红外指纹图谱（共7篇）
红外指纹图谱 篇1
松子仁又名海松子, 为松科松属植物红松、华山松、马尾松的种仁, 其味甘性微温, 具有润燥、养血祛风、润泽皮肤、敷荣毛发之效, 主治肺燥干咳、大便虚秘、诸风头眩、骨节风、风痹[1]。唐代《海药本草》中就有“海松子温胃肠, 久服轻身, 延年益寿”的记载。松子被视为“长寿果”, 又被称为坚果中的鲜品, 因其含有大量脂肪油, 具有润肠通便、止咳作用, 一直作为药食同源的佳品。其主要成分如油脂70.1%、蛋白质14.0%、糖12.0%、纤维素2.1%、灰分1.8%[2], 另外含特殊成分有止杈酸、掌叶防己碱、二-旅烯、p-旅烯、茨烯、曹烯-3月桂烯、二戊烯、Y-松油烯等[3]。目前, 对红松、华山松、马尾松的种仁进行鉴别时除感官检验外, 化学方面末见报道。传统中药鉴别方法, 如理化检验、感官检验、微生物检验等费时、耗力, 具有破坏性且复杂。红外光谱是近年发展起来的一种快速、绿色环保的检测方法, 在中药及食品等行业的品质快速检测中发挥着重要作用。在中药鉴定方面, 已有文献报道采用红外光谱技术检测中药成分如酚酸、生物碱、总多糖、总黄酮、总皂苷、脂肪油、蛋白质[4]。本研究就红外指纹图谱在华山松种仁、红松种仁、马尾松种仁鉴别中的应用价值, 现报道如下。
1 仪器与试剂
1.1 仪器
傅里叶变换红外光谱仪 (Thermo Scientific Nicolet is5) , 扫描范围4000~400 cm-1;HY-12型红外压片机 (天津天光光学仪器有限公司) 。
1.2 药品与试剂 溴化钾, 光谱纯 (天津市津科精细化工研究所) ;红松种仁、华山松种仁、马尾松种仁均购自广州南北行中药行饮片有限公司, 批号分别为C20140810、L20140909、S20140623。
2 试验方法
2.1 试样制作
分别取药材低温粉碎成200目, 准确称量药材细粉按1:100比例加入溴化钾, 在红外光灯下研磨至均匀, 取适量放入红外压片机模具内, 在压力10 MPa条件下作用25 s, 制成均匀透明样品片。取纯溴化钾按同上方法压片作为空白片。
2.2 光谱扫描
以空白片为背景进行扫描, 设定扫描次数为10次, 分辨率4 cm-1, 取上述药材压制成的溴化钾片在4000~400 cm-1下进行测定:每个样品片变换5次扫描位置, 获得5个光谱图, 取平均值作为单个样品的光谱图, 所有光谱图都扣除空白背景光谱。原始光谱数据首先进行多点基线校正, 除去基线影响后将预处理后的光谱数据用软件进行标准归一化, 以消除不同样本的差异化影响, 最后用Thermo Scientific OMNIC处理软件绘制药材粉末的特征红外光谱, 在4000~400 cm-1区域进行详细分析, 见图1~4。
3 结果
3.1 红松、华山松、马尾松种仁的药材粉末红外光谱分析
在3385 cm-1附近有一个极强且宽的吸收峰, 其为水分子吸收峰;2830 cm-1是甲基和亚甲基伸缩振动区;1750~1500 cm-1是酰胺和羰基振动区;1500~1100 cm-1为蛋白质、脂肪酸混合振动吸收区;1200~500 cm-1主要是多糖吸收区[5]。通过红外光谱可以看出松子仁主要含有蛋白质、脂肪酸、脂类化合物、多糖等。
3.2 红松、华山松、马尾松种仁的药材粉末红外光谱比较
3种药材粉末的红外光谱图基本相似, 均有9个基本一致的共有吸收峰: (764.1±5.0) cm-1、 (861.1±5.0) cm-1、 (1023.7±5.0) cm-1、 (1156.8±5.0) cm-1、 (1448.4±5.0) cm-1、 (1517.3±5.0) cm-1、 (1627.9±5.0) cm-1、 (2930.1±5.0) cm-1、 (3365.1±5.0) cm-1。但华山松种仁在420 cm-1处峰形明显, 在500~600 cm-1处峰较尖锐, 1000~1500 cm-1吸收较弱;红山松种仁与马尾松种仁均在817.9 cm-1附近吸收峰明显增强, 但红山松500~1000 cm-1吸收较强, 与其他两者多出875.6 cm-1及701.5 cm-1吸收峰, 马尾松在1355.3 cm-1附近裂开3个吸收峰, 见图1~3。
3.3 3种药材粉末2阶导数红外光谱比较 华山松种仁在501.5 cm-1处有一尖锐峰, 600.9 cm-1处峰强度与698.3 cm-1强度相当;红松种仁在521.1 cm-1峰略弱于550.2 cm-1, 789.3 cm-1处峰平宽但吸收较强, 在895.4 cm-1与973.6 cm-1处的峰强度弱于789.3 cm-1峰;马尾松500~1000 cm-1吸收强度略弱于华山松与红松种仁, 但峰形数多于其他, 特别是600~800 cm-1处, 较其他两者多出656.9 cm-1、699.9 cm-1、783.1 cm-13个非常明显的尖锐峰, 且764.8 cm-1处峰可观察到开裂现象。
4 讨论
华山松、红松、马尾松种仁皆为卵形, 外形较相似, 但尺寸略有区别:华山松种仁长1.0~1.5 cm, 直径0.6~1.0 cm;红松种仁长1.2~1.8 cm, 直径0.9~1.6 cm;马尾松种仁长0.4~1.0 cm, 直径0.3~0.6 cm。由于种仁大小受采收季节、产地来源等影响, 在无对比参照情况下, 仅凭经验、尺寸大小较难区别, 且不科学。所以有必要寻找一种可靠的化学鉴别手段。
