红霉素发酵（精选7篇）
红霉素发酵 篇1
摘要：红霉素是红色链霉菌的次级代谢产物, 是大环内脂类抗生素的一种, 其在生产过程中产生的废水包括提取废水、洗罐废水、滤布清洗废水等, 水质成分复杂, 溶液中含有残留的抗生素和溶媒, 对微生物具有一定的抑制作用。同时, 废水中含有不少生物发酵所产生的难生物降解物质, 属高浓度难生物降解废水。基于此, 探究红霉素发酵废水的处理工艺。
关键词：红霉素,发酵废水,处理工艺
1 红霉素废水水质
红霉素是以黄豆饼粉、玉米浆等为主要氮源, 以淀粉、葡萄糖为主要碳源, 经过三级发酵后得到发酵液, 再经过过滤、萃取、沉淀、转碱、分离、洗涤和干燥等操作而制取的。红霉素生产过程中产生的废水主要包括产品提取过程废水 (离心分离废水、破乳废水、丁酯及丙酮溶剂的回收废水) 、洗罐废水、滤布清洗废水、设备清洗水等。
废水水质具有以下特点:1从水质来看, 差异较大, 其中生产废水COD浓度在1 000~13 000mg/L, 其他辅助系统废水水质COD则低于500mg/L;2废水污染物浓度高;3由于红霉素生产原料主要为各种有机物质, 所以产生的废水中也主要是各类有机物质及其降解产物, 废水的B/C大于0.3, 理论上属于可生化性, 但由于溶液中含有残留的抗生素和溶媒, 对微生物具有一定的抑制作用, 同时废水中含有不少生物发酵所产生的难生物降解物质, 属高浓度难生物降解废水;4硫酸盐浓度高, 大量使用硫酸盐造成发酵废水中硫酸盐浓度高, 给废水厌氧带来困难;5碳氮比低, 发酵过程为满足发酵微生物次级代谢过程特定要求, 一般控制生产发酵的C/N为4∶1左右, 这样废发酵液的BOD/N一般在1∶10, 与废水处理微生物的营养要求 (好氧20∶1, 厌氧40~60∶1) 相差甚远, 严重影响微生物的生长与代谢, 不利于提高废水生物处理负荷和效率;6水质成分复杂, 中间代谢产物、表面活性剂 (破乳剂、消泡剂等) 和提取分离中残存的高浓度酸碱、有机溶剂等化工原料含量高, 容易引起p H波动大, 色度高, 甚至可能影响厌氧反应器中甲烷菌的争产活性。
综上, 红霉素发酵废水主要含有发酵过程使用的培养基和表面活性剂, 提取过程中使用的有机溶剂和絮凝剂, 残余菌丝体、抗生素和中间代谢产物等, 具有有机物浓度高, 悬浮物含量高, 存在生物抑制性物质和生物难降解物质等特点, 是一类处理难度高的废水[1]。
2发酵类废水常规处理工艺
目前, 国内外对抗生素废水处理的工艺已经基本定型[2], 主要分为物化处理和生化处理。物化处理的主要作用是降解难分解的大分子有机物, 能够让废水在进入生物处理工段后能够更高效率地被微生物吸收利用, 其次是失活分解废水中的残余抗生素, 可以有效地避免对后期的生物处理产生不利影响;生化系统是抗生素废水处理的主要工艺, 主要降解水中有机物的浓度。国内部分发酵类制药行业所采用处理工艺及处理后水质状况见表1。
制药废水的水质特点使得多数制药废水单独采用生化法处理根本无法达标, 所以在生化处理前必须进行必要的预处理。一般应设调节池, 调节水质水量和p H, 且根据实际情况采用某种物化或化学法作为预处理工序, 以降低水中的SS、盐度及部分COD, 减少废水中的生物抑制性物质, 并提高废水的可降解性, 以利于废水的后续生化处理。预处理后的废水, 可根据其水质特征选取某种厌氧和好氧工艺进行处理, 若出水要求较高, 好氧处理工艺后还需继续进行后处理[3]。具体工艺的选择应综合考虑废水的性质、工艺的处理效果、基建投资及运行维护等因素, 做到技术可行、经济合理。总的工艺路线为预处理-厌氧-好氧- (后处理) 组合工艺[4,5]。
3某红霉素生产企业发酵废水治理方案
河南省安阳市某制药厂是一家生产固体制剂和原料药的医药企业, 该公司在原料药生产方面已取得批准文号的品种共7个, 分别为红霉素、四环素、土霉素、吉他霉素、麦白霉素、烟酸林可霉素和酒石酸吉他霉素, 公司红霉素生产规模为100t/a。该公司红霉素生产过程中产生的废水主要包括产品提取过程废水 (离心分离废水、破乳废水、丁酯及丙酮溶剂的回收废水) 、洗罐废水、滤布清洗废水、设备清洗水和地面清洗水等。
根据该工程设计情况及物料平衡分析, 项目提取废水中主要含有发酵残留物、乙酸丁酯及丙酮等溶剂、少量残留的红霉素及其他杂质等。由于发酵过程中碳氮比例失调 (氮源过剩) , 废水中含有硫酸盐。此外, 根据物料使用情况, 废水中还会含有磷酸盐、氯化钠等物质。目前, 红霉素生产均采用发酵提取方法, 发酵液经过滤后采用溶剂进行萃取, 然后经离心分离、水洗、转碱、干燥等环节制取红霉素, 国内红霉素生产厂家均采用发酵提取方法进行红霉素生产, 部分环节采用设备不同, 但主体工艺基本一致, 因此废水水质差异不大[6]。根据该红霉素生产项目的物料平衡计算, 废水产生情况见表2。
根据废水产生情况, 该公司选用“气浮+水解酸化+UASB+CASS+絮凝沉淀”组合处理工艺系统, 具体工艺流程示意图见图1, 废水处理结果见表3。具体的废水处理工艺流程如下。
(1) 高浓度生产废水进入调节池, 进行水质水量的调节, 保证后续处理工艺的稳定运行。调节池中加曝气搅拌系统, 防止悬浮物沉淀。
(2) 调节池出水进入水解酸化池, 水解酸化过程能将废水中的非溶解态有机物截留并逐步转变为溶解态有机物, 一些难于生物降解大分子物质被转化为易于降解的小分子物质如有机酸等, 从而使废水的可生化性和降解速度大幅度提高, 以利于后续好氧生物处理[7]。根据《三废处理工程技术手册-废水卷》 (化学工业出版社) 等资料, 预处理对废水的去除效率为COD45%、BOD540%、SS50%。
(3) 水解酸化池出水可进入UASB厌氧反应系统, 经厌氧处理可有效去除废水中大部分的有机物和悬浮物, 其产生的沼气经脱硫后可送燃气锅炉作为燃料使用, 其产生的污泥可送污泥压滤系统进行处理。根据《升流式厌氧污泥床反应器污水处理工程技术规范》 (HJ2013-2012) , UASB对污水的去除效率为COD80%~90%, BOD570%~80%。
4 厌氧系统的出水进入CASS好氧处理系统, CASS好氧处理系统是在传统SBR工艺上发展起来的一种新工艺, 可有效去除废水中大部分有机物质[7]。根据《序批式活性污泥法污水处理工程技术规范》 (HJ577-2010) , 预处理+SBR对污染物的去除效率为COD70%~90%, BOD570%~90%, SS70%~90%, 氨氮85%~95%, 总磷5 0%~80%。故CASS的去除效率取COD85%、BOD595%、SS70%、氨氮85%和总磷5 0%。 (5)
5 出水进入絮凝沉淀系统, 进一步去除悬浮小颗粒物, 泥水分离后, 上清液达标排放。
4结论
1红霉素生产废水含有较多难生物降解物质, 属高浓度难生物降解废水。
2目前国内主要的处理工艺路线为预处理-厌氧-好氧- (后处理) 组合工艺。
3根据安阳市某制药厂红霉素生产废水水质情况, “气浮+水解酸化+UASB+CASS+絮凝沉淀”组合处理工艺系统能够处理红霉素生产废水, 使其达标。
参考文献
[1]周健, 张会展, 方春玉.水解酸化-CASS工艺在红霉素废水处理中的应用[J].水处理技术, 2006 (12) :90-92.
