cDNA文库

cDNA文库（精选3篇）

cDNA文库 篇1

摘要：为了研究新孢子虫与Vero细胞的相互作用蛋白,试验以体外培养的Vero细胞为材料,构建了Vero细胞酵母双杂交c DNA文库。首先,提取Vero细胞的总RNA,经反转录合成第一链c DNA,以SMART方法合成双链c DNA,通过柱层析去除200 bp以下片段;然后,将纯化的双链c DNA与p GADT7-Rec一起转到酵母Y187感受态细胞中,并发生同源重组;最后,计算文库效价、文库容量及文库的重组率。结果表明:文库效价为7.1×108cfu/m L,文库容量为1.8×1010cfu,重组率为100%,插入片段长度在500~2 000 bp之间,达到了建库要求,可用于Vero细胞和新孢子虫蛋白质相互作用的筛选。

关键词：酵母双杂交,cDNA文库,Vero细胞,同源重组,构建,鉴定

酵母双杂交是目前常用于检测蛋白与蛋白相互作用的一种方法,最初由S. Fields等[1]在进行真核基因转录调控研究时建立。M. Liu等[2]通过酵母双杂交技术发现,牛外周血单核细胞的 β - 肌动蛋白等蛋白质和附红细胞体 α - 烯醇化酶相互作用。Y.Wang等[3]通过酵母双杂交技术发现,小鼠的LAMTOR1 和RNase H2B与弓形虫的MIC2 蛋白相互作用,可能参与弓形虫与宿主细胞的黏附。

Vero细胞系是由日本千叶大学的Y. Yasumura和Y. Kawakita于1962 年从健康成年非洲绿猴的肾脏上皮细胞中分离培养出来的。Vero细胞作为病原体的细胞宿主,被广泛用于麻疹病毒、狂犬病病毒、犬瘟热病毒等多种病毒的培养,也被广泛用于弓形虫、新孢子虫等真核寄生虫的培养。

新孢子虫病( neosporosis) 是由新孢子虫( Neospora caninum) 引起的多种动物共患的血液原虫病,以神经、肌肉功能障碍,以及孕畜流产、死胎、弱胎等为主要临床特征。新孢子虫入侵宿主细胞时,需要和宿主细胞蛋白黏附,发生相互作用,引起新孢子虫感染产生致病性。酵母双杂交系统是研究蛋白质和蛋白质之间相互作用的方法,利用该方法可以筛选到与新孢子虫相互作用的宿主细胞未知蛋白。本试验构建了Vero细胞的酵母双杂交c DNA文库,旨在为研究新孢子虫和Vero宿主细胞的相互作用蛋白奠定基础。

1材料与方法

1.1主要试剂

Vero细胞( ATCC CCL - 81) ,由延边大学动物医学实验室保存; MatchmakerTMGold Yeast Two - Hybrid System试剂盒、CHROMA SPINT TE - 400 Columns纯化柱、SD/ - Leu培养基、YPDA培养基等,均购自Clontech公司; RNeasy Plus Mini Kit,购自Qiagen公司; Ta KaRa LA Taq Hot Start Version,购自宝生物工程( 大连) 有限公司。

1. 2 文库鉴定引物

p GADT7 - Rec通用鉴定引物,引物序列: 5' AD primer 5' - CTATTCGATGATGAAGATACCCCACCAAACCC - 3' 和3' AD primer 5' - GTGAACTTGCGGGGTTTTTCAGTATCTACGAT - 3',由上海英骏生物技术有限公司合成。

1. 3 细胞总RNA的提取及鉴定

当有90% Vero细胞铺满75 cm2培养瓶时,弃去培养液,收集Vero细胞,按照RNeasy Plus Mini Kit方法提取总RNA,溶解于30 μL RNase - free water中。用超微量紫外分光光度计测量其浓度和纯度,取7 μL总RNA用1% 琼脂糖凝胶电泳鉴定。

1. 4 c DNA文库的构建

1.4.1 c DNA第一链的合成

按照c DNA文库构建试剂盒操作说明书将Vero细胞总RNA反转录成c DNA第一链。即在0. 5 m L PCR管中加入2 μL质量为3. 9 μg的总RNA、1 μL CDS Ⅲ/6 引物( 随机引物) 、1 μL RNase free water,72 ℃ 孵育2 min,冰上孵育2 min; 瞬离,加入2 μL 5 × First strand Buffer、1 μL DTT( 100 mmol / L) 、1 μL d NTPs Mixs和1 μL SMART MMLV,25 ℃ 孵育10 min; 瞬离,42 ℃ 作用10 min; 加入1 μL SMART Ⅲ - modified oligo,轻轻混匀后于42 ℃ 作用1 h。 待反转录完成后于75 ℃ 作用10 min; 加入1 μL RNase H终止第一链合成,此时完成了文库第一链的合成。