传统中药化学鉴别方法主要是利用各种专业分析检测仪器, 采用高效液相色谱法、薄层色谱法、气相色谱法、质谱分析法等方法获得中药指纹图谱或检测单一成分含量, 在检测前需经过提取分离等复杂手段。在中药研究领域, 红外光谱技术是一种分析物质结构和含量的工具, 可直接用于中药材的分析, 且具有快速、无损、灵敏等特点, 是常用的物质定性鉴别方法之一, 图谱表观为药材中各种成分单体中的分子结构对红外光吸收的叠加结果, 是特征性所有成分的整体效应, 对待测物的整体鉴别具有重要意义。
产生红外吸收的基团是C-O、C-N、C-F、C-P、C-S、P-O、Si-O等和C=S、S=O、P=O等, 华山松、红松及马尾松种仁中成分基本相同, 所以红外光谱整体相似。但物种不同, 其基团含量会不同, 从而导致峰位和峰强度的变化, 而红外光谱能较好、快速、无损伤地鉴别药材。本研究对华山松、红松及马尾松种仁的粉末经溴化钾压片后进行红外光谱扫描, 发现3者的红外光谱虽然相似性较高, 尤其是红松与马尾松具有高度相似性, 推测其主要有效化学成分基本相同。虽然3者红外光谱相似, 但依据彼此之间的细小差异, 特别是二阶导数红外光谱具有明显差别, 可为松子仁种属来源的鉴别提供参考。
综上所述, 红外光谱法能快速、方便地用于华山松、红松、马尾松种仁的鉴别。但本研究有效数据量偏小, 在后续试验研究中应大量采集不同地区、时节的华山松、红松、马尾松种仁, 建立更加完整的红外光谱指纹图库, 为快速鉴别松子仁来源提供理论依据。
参考文献
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红外指纹图谱 篇2
关键词：茶叶,近红外光谱分析,化学计量学,马氏距离,快速鉴别方法
茶叶发源于2000多年前的中国, 是中国重要的经济作物。茶叶与可可、咖啡并称为世界三大饮料。茶叶的种类十分丰富, 并且许多茶叶很难从外观特性上进行准确的区分, 特别是名优茶市场有很多以假乱真、以次充好的茶叶, 严重影响茶叶市场的运营, 损害消费者的利益, 损害中国茶叶品牌信誉, 不利于茶叶的出口。同时, 不同茶叶在保健特性上, 具有一定差异。例如, 茶叶普遍具有杀菌, 消炎等作用, 但是绿茶最突出的作用是抗氧化, 而红茶则有较好的养胃功效。因此, 建立鉴别茶叶品种的快速分析方法是十分重要和必要的。
传统用于茶叶鉴别的方法为感观评定法和化学方法。感观评定法受人为因素和外界环境的影响较大, 同时, 感官评定常要求评定者具有相对丰富的经验, 因此, 难以保证鉴别的客观性与可靠性;化学方法能准确的鉴别茶叶, 如拉曼光谱法[1], 红外光谱法[2,3]等。其中基于红外光谱建立的茶叶品种分析方法, 具有快速、简便、稳定性高等优势。近年来, 许多学者在红外光谱应用于鉴别茶叶品种等方面, 进行了深入的研究。如, 赵杰文[4]等利用近红外光谱结合模式识别的方法鉴别了龙井、碧螺春、毛峰和铁观音4种中国名茶, 取得了满意的结果, 实验证明了近红外光谱在茶叶鉴别上的可行性。周健[5]利用近红外技术结合偏最小二乘法建立了定性模型, 实现了对西湖龙井茶真伪的鉴别。2009年, 周健等[6]利用近红外指纹图谱分析了滇青、青饼和普洱茶 (熟饼) , 采用主成分分析和系统聚类等分析方法实现了对三类茶的定性判别。
本文是利用近红外光谱分析技术, 光谱经过多元散射校正 (MSC) 后结合主成分-马氏距离判别分析方法, 建立一种快速无损同时鉴别市售七种不同品种的茶叶 (碧螺春, 云雾信阳毛尖, 御品天香, 云雾茗茶, 云雾毛尖王, 宜昌绿茶, 云雾茉莉花茶) 的方法。
1 实验部分
1.1 实验材料
于武汉市各大超市购买品种不同的7种茶叶。样品信息见表1。
1.2 主要仪器设备
AntarisⅡ傅里叶变换近红外光谱仪 (美国Thermo Nicolet公司) , 配有积分球漫反射采样系统、In Ga As检测器和石英样品杯;Result软件用于光谱的采集;TQ8.0软件用于分析数据处理。DZF-6021型真空干燥箱 (上海索谱仪器有限公司) , FW-100型高速万能粉碎机 (天津市泰斯特仪器有限公司) , 200目标准检验筛 (孔径0.074mm) 。
1.3 实验方法
1.3.1 样品的制备
将全部茶叶以高速万能粉碎机粉碎, 所得粗粉过200目筛得实验细粉样品, 并于60℃下真空干燥24h后, 将干燥细粉转移至密封袋中密封保存, 贴好标签, 储存在干燥器内备用。
1.3.2 茶叶近红外光谱测定方法
将以1.3.1处理后的茶叶样品分别盛入样品池内, 使用AntarisⅡ型傅立叶变换近红外光谱仪的积分球漫反射附件采集近红外光谱图。采集条件:采集光谱范围为10000~4000cm-1, 扫描次数为32次, 分辨率为8cm-1。温度为25±1℃, 湿度为45±2%。以金箔为参比进行扫描, 每种茶叶样品平行采集10张光谱, 对于七种茶叶共得到70个样品光谱。分别按照测定样品顺序, 以01-70对样品进行编号, 并将每个样本的前7张光谱划分为训练集, 后3张划分为预测集。样品标记列于表2:
1.3.3 光谱数据处理方法
常用于与近红外光谱相结合的化学计量学分类模型有:主成分分析法 (PCA) 、马氏距离 (MD) 、偏最小二乘法 (PLS) 和线性判别 (LDA) 等。本实验主要运用结合主成分分析 (PCA) 的马氏距离 (MD) 判别分析方法, 对不同的茶叶进行模式识别分析。
本实验所采集的近红外光谱数据通过多元散射校正 (MSC) 的光谱预处理, 再通过PCA-MD进行建模分析。
2 结果与讨论