[2]姜家展, 季斌.高浓度抗生素有机废水处理[J].中国给水排水, 1999 (3) :57-58.
[3]曾丽璇, 张秋云, 刘佩红, 等.抗生素制药废水处理技术进展[J].安全与环境工程, 2005 (4) :62-64
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[6]韩德全, 朱义彬, 马清进, 等.红霉素生产废水处理实验研究[J].河南科学, 2006 (3) :443-445.
[7]孙美琴, 彭超英, 梁多.水解酸化预处理工艺及应用[J].四川环境, 2003 (4) :52-55.
红霉素发酵 篇2
【关键词】发酵罐；搅拌器；搅拌形式；发酵质量
【中图分类号】TQ027.2 【文献标识码】A 【文章编号】1672—5158（2013）01—0343—01
在青霉素的发酵生产过程中，一直使用的是发酵罐单层直叶搅拌方式进行发酵，这种搅拌形式有很大优点如结构简单、安装成本较低，但由于只采用位于发酵罐底部一层搅拌器，随着从发酵罐底部进来的高压空气的大量涌入，一层搅拌显然并不能将高压空气充分打碎于水中，导致发酵单位质量不高，由此可见，改变发酵罐的搅拌形式充分利用罐内氧气才是提高发酵罐发酵单位的重点。
一、改变发酵罐搅拌方式的必要性
1、搅拌器对青霉素发酵工艺的影响
发酵罐的罐压维持微正状态可以避免负压时造成的染菌，也能延长氧在发酵液中的停留时间，但是如将罐压从微正状态提高时将不利于废气的排除和发酵液内氧的传递。在这种情况下就不能单一考虑用增大空气流量的形式来提高供氧浓度，因为这样会带走更多的挥发性有机酸对产生菌的代谢十分不利，同时随着发酵液黏度的上升，还会影响液体的湍动程度和氧从气相传递到发酵液中的液膜阻力，使氧的传递阻力增大。除此之外，在发酵液粘度较大的时候还会使气液接触的总面积降低。因此为了消除过多的泡沫就要耗用大量的消沫剂。但是要注意消沫剂的用量如果过多时，不但不能消除泡沫反而会引起泡沫的调节失控最终导致异常发酵，从而给青霉素的生产工艺造成不可挽回的损失。综上可见在青霉素发酵工艺中并不提倡一味地增大空气流量，而应当调整搅拌器的转速，以便满足不同产生菌及其在不同生长代谢阶段对溶氧的需求。但是，如果搅拌器的转速过高，不仅溶氧浓度趋向饱和，并且浪费能源，还容易损伤菌体形态和产生过多的泡沫。
2、发酵罐的搅拌方式改变的必要性
青霉素是青霉菌在发酵代谢过程中产生的次级代谢产物，青霉素生产菌种是决定生产能力的内在因素，所以对青霉素的发酵过程进行有效控制就显得非常重要。目前为了不断降低消耗和制造成本，提高青霉素的发酵水平，很多企业都在不断改革工艺进行设备上的优化，以达到高产的目的。青霉素菌种的发酵水平与原材料和种子制作工艺等都有关系，还有一个重要因素就是设备。发酵罐指工业上用来进行微生物发酵的装置，其主体一般用不锈钢板制成，在设计和加工中应注意结构的严密性及合理性。发酵罐能耐受蒸汽灭菌，有一定操作弹性而且物料与能量传递性能强，并可进行一定调节以便于清洗及减少污染，适合于多种产品的生产以及减少能量消耗。一个优秀的生物反应器必须能提供微生物所需的各种条件，而其中溶解氧是重中之重，而搅拌又是提高溶解氧所必须的手段，所以若改换成更高效的搅拌形式则溶解氧水平肯定会提高，从而使发酵水平在一定程度上提到最高。
二、发酵罐新型搅拌方案的选择
青霉菌是一种好氧菌，它的生长代谢和合成青霉素都需要充分的氧供给。所以在现有空气供给条件下及限定的搅拌功率下提高溶氧水平，可通过优化改进搅拌系统达此目的。目前可运用力学、流体力学等从现有生产晴况分析人手，不断改进气体分散状态液体混合，使气泡得运动形式达到提高供氧能力的目标。通过分析和不断试验发现U型搅拌器的搅拌效果非常好，能够在在搅拌电流略低和空气流量不增的情况下提高了溶氧水平。
1、三层U型搅拌设计方案
搅拌器是一种使液体、气体介质强迫对流并均匀混合的器件，搅拌器的类型、尺寸、转速、功率等参数对介质的搅拌混合效果有着非常重要的影响。不同的搅拌过程需要由不同的搅拌装置运行来实现，在设计选型时首先要根据工艺对搅拌作业的目的和要求确定搅拌器的类型、电机功率、搅拌速度，然后选择减速机、机架、搅拌轴及轴封等各部件。在青霉素的发酵罐中，新的发酵罐搅拌形式把原来搅拌器的一层搅拌增加到了三层，并且将原来直叶形式的搅拌方式改为“U”型，这样的实际处理能够大大增加发酵液中的氧气浓度，减少了由于增加两层搅拌叶所带来的增加运转电流，而且U型搅拌叶的运转电流比直叶型小，如此设计为发酵罐的充分发酵提供了技术上的有效支撑。
2、设备设计要求精确
在进行设计时必须对工艺给定外的隐含条件进行综合考虑，对构件的形式也要进行合理的选择以做到数据精确。在青霉素生产中采用的搅拌器设备在生产过程中所起的作用非同小可，所以要求设备的形状、尺寸和结构型式也要非常精确，所以对搅拌器进行优化合理的设计是非常重要的—件事。在具体的设计中要注意熟练掌握搅拌器的基础知识和工艺特性才能设计出符合要求的新型搅拌器。
3、三层U型搅拌设计的可行性研究及优势
每一种方案的选择必须经过充分的论证之后才能被采用，U型搅拌设计是在选取了充足的实验材料下，对单层直叶形式和三层U型进行了充分的比较下进行的选择。
3.1 可行性研究
实验方案选取的是在100吨发酵罐上分别装上两种不同形式的搅拌器，分别运转四个批次，对其最后放罐效价及指数做对比分析。经初步分析，采用U型搅拌设计能够提高发酵罐的溶解氧将发酵水平提高了1.5%，但是由于只测试了U型搅拌叶在运转过程中的电流比直叶搅拌形式小，而未考虑到启动瞬间的电流大小问题，导致在第一次启动安装U型搅拌的发酵罐时，由于启动电流过大，造成电机烧毁。为此在进行实验时要充分运用调频器来达到对搅拌转速的控制。把安装了U型搅拌叶的发酵罐批次用调频器进行转速控制，使之在开启搅拌的时候缓慢转动，这就会使得启动瞬间的电流由于搅拌转速的降低而大幅降低，从而保证电机的实际电流为额定电流之下。从所得的实验数据上看，采用原来单层直叶搅拌所得的平均发酵指数明显低于安装新式U型搅拌发酵罐所得的平均发酵指数，由此证明新型设计能够提高发酵生产水平，能达到预期的提高生产水平的目的。