1.4.2双链c DNA的扩增和纯化

按照c DNA文库构建试剂盒操作说明书,将反转录得到的第一链c DNA经长距离PCR ( LD - PCR) 合成双链c DNA。即PCR管中加入5 μL c DNA第一链、5 μL 10 × PCR Buffer、1 μLd NTPs Mixs、1 μL 5' AD primer、1 μL AD3' primer、1 μL Ta KaRa Ex Taq HS、36 μL RNase free water。PCR反应条件: 94 ℃ 1 min; 98 ℃ 10 s,68 ℃8 min,每次循环增加5 s,共30 个循环; 最后68 ℃ 延伸5 min。取扩增得到的双链c DNA用CHROMA SPINT TE - 400 Columns纯化柱纯化,然后各取7 μL未纯化和纯化的双链c DNA用1% 琼脂糖凝胶电泳鉴定。

1.4.3文库的构建和收获

用酵母双杂交试剂盒提供的PEG/Li Ac方法制备酵母Y187 感受态细胞,然后每600 μL感受态细胞中加入双链c DNA 20 μL( 485 ng /μL) 、p GADT7 - Rec 4 μL ( 0. 5 μg /μL) 和Yeastmaker carrier DNA 20 μL,用玻璃珠将转化的菌液均匀涂布于30 块直径为120 mm的SD/ - Leu平板上,30 ℃倒置培养3 ~ 5 d,直至长出菌落; 待出现菌落后,将培养皿于4 ℃ 放置3 ~ 4 h; 然后用20 m L预冷的冻存液( 含25% 甘油的YPDA液体培养基) 收获文库,分装到1 m L离心管中,- 70 ℃保存,备用。

1.4.4文库的质量评价

对文库按照1∶100 000和1∶10 000比例稀释并涂布于SD/-Leu平板上,30℃倒置培养,计数生长的单个菌落,计算文库转化效率和文库容量。

随机挑取24 个单个菌落,用文库通用鉴定引物5' AD primer和3' AD primer对菌落进行PCR扩增,分析文库插入片段的大小及重组率。PCR反应条件: 95 ℃ 5 min; 95 ℃ 40 s,60 ℃ 40 s,72 ℃ 2 min,共30 个循环; 72 ℃ 再延伸10 min。

2 结果与分析

2. 1 Vero细胞总RNA的提取

总RNA经超微量紫外分光光度计测定,其浓度为1. 85 μg /μL,OD260/ OD280值为1. 96,比值处于1. 8 ~ 2. 0 之间,说明RNA纯度较高。经1% 琼脂糖凝胶电泳显示,有28 S、18 S和5. 8 S共3 条特异性条带,见图1,说明RNA样品质量良好,可用于后续的文库构建工作。

M.DL-2 000 Marker;1.Vero细胞总RNA。

2. 2 双链c DNA产物的琼脂糖凝胶电泳

对纯化后的双链c DNA和纯化前的双链c DNA进行琼脂糖凝胶电泳,结果见图2。

由图2 可知,纯化前的双链c DNA呈现弥散状条带,而过柱纯化后200 bp以下片段基本去除了,双链c DNA集中在500 ~ 2 000 bp之间。

2. 3 c DNA文库容量的测定

M1.DL-2 000 Marker;1.纯化后的双链c DNA;2.纯化前的双链c DNA;M2.DL-15 000 Marker。

对1∶100 000 和1∶10 000 倍稀释的SD/ - Leu平板进行单个菌落计数,经计算文库效价为7. 1 ×108cfu / m L,总体积为26 m L,文库容量为1. 8 ×1010cfu。

2. 4 c DNA文库的PCR扩增

从SD/ - Leu平板上随机挑取24 个单个菌落进行PCR鉴定,琼脂糖凝胶电泳结果显示,文库插入片段为500 ~ 2 000 bp,经计算重组率为100% ,见图3。

M.DL-2 000 Marker;1~21.随机挑取的单个菌落。

3 讨论

原虫的感染、致病性通常和原虫与宿主相互作用有关。国内外学者开展了原虫与宿主相互作用的研究以探索新孢子虫感染与致病机制。新孢子虫编码蛋白与宿主相互作用的研究取得如下发现: 新孢子虫表面蛋白位于虫体表面,以糖磷脂酰化形式锚定在宿主细胞膜上,并与宿主细胞发生黏附作用,帮助虫体顺利完成入侵过程。一些微线体蛋白或微线体蛋白复合物可以和宿主细胞唾液酸残基( sialic acid residues) 结合,成为潜在的治疗靶点。因此,研究新孢子虫与宿主细胞蛋白的相互作用对阐明虫体的入侵和增殖具有意义。