由于所测得的原始光谱常受到样品颗粒不均匀、散射、物理扰动等因素的干扰, 致使不同波长点量测光谱存在不同程度的差异和影响。因此, 通过对茶叶的原始光谱进行多元散射校正 (MSC) 以克服样品颗粒的大小和折射率及光的波长等物理因素使光谱散射所导致的差异, 光谱的信噪比明显得到改善, 光谱曲线变得光滑。
2.1 七种茶叶的指纹图谱
按2.3.2方法采集7种茶叶的近红外光谱, 如图1所示:
由图1可见, 从七种茶叶的近红外原始光谱图中难以直接判别茶叶的品种。由于所测得的原始光谱常受到样品颗粒不均匀、散射、物理扰动等因素的干扰, 致使不同波长点量测光谱存在不同程度的差异和影响。通过对茶叶的原始光谱进行多元散射校正 (MSC) 可以克服样品颗粒的大小和折射率及光的波长等物理因素使光谱散射所导致的差异, 光谱的信噪比明显得到改善。
2.2 茶叶品种鉴别的模式识别方法
主成分分析-马氏距离判别分析方法[7,8,9]是通过对主成分分析对光谱变量进行转换, 用降维后的新变量进行线性组合最大限度表征原始光谱信息特征。再以新的特征变量进行马氏距离计算[8]表示数据的协方差, 再根据距离度量值进行判别分析。
对7种不同品种茶叶的70张样品近红外光谱进行多元散射校正, 并依据校正后的光谱指纹信息建立PCA-MD判别模型, 其中每种茶叶的前七张样品光谱作为训练集, 后三张样品光谱作为预测集。
通过主成分分析 (PCA) 先对经多元散射校正后的近红外光谱特征进行提取, 降维后, 得到前10个主成分组成的新的变量。其中前10个主成分的贡献率达到99.6%, 故利用主成分为10的累计方差足以解释总方差, 从而实现了对样品近红外多元散射校正指纹信息数据的降维。再基于马氏距离方法计算每两个样本相互之间的相似度, 以距离度量值对七种不同品种的茶叶进行类别划分。
表3为7种茶叶间训练集和预测集样品的相互马氏距离的平均值及预测分类归属结果。从它们的马氏距离平均值中可以看出, 七种茶叶的近红外漫反射光谱的多元散射校正光谱具有较为明显的差异, 通过计算相互间的马氏距离, 能够对不同种类的茶叶进行明确的区分, 且对于七种茶叶的预测分类归属均与实际分类相符, 其预测分类正确识别率均达到100%。
为了直观分析其预测分类归属的识别结果, 可任选取到两种茶叶的距离为度量。表4和表5列出了以所有茶叶样品分别到A类样品碧螺春的距离和到B类样品云雾信仰毛尖的距离为度量时, 七种茶叶各10个样品对碧螺春和云雾信阳毛尖的马氏距离。纵向观察表4和表5, 可显而易见, 每种茶叶的各10个样品分别到A类和B类样品间的距离基本一致, 说明各类样本自身特征性质的稳定性良好。
表4中以各类茶叶到碧螺春的距离为度量时, D类样品云雾茗茶 (红茶) 与A类样品碧螺春的距离最远, 表明化学成分等差异最大, 其余依次为C类样品御品天香, B类样品云雾信阳毛尖, 但是样品E (云雾毛尖王) 、F (宜昌绿茶) 、G (茉莉花茶) 三种茶叶对碧螺春的相对距离十分接近, 这说明, 单独根据7种茶叶分别到样品A碧螺春的距离, 无法对7种茶叶进行明确的分辨, 还需要更多的信息对样品实现模式识别。但当结合各样品到样品B的距离构建二维空间坐标系后, 便可进行各类样本间相似度的评价及明确的样品类别划分。
表5中以各类茶叶到样品B云雾信阳毛尖的距离为度量时, D类样品云雾茗茶 (红茶) 的距离最远, 其余依次为E类样品云雾毛尖王, G类样品云雾茉莉花茶, A类样品碧螺春, F类样品宜昌绿茶和C类样品御品天香。但其中, C类样品与F类样品的相对距离较近。因此, 当组合表4和表5的距离结果值, 组成二维空间坐标时, 才能更好地对7种茶叶的类别进行完整而准确的划分。
为了直观判别分析各种茶叶间的分类情况和相似度, 将其表4和表5的马氏距离值投影在二维平面坐标下。如图2所示即是将7种茶叶分别到碧螺春的距离和云雾信阳毛尖的距离的二维空间中的距离度量值的判别分析图。其中, 图示A~G对应的茶叶类别如表1所示。
由上图2可以观察出:七种茶叶的指纹特征差异比较明显, 可以比较清晰的分辨出各种茶叶的相应归属, 且无错判情况的发生, 说明模型能够准确的对7种不同品种的茶叶样品进行品种分辨。其中, 当以样品A碧螺春和样品B云雾信阳毛尖分别为横纵坐标的作为空间投影图中, 样品E、F、G到样品A的距离相对较为接近, 说明, 此三种茶叶具有较为相近的化学成分。而样品C御品天香相对样品A与B来说, 其性质更加接近样品A碧螺春。而样品D云雾茗茶 (红茶) 与其他6种样品的相对距离最远, 说明化学成分茶叶较大, 这可能与样品D为红茶, 为全发酵茶的原因有关。
3 结论
由以上结果分析可知:通过马氏距离法对茶叶样品的近红外指纹图谱进行分类建模, 可以实现对不同品种的茶叶进行鉴别, 其分类正确率均达到了100%。此方法方便易行, 鉴别结果良好, 为茶叶的品种鉴别提供了一种有效的检测手段, 具有广阔的应用前景。
参考文献
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川牛膝的HPLC指纹图谱研究 篇3
目前国内对川牛膝的研究主要集中在其化学成分及药理研究方面, 缺乏综合评价药材品质的方法和标准, 且川牛膝在长期的应用和栽培的过程中, 种内产生很大的变异, 出现伦理较多的类型, 同时由于加工、储存等方法的不同, 药材质量存在较大的差异, 造成目前药材质量不稳定和市场药材质量无法评价的局面。本研究通过采用HPLC法建立川牛膝药材指纹图谱, 为控制川牛膝药材的综合质量提供参考依据。
1 试验材料、试药、试剂与仪器