3.2 U型搅拌设计的优势
在机械搅拌通风发酵罐中，搅拌所消耗的能源占发酵全过程的一半左右，所以在机械搅拌通风发酵罐内强化通风就能使加速发酵罐的溶氧过程，并且能够有效的降低发酵能耗。采用U型搅拌器能够强化发酵罐内的气体分散，所以在设计时要合理设计各层搅拌器的直径。U型搅拌器比传统的机械搅拌通风发酵罐能耗上能够降低很多，还提高了溶氧效果及发酵水平。传统青霉素的发酵罐搅拌大多数都是多档搅拌才能达到发酵溶氧的要求，但是通过实验我们可知发酵液中的溶氧水平主要取决于发酵罐底档搅拌气液的混合效果。经改进搅拌器结构形式，就可以在罐底部使气液达到充分的混合，从而使气泡直径达到微型化直至乳化状态，这样就能更有效的提高溶解氧。
结束语
格尔德霉素发酵工艺的优化 篇3
1 材料和方法
1.1 菌种。
吸水链霉菌 (Streptomyces hygroscopicus) SIPI.A.2039。
1.2 材料。
葡萄糖 (山东西王糖业有限公司) 、玉米淀粉 (新沂华夏淀粉糖有限公司) 、酶水解酪蛋白 (上海华门科技实业有限公司) 、酵母粉 (唐山绿仙生物科技有限公司) 、牛肉浸膏 (山东梁山科鑫生物制品有限公司) 、琼脂条 (莆田市海悦食品有限公司) 、黄豆粉 (新沂华夏淀粉糖有限公司) 、蛋白胨 (湖北兴银河化工原料有限公司) 、硫酸铵 (东莞市凌志化工有限公司) 、碳酸钙 (东莞市凌志化工有限公司) 、淀粉 (曲阜市天利药用辅料有限公司) 、糊精 (曲阜市天利药用辅料有限公司) 、蔗糖 (北京广联行科技发展有限公司) 、乳糖 (唐山绿仙生物科技有限公司) 、麦芽糖 (唐山绿仙生物科技有限公司) 、甘露醇 (唐山绿仙生物科技有限公司) 、果糖 (北京广联行科技发展有限公司) 、甘油 (济南东润精化科技有限公司) 。
1.3 仪器。
LC2000液相色谱 (上海天美科学仪器有限公司) 、欧洲Radwag瑞德威电子天平 (深圳市怡华新电子有限公司) 、PHS-3C雷磁p H计 (上海楚柏实验室设备有限公司) 、Temp 300双通道热电偶式温计 (赛默飞世尔科技水质分析仪器) 、5804R台式高速大容量离心机 (Eppendorf中国有限公司) 、WP-UP-Ⅲ-20精密型实验室专用超纯水机 (四川沃特尔水处理设备有限公司) 、KQ-300B型10L台式超声波清器 (上海楚定分析仪器有限公司) 、卡赛帕克C18MGⅡ液相色谱柱 (4.6×250mm 5μm) 。
1.4 培养基及培养条件。
斜面培养基:p H7.0, 葡萄糖:酵母粉:牛肉浸膏:琼脂条 (10:1:1:25) 28℃培养10天。发酵培养基 (g/L) :p H6.8~7.0, 黄豆粉:玉米淀粉:硫酸铵:碳酸钙 (40:100:3:10) 湿热灭菌二十分钟, 28℃, 转速220r/min培养6天。种子培养基:酵母粉:葡萄糖:蛋白胨 (5:10:10) , 湿热灭菌二十分钟, 28℃, 转速220r/min培养2天。
1.5 分析方法。
还原糖测定:采用斐林试剂法。菌丝浓度测定:高速离心, 测得沉淀物在培养液中的比例。p H测定:酸度计测定。溶氧浓度测定:用溶氧电极在线测定。发酵效价测定:高效液色谱法。卡赛帕克C18MGⅡ液相色谱柱 (4.6×250mm 5μm) , 乙腈-水 (55∶45) , 检测波长为304nm, 流速为1.0ml/min, 柱温为25℃。
2 结果与讨论
2.1 摇床转速对GDM生物合成的影响。
本文分别采用摇床转速为250r/min、220r/min、190r/min、160r/min、130r/min进行试验, 考查摇床转速对GDM生物合成的影响。实验结果表明随着摇床转速提高, p H和发酵效价也随之提高, 菌生长越旺盛, 摇床转速为250r/min合成效果最好。实验结果表明GDM的生物合成过程中需要大量的氧气参与反应。
2.2 摇瓶装量对GDM生物合成的影响。
采用固定转速250r/min, 分别将摇瓶装量设为20m L/750m L、40m L/750m L、60m L/750m L、80m L/750m L、100m L/750m L、120m L/750m L、140m L/750m L、160m L/750m L、180m L/750m L对GDM生物合成的影响。实验结果发现摇瓶装量对GDM生物合成有较大影响。实验结果表明随着摇瓶装量的增加PH值呈下降趋势。实验结果表明随着摇瓶装量的增加效价先呈现增加趋势, 当摇瓶装量为80m L/750m L时效价为最高, 随后呈下降趋势。装量小于80m L/750m L时可能由于供氧过多造成菌体过度生长, 导致GDM的生物合成受到严重影响;装量大于80m L/750m L时可能由于供氧不足, 导致效价呈下降趋势。
2.3 不同碳源对GDM生物合成的影响。
本实验分别采用淀粉、果糖、甘油、糊精、蔗糖、乳糖、麦芽糖、葡萄糖、甘露醇等作为唯一碳源进行试验。结果表明使用淀粉、果糖、糊精、葡萄糖、甘露醇时效价较高, 使用蔗糖、乳糖、麦芽糖、甘油时效价较低, 以葡萄糖和淀粉最优。
2.4 不同葡萄糖含量对GDM生物合成的影响。
本实验分别采用不同含量的葡萄糖进行试验, 研究其对GDM生物合成的影响。试验结果表明葡萄糖含量为10%发酵效价最高。
2.5 发酵罐对GDM生物合成的影响。
在100L的发酵罐中装液量65L, 在发酵前48h长菌体阶段保持转速和通气量固定不变, 48h后通过控制搅拌转速和空气流量, 考察发酵罐参数的设置对GDM生物合成的影响。试验结果表明溶氧值越高, 发酵效价越高。由于发酵液比较粘稠, 增加搅拌转速和空气流量可以提高发酵效价。
2.6 分批补料对GDM生物合成的影响。
多阶段的青霉素发酵过程故障诊断 篇4
1 MPLS建模
间歇过程中多个批次的测量数据可以用 (Ix Jx K) 三维数据矩阵来表示, 其按照时间轴展开成二维矩阵并做标准化处理, 然后对处理后的数据矩阵用部分最小二乘法建模的。
2 影响发酵产率的因素
