53 mm，膜厚20 μm；柱温80 ℃；汽化温度120 ℃；检测温度130 ℃；进样量10 μL。
1.8 产气动力学参数
1.9 数据统计分析
采用Excel 2003进行数据整理，SAS 9.1统计软件中单因素试验统计分析采用Duncans新复极差法进行多重比较，在0.05水平进行差异显著分析。
2 结果与分析
2.1 4期牧草常规营养成分
全年4期高寒草地牧草常规营养含量（干物质基础）见表1。
2.2 添加不同水平YC时4期牧草的累积产气量
体外产气试验结果（表2）显示，以枯草期牧草为发酵底物，添加YC降低了48 h累积产气量，添加1%YC组与对照组差异不显著（P>0.05），当添加量加大时，48 h累计产气量显著下降（P<0.05），但在发酵前12 h，枯草期添加3%、4%YC组，返青期添加1%、2%YC组，枯黄期添加4%YC组的产气量均较其对照多（P<0.05）。在返青期，添加YC可以提高牧草的48 h累积产气量，1%、2%YC组较对照组显著提高（P<005），前12 h，YC对产气量影响较小，之后出现显著变化趋势。在青草期，2%YC添加组各时间点的产气记录显著低于对照（P<0.05）。枯黄期试验未发现YC对累积产气量影响显著。
由表3可知，当在枯草期添加≥2%YC时，快速降解部分的产气量A显著增大（P<0.05），而慢速降解部分的产气量B减小，其中添加4%YC组显著减小（P<0.05），A+B下降，与48 h累积产气量的下降吻合。YC对返青期A影响较小，因此在发酵前12 h各组间累积产气量差异不显著（P>005），B增加导致各组48 h累积产气量升高；青草期A除添加2%YC组外均显著升高（P<0.05），而B在添加1%、2%YC时显著下降（P<0.05），添加2%YC组的A+B顯著下降（P<0.05），相应48 h累积产气量也显著减少（P<0.05）；YC对枯黄期各部分发酵影响不显著（P>0.05）。各期YC不同添加水平对产气速率常数c影响不显著（P>0.05）。
2.3 添加不同量YC时4期牧草的发酵参数与甲烷产量
由表4可知，在4期牧草体外培养试验中添加YC对pH值和NH3-N浓度影响在各期内均不显著（P>0.05）；SCFA、OMD、ME、NEL的值在各期试验统一添加水平时的变化趋势一致，枯草期除添加2%YC组较对照组显著下降（P<0.05）外，其余添加量组变化较小（P>0.05），随添加水平的增加呈先减小后增大的趋势；返青期这4个值受YC添加量的影响，随添加量加大呈先增大后减小趋势，添加2%YC组的各值较对照显著增大（P<0.05）；在青草期添加2%YC时，这4个值比对照显著小（P<0.05），当YC的添加量>2%时回升，但与对照组差异不显著（P>0.05）；在枯黄期添加YC后，这4个值均与对照差异不显著（P>0.05）。YC的存在可减少各期牧草体外发酵的甲烷产量，其中在枯草期添加≥2%YC组的甲烷产气量显著减小（P<0.05）；返青期YC各添加水平均能显著降低甲烷产量（P<0.05）；青草期添加1%、2%、3%YC组的甲烷产量显著减小（P<0.05），添加4%YC组的甲烷产量也低于对照，但差异不显著（P>0.05）；枯黄期添加>1% YC能使甲烷产量显著减小（P<0.05）。
经双因素方差分析考察甲烷生成量，得到青草期>返青期>枯草期>枯黄期，且两两之间差异显著（P<0.05）。其中，对照组的甲烷产量显著高于各YC添加组（P<0.05），添加1%、4%YC组仅次之，差异不显著（P>0.05），与生成甲烷最少的添加2%、3%YC组也均差异显著（P<0.05），不同期与不同YC添加水平间存在互作（P<0.05），即不同期要求不同的YC添加量达到最佳的减少甲烷产量效果。经考核发现，枯黄期添加3%YC时的甲烷生产量最少。
3 结论与讨论
关于YC在反刍动物瘤胃内的作用机理存在控氧理论、小肽营养代谢扳机理论和营养理论等3种理论。控氧理论认为，培养物质仍存在一些酵母菌，它作为好氧菌将瘤胃中的氧气消耗掉后有利于瘤胃保持厌氧环境，对瘤胃微生物厌氧菌群（如纤维菌）生长发酵形成有利条件；小肽营养代谢扳机理论认为，培养物中所含的活性类似于小肽结构物质会促进瘤胃微生物活性而改变瘤胃发酵；营养理论认为，培养物中代谢产物包括有机酸、维生素、矿物质等，有利于微生物繁殖代谢而增强其发酵活性[12]。
3.1 YC对4期牧草体外发酵产气量的影响
瘤胃发酵产气主要来自饲料中OM的降解[6]，这些气体包括一些挥发性酸类、CO2、H2及甲烷等[13]，产气量反映饲料的可发酵程度，可用以衡量饲料营养价值[14]。枯草期前8 h产气量升高，促进牧草OM中易降解部分发酵，A增大。有研究证实，YC能增加纤维菌的数量和活性[3，15]，酵母菌是好氧菌，其代谢过程会减少瘤胃内的氧气，加强形成瘤胃厌氧环境，促进纤维分解菌等厌氧菌的代谢。饲料碳水化合物被纤维分解菌快速降解产生大量气体，而随微生物迅速增殖加大了对瘤胃内挥发性营养物质的消耗，因此累积产气逐渐减少，同时A的增大弥补了B减少的量，因此仅添加4%YC组的产气量显著下降；在返青期，低浓度YC对牦牛瘤胃微生物的刺激作用较强，与OMD的增大一致，累积产气量增多；在青草期期添加2%YC时，底物发酵被抑制，因为OMD显著下降（P<0.05），发酵自始至终产气显著低于对照（P<0.05），说明添加2%YC对以青草期为底物的瘤胃微生物有抑制作用，其原因可能是青草期牧草营养相对均衡，P含量和Ca含量比例合理，而YC中也含矿物质和一些酶类，添加2%YC破坏了这种平衡，对微生物活性和对饲料降解不利；而添加YC对枯黄期牦牛瘤胃体外发酵产气和OMD无影响，各添加水平下的变化与对照组差异均不显著（P>0.05），A+B的变化趋势与 48 h 累积产气量趋势一致。4期试验添加YC对累积产气量的影响变化不一致，主要受各期牧草营养成分影响，主要受饲料中ADF和NDF含量差异影响[16]。
3.2 YC对4期牧草体外培养48 h后各发酵参数的影响