1.1 试验材料、试药、试剂
川牛膝药材:经成都中医药大学峨眉学院王书林教授鉴定为苋科植物川牛膝 (Cyathula officinalis Kuan.) 的干燥根, 符合2005年版《中国药典》规定, 见表1。
对照品:杯苋甾酮 (cyasterone) 由四川省中医药研究所提供。试剂:甲醇 (色谱纯) , 水为重蒸水, 其它试剂均为分析纯。
1.2 仪器
Waters2996-2695型高效液相色谱仪;Waters Empower化学工作站;KQ3200型超声波清洗器 (40KHZ, 120W) , 昆山市超声仪器公司;BP-211D型电子分析天平 (Max:210g, d=0.1mg) , 北京赛多利仪器系统有限公司) 。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱:Symmetry® C18 (5μm, 4.6×250mm, Waters公司) ;流动相:甲醇-水二元梯度洗脱, 如表2;流速:0.9ml/min;柱温:35℃;检测波长:266nm;进样量:20μl;运行时间:35min。
2.2 溶液的制备
2.2.1 对照品溶液的制备
取杯苋甾酮对照品适量, 精密称定, 加甲醇制成每1ml含60μg溶液, 即得。
2.2.2 样品溶液的制备
取川牛膝药材细粉 (批号7#) 5g (过四号筛) , 精密称定, 置于100ml锥形瓶中, 精密量取甲醇50ml, 振摇, 回流提取1h, 放冷, 加甲醇补足损失的重量, 摇匀, 水浴挥干, 残渣加甲醇使溶解, 定容至10ml, 0.45μm微孔滤膜滤过, 取续滤液, 即得[3,4,5,6]。
2.3 方法学考察
2.3.1 精密度试验
精密吸取对照品溶液20μl, 重复进样5次, ≥5%总峰面积的各共有峰相对峰面积的RSD在1.3263%～2.1634%之间, 表明精密度良好。
2.3.2 重复性试验
取同一批次的川牛膝药材6份, 按上述样品测定方法分别测定, ≥5%总峰面积的各共有峰相对峰面积的RSD在2.3013%～2.8706%之间, 表明方法重现性良好。
2.3.3 稳定性试验
取同一供试品溶液, 分别在0, 2, 4, 8, 12, 24h分别进样20μl, ≥5%总峰面积的各共有峰相对峰面积的RSD在2.1181%～2.5066%之间, 表明样品在24h内稳定。
2.4 指纹图谱相似度分析
2.4.1 共有峰的标定
根据18批次供试品测定结果所给出的峰数, 对峰值和峰位等相关参数进行分析、比较, 川牛膝药材高效液相色谱可分离出20多个色谱峰, 经与杯苋甾酮对照品对照, 并比较所有记录的色谱图, 选取11个共有峰作为指纹图谱的特征峰, 其中9号峰为杯苋甾酮。
2.4.2 共有图谱模式的建立
根据《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求 (暂行) 》, 以参照物峰 (S) 的相对保留时间和相对峰面积为1, 计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。杯苋甾酮为川牛膝药材中的主要有效成分, 且其峰面积在图谱中相对较大, 保留时间适中, 故选择杯苋甾酮为参考峰 (S) , 以其保留时间和峰面积为1, 计算各样品共有峰的相对保留时间和相对峰面积。
2.4.3 图谱相似度分析
根据18批样品的相对保留时间及指纹图谱的整体谱峰特点对峰进行匹配, 以相对方面积的平均值建立共有模式, 见图2, 以相关系数法对样品的相似度进行评价, 各样品相似度结果见表3, 结果表明, 大多数样品之间相似度良好, 都达到0.90以上, 平均相似度为0.906。
3 讨论
本课题首次将HPLC法运用到川牛膝药材的鉴定与质量评价中, 能更加有效地解决药材化学成分的多样性与复杂性的质量评价技术难题。本实验采用二极管阵列检测器对指纹图谱的检测进行了选择, 结果表明在检测波长266nm处, 色谱图所包含的信息量更大。从相似度分析结果来看, 18批川牛膝药材相似度均在0.9以上, 表现出良好的相似性。在川牛膝药材指纹图谱的共有特征峰中, 整体分离度较好, 能充分反映出川牛膝药材醇溶性物质的化学成分特征, 可用于川牛膝药材鉴定及内在质量评价。在本实验建立的川牛膝药材指纹图谱分析方法中, 杯苋甾酮的保留时间适中, 与相邻色谱峰达基线分离, 分离度良好。
本实验所建立的方法, 精密度、稳定性和重复性均符合指纹图谱研究的技术要求, 为进一步制订川牛膝质量评价标准提供了科学依据。
摘要：目的:采用HPLC法构建川牛膝药材的化学指纹图谱。方法:采用Waters2695高效液相色谱仪, 色谱柱为Symmetry (C18 (5μm, 4.6×250mm, Waters公司) ;流动相为甲醇-水二元梯度洗脱;流速为0.9ml/min;柱温为35℃;检测波长为266nm。结果:测定基地产及市场上流通的样品共18批次, 标示了11个共有峰, 其指纹图谱相似度均在0.9以上, 指纹图谱整体面貌基本一致。结论:该方法简便、快速、准确、重现性好, 为川牛膝药材的定性鉴别和药材内在质量评价提供了依据。
关键词：川牛膝,指纹图谱,HPLC
参考文献
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中药材指纹图谱的研究概况 篇4
关键词：中药材,指纹图谱,研究进展