在分批发酵中, 常常因为前期基质量浓度过高对菌丝生长产生抑制, 因为即使是超出最适浓度范围较小的波动都将引起严重的阻遏或限制在青霉素发酵中通常采用补料分批操作法。青霉素发酵的最适温度随所用菌株的不同可能稍有差别, 温度过高将明显降低发酵产率, 降低葡萄糖至青霉素的转化率。对菌丝生长和青霉素合成来说, 最适温度不是一样的。因为青霉素在碱性条件下不稳定, 尽量避免p H值超过7.0。p H值的变化是葡萄糖流加速度高低的反映。过高的流加速率造成酸性中间产物的积累使p H值降低;过低的加糖速率不足以中和蛋白质代谢产生的氨或其他生理碱性物质代谢产生的碱性化合物而引起p H值上升。
对于好氧的青霉素发酵来说, 溶氧浓度是影响发酵过程的一个重要因素。当溶氧浓度降到30%饱和度以下时, 青霉素产率急剧下降, 低于10%饱和度时, 则造成不可逆的损害。溶氧浓度是氧传递和氧消耗的一个动态平衡点, 溶氧浓度过高, 说明菌丝生长不良或加糖率过低, 造成呼吸强度下降, 同样影响生产能力的发挥。发酵过程中必须控制菌丝浓度不超过临界菌体浓度, 从而使氧传递速率与氧消耗速率在某一溶氧水平上达到平衡。青霉素发酵的临界菌体浓度随菌株的呼吸强度、发酵通气与搅拌能力及发酵的流变学性质而异。呼吸强度低的菌株降低发酵中氧的消耗速率, 而通气与搅拌能力强的发酵罐及黏低的发酵液使发酵中的传氧速率上升, 从而提高临界菌体浓度。
3 青霉素发酵过程的在线监测
(上接96页) 络是否可以正确诊断出汽轮机系统的故障。取样本
本文选取40个正常批次数据, 9个过程变量 (冷却水流加速度、培养基体积、溶氧饱和度、通风率、搅拌功率、底物流加速度、发酵容器温度、p H值、二氧化碳浓度) , 4个质量变量 (底物浓度、生物质浓度、青霉素浓度、反应产生的热量) , 每小时采样1次构成模型数据集合。
用FCM方法进行分类将青霉素发酵分为三个阶段采并结合Pensim仿真平台仿真出的各个变量的轨迹。
第一阶段:菌体生长阶段, 前五十小时, 在适应的环境下发酵培养基接种后经过短时间的适应即开始发育、生长和繁殖, 直至达到合成青霉素需要的菌体临界浓度, 当菌体生长达到定浓度后, 发酵就从菌体生长阶段转入青霉素合成阶段。该阶段反应时间短, 相对平稳, 可采用MPLS方法建模。
第二阶段阶段青霉素的合成速度达到最大值即青霉素合成阶段, 开始时间为五十一小时一直持续到青霉素合成能力衰退的二百九十小时。青霉素合成阶段适合采用MNNPLS模因为其反应过程强度大、过程变量及外界因素影响大、非线性比较强。
第三阶段为菌体自溶阶段, 从二百九十一小时到四百小时。菌体自溶阶段适合采用MPLS方法建模, 因为该阶段菌体开始衰老, 青霉素合成能力降低。通过数据可以看出:分阶段多模型方法的SPE控制限从反应开始到结束都要低于用传统的MPLS模型和MNNPLS模型得到的控制限, 在第二阶段也就是青霉素合成阶段更明显。试验表明采用分阶段多模型法在间歇过程故障监控中的灵敏性更高。
为了验证本文提出的方法对间歇过程故障诊断的良好效果, 在故障批次的第245个小时对通风率增加0%~3%斜坡扰动, 直到反应结束。通常通风率的改变会影响到反应进程中的溶氧浓度温度等, 最终会影响到青霉素的产率。通过试验可以看出采用MNNPLS方法虽然检测到了故障, 但是有很长的延迟时间, 不能在故障发生时刻及时的检测到故障, 而采用传统的MPLS方法没能有效的检测到故障的发生。
4 结论
本文采用分阶段多模型方法多阶段的青霉素发酵过程监控和故障诊断。该方法将间歇过程分成多阶段, 克服了传统MPLS的缺点。通过和传统MPLS、MNNPLS的监控结果比较证明了本方法对间歇过程故障诊断的优适。
本文利用RBF神经网络对汽轮机故障进行了模型的构建, 利
摘要：由于青霉素发酵过程中不同阶段具有不同的动态特性, 所以将整个发酵过程分成不同的阶段并对其研究。本实验对青霉素发酵不同阶段进行研究并分别建立模型, 以达到其准确性。本文采用分阶段多模型的方法对青霉素发酵过程实施监测, 并采用不同的建模方法来描述各阶段数据间的动态特性, 最后采用MPLS、MNNPLS方法进行监测的结果比较。
青霉素G发酵过程自动控制设计 篇5
关键词：青霉素,发酵,过程控制
6-氨基青霉烷酸(6-APA)是合成各种半合成青霉素的重要中间体,目前氨苄青霉素,羧苄青霉素,甲氧苯青霉素等半合成青霉素已成为在细菌感染医疗领域的首选治疗药物。目前工业中生产6-氨基青霉烷酸多以青霉素G为原料,因此在一个完整的半合成青霉素生产企业中,青霉素G发酵生产装置已经成为不可或缺的一部分。
青霉素G发酵过程是一个非常复杂的化学变化和生理变化的综合过程,是一种典型的复杂演化系统。由于过程涉及活的细胞体或组织,从而使得反应呈现高度的非线性和时变性;同时由于缺乏可靠的生物传感器,一些生物参数(如菌体浓度、基质浓度、产物浓度等)在线检测相当困难[1]。因此在青霉素G工业发酵过程中,可以通过控制青霉素产生菌所需要的培养基、pH、压力、温度、通风、搅拌等参数来实现对这些生物参数的间接控制。本文根据某跨国制药企业的6-APA工程设计中的青霉素发酵部分,来进行青霉素发酵过程自动控制设计的探讨。
1 青霉素发酵工艺概述
在目前主流的青霉素发酵工业生产中,一般都是采用补料分批发酵的生产方式。它是一种间歇性的分批发酵方式,即随着发酵过程的进行,发酵液不断膨胀,当达到当前发酵罐的容量时,会向后续生产的更大容量的发酵罐放出一部分发酵液,如此周而复始的分批操作,从而达到青霉素发酵工业大规模生产的需求。向青霉素一级发酵罐加入浓度为62%的葡萄糖浆,无机盐混合料。将已经准备好的接种液罐中的接种液加入到一级发酵罐中,在接种完成后,开始进行大约20 h的分批发酵阶段。每隔一段时间流出一定体积的发酵液至后面的二级和三级发酵罐继续发酵。之后,葡萄糖浆和前体NaPA溶液按照一定的比例经过高温消毒后流加进二级和三级发酵罐,与此同时,按照一定的速率加入氨水和硫酸铵。氨水和硫酸铵提供发酵所需要的氮源,同时也起到调节发酵液pH的作用。大豆油作为消泡剂,在发酵中泡沫产生的时候进行消泡处理。整个发酵过程持续数百小时。青霉素浓度通过检测尾气中的CO2浓度来测定。图1为青霉素发酵过程示意图。