通常情况下，反刍动物采食后瘤胃正常的pH值在5.5～7.5之间变动[17]，瘤胃酸碱环境与动物消化机能密切联系，大至瘤胃原虫，小至诸多作用酶等都对瘤胃内pH值很敏感，维持瘤胃正常的酸碱环境对机体正常代谢尤为重要[18]。氨态氮是饲料中蛋白氮和非蛋白氮等含氮物质被微生物分解代谢形成的终产物，大部分会被瘤胃微生物利用合成MCP[19]，成为反刍动物的蛋白质来源[20]，其浓度是饲料被分解程度和瘤胃微生物合成利用情况的平衡动态值，最适为0.065 8～0367 0 mg/mL[21]，即0.06～0.30 mg/mL[22]。分别进行的4期试验结果显示，与对照组相比，YC不同添加水平对pH值和NH3-N浓度影响均不显著（P>0.05），与姜艳美等的结论[23]一致，说明YC不会改变动物瘤胃的正常运作机能，可使牦牛瘤胃内适宜酸碱环境和氮的循环保持良好平衡。虽然按照理论推测，因YC可促进纤维的快速降解，会加速有机酸累积，而使瘤胃pH值下降，但诸多试验并未发现pH值下降，而是维持在恒定范围内，这是因为YC中含有的二羧酸可通过促进瘤胃内乳酸利用菌的活性增强对乳酸的循环利用[24-25]，不致瘤胃形成过酸环境，可达到稳定pH值的效果，调节瘤胃内对酸环境敏感的菌群，增加瘤胃微生物菌群多样性[26]，因此可添加YC防止动物因日粮中添加精料而导致酸中毒的现象。据报道[27]，YC能使饲料中的CP降解率提高，同时促进MCP合成，瘤胃细菌数增加是添加YC最显著的变化，这是YC可提高动物生产力的源动力[28]。瘤胃微生物加快增殖，生成更丰富的MCP为机体提供蛋白质，因此YC可改善瘤胃内氮循环。本试验中的NH3-N浓度均未受影响，但蒋小军等的试验结果显示，YC添加后NH3-N浓度降低，因MCP合成迅速增加[29]，与微生物数量增加的报道一致，同样是YC的积极效应；而Yoon等发现，YC能刺激蛋白分解菌增长[30]，一方面导致NH3-N生成增多，另一方面MCP合成加快，因此本试验NH3-N浓度无变化。
SCFA也被认为是挥发性脂肪酸（VFA），可被瘤胃上皮细胞和瘤胃微生物直接吸收，是主要来自饲料中碳水化合物的降解产物。试验证明，YC能促进纤维素及木质素的降解，改善瘤胃发酵，在总VFA中乙酸和丙酸占绝大多数，YC活性因子对瘤胃微生物群系有选择性刺激作用，据报道，YC能提高产乙酸菌活性，增强产乙酸菌利用氢，可使乙酸产量增加5倍[31]，因为氢更多被用于合成乙酸，可被产甲烷菌利用的氢减少，这是本试验得到添加YC后甲烷生成量减少的原因之一。在枯草期和青草期，随YC添加量加大，SCFA含量先下降后上升，添加2%YC时显著下降（P<0.05），而返青期的变化为先上升后下降，添加2%YC时显著上升（P<0.05），这些变化与产气量和OMD变化紧密相关，都源自YC对瘤胃微生物的刺激作用，进而造成饲料被分解程度的差异。在枯黄期添加YC后，SCFA与对照差异不显著。这与Williams等的结论[32]一致。不同水平YC对4期牧草产生的SCFA量影响变化不一致，主要受牧草营养类型差异的影响，有研究指出，VFA量会随YC添加时间及日粮类型变化而变化[33]。有研究显示，活性酿酒酵母能提高真菌对纤维的分解能力，显著提高甲酸、乳酸、乙酸等的浓度[34]，因此SCFA浓度增大；但有报道，酵母培养物对总VFA无影响[32]。
3.3 YC对4期牧草体外培养生成甲烷量的影响
联合国专委会表示，每年仅反刍动物向大气中排放的甲烷量达85 Tg，占全球温室效应危害的2%左右[35]，与此同时，反刍动物瘤胃甲烷的产生也浪费掉2%～12% 的饲料总能[36]，面临高寒牧区天然草场日渐退化的压力，在可持续发展和减排温室气体的胁迫下，有效抑制甲烷的研究就变得尤为重要。据报道，产乙酸菌生成乙酸的过程需要H2的参与，YC能刺激瘤胃中产乙酸菌利用H2，甚至添加活酵母菌能使乙酸产量及产乙酸菌利用H2效率提高5倍，这样增强与产甲烷菌竞争氢的作用，会有效减少甲烷的生成。改变瘤胃发酵方式，乙酸含量/丙酸含量的值减小[25]，丙酸大量形成消耗氢，可减弱甲烷的生成。但这种效果与日粮类型关联，因此出现不一致的结论[37]。甲烷的减少还与原虫数量减少相关，YC可减少瘤胃中45%的原虫[38]。枯草期添加≥2% YC可显著降低甲烷生成量，但添加2%YC组的SCFA、OMD、ME、NEL显著减小（P<0.05）；返青期添加YC各组的甲烷生成量均下降（P<005），其中添加2%YC组对底物发酵程度的促进作用更大，能量转化率显著增大（P<0.05）；青草期添加4%以下YC组的甲烷生成量显著下降（P<0.05），对添加1%YC组的饲料能量转换无影响，而添加2%YC组的能量转化效率下降，虽然4%YC使SCFA含量升高，OMD、ME、NEL均提高（P<005），但甲烷未见减少；在不影响能量转化时，添加2%YC可显著减少枯黄期的甲烷生成量（P<0.05）。
枯草期产气量因YC的添加而下降（P<0.05），对返青期和枯黄期产气量影响不显著（P>0.05），添加2%YC组的产气量在青草期显著下降（P<0.05）。在维持牦牛瘤胃正常发酵环境和有效改善饲料能量转化率的情况下，分别在枯草期、返青期、青草期、枯黄期添加3%、2%、1%、2%YC可使甲烷生成量显著降低（P<0.05）。其中，枯黄期的甲烷生成量最少，且该生育期添加3%YC组为各试验组的最低值。
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舞茸菌液体发酵富硒培养研究 篇4
材料与方法
供试菌种:舞茸菌菌种购于乐百汇食用菌大全;试剂:亚硒酸钠, 葡萄糖, 蛋白胨, 酵母浸粉, 磷酸二氢钾, 硫酸镁;主要仪器:电子精密天平, 无菌操作台, 紫外可见分光光度计, 高温灭菌锅, 恒温摇床。实验方法菌种活化将保存菌种按常规方法接入斜面PDA培养基中活化。液体菌种培养将活化的菌种按接种量10%接种于液体培养基中, 配方为葡萄糖20g, 蛋白胨3g, 酵母浸粉2g, 磷酸二氢钾2g, 硫酸镁1g, 蒸馏水1000ml, 置于25℃条件下恒温震荡培养10d。富硒发酵培养将液体菌种按接种量10%接种于终浓度分别为0、20、50、100、150、200mg/L的亚硒酸钠培养基中, 置于25℃条件下恒温震荡培养10d。测定方法采用紫外分光光度法对舞茸菌菌丝体中的硒含量进行测定[5]。总富硒量 (mg/L) =菌丝产量×菌丝体硒含量;富硒率 (%) = (总富硒量/添加硒总量) ×100%。
结果与分析
亚硒酸钠添加量对菌丝产量和菌丝体硒含量的影响
从图1可以看出, 随着培养基中硒浓度的增加, 舞茸菌菌丝产量逐渐增加, 在硒浓度添加量为50mg/L时, 菌丝产量达到最高值, 随着硒浓度的进一步增大, 菌丝产量反而下降, 说明增大硒浓度抑制了菌丝体的生长;而菌丝体中硒含量随培养基中硒浓度的增大而不断上升。
亚硒酸钠添加量对总富硒量和富硒率的影响
从图2可以看出, 总硒含量随着培养基中硒浓度的增加而逐渐上升;培养基中硒浓度在0-50mg/L时, 舞茸菌富硒率与硒的添加浓度呈正相关, 且在50mg/L时富硒率达到最高值, 而后随着培养基中硒浓度的不断上升, 富硒率反而逐渐下降。可见, 从富硒率来看, 培养基中硒浓度以50mg/L为宜。
发酵培养 篇5
海洋低温BS070623菌株选育及其发酵培养基优化(Ⅰ)
以大连渤海湾分离260余株低温条件下生长良好的菌株为出发菌株,利用双层平板筛选方法选出2株低温蛋白酶产生菌(Bacillus subtilis).经UV、DES、NTG、EMS、LiCl单独及复合诱变,选育出一株(BS070623)蛋白酶高产突变株.通过单因素实验,确定了BS070623菌株蛋白酶发酵培养基为:玉米淀粉糖0.8%,豆饼粉1.4%,磷酸氢二钾1.0%,磷酸二氢钾0.7%.上述条件下该突变株低温蛋白酶产量为913.2 U/mg.