自1989 年酵母双杂交方法建立以来,该方法立即被广大研究者认为是一种研究蛋白质之间相互作用的非常有力的工具。酵母双杂交方法是在酵母细胞中进行的,利用酵母生长迅速、操作方便的特点,筛选和验证蛋白质之间的相互作用。目前,酵母双杂交技术已经应用于很多领域,如药物的发现、病原入侵机制、蛋白质相互作用图谱等[4,5]。A. Ueno等[6]利用酵母双杂交方法筛选到与弓形虫缓殖子特异性蛋白Dna K - TPR相互作用的p23 蛋白,p23 蛋白参与了速殖子向缓殖子的转变。杨永军等[7]利用酵母双杂交技术验证了甘蓝SCR、THL与SRK的交替相互作用。

为了获得c DNA全长序列,采用Oligo - capping[8]、Cap - trapper[9]等方法构建不同物种的c DNA文库,这几种方法需要充足的高质量的起始原料mRNA和多次酶促反应。本研究通过SMART方法构建c DNA文库,以总RNA为反转录模板,避免因mRNA在分离纯化时的降解和多次酶促反应时造成的基因丢失,从而保证了文库的容量。段志强等[10]采用SMART技术构建的鸡胚成纤维细胞c DNA文库容量为3. 0 × 106cfu,重组率为100% 。本试验构建的Vero细胞酵母双杂交c DNA文库效价为7. 1 ×108cfu / m L,文库容量为1. 8 × 1010cfu,重组率为100% ,插入片段长度在500 ~ 2 000 bp之间,达到了合格文库的条件,可以用于新孢子虫与Vero细胞相互作用蛋白的研究。

参考文献

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cDNA文库 篇2

羽衣甘蓝柱头酵母双杂交cDNA文库的构建与分析

目的:构建应用于酵母双杂交系统的羽衣甘蓝柱头cDNA文库.方法:以羽衣甘蓝S13-bS13-b自交不亲和系为材料,提取柱头的.总RNA,用亲和层析法分离纯化mRNA,利用CytoTrap XR建库试剂盒构建羽衣甘蓝柱头cDNA文库.结果:羽衣甘蓝柱头cDNA原始文库的库容量为2.5×105;扩增后文库的库容量约为4×108,重组率为96%,插入片段大小为0.4～3 kb,平均长度在0.8 kb左右.结论:构建了应用于酵母双杂交系统的羽衣甘蓝自交不亲和系柱头的cDNA文库,为探讨芸苔属植物自交不亲和的分子机理奠定了基础.

作 者：杨佳 王艳红 李玉花 蓝兴国 YANG Jia WANG Yan-Hong LI Yu-Hua LAN Xing-Guo 作者单位：东北林业大学,生命科学学院,黑龙江,哈尔滨,150040刊 名：生物技术通讯 ISTIC英文刊名：LETTERS IN BIOTECHNOLOGY年，卷(期)：21(2)分类号：Q78关键词：羽衣甘蓝 柱头 cDNA文库 酵母双杂交

cDNA文库 篇3

法氏囊是禽类特有的中枢免疫器官, 它位于肠道末端、泄殖腔背侧, 是B淋巴细胞发育和成熟的场所, 在禽类早期的免疫反应中发挥重要作用。有研究表明, 法氏囊是IBDV的主要靶器官, IBDV感染后主要在法氏囊B淋巴细胞中复制、增殖[3]。然而, IBDV与法氏囊B淋巴细胞相互作用的分子机理仍不十分清楚。本研究成功构建了法氏囊B淋巴细胞c DNA酵母表达文库, 为进一步利用酵母双杂交系统研究IBDV的感染和致病机制奠定了基础。

1 材料

3周龄SPF白来航鸡, 由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物中心提供;RNA提取相关试剂, 购自宝生物工程 (大连) 有限公司;酵母双杂交文库构建试剂盒及相关试剂, 购自Clontech公司。其他试剂均为国产分析纯。

2 方法

2.1 法氏囊B淋巴细胞的制备

摘取3周龄SPF鸡法氏囊, 使用4℃预冷的PBS清洗, 置200目铜网上研磨, 然后再次加入PBS冲洗, 将PBS洗液收集于15 m L离心管中, 30 g离心5 min;去除杂质, 将上清液转移至新的离心管中, 510 g离心5 min;弃去上清液, 用PBS重悬沉淀, 510 g离心5 min;弃去上清液, 沉淀用2 m L PBS轻轻重悬;取少许悬液在显微镜下观察细胞形态, 其余细胞悬液用于提取总RNA。