2 青霉素发酵过程控制
青霉素发酵的过程控制就是要把发酵过程所需要的各种状态变量控制在期望的恒定水平上或者特定的函数曲线上。为实现青霉素发酵过程的最佳补料控制,得到最大的青霉素产率,发酵中环境因素的调控尤其是溶解氧DO、酸碱度pH值、温度和压力的控制是至关重要的[4]。另外,反应器内的搅拌速度和泡沫等也对发酵过程有一定的影响,因此还需要一些辅助的控制系统,而这些辅助的控制系统往往被包含在DO、pH等控制回路中。
2.1 溶解氧DO浓度控制
青霉素发酵过程属于微生物需氧发酵,因为氧气是青霉素代谢网络中通过氧化磷酸化产生能量的必须物质。在发酵过程中,发酵液中溶解氧浓度与菌体细胞的生长代谢密切相关,若溶解氧浓度过低,细胞的生长就会受到抑制,甚至会分解出酸性物质,影响生物的代谢;相反,若溶解氧过高,则会使生物在发酵前提前衰老。因此,在青霉素发酵过程中,控制好溶解氧浓度是非常重要的[4]。
溶解氧容易受到发酵罐内压力,搅拌器速率,通气流量,这几种状态变量的影响,另外需要控制的发酵罐内温度也对溶解氧的检测有一定的影响,因此,选用带有温度补偿功能的溶解氧测量分析仪表,并通过发酵过程控制系统对罐顶压力、搅拌器速率及通气流量进行控制可以达到调节溶解氧的目的。在三级发酵罐的溶解氧过程控制系统中,采用两个反馈串级控制系统分别控制与溶解氧有关的发酵空气流量及搅拌器转速,构成的溶解氧控制方案与控制系统图如图2和图3所示。
如果在溶解氧控制系统中采用以往的单回路控制系统,单纯靠测量发酵液的溶解氧数值去控制发酵空气进气流量和搅拌器速度,在复杂的青霉素发酵过程中往往达不到要求。因为溶解氧的测量存在较大的滞后性,发酵空气由于受着很多其他因素的影响,自身的流量本身就不稳定,肯定会对发酵液中的溶解氧数值产生较大波动。再加之用变频器驱动搅拌器并不一定能达到理想的转速。以发酵空气串级控制系统为例,采用了如图所示的系统,可以及时克服发酵空气流体的扰动。以发酵液的溶解氧数值作为一个主参数,构成一个主回路,以发酵空气流量为副参数,构成一个副回路。假设发酵罐处于平衡状态,当发酵空气由于某个不可预知的干扰出现,使得发酵空气流量减小,如果是溶解氧单回路控制,势必要等到溶解氧数值产生减小到设定值,发酵空气控制阀FV1才能开启增加供气,由于这个过程较慢,很有可能使得发酵细胞在缺氧的条件下转而消耗自身的乳酸,造成发酵环境pH的变化。在采用串级控制系统的情况下,当发酵空气出现流量减小的情况时,由于有流量调节副回路的存在,流量检测可以很快相应,流量调节阀可以立刻增大发酵空气进气量。这样,发酵空气扰动对于发酵液溶解氧数值的影响可以降到最低。如果这个流量的干扰仍然对溶解氧数值产生影响,溶解氧控制器可以输出一个调节信号给副回路的流量控制器,再去微调流量,直至溶解氧重新回到正常水平。显然采用如图这样的串级控制系统可以获得响应更快精度更高的控制效果。
2.2 酸碱度pH值控制
发酵液的pH值既是培养基理化性质的反映,又是微生物生长代谢的结果;反过来又影响微生物生长和发酵产物的合成。不适当的pH,将显著降低微生物的生长速度,减少发酵产物,甚至完全没有发酵产物产生[7]。因此,对青霉素发酵液中的pH在线检测是间接检测发酵过程中微生物生理状态变化的重要方法。在发酵进行的过程中,葡萄糖代谢产物氨基酸等酸性物质不断的产生和积累,造成pH值的不断变化。pH下降后,通过加入氨水和硫酸铵来控制pH值,这样不但保持了发酵罐中pH值的稳定,还同时对反应物质自动补给的氮源。对于需要分批补料的青霉素发酵过程控制,对加入的氨水(生理碱性物质)和硫酸铵(生理酸性物质)进行控制,用来调节发酵罐中的pH值。图4与图5为三级发酵罐控制系统中的pH控制方案与控制系统图。
由图4、图5可以看出,发酵罐pH过程控制系统由两个回路组成,一个是单回路的(NH4)2SO4流量控制回路,一个是由pH分析仪和流量变送器组成的串级控制回路。在发酵过程中,pH的控制首先要考虑的是发酵液中的酸碱物质的平衡,使它们能够均衡代谢以保证pH值的稳定;其次是维持生理酸(NH4)2SO4和碱性物质NH4OH在补料中的平衡,使得发酵环境的pH值不会因为补料而造成大幅度波动;再次是当发酵罐中的pH值偏离了设定范围,适当加入酸碱予以调节。由于采用了单独的分批补料控制系统来对进料进行控制,维持了发酵液中碳源的稳定,因此,此回路只针对氮源(NH4)2SO4进行控制就可以达到就行,使用一个简单的反馈控制回路就可以稳定的控制(NH4)2SO4的流量。另外一个回路以pH为主参数,建立一个主回路,以NH4OH的流量为副参数,建立一个副回路,构成一个串级pH控制系统。假设发酵罐的pH处于5.8～6.9的稳定状态,当NH4OH由于某个不可预知的干扰出现,使得NH4OH流量突然增大,如果采用的是pH单回路控制,势必要等到pH数值增大到上限,NH4OH控制阀FV3才能减小NH4OH的流入速度,由于这个过程较慢,造成在发酵液中的氮源过剩,碳源相对不足的情况,这时细胞为维持生命和代谢能量会分解自身的有机酸和其他物质,对正常发酵产生影响。在采用串级控制系统的情况下,当NH4OH出现流量变化的时候,由于有流量调节副回路的存在,流量检测可以很快响应,调节阀可以立刻NH4OH的流量。这样,生理碱溶液的扰动对于发酵液pH的影响可以降到最低。由于碳源补给可控,生理酸流量稳定,采用如图这样的串级控制系统控制生理碱的流量不但可以使得发酵液中的碳源与氮源保持相对稳定,也可以获得响应更快精度更高的pH控制效果。
2.3 发酵温度控制
青霉素发酵的温度控制在整个生产过程中也是及其重要的,因为青霉素整个发酵过程都需要酶将原料葡萄糖降解成丙酮酸,而每个生产工厂所使用的酶的最佳活力就都有各自不同的温度。因此,青霉素发酵过程的温度进行控制,就是一个重要的青霉素发酵环境因素的控制。此外,发酵罐内的温度还对某些微生物检测所使用的电极传感器产生微弱的影响,如pH传感器和溶解氧电极。青霉素发酵罐内的温度影响主要因素有流加的各种反应物的温度、微生物发酵产生的热量、搅拌机产生的热量,加热蒸汽的热量、所加的发酵空气的温度、冷却水本身的温度的偏差及环境温度的变化等。在青霉素发酵生产过程中,涉及温度控制有两个生产工序:消毒与发酵。因此采用两个单回路温度控制系统对三级发酵罐进行温度的控制。图6与图7为三级发酵罐控制系统中的温度控制方案与控制系统图。