作 者：王晓辉 窦少华 迟乃玉 张庆芳 WANG Xiao-hui DOU Shao-hua CHI Nai-yu ZHANG Qing-fang 作者单位：大连大学生物工程学院,辽宁,大连,116622 刊 名：渤海大学学报（自然科学版） 英文刊名：JOURNAL OF BOHAI UNIVERSITY(NATURAL SCIENCE EDITION) 年，卷(期)： 30(2) 分类号：Q815 关键词：低温蛋白酶 选育 优化发酵培养 篇6
关键词 火龙果溃疡病 ；皮氏类芽孢杆菌 ；拮抗菌 ；培养基优化
分类号 S667.9 ；S436.68
火龙果（Hylocereus spp.）是一种热带、亚热带水果，属于仙人掌科Cactaceae量天尺属Hylocereus植物。火龙果原产中美洲，20世纪90年代引入我国，在广东、广西、海南、福建、云南和贵州等地广泛种植，种植面积约1.3万hm2。
近年来，火龙果遭受多种病害的侵袭[1]，其中，溃疡病是危害最为严重的病害，在广东、广西等地导致许多果园丢荒，严重威胁火龙果的大面积种植和生产。火龙果溃疡病是由新暗色柱节孢Neoscytalidium dimidiatum引起，主要危害茎，在高温高湿下出现茎杆腐烂和果实开裂[2-3]，也可引起果肉褐腐或黑腐[4-5]。室内毒力测定显示，许多化学药剂对火龙果溃疡病菌有很好的抑制作用[6]，但在生产上还没有行之有效的方法控制火龙果溃疡病发生和蔓延。
笔者研究了一株从发病果园及其周围土壤中分离筛选到对火龙果溃疡病菌具有拮抗作用的细菌，对其进行鉴定和发酵培养基成分的优化，以期为开发防治火龙果溃疡病的生防制剂提供依据。
1 材料和方法
1.1 火龙果溃疡病菌
采用病组织分离法[7]，从具有火龙果溃疡病典型症状的组织上分离得到，经致病性测定，确定为病原菌，通过形态学和分子生物学鉴定为新暗色柱节孢N. dimidiatum[3]，菌种保存在广东海洋大学农学院微生物学实验室。
1.2 拮抗菌的分离筛选
分离：采用稀释平板法从样品分离细菌。将从广东湛江地区发病果园及其周围土壤中采集样品，稀释105倍，沸水浴5 min后，取200 μL稀释液涂布于冷却的PDA培养皿上，28℃培养48～64 h。
筛选：采用平板对峙法进行筛选。将火龙果溃疡病菌接种到PDA平板上28℃培养3 d，用打孔器取直径6.0 mm 的菌饼接种到PDA培养皿中央。用接种环挑取细菌接种到距菌饼3 cm处，每个菌饼周围接种4 个细菌单菌落，28℃黑暗培养，3 d后观察抑菌带的形成，记录抑菌带的宽度和细菌菌落直径，计算抑菌带的宽度与细菌菌落直径的比值，比值越大，抑菌效果越好。将对火龙果溃疡病菌有拮抗作用的细菌转接到PDA平板，划线分离纯化，在4℃冰箱中保存。
复筛：将有抑菌活性的细菌再次进行平板对峙试验，测定其抑菌作用，挑取抑菌效果最好的菌株进行鉴定及产抗菌物质培养基的优化。
1.3 产抑菌活性物质培养基筛选
供试培养基有（1）BPDB：马铃薯200 g、牛肉膏20 g、葡萄糖20 g、蒸馏水1 000 mL、pH自然；（2）改良BPDB：马铃薯200 g、牛肉膏20 g、蛋白胨7 g、葡萄糖20 g、玉米粉7 g、水1 000 mL、pH自然；（3）YPAD：蛋白胨20 g、酵母膏10 g、葡萄糖20 g、蒸馏水1 000 mL、pH自然；（4）NYDA：牛肉膏8 g、酵母膏5 g、葡萄糖10 g、蒸馏水1 000 mL、pH自然；（5）BPY：牛肉膏5 g、蛋白胨10 g、酵母膏5 g、葡萄糖5 g、氯化钠5 g、蒸馏水1 000 mL、pH 7.2；（6）玉米粉培养基：玉米粉5 g、蛋白胨0.1 g、葡萄糖1 g、蒸馏水1 000 mL、pH自然；（7）IFFI：蛋白胨10 g、牛肉膏5 g、酵母膏5 g、葡萄糖10 g、乳糖尿5 g、氯化钠5 g、蒸馏水1 000 mL、pH 6.8；（8）NA：牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、氯化钠5 g、蒸馏水1 000 mL、pH自然。
将经活化后的拮抗菌用无菌水配成106～107 CFU/mL的菌悬液，按1%的接种量接种到装有20 mL BPDB 培养液的50 mL三角瓶中，在转速为150 r/min 振荡培养箱中28℃下黑暗培养24 h，作为种子液。按1%的接种量将种子液分别接种到装有供筛选培养基的50 mL三角瓶中，装瓶量为20 mL，150 r/min 振荡培养72 h 后，经12 000 r/min，离心15 min，取上清液，用0.22 μm细菌过滤器过滤除菌，经无菌检验后得到无菌发酵液。
牛津杯法测定无菌发酵液的抑菌活性。火龙果溃疡病菌在PDA平板上培养7 d后，用无菌水将孢子洗后加入PDA培养基中，制备含菌量为104～105个孢子/mL的带菌PDA平板。在每个平板中放4个牛津杯，加200 μL无菌发酵液至牛津杯，28℃培养72 h后，测量抑菌圈大小，筛选得到最有利于产抑菌活性物质的培养基进行成分优化。每个处理重复3次。
1.4 产抑菌活性物质培养基优化
从8种供试发酵培养基中筛选出最有利于拮抗菌产抗菌活性物质的培养基IFFI，采用L16（45）正交试验进行培养基成分优化（表1）。培养基接种、发酵条件和发酵液抑菌活性测定同1.3，确定最佳发酵培养配方。
1.5 拮抗菌的鉴定
形态学和生理生化特性：参照《常见细菌系统鉴定手册》[8]与《伯杰氏细菌鉴定手册》[9]。
16s rDNA序列分析：16s rDNA序列扩增引物为细菌鉴定通用引物（27f：5-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3和1512R：5-ACG GCT ACC TTG TTA CGA CTT-3）[10]。将保存的拮抗菌划线接种PDA平板，用无菌牙签挑取单菌落进行菌落PCR[11]。PCR反应体系采用TaKaRa公司的MightyAmp DNA Polymerase Ver.2试剂盒，反应体积50 μL。PCR扩增程序：98℃预变性5 min；98℃变性1 min，56 ℃复性30 s，72℃延伸1 min，35个循环；72℃延伸10 min。PCR产物送生工生物工程（上海）股份有限公司测序。将所得序列在GenBank进行BLAST分析，选取与病菌序列同源性高及近缘种菌株序列，用MEGA 6.0[12]软件构建系统发育树，并用Bootstrap进行自举检验，1 000次重复。
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2 结果与分析
2.1 拮抗菌的分离及筛选
从广东省湛江地区发病果园及其周围土壤中采集的样品中分离得到136株细菌，平板对峙试验结果显示，其中12株对火龙果溃疡病菌有抑制作用，通过复筛，7菌株仍有很好的抑制作用（表2）。
从表2可以看出，细菌HTN-5抑菌效果最好，在初筛和复筛时，均形成抑菌带宽9.00 mm，抑菌活性稳定。复筛时，抑菌带宽与菌落直径比值最大为1.64。
2.2 产抑菌活性物质培养基筛选
将HTN-5接种到8种供试发酵培养基中，无菌发酵液的拮抗活性顺序为：IFFI>NYDA>YPAD>改良BPDB> BPDB>玉米粉培养基>BPY>NA。对应的抑菌圈直径分别为21.00、20.50、18.50、17.50、15.50、13.00、11.50和9.50 mm。用IFFI发酵的发酵液拮抗效果最好，故以IFFI作为最适发酵培养基进行含量优化试验。
2.3 产抑菌活性物质培养基成分优化
对拮抗效果最好的发酵培养基IFFI进行L16（45）正交试验，改变蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、葡萄糖、乳糖5个因素的用量，用L16（45）正交试验设计优化产抗菌活性物质的培养基成分，试验结果见直观分析表（表3）。
从表3可以看出，各因素的极差排序为牛肉膏>蛋白胨>葡萄糖>乳糖>酵母膏，表明牛肉膏为影响拮抗菌HTN-5产抗菌活性物质的最主要因素，发酵最佳培养基配方为牛肉膏2.50 g/L，蛋白胨10.00 g/L，葡萄糖12.50 g/L，乳糖10.00 g/L，酵母膏2.50 g/L，氯化钠5.00 g/L，pH 6.8。经检验，无菌发酵液的抑菌圈直径为23.30 mm，抑菌活性提高了11.0%，更有利于生产抗菌活性物质。
2.4 拮抗细菌的形态学及生理生化鉴定
形态学特征：在PDA培养基，菌株HTN-5菌落圆形突起，乳白色，有光泽，不透明，具有粘性，边缘整齐，培养72 h可活跃扩展为“运动的菌落”（图1A）。菌体细胞杆状，成对排列，G+（图1B），0.33 μm×1.87 μm （n>50）；可形成内生芽孢，芽孢囊膨胀，芽孢椭圆形。