中药指纹图谱已作为一种重要的中草药质量控制技术,它是指通过对中药材、中药材提取物或中药制剂等采用一定的处理方法和分析手段,得到的能够标示其化学特征的色谱图或光谱图。中药指纹图谱的研究已经从测定方法、构建模式等等多方面进行了较深入的研究,在建立中药化学成分系统研究模式、评价中药材、中药材中间品以及中药制剂质量的真实性、安全性、优良性和稳定性等方面表现出很好的作用,逐步成为一种药材或成药新的质量控制的手段和方法。目前,对中药材指纹图谱的研究较多,本文就中药材指纹图谱的建立方法等进行了较全面的综述。
1 DNA指纹技术在中药材鉴别中的应用
随着DNA鉴别技术如DNA指纹技术、PCR指纹分析法等的发展和应用,指纹图谱技术也逐步发展起来,中药材中均含有蛋白质、核酸等生命物质,因而DNA指纹技术成为中药材的鉴定有效手段之一。马小军等[1]采用扩增酶切片段多态性(AFLP)方法研究5种农家类型,结果5种人参农家类型多态位点仅46%,说明各农家类型之间的遗传差异性很小,但长脖的AFLP有相对较高的多态性,说明长脖类型内部有更多的杂合态个体,更接近野生人参;同时,他们[2]分析山参遗传多样性及其遗传特性,采用随机扩增多态DNA(RAPD)标记方法对7个来源地不同的山参和1个园参样品进行遗传多样性检测和遗传分析,结果用14个10mer寡聚核苷酸引物共检测111个位点,其中多态位点76个,占67.6%,远大于园参内的遗传变异,因此山参在人参育种上有很大利用价值。聚类分析表明,山参之间及其与园参之间的遗传变异,没有超出与近缘种西洋参之间的遗传差异;遗传因素在人参形态变异上的作用小于环境因素,这一结果为“山参”的培育提供了理论依据。王培训等[3]采用随机扩增引物DNA(RAPD)法,筛选适于鉴别南、北五味子的随机引物,结果总共筛选了80条随机引物,得到一条引物S429能准确区分南、北五味子,并且其重复性非常高,可利用随机引物S429通过RAPD准确区分南、北五味子。
2 高效液相色谱法(HPLC法)构建中药材指纹图谱的应用
高效液相色谱法法因其分离效能高、速度快等特点已成为指纹图谱应用最多的分析方法,同样也广泛应用于中药材指纹图谱的建立。张聪等[4]对同一组中国红参和高丽红参进行指纹谱(HPLC FPS)比较研究。刘丽娟等[5]研究了不同来源的刺五加药材,采用HPLC指纹图谱分析法,建立3个刺五加药材样品的指纹图谱。陈蕴等[6]采用HPLC法分析检测8个蝎毒样品,结果获得了蝎毒的指纹图谱。周晓英等[7]用高效液相色谱法建立红花的指纹图谱分析方法。潘馨等[8]应用RP-HPLC(DAD)对三七药材进行指纹图谱研究,该方法简便,重现性好,对三七的质量控制有很好的实际应用价值。
3 气相色谱法(GC法)构建中药材指纹图谱的应用
GC法也同样因为具有分离效能高、速度快等特点,尤其适用于含有挥发性成分中药材的分析。近来的研究中,GC法常与MS法联用用于中药和中药材的指纹图谱构建。高广慧等[9]建立了羌活挥发油指纹图谱测定方法,为含羌活中药制剂制定指纹图谱奠定基础,采用水蒸气蒸馏法提取不同产地羌活的挥发油,用毛细管气相色谱技术测定指纹图谱(GC FPS),选用聚类法分析比较,结果该方法灵敏度高,稳定性、重现性的RSD<3%,该气相色谱指纹图谱分析法与聚类分析可作为羌活药材的质量控制方法。魏刚等[10]采用GC-MS法对不同采集期石牌藿香,以及同基地栽培的高要、湛江藿香挥发油进行主成分比较分析,结果以11个主要共有峰为评价指标,GC-MS色谱条件的精密度、稳定性、重现性良好,固定产地的石牌藿香稳定性好,不同采收期主成分基本相同,其中广藿香酮的含量随种植时间的延长而明显增高,与同地栽培的高要、湛江藿香相比,广藿香酮、广藿香醇等含氧组分以及不含氧的倍半萜烯类主成分的相对含量均有明显差异,从而建立了石牌广藿香挥发油GC-MS分析色谱条件,初步拟定了石牌藿香挥发油特征指纹图谱指标成分群,阐明石牌藿香的道地特性。叶崇义等[11]采用程序升温毛细管气相色谱法,分析挥发油成分,建立了术类药材气相色谱保留指数(GC-RI)指纹谱,并根据色谱峰的重叠率和含量特征图分析对比,以此对术类药用植物种缘关系进行探讨,试图为生药品种鉴定、内在质量评价及药用植物分类学研究开辟一条新途径。
4 核磁共振法(NMR法)构建中药材指纹图谱的应用
秦海林等[12]对苦皮藤的1HNMR指纹图进行解析,采用硅胶柱色谱法分离苦皮藤根皮CGEA的化学成分,鉴定单体化合物的结构并对其进行1HNMR研究,结果不同来源的苦皮藤样品,其1HNMR指纹图有很好的重现性和高度的特征性,说明苦皮藤根皮的1HNMR指纹图可用于其基源鉴定,并主要显示了以上3个化合物的特征共振信号。王思宏等[13]研究长白山地区野生和栽培高山红景天核磁共振特征图谱,采用赵天增总提取物通用方法,用液-质联机作比较,同时以长白红景天作对比,结果采用赵天增总提取物通用方法,薄层层析后都可以得到有效成分红景天苷特征明显的核磁共振特征图谱,长白红景天有效成分红景天苷特征不明显的核磁共振特征图谱,根据野生和栽培高山红景天核磁共振特征图谱,可以成为高山红景天真伪鉴别的依据。
5 红外光谱法(IR法)构建中药材指纹图谱的应用
倪力军等[14]提出简便易行的对指纹图谱间相似程度进行量化评价的方法并开发用户友好的应用软件,对9个丹参提取物的红外图谱的相似度分析结果与实际情况分析其红外指纹图谱。结果红外图谱之间有很好的相似程度。周红涛等[15]首次运用傅里叶变换红外光谱技术对不同产地芍药根部的混合化学体系进行了全组分快速分析,对所获得的指纹图谱进行特征峰指认和对比分析,结果赤芍野生品与栽培品的红外吸收频率、吸收峰的相对强度都存在比较大的差异,多伦赤芍(道地药材)的红外吸收峰形状也有一定的特异性。