在发酵准备过程中的消毒生产工序中,采用通入高温蒸气来进行整体的消毒,并且要求发酵罐内温度保持在130 ℃以上不低于半个小时,以达到药品生产的灭菌目的。在升温阶段,采用手动控制通入高温蒸汽使温度迅速升至130 ℃,然后切换到TV1的控制回路进行温度保持控制。热媒介质为139 ℃的蒸气,由TV1控制,出于安全考虑,热媒调节阀TV1选用气开阀。在消毒过程中,一旦发酵罐内温度低于设定温度,控制信号便由TIC发出控制TV1,调节进入发酵罐内的蒸气,使发酵罐内消毒温度重新回到设定状态。
在这个青霉素发酵生产工序中,发酵罐内温度保持在25 ℃±0.5 ℃被认为是最佳的环境温度,而分批流加的反应物都是经过高温消毒后的葡萄糖和NaPA的混合溶液,温度在80 ℃左右。冷媒介质为5 ℃的冷凝水,由TV2控制。在反应过程中,由于在高温消毒后只针对补料溶液进行流量控制而没有进行温度控制,因此,进入发酵罐的分批补料流量稳定但温度并不稳定。在分批补料过程中,由于反应物温度高于设定值许多,由TIC控制TV2,调节冷媒流量。出于安全的考虑,冷媒调节阀TV2选用气关阀,冷媒流量越大,发酵罐夹套导热介质吸收发酵液的热量越多。冷媒介质回路的被控对象显然是正作用的,即发酵液温度高于25 ℃越多,阀门开启度越大。
2.4 发酵罐压力控制
在青霉素生产过程中,对发酵罐进行压力控制也是非常必要的。因为青霉素发酵罐在整个生产过程中都必须处于无菌状态,因此保持发酵罐内正压有助于防止外界空气倒流造成污染;此外,保持一定的压力还有助于增加氧气的分压,提高氧的溶解度;而且在压力的不稳定会对溶解氧和pH分析仪的读数造成变化,因此保持压力的稳定对溶解氧及pH电极的标定及测量都是十分必要的。青霉素发酵罐内的压力影响主要因素有发酵空气的流入、反应时产生的废气的排放及环境温度的变化等。在青霉素发酵生产过程中,涉及压力控制与温度控制一样有两个生产工序:消毒与发酵。因此同样采用两个单回路压力控制系统对三级发酵罐进行压力的控制。图8与图9为三级发酵罐控制系统中的压力控制方案与控制系统图。
在这个青霉素发酵生产工序中,发酵罐内的压力需要保持在0.3 MPa(G)。由于是控制两个生产工序,一个工序是控制杀菌蒸气,另外一个工序是控制发酵废气排放,因此每个工序的排气量并不一样,因此采用两个不一样大小的排气阀门。虽然这两个阀是排气阀门,出于安全起见本应采用气关阀门,但是由于采用了爆破片等其他安全措施,因此这两个排气阀仍然选用气开阀。
3 结 语
由于制药工厂在工程设计阶段对每个生产过程都采用了适宜的控制回路,并在整体上采用了先进的自动控制工程设计,使得在生产阶段能够方便的进行扩展并实现一些复杂的控制方案。在生产过程中由操作工程师通过对传统的控制方式进行优化,可以满足青霉素工业化生产这种时变、非线性、多输入多输出的生产过程控制要求。
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红霉素发酵 篇6
1.1 青霉素发酵过程生产方式的原料
以产黄青霉菌的JS-8和STP-3 (球状结团形态) 为菌种, 在玉米浆、棉籽粉等基础培养基中进行实验室条件或工厂生产规模发酵, 小试在30L发酵罐 (MA RUBISHI, MSJ-U3) 上进行, 中试为6吨罐, 生产规模为50发酵罐, 有关实验数据在中试和生产罐上得到。大罐的参数检测与控制。其中第二级计算机 (DIMENSION) 主要作数据管理用, 有两个智能终端 (东海0520) , 其中NO1终端作数据处理, 例如数据保存、间接参数计算、过程显示和人工干预等、NO2终端主要作过程建模、辨识或实施模糊专家系统控制。
1.2 青霉素发酵过程生产方式的分类
青霉素发酵过程的生产方式有三种, 分别是连续方式、批操作方式和间歇补料批处理方式。间歇补料批处理方式是目前我国青霉素生产最主要的生产方式, 它在发酵开始时一次加入基础料, 在发酵过程中不断流加营养物质, 发酵终止时一次移走产物。在青霉素分批发酵过程中, 分泌期产生的青霉素约占总量的70%~80%左右。可见提高青霉素产量的关键是缩短菌体生长期、延长青霉素分泌期并保持青霉素生产的最大增长率。因此, 我们不仅要按照产生菌的生理特性选择合适的发酵培养基和发酵条件, 而且必须根据发酵过程中的代谢变化对培养基和发酵条件进行控制, 使菌体生长既迅速又不易衰老, 且能保持青霉素的最大生产速率。
在实际生产中, 对补料的控制是以固定补料浓度的补料速率作为控制手段。因此, 在优化工作中一般也是以补料速率作为控制变量, 即间歇补料过程的补料优化问题是:以补料速率作为控制变量, 求取最优补料轨线, 使得发酵终止时青霉素浓度最高。
2 青霉素发酵的过程的主要控制任务及其特点
2.1 青霉素发酵的过程的主要控制任务
青霉素发酵过程中, 产物青霉素的生产是整个青霉素发酵过程的关键阶段, 此阶段是在发酵大罐中进行, 目的是为了使微生物分泌大量的抗生素。
2.1.1 为通入发酵藏的消毒空气温度、压力、流量
2.1.2 尾气温度、压力、CO2含量和氧含量
2.1.3 冷却水进出口温度, 冷却水进口压力和流量
2.1.4 发酵罐温度
2.1.5 发酵过程补料量
2.1.6 搅拌电流
2.1.7 发酵液p H值
2.1.8 发酵液溶解氧浓度
2.1.9 搅拌速度
2.1.1 0 发酵液中的菌丝浓度、萄萄糖浓度、产物效价、发酵体积
为了更好地研究生化过程的机理, 需要对一些物理参数, 化学参数, 及生理参教进行检测和控制。需要检测的物理参数为.罐温、罐压, 冷却水流量及进出口温度, 化学参数为:尾气O2含量、C02含量、溶解氧、p H值等;生理参数为菌丝浓度, 基质浓度、代谢产物浓度等, 由于传感器及检测元件等原因, 目前这些生理参数还不能直接在线测橄, 只能通过建立模型进行在线推算或离线化验分析, 另外通过这些在线可测量还可以在线计算一些重要参数, 如:氧摄取率、呼吸商、生物热等。