生理生化特征（表4）：该菌产生过氧化氢酶，可分解葡萄糖和甘露醇，能够液化明胶和水解淀粉；在pH 5.7和6.8的营养肉汤中能生长；在含2%、5%和7% NaCl的培养基中生长；在20、30、37和41℃下可生长。V.P.反应、肌醇降解、利用葡萄糖产气、苯丙氨酸脱氨酶和卵磷脂酶测定、吲哚产生试验，硝酸盐还原反应均为阴性；在含10% NaCl的培养基中不生长；在4、45和65℃下不可生长。
16s rDNA序列分析：菌株HTN-5的16s rDNA序列经PCR扩增得到1 039 bp的片段（KT274704），在GenBank中进行Blast比对，菌株HTN-5的16s rDNA序列与皮氏类芽孢杆菌Paenibacillus peoriae 模式菌株DSM 8320（HG794409），多粘类芽孢杆菌P. polymyxa 模式菌株DSM 36（HG324071）和P. brasilensis模式菌株ATCC BAA-413（AF273740）的序列同源性均为99%。从GenBank中选取类芽孢杆菌属Paenibacillus的近缘种序列，Mega 6.0 软件进行Clustal比对后，采用最大似然数法（Maximum Likelihood method）构建系统发育树（图2）， HTN-5与P. peoriae DSM 8320聚集在同一个分枝上，而与P. polymyxa DSM 36和P. brasilensis ATCC BAA-413位于不同分枝上。综合形态学、生理生化特性以及系统发育分析，将拮抗菌HTN-5初步鉴定为皮氏类芽孢杆菌Paenibacillus peoriae[13-16]。
3 讨论与结论
火龙果溃疡病是一个世界性的病害，在马来西亚、以色列、墨西哥、美国和尼加拉瓜等火龙果种植区均有发生，严重危害火龙果的产量和质量。火龙果溃疡病菌在自然界中通过无性孢子蔓延和传播，在高温高湿条件下容易爆发。虽然毒力测定结果显示有一些化学药剂对其有很好的抑制作用，有希望控制该病的发生和蔓延，但是在田间并没有表现出很好的防治效果，因此，应用拮抗菌防治火龙果溃疡病是一条很好的途径。
皮氏类芽孢杆菌P. peoriae（早期为Bacillus peoriae）是一个土壤习居菌，最早于1993年从土壤根际中分离，Heyndrickx等对Bacillus peoriae和B. lautus进行修订时确定的一个新组合种[13]。皮氏类芽孢杆菌P. peoriae对多种植物病原菌有很好的拮抗作用，产生如细胞外蛋白水解酶和几丁质酶等抗菌物质，并且能够固氮[17-18]，是一个潜在的生物防治菌。本研究筛选到一株细菌菌株HTN-5，对火龙果溃疡病原菌具有明显的拮抗作用，通过形态学、生理生化特性以及16s rDNA序列分析，将拮抗菌HTN-5初步鉴定皮氏类芽孢杆菌Paenibacillus peoriae。目前，有关皮氏类芽孢杆菌P. peoriae作为生物防治菌的研究报道较少，因此有必要深入研究该菌的抑菌机制、在环境的定殖以及产生抗菌活性物质的主要成分等，以期更好开发利用皮氏类芽孢杆菌P. peoriae。
皮氏类芽孢杆菌P. peoriae菌株HTN-5对火龙果溃疡病菌有稳定的抑制作用，具有一定的开发应用前景。本研究对其产抗菌活性物质的发酵培养基成分进行了优化，获得了最佳发酵培养基配方，为开发菌株HTN-5防治火龙果溃疡病的生防药剂奠定一定的基础。
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发酵培养 篇7
免疫接种是预防本病的主要措施之一。目前主要使用灭活菌苗，国内预防IC以A型、C型单双价灭活苗为主，Matsumoto M等[2,3]研究发现，经卵黄囊接种培养制备的疫苗保护率低于经肉汤培养制备的疫苗，而且卵黄中杂蛋白含量较多，粘稠且难于确定疫苗中的总菌数。肉汤摇瓶培养 (生物制品规程2000版) 产量低，成本高，液体发酵培养技术能很好的解决此类问题，但国内对副鸡嗜血杆菌液体发酵培养工艺的报道不多，为此我们进行了多次A、C型IC的发酵培养试验，摸索培养条件，取得良好效果。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌种
副鸡嗜血杆菌Hpg-8，由中国兽医药品监察所鉴定、保存和供应，冻干保存。
1.1.2 主要仪器
GUJS-10L型发酵罐，镇江东方生物工程设备技术公司生产。水浴摇床。7200型紫外分光光度计。1.1.3培养基IC琼脂平板：副嗜血杆菌培养基干粉，青岛高科园海博生物技术有限公司，按说明配制，加入1.5% (W/V) 琼脂粉，115℃高压灭菌20min，降温至50℃左右时，加入10%的鸡血清和0.05%的辅酶Ⅰ，混匀，倾倒灭菌平皿，4℃保存备用。摇瓶培养基BHC：半合成培养基，按生物制品规程2000版配制。发酵培养基：半合成培养基，按生物制品规程2000版配制。
1.1.4 其它
鸡血清，郑州益康生物工程有限公司。辅酶I，产地Roche。
1.2 方法
1.2.1 一级种子制备
将菌株HPg-8接种于5日龄SPF鸡胚卵黄囊内，置37℃继续孵育，取30h内死亡的鸡胚卵黄囊，-20℃冷藏保存，应不超过1个月。
1.2.2 二级种子制备
取感染的鸡胚卵黄液，划线接种IC平板，置于含5%～10%CO2培养箱内，37℃培养16～18h。挑荧光性强的典型菌落接种于IC平板，置于含5%～10%CO2培养箱内，37℃培养16～18h，不超过6代。
将菌苔用灭菌BHC洗下，分别接种于400ml BHC中，并加入2%鸡血清，置37℃恒温100rpm震荡培养7～8h，纯检合格后，做为二级种子，置2～8℃保存。
1.2.3 发酵种子制备及最佳培养时间和保存期的确定
将二级种子按2%接入400mlBHC中，并加入2%鸡血清，置37℃恒温100rpm震荡培养16h，每1h取5.0ml，进行OD值检测，以OD值为纵坐标，培养时间为横坐标，作生长曲线 (图1) 。发酵菌种在摇床培养8h及冷藏后24h、48h各做活菌计数，观察活菌数变化。
1.2.4 发酵培养工艺要求
将2.3项培养的种子液4%及发酵液体积4%鸡血清、辅酶I0.003%和0.2%葡萄糖，接种于已灭菌的发酵罐培养基中，37℃培养，p H7.2～7.4，搅拌转速150rpm，通气比为1:4，接种后每隔2h取样做吸光度检测和活菌计数。
1.2.5 收获及浓缩
按生物制品规程2000版，浓缩至50亿/ml，灭活冷藏保存备用。
2 结果
2.1 各培养批次发酵菌种OD值（见表1)
OD600生长曲线表明，摇瓶菌种的最佳培养时间控制在8～10h，有利于发酵时缩短静止期，超过12h，菌体形态出现长丝状，OD值降低，此时细菌衰亡老化，不适合发酵罐接种。
2.2 发酵菌种保存时活菌数变化曲线
从图2可以看出，发酵菌种活菌数随时间呈大幅下滑的趋势，所以菌种培养完毕后应及时接罐。
2.3 各批次发酵培养时OD600值及活菌数（见表2)
菌种接入约4h后细菌进入对数增殖期，发酵10～14h后OD值有下降趋势。发酵时产酸，通过流加碱液控制pH值7.4左右。
本试验条件下培养10h活菌数的平均值为16.5/ml，菌体形态均一;培养12 h后活菌菌数有下降趋势，平均值为13.4亿/ml，镜检有长丝状菌出现，着色浅，有老化迹象，故发酵培养收获时间为10～12h即可。
3讨论
培养副鸡嗜血杆菌的液体培养基有多种，常见的有：市售副鸡嗜血杆菌干粉、半合成培养基和鸡血清鸡肉汤，胰酪胨大豆肉汤TSA均能支持副鸡嗜血杆菌的生长，但从疫苗的生产成本考虑，半合成培养基为最佳选择。
本研究的试验结果表明，副鸡嗜血杆菌hpg-8株 (血清A型) 摇瓶菌种在水浴摇床中振荡培养8～10h生长达最高峰，静置培养时生长较差，与张洪等[4]试验结果基本相同。液体发酵培养10～12h生长达最高峰，活菌数为13～16×108/ml，发酵培养时间不易超过12h。
发酵培养活菌数明显高于鸡胚培养方法，适合工业化大规模生产，但仍需通过浓缩工序进一步提高菌数，以满足规程要求，发酵工艺有待于进一步提高。
摘要：用发酵罐采取相应工艺对副鸡嗜血杆菌的液体培养特性进行试验。结果发现发酵罐培养的活菌数平均能达到16.5亿/ml, 培养最适时间为10～12h。用发酵罐培养菌体抗原比鸡胚接种培养产量高, 更适合工业化大规模生产, 且方便浓缩。
关键词：副鸡嗜血杆菌,液体培养,发酵罐,浓缩
参考文献
[1]吴清民.兽医传染病学[M].中国农业大学出版社.2002.