6 其他方法构建中药材指纹图谱的应用
目前,其他一些方法如薄层扫描法(TLCS)、高效毛细管电泳法(HPCE)等也应用到中药材的指纹图谱的研究中,还有一些是多种方法的综合应用。
王东等[16]为鉴别生熟地黄及考察熟地黄饮片质量的稳定性和一致性,建立了薄层色谱指纹图谱,采用乙酸乙酯∶丙酮∶甲酸∶水(3∶5∶1∶1)为展开剂,苯胺-二苯胺-磷酸溶液为显色剂,85℃加热至斑点显色清晰,色谱图谱及全通道扫描结果显示10批清蒸和10批酒炖样品间的相似程度较高,饮片质量比较均一、稳定,薄层色谱方法操作简单,图谱特征明显,可比性强,是一种可以快速鉴别药材真伪及考察药材质量是否稳定、一致的有效手段。
林文津等[17]建立了中药枇杷叶的高效毛细管电泳(HPCE)指纹图谱,采用正丁醇超声提取法制备品种、批次不同的枇杷叶供试液,以熊果酸对照品为内参考物,运用高效毛细管区带电泳法测定指纹图谱,并用相似度评价软件分析其相似度,结果所测定的13个品种枇杷叶样品,其指纹图谱相似度0.9以上有11个,0.9~0.8之间1个,0.8~0.7之间1个,指纹图谱整体面貌基本一致的,所建立的枇杷叶高效毛细管电泳指纹图谱稳定、可靠,可作为枇杷叶的特征指纹图谱。
苏娴等[18]建立了黄芪的RRLC/UV-MS指纹图谱分析方法,采用Agilent Zorbax Extend C18色谱柱(2.1 mm×100mm,1.8μm),以乙腈-0.1%甲酸为流动相进行梯度洗脱,流速0.3 m L.min-1,进样量0.5μL,柱温30℃,检测波长254 nm,结果建立了黄芪药材RRLC UV-MS指纹图谱分析方法,对11批样品进行了分析,其相似度均达到0.92以上。
7 构建中药材指纹图谱模式的研究
指纹图谱标准模式构建方面,有根据不同的方法构建指纹图谱的识别模式,都具有一定的可行性和科学性,而这些标准模式的建立正催化规范的、广泛适用的标准指纹图谱模式的出现。
尚刚伟等[19]提出中药“指纹-药剂学”方法论,意在为中药现代化提供一种具科学性、先进性、可行性及实用性的方法,在中药的研究过程中,采用现代科学方法和分离分析手段,在药物(复方、单方)、有效成分群和有效成分三个层次上进行研究工作,密切结合药效学研究与临床。
余杰等[20]提出研究中药材质量分析与评价的新方法,运用科学计算可视化原理,建立了仪器分析数据可视化技术,通过主成分分析和空间投影变换方法对药材的红外光谱分析数据进行预处理,实现特征提取和高维数据空间的降维,进而采用二维灰度图对变换后的数据进行可视化处理,获取中药材质量的特征指纹图谱,对野生、栽培桑白皮及其伪品共42个样品进行了测定,结果表明样品鉴别的准确率达到90.5%,从而说明该方法是一种具有重要发展意义的中药材质量鉴定新技术。
安金兵等[21]针对中药色谱指纹图谱中色谱峰面积值存在较大变异性的问题,从拟分布函数的角度介绍了一种新的分析方法,采用秩变换将色谱峰面积值转化为相对秩次,然后通过一系列变换将原数据转换成拟分布函数的形式,再利用柯尔莫哥洛夫检验实现不同类别样品的色谱指纹图谱之间的相似性分析,通过对北马兜铃和南马兜铃样品的比较,说明了该方法有较好的灵敏度和稳健性。
紫外指纹图谱技术检验鞋油的研究 篇5
在日常生活中鞋油广泛应用于皮鞋护理,其使用具有较强的个体差异性,不同的人会有使用不同品牌或不同颜色鞋油的习惯,其使用频次也因人而异。
在一些案件中,当嫌疑人穿着用鞋油护理过的皮鞋作案时,鞋子与墙壁、纺织品、地毯等物品会有接触,鞋油很有可能发生转移从而形成相应污痕或瘢渍,因此通过对此类痕迹的检验鉴别,可以为侦查破案提供线索,指明方向,为证实犯罪提供科学的依据。
鞋油有液体鞋油和固体鞋油之分,其主要成分是石蜡、虫蜡、松节油、棕榈油等[1,2,3,4]。
指纹图谱技术是目前较为新颖检测技术,由于不同物质其组成成分不同、组成成分含量有区别,其反映在紫外吸收曲线上的峰高、峰形及相对强度则存在差异,可据此进行物质的定性检验[5,6,7,8,9,10]。
本文利用紫外—可见分光光度仪,对30份鞋油的有机成分进行分析,使用优选出的检测方法,对膏状鞋油样品进行了谱图采集,依据每个样品的紫外光谱图进行指纹图分析,并对该方法的重现性进行了考查,所测样品均得到较好区分。该方法可以为公安实践部门检验鞋油物证提供借鉴。
1 试验条件
样品:常见液体和膏体鞋油样品30份,见表1。
试剂:蒸馏水、甲醇、乙醇、乙腈、丙酮、乙醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、三氯甲烷(均为分析纯)。
仪器及试验条件:TU-1950双光束紫外可见分光光度仪(北京普析),波长范围190～300nm;分辨率0.5nm。
2 试验方法
2.1 膏状鞋油检测方法的选择
2.1.1 提取剂
根据溶解能力选择提取剂,试验发现,除蒸馏水以外,所选溶剂均能溶解鞋油样品,这是由于鞋油多数为油溶性物质,可溶于有机溶剂。根据溶解能力大小,选择乙醇、丙酮、二氯甲烷、三氯甲烷作为提取剂。
将鞋油样品分别配成质量分数为25mg/mL的鞋油/乙醇溶液、鞋油/丙酮溶液、鞋油/二氯甲烷溶液与鞋油/三氯甲烷溶液,并分别以各自的空白溶剂作为参比液进行对照试验,在波长为190～300nm进行光谱扫描,根据谱图质量确定提取剂,见表2。
2.1.2 扫描波长的选择