罐温、发酵液p H、发酵液中的溶解氧及罐压等环境参数对菌丝的生长、衰老及抗生素的合成有很大的影响, 所以本文设计的系统对这几个参数实行了自动控制, 这个系统还对发酵体积、发酵液重量等进行了在线检测, 有利于生产的统一管理, 还有对液位、p H值、罐温等进行报警监测。
2.2 青霉素发酵过程的特点
青霉素发醉过程中, 糖液是一种重要的营养物质, 补糖量的多少对菌丝代谢有着很大的影响。如果加糖率偏低, 将使菌丝的比生长速率过低, 从而使发醉液中缺乏足够数量的有活力的菌丝, 影响分泌青霉素。如果加糖率偏高, 则使发醉向合成菌丝的方向发展, 发醉液变得粘稠, 菌丝量过高, 发醉液的溶解氧很快下降, 同时发醉液中残糖过高会产生碳源降解物, 从而对分泌青霉素产生限制。
目前, 青霉素的生产中, 糖液的流加量是依据一条固定的加糖率曲线来执行的。此曲线是经过中试得出, 再放大到大雏生产规模而得来的, 而且通过离线优化分析和大雄发醉过程工艺摸索, 使得这条曲线不断得到修正且处于一个次优范围。然而在各批发酵过程中, 由于基础料来源的差异和各批菌种的特性受种子箱培养情况的影响而不同, 同样按照一条固定的加糖率曲线来补糖, 有的可能获得高产, 有的却不能令人满意。如何针对菌丝的代谢情况调整加糖率, 成为青霉素发酵过程控制中的一个重要问题。尾气CO2释放率 (CER歹是反应菌丝代谢旺盛程度的重要标志, 曹竹安等人建立了CER和耗糖量的相关方程, 从而决定糖液流加的速率。补糖控制还必须考虑到p H值和溶解氧 (D0) 的限制。
3 青霉素发酵过程的计算机控制
3.1 p H值的自动控制
发酵液中的p H值对微生物的生长及产物合成影响很大, 需加以很好的控制。在发酵过程中, 由于生化反应过程的特性, 会使p H值渐渐下降, 另外, (NH4) 2SO4也会作为生物质合成的氮源加入发酵液中, 为了维持适宜的p H值, 需加入碱性物质加以调整, 一般以NH3·H2O来调节发酵液中的p H值, 原因为NH3·H2O也可作为生物质的氮源物质。另外, 青霉菌适宜于稍偏酸性的环境生长, 发酵液中出现偏碱性或中性, 会不宜于菌体生长和产物合成, 菌体衰老加快, 这样设计的p H控制系统中应避免出现超调现象, 并且如果出现超调, 即p H值大于适定值时, 就得靠发酵过程的生化反应机理来自然地降低p H值, 这样整个调节速度就比较缓慢。一般避免超调的办法是采用高比例度的PID调节规律, 这样当遇干扰时, 调节过程虽不出现超调现象, 但过渡过程时间较长。所以, 在控制系统时, 最好既保证系统不出现超调, 又要有较快的过渡过程。
3.2 溶解氧的自动控制
青霉菌是好氧型菌, 所以发酵液中的溶解氧浓度也是一个很重要的指标, 控制进入发酵罐内的消毒空气可以控制溶氧浓度, 在控制系统投运前都是把消毒空气量开至最大, 以满足对氧的需求, 这样罐内溶解氧浓度虽满足了要求, 但要消耗过多的消毒空气, 从而消耗了过多的能量。所以提出以消毒空气量来调节溶解氧浓度的控制方案, 以达到节能目的。根据发酵过程的生化特点, 此控制回路的设定值应是满足菌丝正常生长、代谢的一个适宜范围。
该控制回路的工作原理为:当溶氧浓度接近或低于下限时, 此时逻辑门开关开至其中一种算法, 根据偏差和偏差变化状况, 算出增加消毒空气量, 开大阀门。反之, 如果溶氧高于或接近, 在接近并有继续上升趋近时, 开关至向另一种算法, 以减少空气量。当溶解氧浓度适宜时, 逻辑开关转至不工作状态。
4 结束语
红霉素发酵 篇7
链霉素(streptomycin, SM)是常用的氨基糖苷类抗生素,在治疗家畜感染性疾病中发挥了重要的作用,还可用于农作物细菌性病害的防治。《中国药典》(2010版 二部)规定链霉素的效价采用抗生素微生物检定法进行测定[1],其中最常用的是管碟法,即利用链霉素对敏感指示菌枯草芽胞杆菌的抑菌圈直径大小来描述其生物活性高低。由于管碟法具有准确、直观、重复性好等优点,目前已广泛用于链霉素成品含量[2]及生物样品中链霉素残留量[3]的检测。但该法操作繁琐,耗时长,不能及时提供效价检测数据,因此不适用于发酵过程的监控。由于链霉素在碱性溶液中,其链霉糖结构经重排使环扩大形成麦芽酚,麦芽酚与硫酸铁铵溶液形成紫红色配位化合物,此配位化合物在520 nm处存在最大吸收,因此,有研究采用分光光度法来检测成品中硫酸链霉素的含量[4,5],对于发酵液中的链霉素的含量,由于受多种干扰物质的影响,则无法采用此方法。本研究利用盐酸羟胺法使发酵液中链霉素失活,并以此液作为对照来排除发酵液颜色对吸光度的干扰,成功地将分光光度法用于发酵液中链霉素效价的检测,该方法简便、快速、准确,适用于发酵生产中间过程的监测、菌种选育等。
1材料与方法
1.1仪器
UV—752型紫外可见分光光度计,上海佑科仪器仪表有限公司;METTLERAE240型电子天平,梅特勒—托利多仪器(上海)有限公司;HH—4型数显恒温水浴锅,国华电器有限公司;TGL—10TA型高速冷冻离心机,上海安亭科学仪器厂。
1.2药品与试剂
链霉素标准品,购于中国药品生物制品检定所,批号 0308-200012,效价731 u/mg;1%硫酸铁铵溶液(称取硫酸铁铵·12H2O 1.8 g,置于100 mL容量瓶中,加入5%硫酸溶液溶解并定容至刻度,摇匀);草酸;盐酸羟胺;氢氧化钠。所用药品均为分析纯。
1.3链霉素发酵液
灰色链霉菌(Streptomyces griseus),中国工业微生物菌种保藏管理中心提供。采用葡萄糖、黄豆饼粉、硫酸铵、玉米浆、磷酸氢二钾、碳酸钙培养基(pH 7.5),接种量6%,160 r/min摇瓶振荡培养7 d,0～96 h温度为30 ℃,96～168 h温度为28 ℃。
1.4溶液的配制
1.4.1 链霉素标准贮备溶液
精确称取链霉素标准品,精确至0.1 mg,用水溶解并稀释成含链霉素1.4 mg/mL的溶液,0～4 ℃保存备用。