[2]Matsumoto M.Pretective quality of an alum inumhydroxide absorbed broth bacteria against infectious coryza[J].American J Vet Ras, 1975, 6:579-582.
[3]Davis PB, RB Rimler, EB Shotts, et al.Efficacy studies on Haemophilus gallinarum bacterin preparations[M].American Journal of Veterinary Research, 1976, 37:219-222.
发酵培养 篇8
混菌固态发酵是生物饲料一个新的发展趋势, 尽管前人在这方面做过大量的研究, 但是对山西本地酒糟的研究, 尚属少见。
一、材料和方法
1. 试验材料
(1) 原料试验所用酒糟取自清徐酒厂。
(2) 菌种产朊假丝酵母 (Candida Utilis 2.1005) :购自中国微生物菌种保藏中心;毛霉-0415 (Mucor-0415) 由山西农大动物科技学院微生物实验室提供。
(3) 培养基 (1) 麦芽汁培养基; (2) PDA培养基; (3) 固态发酵基础培养基:麸皮10%, 酒糟90%, 含水量65%, 装量为30 g, 0.10～0.12 MPa, 灭菌40min; (4) 固态发酵培养基, 经优化得到的培养基:麸皮10%, 酒糟90%, 含水量65%, 添加硫酸铵0.5%, 尿素0.3%, 磷酸二氢钾0.5%, 0.10～0.12MPa, 灭菌40 min。
2. 培养方法
(1) 菌株的活化与扩大培养在无菌操作台上将酵母菌转接到麦芽汁固体培养基上, 霉菌接到PDA培养基上, 在28℃恒温培养箱中培养3 d, 菌株长好后再次转管扩繁, 选取一部分作为试验种, 剩余菌种在4℃冰箱中保存备用。
(2) 液体菌种的制备 (1) 酵母菌液体菌种, 酵母经过斜面活化, 取一环接种于5m L液体培养基的试管中, 28℃培养24 h, 转接于250 m L的三角瓶中, 装液量为50 m L, 接种量5%, 170 r/min, 28℃培养6～8 h。 (2) 霉菌液体菌种, 从活化的霉菌斜面上刮下几环孢子, 接种于PDA液体三角瓶培养基中, 28℃恒温培养5 d。
3. 发酵产物的分析方法
(1) 真蛋白含量测定
4. 试验内容
(1) 不同营养组分在固态发酵中对真蛋白的影响及其优化分别研究固态发酵培养基中添加非蛋白氮源、磷酸二氢钾对真蛋白的影响。 (1) 不同氮源形式对固态发酵真蛋白的影响, 在试验中选择硫酸铵的添加量为0, 0.5%, 1.0%, 1.5%, 2.0%, 3%, 4%;尿素的添加量为0, 0.3%, 0.5%, 1.0%, 1.5%, 2.0%, 3%, 分别添加到基础培养料中, 配制成不同的发酵培养基并进行固体发酵, 其他条件和具体的发酵过程同。 (2) 磷酸二氢钾对固态发酵真蛋白的影响, 按尿素最佳添加量进行添加, 磷酸二氢钾的添加水平为0, 0.2%, 0.5%, 1%, 1.5%, 2%配制不同处理的培养基, 其他条件和具体的发酵过程同上。 (3) 固态发酵培养基的优化, 在单因素试验的基础上, 选择硫酸铵, 尿素, 磷酸二氢钾, 正交设计, 以找出最优的水平组合, 具体水平设计如下:四因素三水平L9 (34) 正交设计, 共九个处理, 每个处理3个重复。发酵方法及其他条件同上。
5. 数据统计方法
数据经EXCEL和SAS软件方差分析
二、结果与分析
1. 不同营养组分对固态发酵真蛋白的影响
(1) 不同氮源对固态发酵真蛋白的影响 (1) 尿素对固态发酵真蛋白的影响, 基础培养基中, 添加磷酸二氢钾0.2%, 进行尿素的不同浓度试验。由图1可以看出随着尿素浓度增加, 真蛋白含量逐渐增加, 在0.5%时真蛋白含量达最大值, 随后真蛋白含量逐渐降低, 总体来说尿素浓度对真蛋白含量影响明显。 (2) 硫酸铵对固态发酵真蛋白的影响, 培养基同上, 进行硫酸铵的不同浓度试验。
从图2看出, 随着硫酸铵浓度的增加, 产物真蛋白含量相应提高, 在1.0%时真蛋白含量达到最高, 但在浓度高于1.0%时, 继续增加硫酸铵浓度, 产物真蛋白含量逐渐减少。综合图1和图2可以得出结论:混合菌固态发酵过程中对于1.0%以上高浓度的非蛋白氮源利用率较小, 而且在发酵过程中对硫酸铵和尿素的利用能力都较好, 尤其是添加适量的尿素, 能使发酵物中的真蛋白含量增加到14.32%。
(2) 磷酸二氢钾对固态发酵真蛋白的影响在酒糟90%, 麸皮10%, 添加尿素0.5%的基础上, 试验按磷酸二氢钾0%, 0.2%, 0.5%, 1.0%, 1.5%, 2%的不同添加水平进行发酵试验, 结果表明, 在添加0%～0.5%时发酵, 真蛋白含量逐渐增加。而超过0.5%时, 真蛋白含量将明显下降, 见图3, 因此, 最终确定磷酸二氢钾的添加水平为0.5%。
(3) 混菌固态发酵最佳培养基的优化试验方法:选用正交试验方法优化培养基, 所选的水平及正交表如表2和表3所示。
对试验结果进行直观分析如下: (1) 比较表2中各考察因素的极差R, 由于RB>RA>RC, 所以各因素的主次顺序为B→A→C, 即硫酸铵是主要因素, 尿素次之, 磷酸二氢钾是次要因素。 (2) 从各因素不同水平下的均值中可以看出, 对于因素B和A, 其均值——水平的变化趋势相似, 都是先降后升;因素C呈先升后降趋势。经比较后可以确定混菌固态发酵最佳培养基为A1B2C2, 即发酵培养基中添加尿素0.3%, 硫酸铵0.5%, 磷酸二氢钾0.5%时, 真蛋白含量最高。
三、讨论
(1) 固态发酵中菌体蛋白质的增加都需要培养基内充足的氮源有资料表明对于非蛋白氮源, 如尿素、硫酸铵、硝酸铵等, 尿素、硫酸铵对于霉菌酶的活力及酵母菌的生长都较为有利, 试验中尿素、硫酸铵添加浓度分别为0.5%, 1%时, 发酵料真蛋白含量最高, 说明氮源添加量适宜, 利于菌体的生长和酶活力的提高;试验中, 在低氮源含量时, 不能满足混菌生长的需要, 表现为菌体生长慢, 发酵料蛋白质的含量相应较低;而氮源过量也会抑制菌体的生长和代谢, 试验中培养基添加尿素、硫酸铵的浓度太高的处理组合, 抑制菌体的生长, 使得蛋白含量降低。
(2) 磷是某些蛋白质和核酸的组成成分三磷酸腺苷和二磷酸腺苷是重要的能量传递者, 参与一系列代谢反应, 它也是许多酶的辅酶和辅基成分, 酵母对磷的需要量较高, 主要从无机磷化合物中获得, 而且磷酸盐在培养基中还具有缓冲作用。试验中磷酸二氢钾添加量为0.5%时, 发酵料中的蛋白含量最高, 表明, 磷酸盐浓度适当, 能加快菌体的生长, 也加快了基质的利用;磷酸二氢钾浓度在1%～2%时, 真蛋白下降, 主要是因为浓度过高会抑制菌体生长及纤维素酶的合成, 从而使蛋白含量下降;当浓度在0～0.2%, 磷酸盐添加量不足, 不能满足两种菌生长的要求, 菌体及酶的合成受阻。
4、结论
发酵培养 篇9
本文主要研究烟草节杆菌K9对于烟碱的降解培养基优化条件。烟草节杆菌K9[3]是降解烟碱的高效菌株,用NB培养基培养烟草节杆菌K9时,细胞浓度仅能达到7.4×108cfu/m L左右,故为提高菌体浓度,对培养基进行相应优化,以获得高浓度的烟草节杆菌K9。研究以易于细菌生长的改良培养基为基础,利用单因素实验法对烟碱节杆菌的碳源、氮源和无机盐生长强化因子进行筛选,为研制烟草降碱菌剂奠定基础。
1 材料与方法
1.1 试验概况
本研究于2015年在安徽皖南烟叶有限责任公司技术中心实验室进行。供试菌株为烟草节杆菌K9,为云南省烟草农业科学院微生物实验室保存菌株。
1.2 试验设计与实施
先利用单因素实验方法筛选出K9的碳源、氮源和无机盐离子,再利用响应面法对其培养基进行优化,从而得出培养基最佳成分和浓度。然后进一步用响应面法中的旋转中心组合设计对其进行优化,以获得菌株生长的最佳培养浓度。