将鞋油样品配制成质量分数为25mg/mL的鞋油/乙醇溶液,按一定比例稀释后作为待测液,在乙醇溶液为参比条件下,对待测样品进行光谱扫描。以波长为横坐标、吸光度值为纵坐标,绘制紫外吸收光谱图,根据紫外吸收峰分布情况确定扫描波长。
2.1.3 样品浓度的选择
如果使用样品原液直接进样测试,紫外吸收响应值过高,易超出仪器量程,因此需要确定合适的样品稀释浓度,将5#鞋油样品配制成质量分数为25mg/mL的鞋油/乙醇溶液,再使用乙醇分别按照1:2、1:3、1:5、1:10、1:15进行稀释,以乙醇溶液为参比,波长190～300nm下进行光谱扫描,按照吸收峰强度确定样品配制浓度。
2.1.4 样品载体物的选择
选择14#样品“意尔康”牌黑色膏状鞋油,分别等量涂抹于洁净无纺布与载玻片上,待挥干后用乙醇溶解,于相同试验条件采集扫描光谱。
2.2 特异性检验
将23#鞋油溶液,按照1:2、1:3、1:5、1:6、1:7、1:9、1:10的比例进行稀释,按照上述试验条件扫描光谱,检验稀释浓度对紫外谱图特异性的影响。
2.3 重现性检验
选择2#、19#鞋油样品,稀释1:5后,重复测定3次谱图,观察谱图重复性。
3 试验结果分析与讨论
3.1 试验条件的确定
3.1.1 提取剂
由表2可知,使用乙醇作为鞋油样品的提取剂,溶解效果较好,且乙醇在190～300nm范围内无干扰,所以本试验采用乙醇做提取剂。
3.1.2 样品浓度
根据朗伯—比尔定律,物质吸光度与物质的浓度在一定范围内成正比,当溶液过浓时(物质浓度超过0.01mol/L),吸光粒子由于间距减小,摩尔吸光系数将发生变化,导致吸收曲线线形改变[11]。
将5#样品使用乙醇溶液按照1:2、1:3、1:5、1:10、1:15稀释,进行紫外曲线扫描,结果如图1所示。
由图1可知,当样品浓度过高(稀释比1:2)时,紫外曲线相应值过高,出现吸光度大幅度跃升,曲线峰形出现改变,样品在稀释比1:15时,吸收曲线虽然有完整峰形,但响应值过低,峰形不能完整反映鞋油样品所含信息。
当稀释比在1:5时,紫外吸收曲线响应值适中,并且峰形完整,因此样品稀释比例最终确定为1:5,即按照上述试验条件,取30份鞋油样品,分别配制为25mg/mL鞋油/乙醇溶液,按照1:5稀释后扫描光谱,重复3次,绘制鞋油吸收谱图。
3.1.3 扫描波长的选择
经过试验发现,鞋油样品的紫外吸收峰均集中在190～250nm之间,为鞋油中杂原子不饱和基团C=O和=N的不饱和n→π紫外吸收峰,因此将扫描波长定为190～400nm。
3.2 鞋油样品紫外光谱指纹特异性分析
3.2.1 数据处理
紫外吸收光谱曲线相似度:
式中:n—数据点个数;h1j,h2j—第1,第2条曲线中第j个点的吸光度值。
以相似度s=0.90为临界值,当s>0.90时,认为2条曲线为相同鞋油紫外扫描曲线;当s<0.90时,认为2条曲线为不同鞋油紫外扫描曲线。所得数据使用Excel软件进行处理。
3.2.2 鞋油样品特异性分析
1#～15#鞋油样品紫外吸收曲线如图2所示,16#～30#鞋油样品紫外吸收曲线如图3所示,1#～30#样品紫外吸收曲线相似度对比如表3所示。
由图2、图3、表3可知,30份鞋油样品的紫外吸收曲线均能表现出足够的特异性,鞋油的紫外吸收曲线特异性来源有两个,第一为样品中紫外吸收活性物质的含量,第二为样品紫外吸收活性物质的组成,其中后者是造成鞋油紫外曲线特异性的主要原因。
从表3可看出,s>0.9为相同成分,差异较小,s<0.9则认为成分不同,差异显著。
在3 0份样品的两两比较结果中,大部分的样品可以得到较好的区分,区分率为96.8%。其中即使是相同品牌不同批次的鞋油,相互之间相似度也有差异,如“奇伟”牌新旧两款鞋油的紫外吸收曲线相似度为0.39,说明两款产品在生产配方上有一定的差异,导致曲线变化。使用紫外分光光度检验鞋油样品,具有较好的区分度。
3.2.3 鞋油样品紫外光谱特征
通过分析鞋油样品紫外谱图,发现具有共同特征:在200nm存在一个较强吸收峰,这是由于多元醇和酚产生缔合现象,-OH基的n→π紫外吸收峰发生红移作用,由原来的190nm向200nm移动。
部分鞋油样品的紫外谱图,在225nm,出现一个中等强度的吸收峰。
由此可以推测出鞋油中有N或S等杂原子未成对电子跃迁吸收。根据鞋油样品的紫外吸收峰在225nm附近有无吸收峰,可以将30个样品分为两大类,第Ⅰ类为225nm附近有吸收峰,该类鞋油样品共有6个品牌8个样品;第Ⅱ类为225nm附近没有吸收峰,该类鞋油样品共有15个品牌22个样品。见图4、图5。
3.2.4 相同样品、不同浓度的检验
选择“万金”黑色膏状鞋油(23#)样品,配制25mg/mL鞋油乙醇溶液,分别按照溶液比乙醇1:2、1:3、1:5、1:6、1:7、1:9、1:10进行稀释,其紫外线图谱及相似度对比如图6、表4所示。
从图6、表4可以看出,稀释比在1:10～1:3之间,紫外吸收曲线峰形基本不发生变化,相似度均在0.99～0.98之间。
说明在该浓度范围内同一样品的紫外吸收曲线线形保持稳定,样品中各组分在同比例增加或减少的情况下不会形成差异。
但当稀释比小于1:2时,峰形发生较大变化,说明浓度过大时,样品中对紫外线吸收响应较大的物质会产生较强的掩蔽效应,造成曲线变形。
3.2.5 相同样品、相同浓度、不同载体的检验
实际办案条件中,采集到的鞋油检材均为不新鲜的、转移型的鞋油痕迹,为模拟现场情况,选择“意尔康”黑色膏状鞋油(14#)样品,配制成25mg/mL的鞋油/乙醇溶液后,再用乙醇稀释1:5,均匀涂抹于洁净玻璃板与洁净白色无纺布上,干燥后使用乙醇浸泡溶解,采集光谱,见图7。