2.2 B淋巴细胞总RNA的提取与鉴定

选用新鲜制备的法氏囊B淋巴细胞, 使用RNAiso Plus (Ta KaRa) 按照操作说明提取细胞总RNA, 用20μL DEPC水溶解, 使用紫外分光光度计测定所提RNA的浓度和纯度, 并进行琼脂糖凝胶电泳分析。

2.3 c DNA文库的构建

2.3.1 c DNA第一链的合成

按照Make Your Own“Mate&Plate”Library System User Manual提供的方法, 取2μg总RNA, 加入1μL CDSⅢ (Oligo-d T) 引物, 加dd H2O至4μL, 72℃水浴2 min, 冰上冷却2 min, 14 000 g离心10 s;加入2μL 5×First-Strand Buffer, 1μL DTT (100 mmol/L) , 1μL d NTP (10 mmol/L) , 1μL SMART M-MLV Transcriptase, 42℃水浴10 min;加入1μL SMARTⅢ修饰的Oligo, 混匀, 42℃作用1 h;然后72℃水浴10 min终止反应。反应体系冷却至室温后加入1μL RNase H (2单位) , 37℃作用20 min。

2.3.2 双链c DNA的合成

使用LD-PCR合成双链c DNA。反应体系为:c DNA第一链2μL, 10×Advantage 2 PCR Buffer 10μL, 50×d NTP Mix 2μL, 5'PCR引物2μL, 3'PCR引物2μL, 10×Melting Solution10μL, 50×Advantage 2 Polymerase Mix 2μL, 加dd H2O至100μL, 共做两管。PCR反应条件:95℃30 s;95℃10 s, 68℃6 min (每增加1个循环延伸时间增加8 s) , 共26个循环;68℃5 min。反应完成后, 每管取7μL反应产物进行1%琼脂糖凝胶电泳, 检测c DNA条带。

2.3.3 双链c DNA的纯化

将上述两管PCR反应产物合并, 使用CHROMA SPIN TE-400柱子纯化c DNA, 去除200 bp以下的c DNA片段, 将纯化的c D-NA溶于20μL dd H2O中。

2.3.4 酵母感受态细胞的制备

按照Yeastmaker Yeast Transformation System 2 (Clontech) 所提供方法制备酵母菌株Y187的感受态细胞。

2.3.5 酵母感受态细胞的c DNA转化

将纯化的法氏囊B淋巴细胞ds c DNA与6μL p GADT7-Rec共转化酵母感受态细胞Y187, 所用试剂和方法参照Yeastmaker Yeast Transformation System 2 User Manual (Clontech) 。将转化后的酵母沉淀用15 m L生理盐水重悬, 取少量悬液用生理盐水倍比稀释至1/10和1/100, 分别取100μL稀释液均匀涂布于直径为100 mm的SD/-Leu平皿, 30℃倒置培养3~5 d, 计算酵母菌落数, 判定转化效率, 转化效率以总菌落数来指示。总菌落数=酵母菌落数 (cfu/m L) ×15 m L。若总菌落数大于1×106cfu, 则本次转化合格。将剩余悬液用无菌玻璃珠均匀涂布于直径为150 mm的SD/-Leu平皿 (约100个) , 倒置培养3~5 d;酵母菌落长出后, 将平皿放置4℃预冷3~4 h, 每个平皿加入5 m L冻存液, 冲洗菌落并收集于无菌玻璃瓶, 混匀后分装成每管1 m L, -80℃保存。

2.4 c DNA文库的质量评价

2.4.1 文库酵母细胞浓度的测定

使用细胞计数板计数所保存文库酵母细胞的数目并计算其浓度。

2.4.2 文库效价的测定

取10μL酵母文库, 倍比稀释至1/1 000、1/10 000, 分别取100μL稀释液均匀涂布于直径为100 mm的SD/-Leu平皿, 30℃倒置培养3~5 d, 通过酵母菌落计数得到文库效价。文库效价 (cfu/m L) = (酵母菌落数/0.1) ×稀释倍数。

2.4.3 文库插入片段的检测

在SD/-Leu培养皿中随机挑取10个菌落, 使用质粒p GADT7测序通用引物T7SPU和3ASPL, 进行菌落PCR, 验证插入基因的大小。具体方法如下:用枪头挑取菌落少许, 溶于10μL dd H2O中, 加入10×Ex Buffer 5μL, d NTP4μL, 上、下游引物各1μL, Ex Taq 0.5μL, 加dd H2O至50μL。反应条件为:95℃5 min;95℃30 s, 58℃30 s, 72℃3 min, 共35个循环;72℃10 min。取5μL PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳, 然后将剩余PCR产物送华大生物工程技术服务有限公司进行测序, 以确定插入基因的种类。