2 结果与分析
2.1 降碱菌K9在NB培养基中的生长曲线
以活菌数为衡量标准,每隔3 h取样1次,将样品稀释涂平板,培养48 h,检测活菌数,绘制降碱菌K9在NB培养基中的生长曲线(图1),可以看出降碱菌K9在NB培养基中连续培养48 h,在0~9 h为菌体的延滞期,菌体生长9 h之后进入对数生长期,菌体浓度迅速增长,42 h左右达到最高,为35×108cfu/m L,48 h之后进入衰亡期。
2.2 降碱菌K9最适培养基的筛选
2.2.1 不同碳源、氮源对降碱菌生长的影响。
不同碳源对降碱菌K9生长的影响结果见表1,可知最佳碳源为可溶性淀粉,菌浓度达到7.30×108cfu/m L。不同氮源对降碱菌的影响结果见表2,可知最佳有机氮源为蛋白胨,菌浓度达到4.97×108cfu/m L。最佳无机氮源为硝酸铵,菌浓度达到6.94×107cfu/m L。而不添加氮源物质时降碱菌的生长情况最差,菌浓度仅为1.00×106cfu/m L。因此,选定可溶性淀粉、蛋白胨和硝酸铵作为最佳的碳源、氮源进行响应面分析试验[1,2,3,4]。
2.2.2 不同无机盐离子对降碱菌生长的影响。
(1)无机盐单因子筛选。通过对无机盐培养基中的8种无机盐离子进行逐一筛选发现不同无机盐离子的有无对降碱菌生长的影响各不相同。从表3可知,当无机盐离子中无K2HPO4时菌浓度最小,为2.35×103cfu/m L,说明该无机盐对降碱菌的生长影响最大,同理分别缺少Zn SO4·7H2O、Mg SO4·7H2O、Ca Cl2、Fe SO4·7H2O、Mn SO4·5H2O时对降碱菌的生长影响较大。而缺少Cu SO4和Na Cl时对降碱菌的生长基本没有影响。因此,影响降碱菌生长的无机盐离子有K2HPO4、Mg SO4·7H2O、Fe SO4·7H2O、Ca Cl2、Mn SO4·5H2O、Zn SO4·7H2O。然后用正交试验来进一步确定每种无机盐的含量[5,6,7,8,9]。
(2)正交试验确定无机盐的含量。通过对不同无机盐离子进行筛选,选取影响降碱菌生长的6种无机盐离子作为优化因素,每个因素选取5个水平,以菌浓度为优化指标按表4进行L25(56)的正交试验,结果见图2。由效应曲线图可以看出K2HPO4和Mg SO4·7H2O 2种物质的含量没有达到最大值。
(3)2种主要无机盐进行筛选。选取K2HPO4的含量分别设4个水平,Mg SO4·7H2O的含量分别设3个水平如表5所示。然后加入5%的可溶性淀粉和3%的硝酸铵制成100 m L的培养液,并调节p H值至7.2~7.4,装入250 m L的三角瓶中。灭菌后分别接入8%的50 m L菌悬液在150 r/min的摇床上,28℃恒温培养48 h后,进行菌落计数[10,11,12]。
由表5中结果可知,2种无机盐的最佳组合为K2HPO40.15 g/L,Mg SO4·7H2O 0.125 g/L,此时菌浓度为3.13×106cfu/m L,远大于其他组合。因此,无机盐离子的最佳浓度为K2HPO40.15 g/L,Mg SO4·7H2O 0.125 g/L,Zn SO4·7H2O 0.001 5g/L,Fe SO4·7H2O 0.001 g/L,Ca Cl20.005 g/L。
2.2.3 响应面分析优化烟草节杆菌K9培养基。
进行K9菌体浓度多元二次模型方程的建立及检验,根据试验设计进行了20组试验,其结果见表6。
表6中,x1=(X1-25)/10;x2=(X2-5)/2;x3=(X3-5)/2。
对试验数据进行二次多项回归拟合,获得K9菌体浓度的二次多项式回归方程为:
(106cfu/m L)
式中,Y为预测响应值,x1、x2、x3分别为可溶性淀粉、蛋白胨以及硝酸铵的编码值。由K9菌体浓度的二次多项式回归方程得出K9的菌体浓度预测值(表6),方差分析结果见表7。
由表7可知,该模型极显著(P<0.000 1),失拟项在α=0.1水平上不显著,模型的校正确定系数R2Adj=0.984 7,表明模型能解释烟草节杆菌K9菌体浓度响应值的变化。
3 结论与讨论
我国烤烟烟碱的平均含量为3%~4%,不同部位的烟叶中上部烟叶的烟碱含量最高,因而在叶组配方中一般因其烟碱含量较高而难以应用。近年来,随着消费者对自身健康的关注度提高,对于烟草的烟碱含量也有较高的要求。目前卷烟产品正在逐渐向低烟碱含量的方向发展,并且已经出现了许多降低烟草中烟碱含量的技术方法,包括一些农业技术措施及烟叶浸提法等,但是上述降低烟碱含量的技术方法在实施过程中也降低了烟草的综合品质,而应用微生物降解烟碱技术则具有高效且负面作用小的特点,因此研究利用微生物降低烟叶中的烟碱对于国内烟草业的发展具有重要意义。
本研究通过对菌体在NB培养基中的生长曲线的测定发现在NB培养基中菌体的延滞期时间相对较长,进入对数生长期时间也较长,考虑到菌体的最佳生长时间较长,一般为42 h,为了节省细菌培养所需要的时间以及培养细菌材料的使用,本试验采用制作菌悬液直接接入改良培养基中对碳氮源进行筛选。本次试验得到烟碱节杆菌的最佳培养基为无机盐离子(K2HPO40.15 g/L,Mg SO4·7H2O 0.125 g/L,Zn SO4·7H2O 0.001 5 g/L,Fe SO4·7H2O 0.001 g/L,Ca Cl20.005 g/L)+35.0 g/L可溶性淀粉+5.14 g/L蛋白胨+3.73 g/L硝酸铵。在优化试验条件下,得出K9菌体浓度为32.4×108cfu/m L,比优化前用NB培养基得到的菌浓度(7.4×108cfu/m L)提高了4.4倍,从而为研究真空冷冻干燥降烟碱菌剂奠定了基础。
发酵培养 篇10
关键词：H008菌株,培养基成分,优化,杀虫活性
农业生产中每年都会因病虫害而造成巨大损失,长期以来一直使用化学农药控制病虫害,但其对环境有较大危害。随着人类环保意识的加强,具有无毒、环保、无残留等优点的生物农药成为研究的热点[1]。
生物农药具有以下特点:首先,它的生物活性较高、用较小剂量或较低浓度就可以达到很好的防治效果,对环境的污染也小;其次,生物农药在自然界易被其他生物所分解,环境中不易被积累和残留;第三,生物农药生产原料来源广泛,许多为农副产品,生产较容易;第四,各种微生物农药生产工艺、设备都比较相似,且生产过程中产生的废弃物可再利用,生产对环境的污染小[2～4]。
微生物发酵产生的生物杀虫剂在生物农药中占有重要地位[5～7],相对化学农药而言,具有对环境污染小、针对性强、不易产生抗药性、生物防治效果好等特点。因此,研制与开发对环境友好的微生物杀虫剂,具有重要的经济意义和社会效益[8,9,10]。作者在俄罗斯全俄生物防治研究所的协助下开展了生物杀虫剂的研究,分离出了一株具有高效杀虫活性H008菌株(Streptomyces laindensis)。本文对该菌株的发酵培养基成分进行了优化,为该菌株的产业化开发进一步提供了依据。
1 材料与方法
1.1 供试菌株和虫源
H008菌株系从俄罗斯全俄生物防治研究所提供的土样中分离得到,初步鉴定为链霉菌属(Streptomyces laindensis)。供试的虫种为菜缢管蚜(R.pseudobrassicae),黑龙江省科学院生物肥料研究中心室内常年累代饲养多代敏感虫种。
1.2 培养基
斜面培养基:LB培养基(蛋白胨10%,酵母浸粉5%,Na Cl 5%,蒸馏水,pH值自然)。
种子培养基:LB培养基,pH值(7.2±0.05)。
发酵培养基:玉米淀粉5.0%,酵母粉1%,α-淀粉酶0.3%,消泡剂0.05%,蒸馏水配制,pH值(7.5±0.05),121℃高压灭菌30 min。
1.3 菌株发酵培养基的优化
1.3.1 培养基中碳源的优化