1.4.2 链霉素标准工作溶液
精确量取链霉素标准贮备溶液,用水稀释成含链霉素质量浓度为1.4、1.2、1.0、0.8、0.6、0.4和0.2 mg/mL的标准工作溶液,各浓度对应效价分别为1 023.4、877.2、731、584.8、438.6、292.4、146.2 u/mL。
1.4.3 供试品溶液的制备
吸取15 mL稀释一定倍数的发酵液于离心管中,用草酸将发酵液酸化至pH=3左右,75 ℃水浴10 min,既可使与菌丝体结合的链霉素释放出来,又可使蛋白质沉淀,再冷却至室温,于7 000 r/min 离心10 min,上清液即为供试品溶液。
1.5测定方法
1.5.1 标准曲线制作
分别吸取各浓度链霉素标准工作溶液5 mL于试管中,空白试管中加入5 mL水和1滴4%盐酸羟胺,分别向各管中加入2 mol/L NaOH溶液1 mL,摇匀后置于85 ℃水浴中15 min,冷却至室温,再加入1%硫酸铁铵2 mL,摇匀,静置10 min,于520 nm波长下测定吸光度。以链霉素效价为纵坐标,吸光值为横坐标作线性回归,求出回归方程。
1.5.2 供试品溶液效价的测定
分别吸取5 mL供试品溶液置于两支试管中,向其中一支试管中加入4%盐酸羟胺1滴作为空白对照,按1.5.1方法测定其在520 nm波长下的吸光度,将所测得的吸光值代入回归方程,计算供试品效价,再根据稀释倍数,即可求出发酵液的效价。
1.6回收率试验
吸取2.5 mL已知效价的供试品溶液置于5支试管中,分别向各管中加入效价为82、156、338、454和520 u/mL的链霉素标准工作溶液2.5 mL,空白试管中加入2.5 mL供试品溶液、2.5 mL水和1滴4%盐酸羟胺,混匀,按1.5.1和1.5.2的方法检测并计算混合液效价,再根据供试品溶液的已知效价值,求出加入的链霉素标准品效价测量值,计算回收率。
1.7稳定性试验
取一定量发酵168 h的灰色链霉菌发酵液,适当稀释后立刻按1.4.3的方法制备供试品溶液,在室温、无日光照射下放置,分别于放置后的0、6、12、18和24 h按1.5.1和1.5.2的方法检测并计算供试品溶液的效价。
1.8重复性试验
分别吸取5 mL供试品溶液置于6支试管中,向其中的一支试管中加入1滴4%盐酸羟胺作为空白对照,按1.5.1和1.5.2的方法检测并计算供试品溶液的效价。
2结果
2.1标准曲线的绘制
利用链霉素的专属反应——麦芽酚反应,用硫酸铁铵溶液作为显色剂,采用分光光度法测定不同浓度链霉素标准品溶液在520 nm 处的吸光度,结果如表1所示。
以吸光值为横坐标,链霉素效价为纵坐标做线性回归,结果见图1。
线性回归结果表明,链霉素效价在146.2～1 023.4 u/mL,吸光值与效价呈良好的线性关系。回归方程为y=1 444.188x-7.523,相关系数r2=0.999 1。
2.2回收率
通过回收率试验,测量发酵液及链霉素标准品混合液经麦芽酚反应和硫酸铁铵显色后在520 nm处的吸光度,计算混合液的效价,并进一步求出链霉素标准品的效价,结果见表2。
由表2可见,分光光度法测定发酵液中链霉素的平均回收率99.16%。
2.3稳定性
将制备好的供试品溶液于室温、无日光照射下放置,分别在0、6、12、18、24 h后采用分光光度法测定链霉素效价,结果见表3。
由表3可见,供试品溶液的链霉素效价在24 h内基本无变化,RSD为0.52%,表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。
2.4重复性
测量5份供试品溶液的效价,RSD为0.64%(n=5),表明该法重现性较好。
2.5分光光度法与管碟法测定链霉素效价的结果比较
随机取4份供试品溶液分别用分光光度法和管碟法检测链霉素的效价,结果见表4。
由表4可知,用2种方法测定的链霉素效价结果基本一致,二者相对偏差均在5%以内,实验结果可靠。
3讨论与结论
分光光度法是检测抗生素效价的一种主要方法,它是根据抗生素的特征性光吸收值或与显色剂反应后的特征性光吸收值来进行检测的,由于具有简便、快捷、准确等优点已普遍用于纯品抗生素的分析[5]。对于发酵液中抗生素效价的检测,由于受多种有色物质的干扰,使光吸收受到影响,从而限制了分光光度法的应用[6]。以链霉素失活的发酵液作为对照,解决了发酵液颜色对检测结果的影响,通过回收率、稳定性、重复性等试验,得出以下结论。
(1)用分光光度法测定链霉素生产发酵液的生物效价,结果可靠,重现性好,操作步骤简单,检测周期短,从样品制备到检测结束的整个过程在90 min内即可完成。
(2)随机抽取4份链霉素发酵液,同时用分光光度法和管碟法检测发酵液的链霉素效价,结果显示:分光光度法与管碟法的结果基本一致,可见,分光光度法在实际工作中可行。与管碟法相比,分光光度法操作步骤简单、耗时短,更适合于发酵生产中间过程的监测和菌种选育等。
(3)分光光度法检测发酵液中链霉素效价的操作要点是,发酵液在检测前必须先进行酸化处理,以使与菌丝体结合的链霉素释放出来。另外,发酵液的颜色是影响吸光度的重要因素,制约了分光光度法的应用,利用盐酸羟胺与链霉素反应生成链霉污,从而使链霉素失活的特性,在发酵液中加入一滴4%盐酸羟胺作为空白对照,即可排除发酵液颜色对测定结果的影响。
摘要：建立使用分光光度法测定发酵液中链霉素效价的方法。发酵液经草酸预处理后,利用链霉素的专属反应——麦芽酚反应,用硫酸铁铵溶液作为显色剂,于520nm波长下测定吸光度。检测过程中以链霉素失活的发酵液作为对照,成功排除了发酵液颜色对吸光度的干扰。结果表明:链霉素效价在146.2～1023.4u/mL范围内,吸光值与效价呈良好的线性关系,r=0.9991,平均回收率为99.16%(RSD=0.94%,n=5)。该法简便、准确、回收率高,可快速测定发酵液中链霉素效价。
关键词：链霉素,分光光度法,发酵液
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