3 结果

3.1 法氏囊B淋巴细胞的制备结果

制备的法氏囊B淋巴细胞形状均一, 状态良好 (见图1) , 经计算细胞浓度为2×108/μL。

3.2 B淋巴细胞总RNA的提取与鉴定结果

经紫外分光光度计测定, 法氏囊B淋巴细胞总RNA浓度为2.44μg/μL, OD260/280值为1.9。琼脂糖凝胶电泳可见28S、18S和5S RNA3条带, 见图2。

3.3 双链c DNA的合成及纯化结果

使用LD-PCR方法扩增得到ds c DNA, 经琼脂糖凝胶电泳, 可见呈涂布状分布的电泳条带, 介于200~5 000 bp之间, 见图3。

1.细胞总RNA。

M.DL-2 000 Marker;1, 2.ds c DNA;3.DL-15 000 Marker。

3.4 文库的质量评价结果

3.4.1 转化效率

法氏囊B淋巴细胞c DNA和线性化的空载体共转化Y187, 在1/100稀释度的SD/-Leu平皿中有322个酵母菌落生长, 计算可得文库总菌落数为4.8×106cfu, 高于参考标准1×106cfu, 说明文库制备时转化效率较高。

3.4.2 文库酵母细胞浓度的测定结果

文库的酵母细胞浓度为5.2×107个/m L, 高于参考标准2×107个/m L。

3.4.3 文库效价测定结果

在1/10 000稀释度的SD/-Leu平皿中有950个菌落生长, 计算可得文库效价为9.5×107cfu/m L, 高于参考标准2×107cfu/m L。

3.4.4 文库插入片段的检测结果

在SD/-Leu培养皿中随机挑取10个菌落, PCR结果表明, 重组率为100%;测序结果表明, 这些序列均为鸡源序列。见表1。

%

4 讨论

酵母双杂交技术在1989年由S.Fields等[4]发明, 经过不断改进与发展, 该技术已经成为研究蛋白质之间相互作用的重要方法之一[5,6,7]。与其他蛋白质研究技术相比, 该技术具有其独特的优势:灵敏度高, 可以检测到蛋白质间微弱的相互作用;由于融合蛋白之间的相互作用发生在真核酵母细胞内, 蛋白质可能保持其天然的折叠状态, 由该系统检测到的蛋白质之间的相互作用更接近于体内的真实水平[8]。

研究根据Clontech公司的Make Your Own“Mate&Plate”Library System User Manual所提供方法构建鸡法氏囊B淋巴细胞c DNA文库, 提取法氏囊B淋巴细胞总RNA, 采用SMART技术来合成c DNA, 不需要添加接头, 提高了连接效率。使用LD-PCR技术合成了质量较好的c DNA, 通过同源重组将这些片段克隆入酵母载体p GADT7。与以往酵母双杂交文库构建的方法相比, 该方法更加简单, 而且文库质量也较好。

构建文库时选择了IBDV强、弱毒株均可感染的法氏囊B淋巴细胞, 是基于其在IBD发生中所起的重要作用。有研究表明, 人为去除法氏囊的鸡感染致死量IBDV后不表现任何临床症状[9]。3~6周龄的雏鸡对IBDV最易感, 其他年龄段的鸡也可感染该病毒。IBD的急性发病期持续7~10 d, 期间法氏囊中B细胞迅速坏死、减少, 法氏囊萎缩, 并伴有结缔组织增生。IBDV进入机体后首先在肠道相关巨噬细胞和淋巴细胞中复制, 进入血液循环造成原发性病毒血症。感染后4小时, 盲肠巨噬细胞和淋巴细胞内可检测到病毒;感染后5小时, 病毒抵达肝脏;感染后1 1 小时, 病毒到达法氏囊并在其中复制, 随后病毒再次进入血液并向其他组织扩散, 继而引起发病[10]。此外, 法氏囊中B细胞的发育阶段也对IBDV的复制有重要影响, 而IBDV与法氏囊中相关因子的相互作用是IBD发生的关键。

本研究构建了鸡法氏囊B淋巴细胞c DNA酵母表达文库, 为应用酵母双杂交技术来研究IBDV与宿主的相互作用奠定了基础, 对进一步揭示IBDV的致病机理有重要意义。

参考文献

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