将H008菌种经LB培养基活化后,按10%接种量将孢子悬液接入种子培养基,于28℃摇床培养48h后,按10%接种量将种子液接入10L发酵培养基的发酵罐中,其中分别加入不同的碳源:葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、玉米淀粉,用量5%,置于121r/min条件下搅拌培养,以杀虫活性为指标。
1.3.2 培养基中氮源的优化
将H008菌种经LB培养基活化后,按10%接种量将孢子悬液接入种子培养基,于28℃摇床培养48 h后,按10%接种量将种子液接入10L发酵培养基的发酵罐中,其中分别加入不同的氮源:酵母粉、蛋白胨、牛肉膏、尿素,用量1%,置于121r/min条件下搅拌培养,以杀虫活性为指标。
1.3.3 培养基中碳氮比的优化
在上述实验基础上,分别设定所选碳源、氮源的比值为1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1,对发酵产物杀虫作用的影响。
1.4 发酵液杀虫活性的检测—浸叶法
将带有菜缢管蚜的甘蓝叶片剪成小块,放入H008菌株浓缩发酵液中浸渍10s,用吸水纸吸去多余的发酵浓缩液,并除去死蚜及过大和过小的蚜虫,只留个体一致的中等活蚜,计数,放入培养皿中的新鲜甘蓝叶片上(用含0.2%硝酸钠、0.1%磷酸氢二钾的棉球裹住叶柄基部,保持叶片新鲜)。空白对照为供试幼虫分别浸清水和发酵培养基浓缩液(2倍浓缩)。重复3次,每次重复30头蚜虫。处理后置于温度(25±0.5)℃、光周期L∶D=14∶10、相对湿度75%～85%的培养箱中饲养。48h后检查幼虫死亡率,如对照组有死亡,用Abbort公式校正死亡率。
2 结果与讨论
2.1 H008菌株发酵培养基成分的优化
2.1.1 培养基中碳源的影响
由表1可见,H008菌对葡萄糖、蔗糖、麦芽糖的利用不理想,对淀粉的利用效果好,发酵产物杀虫活性高。
2.1.2 培养基中氮源的影响
由表2可见,H008菌在以酵母粉为氮源时,发酵产物杀虫活性高。
2.1.3 培养基中碳氮比的影响
由实验结果,培养基中碳氮比低时,微生物生长较好,但不利于代谢产物的生成;反之,碳氮比高,有利于积累代谢产物,因此杀虫作用好。因此选择5∶1的碳氮比最为合适。
2.2 讨论
单因素试验结果表明,发酵生产乳酸的培养基中最佳碳源是淀粉,最佳氮源是酵母粉,碳氮比为5∶1。进行发酵实验,得到的发酵产物进行杀虫活性实验的杀虫活性最高,可以达到94%以上。
参考文献
[1]余琼,张巍,杨旭升,等。H008菌株发酵条件的优化及其发酵液杀虫活性物质的研究[J].农药,2010,49(10):726～729.
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发酵培养 篇11
关键词：液体发酵；发酵条件；正交优化；蛋白酶活力
中图分类号：TQ920.1 文献标志码：A
文章编号：1002-1302（2014）08-0273-03
大豆肽是一种比大豆蛋白质更为优质、新型的大豆蛋白酶改性产品，广泛应用于发酵、制药、食品、化妆品、饲料及植物营养剂等行业[1-3]。大豆肽易消化吸收，能迅速供给机体能量，无蛋白变性，无豆腥味，液体黏性小和受热不凝固等，并具有降低血清胆固醇[4]、降低血压、抗疲劳[5]、抗氧化[6]等许多生物功能，因此大豆肽成为研究热点。目前，大豆肽多采用酶解法和微生物发酵法生产[7]，微生物发酵法把蛋白酶的发酵生产和大豆肽的酶解生产有机结合在一起，降低了大豆肽功能的生产成本，克服了酶水解法制备大豆肽产品的苦味大和口感差等缺点[8]。目前，利用微生物发酵法生产大豆肽被认为是较先进有效方法，应用前景较好。本试验以蛋白酶活力为指标，通过单因素和正交试验对产蛋白酶芽孢杆菌 B-15 发酵处理豆粕的产酶培养基组成、发酵工艺条件进行了优化，以确定最佳的豆粕发酵产酶工艺，为大豆肽的大规模液态发酵生产奠定坚实基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 供试菌株 细菌菌株：解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）B-15，由河北农业大学生命科学学院制药工程实验室分离并保存。
1.1.2 培养基 NA培养基、NB培养基的配制详见文献[9]。种子培养基即NB培养基；基础发酵培养基：豆粕10%、Na2HPO4 0.84%、KH2PO4 0.032%、CaCl2 0.17%、混匀后调pH值6.0～6.5。
1.1.3 试剂
福林-酚试剂；0.55 mol/L 碳酸钠溶液、10% 三氯醋酸溶液、0.02 mol/L pH值7.5磷酸缓冲液、1%酪蛋白溶液、100 μg/mL标准酪氨酸溶液，所用试剂皆为分析纯。
1.2 试验方法
1.2.1 菌种的培养与发酵
1.2.1.1 摇瓶种子曲线（生长曲线）及种子培养
将斜面培养的菌株接种于NB培养基中，250 mL三角瓶中的装瓶量为75 mL（250 mL，下同），在37 ℃下180 r/min振荡培养，在零时开始取样，以后每隔1 h或2 h取样1次，直至培养24 h为止，以未接菌的培养基作空白调零，用分光光度计在600 nm下测D，以发酵时间为x轴、以D为y轴作曲线，绘制生长曲线。将斜面培养的菌株接种于NB培养基中，装瓶量为 75 mL，180 r/min摇床培养，培养时间由生长曲线确定，得到种子液。
1.2.1.2 发酵培养
对培养基成分采用以下的培养条件进行优化：将种子液以2%的接种量接入75 mL/250 mL三角瓶发酵培养基中，于37 ℃、180 r/min下振荡培养48 h，将发酵液在5 000 r/min条件下离心10 min，弃去沉淀，收集上清液，进行蛋白酶活力测定。
1.2.2 单因素试验
1.2.2.1 不同碳源
分别以2%的蔗糖、葡萄糖、乳糖、甘露醇、可溶性淀粉、玉米淀粉、D-果糖等7种碳源进行B-15菌株产酶活力比较试验，配制7种碳源不同的发酵培养基，均加入10%氮源豆粕，0.84% Na2HPO4，0.032% KH2PO4，0.17% CaCl2，混匀后调pH值6.0～6.5，筛选出最适碳源。
1.2.2.2 不同氮源浓度
配制豆粕浓度分别为2%、5%、8%、11%、14%的培养基发酵培养，进行B-15菌株产酶活力比较试验，均加入2%最适碳源，0.84% Na2HPO4、0.032% KH2PO4、0.17% CaCl2，混匀后调pH值6.0～6.5，筛选出最适氮源浓度。
1.2.2.3 不同无机盐
以浓度为0.05%的CaCl2、MgSO4、FeSO4、MnCl2、KCl、NaCl、ZnCl2等7种供试无机盐进行B-15菌株产酶活力比较试验，配制7种无机盐不同的发酵培养基，均加入2%最适碳源，最适氮源浓度的豆粕，0.84% Na2HPO4、0.032% KH2PO4，混匀后调pH值6.0～6.5，筛选出最适2种无机盐。
1.2.3 正交试验
1.2.3.1 培养基组分
在培养基各组分初步筛选的基础上，研究培养基成分的不同配比对酶活力的影响。选用L16（44）设计方案设计4因素4水平正交试验（表1），根据上述试验确定的最适碳源、氮源、无机盐配制不同组成的培养基，测定发酵菌株产酶活力。综合正交試验结果，初步确定最佳组合，得出B-15菌株产酶的最佳培养基组成。
肽发酵培养基最佳组成，即葡萄糖为2%，豆粕浓度为12%，KCl为0.01%，MgSO4为0.05%。通过对其进行发酵工艺条件参数的正交优化试验得出发酵培养基的最佳工艺参数，即发酵时间为48 h，装瓶量为50 mL，种龄为14 h，pH值为6.5。在此条件下，B-15菌株发酵产蛋白酶活力为125.05 U/mL，与基础发酵培养基相比提高了11.9%，研究结果为进一步利用豆粕提供了理论依据。
参考文献：
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发酵培养 篇12
在菌种和发酵条件确定后,培养基的配方成为了影响代谢产物和原料成本高低的决定因素[3],但目前关于CpG基序重组菌发酵培养基优化的研究,少见报道。目前应用重组大肠杆菌的培养基多为LB培养基,一般都用进口试剂配制,价格昂贵[4],为了降低重组质粒的生产成本,本实验首先采用Plackett-Burman设计法筛选出影响发酵水平的最显著因素,再用响应面分析法对显著因素的最优值进行了研究探讨,以期为大规模、低成本生产CpG重组质粒提供一定的可行性依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验材料:
含CpG序列重组质粒pVAX1-49的大肠杆菌DH5α,由作者实验室构建并保存。
1.1.2 试剂:
进口胰蛋白胨、酵母提取物购自OXOID公司;糖蜜、工业级蛋白胨、玉米浆、由广东省农科院生物技术研究所提供;卡那霉素购自广州威佳生物有限公司;甘油、NaCl、MgSO4、KH2PO4、K2HPO4、CaCl2、ZnSO4、FeSO4均为分析纯试剂,购自广州精科试剂公司。
1.1.3 仪器:
电子天平,PL202-S,梅特勒-托利多仪器公司;生化培养箱,SHP-9052,上海一恒科技有限公司;全温振荡培养箱,HZQ-F160,哈尔滨市东联电子技术开发有限公司;分光光度计,UV mini1240,Thermo公司;电热恒温鼓风干燥箱,DHP-9146A,上海精宏实验设备有限公司;双联自动机械搅拌不锈钢发酵罐,镇江东方生工。
1.1.4 培养基:
LB培养基。
1.2 方法
1.2.1 Plackett-Burman实验筛选培养基内影响显著组分
设计Plackett-Burman实验,找出培养基中的显著影响因子[5]。本实验中选取了11个因素:X1、X2、……、X11作为考察对象见表1,每个因素取两个水平,以大肠杆菌OD600为响应值,使用minitab 16.0软件设计了实验次数N=12的Plackett-Burman实验见表2。
线性系数关系:Y = β0 + βi fi (i = 1… k),Y为响应值(大肠杆菌OD600),βi为回归系数,fi表示独立因子的变量水平。反差系数用b表示,用作计算各个独立因子中不同浓度High(+1)、Medium(0)和Low(-1)的差异,找出主要影响因子。使用SPSS 17.0进行显著性分析。
1.2.2 响应面分析法优化培养基
通过Plackett-Burman实验筛选出培养基中最显著因素,使用minitab 16.0软件进行响应面分析确定影响显著因子的最佳浓度值,获得一个用于提高质粒产量的试验次数为N=15的试验模型[6]。
1.2.3 优化验证
使用10L全自动发酵罐进行发酵试验,以优化前培养基做对照,对获得的最佳优化培养基进行验证,对比优化前后质粒产量。
2 结果与分析
2.1 Plackett-Burman实验筛选培养基内影响显著组分
Plackeett-Burman可用于高效迅速地从众多因素中筛选出影响显著因子供下一步研究,简化实验过程[7],实验结果表2。
将Plackeett-Burman实验数据用SPSS软件进行统计学分析,找出11个因素中对大肠杆菌生长影响最显著因子,结果(如表3)表明F1(糖蜜)、F2(玉米浆)、F3(工业蛋白胨)三个因子影响最显著,其中这三个因子的显著因素均为P<0.01。
注:SE:标准误;***:0.0001
2.2 响应面分析法优化培养基
响应面实验对Plackett-Burman实验中筛选出的重要影响因子F1(糖蜜)、F2(玉米浆)、F3(工业蛋白胨)进行进一步优化,获得最佳培养基方案,结果如表4所示。
根据实验结果,采用逐步回归的方法对数据进行二次回归分析,由表5的实验结果可以看到蜜糖、玉米浆、工业蛋白胨系数数值为正值,这表示这个三个因子对大肠杆菌生长密度影响显著,在一定程度上,这三个因子的浓度越高,大肠杆菌的生长密度则越高;而糖蜜*糖蜜、玉米浆*玉米浆、工业蛋白胨*工业蛋白胨、玉米浆*糖蜜系数均为负值,表示过高浓度的糖蜜、玉米浆、工业蛋白胨或者玉米浆*糖蜜对大肠杆菌的生长都是不利的,因此存在一个生长密度的极大值也就是培养基浓度的最佳点。
对响应面实验的统计学显著分析结果进行F-test,结果(如表6)表明响应面实验符合统计学意义,回归显著(***),失拟不显著(27.4%)。
根据回归分析结果,用Design Expert软件做出相应曲面图,见图1～3,其中糖蜜、玉米浆、工业蛋白胨对生长的影响显著,两两因素间交互作用微弱。
2.3 优化验证
借助Design Expert软件工具,获得OD600最高峰值时即OD600=0.664 324时,糖蜜=4.667 81,玉米浆=8.635 96,工业蛋白胨=8.582 96,即优化最佳值。以此为基础,在10 L全自动发酵罐上进行发酵验证实验,取5 mL发酵样品,用标准的碱裂解法提取质粒DNA,用微量紫外可见分光光度计对质粒 DNA进行定量分析,3次重复试验的结果表明,质粒产量与培养物的OD值高低具有一致性。为了方便配制培养基而又保证OD600值,选取最适合点为:糖蜜=4.5 g/L,玉米浆=8.5 g/L,工业蛋白胨=8.5 g/L。
转化质粒pVAX1-49的大肠杆菌DH5α的优化培养基为:糖蜜4.5 g/L,玉米浆8.5 g/L,工业蛋白胨8.5 g/L,甘油10 mL/L,KH2PO4 1.5 g/L,K2HPO4 2.3 g/L,MgSO4·7H2O 0.25 g/L,在此优化培养基中进行3次重复发酵试验,测得培养16h后测得OD600的平均值为0.677 1,实测值与模型预测值重合度较高,说明用此方法分析最优培养基结果是可信的。同时用标准LB培养基作对照,培养16 h后各取1mL样品测OD600,同时取5 mL样品抽提质粒,3次重复试验的结果表明,经以上优化后的培养基培养所得到的质粒产量与标准LB培养基相比,提高了15%左右,综合考虑培养基成本及质粒产量,最终筛选到的培养基具有较高的性价比。
3 讨论
生产经济形态一直是多数生物技术类产品生产的核心利益,多数时候,工业发酵生产所用的培养基成分以及用量在生产成本中所占比例十分可观[8]。利用实验性规划方法对培养基营养组成进行优化以提高细菌生长密度和次生代谢产物,这一课题已经引起了广泛的探讨。因培养基营养组分和浓度对产物产量和生产成本的影响很大[9],本实验期望得到简单廉价的适用于大肠杆菌发酵的培养基,以生产含有CpG基序的重组质粒。有研究报道,细菌能够使用多种碳源如甘油、蔗糖、淀粉、糖蜜等生产次生代谢产物[10]。其他培养基营养组分如氮源和盐离子如铁离子、镁离子被报导对质粒的产生以及细菌的生长繁殖过程有重要的影响,最终会影响质粒的浓度和质量[11]。因此,为了利用大肠杆菌最大程度的生产含有CpG基序的重组质粒,用实验性规划方法学对生产所用的培养基营养成分和浓度进行研究是必要的。根据之前的一些报导和研究,11个营养因子包括糖蜜、玉米浆、甘油、工业蛋白胨、NaCl、MgSO4、KH2PO4、FeSO4等被选作影响大肠杆菌生产和质粒产量的关键考察对象进行研究[4]。第一步通过Plackett-Burman实验设计,对影响显著因子进行筛选,在11个因子中,糖蜜、玉米浆以及工业蛋白胨被发现对大肠杆菌生长影响系数较高;第二步则通过响应面实验来优化这三个影响最显著的因子。传统的优化方法单因素实验繁重且费时,且具有忽视各参数的交互作用的局限性,可能导致实验出现错误的结果。响应面实验则能够研究不同参数之间的交互作用,最终确定最佳的优化水平。本研究得到的培养显著因子最优化值即糖蜜=4.667 81、玉米浆=8.635 96、工业蛋白胨=8.582 96,使用10 L发酵罐进行发酵验证,实测值与理论预测值较接近,质粒产量比优化前的LB标准培养基提高了15%左右。
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