由图7可知,从不同的载体上采集到样品的吸收曲线峰形基本不发生变化,曲线之间的相似度均在0.98以上,仅仅在吸收强度上略有变化(1:5稀释溶液最高,玻璃载体其次,无纺布载体最低)。
这主要是因为转移到载体上的鞋油成分不能全部回收,造成浓度降低的缘故。因此,使用紫外指纹图谱技术检验鞋油,载体的不同不会引起相同样品的误判。
3.2.6 重现性试验
在相同的试验条件下,对“庄臣”黑色膏状样品(2#)和“红鸟”黑色膏状鞋油样品(19#)进行重复试验表明,该方法的重现性良好,4次试验中相对峰高比值的变异系数均<0.1%。
4 结论
利用紫外光谱可以对不同品牌、同一品牌不同批次的鞋油样品进行鉴别,该方法操作简便快速,结果准确可靠,重现性高,可以在实际办案中对现场中提取到的膏状鞋油物证进行检验。
关键词：鞋油,紫外光谱,比较研究,法庭科学
参考文献
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丹参药材指纹图谱建立方法研究 篇6
丹参, 为唇形科植物丹参Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根及根茎。秋季9—10月份采挖, 除去泥沙, 干燥。
丹参药材中有效成分主要分为两类:一类为水溶性的酚酸类成分 (丹参素、原儿茶醛和丹酚酸A、B、C等) , 另一类为脂溶性的二萜类成分 (丹参酮I、丹参酮II和隐丹参酮等) 。定性鉴别上述两类成分或定量测定其某种或多种有效成分含量, 已成为评价丹参及其制剂质量的重要方法[1]。据统计, 丹参制剂达100多种, 而丹参制剂中主要有效成分为水溶性的酚酸类成分, 考虑到原药材的质量控制与制剂质量之间的相关性, 我们主要对丹参药材水溶性酚酸类成分进行了指纹图谱的研究, 该类成分对紫外线具有较强的吸收值, 可采用HPLC-UV法建立制剂指纹图谱。
1 丹参指纹图谱研究情况
1.1 脂溶性成分的指纹图谱
丹参脂溶性成分的指纹图谱, 一般将药材经处理提取后, 以甲醇-水溶剂系统进行梯度洗脱。由于丹参药材、对照品以及使用仪器等条件的不同, 洗脱系统存在差异。徐德然[2]等以丹参酮ⅡA、隐丹参酮为对照进行指纹图谱研究。
目前获取指纹图谱的主要方法有色谱法、光谱法、X射线衍射法和分子生物技术等。其中, 色谱技术是近年来分析化学领域中发展快、应用广的方法之一。常用的色谱技术包括薄层色谱、液相色谱、气相色谱和毛细管电泳等[3]。其中, 高效液相色谱是液相品, 5%甲醇与0.1%乙酸-甲醇梯度洗脱, 在254 nm波长处检测, 用于不同产地丹参脂溶性成分指纹图谱的比较研究。
1.2 水溶性成分的指纹图谱
近10年来, 采用HPLC法分析技术对水溶性酚酸类化合物进行指纹图谱研究有显著的优势。研究中一般采用C18柱, 甲醇或乙腈同时加入酸抑制剂进行线性梯度洗脱, 分离效果较佳。周欣[4]等以丹参素钠、原儿茶醛为对照品, 乙腈-0.4%冰醋酸水溶液进行梯度洗脱, 检测波长254 nm, 建立了贵州铜仁地区丹参药材的HPLC水溶性共有指纹图谱;宋敏[5]采用甲醇-1.0%冰醋酸溶液梯度程序洗脱, 以丹参对照药材制备指纹对照品进行了色谱系统适用性试验, 并考察了梯度洗脱程序、流动相酸度以及色谱柱填充剂对指纹图谱重现性的影响。
1.3 有效成分的指纹图谱研究
随着丹参指纹图谱研究的深入, 丹参有效成分 (脂溶性和水溶性) 指纹图谱的研究也日益成熟。鉴于药材的有效成分理化性质差异较大, 实际操作中, 多采用水提、不同浓度甲醇提取等方法, 以含酸抑制剂的乙腈或甲醇为流动相, 建立丹参有效部位指纹图谱定性研究的分析方法。
刘艳华[6]等采用水提法, 以原儿茶醛为外标, 1%冰醋酸和1%冰醋酸甲醇溶液梯度洗脱, 检测波长270 nm, 建立了河南灵宝地区丹参药材的指纹图谱;郑晓珂[7]等以甲醇-0.5%冰醋酸梯度洗脱, 流速0.8 m L/min, 检测波长281 nm, 柱温35℃, 建立了丹参药材的指纹图谱;黎琼红[8]等采用甲醇为溶剂进行索提后, 以丹参酮ⅡA、原儿茶醛、丹参素钠为对照品, 0.02%磷酸乙腈-0.02%磷酸梯度洗脱, 40℃柱温, 检测波长280 nm, 建立了丹参药材的高效液相指纹图谱;刘洋[9]等采用水回流提取后甲醇超声的方法, 以丹参素、原儿茶醛、丹酚酸B、隐丹参酮、丹参酮I、丹参酮ⅡA为对照品, 用0.1%三氟乙酸水溶液-乙腈为流动相梯度洗脱, 检测波长270 nm, 柱温30℃, 在同一图谱中同时建立起水溶性成分和脂溶性成分的指纹图谱。
1.4 其他方法
近些年来, 随着毛细管电泳 (HPCE) 、高速逆流色谱 (HSCCC) 及HPLC-MS联用技术的发展, 这些技术已经被用于丹参指纹图谱的研究。
季一兵[10]等用毛细管电泳技术, 采用50μm×50 cm未涂渍毛细管柱, 20 mmol/L硼砂溶液作缓冲液, 运行电压为15 k V, 检测波长210 nm, 建立了丹参中药材的HPCE指纹图谱;顾铭[11]等采用HSCCC法, 以正己烷-乙醇-水体系采用分步洗脱, 建立了丹参药材中脂溶性成分的HSCCC指纹图谱;陈勇[12]等应用电喷雾-质谱 (ESI-MS) 技术研究了原儿茶醛和丹参素的ESI-MS规律, 并对丹参药材中已知的18种水溶性成分中的5种进行了质谱检测和电喷雾行为探讨, 初步制定了丹参药材的水溶性成分的特征图谱。此外, 汪红[13]等以丹酚酸B为指标, 以0.5%甲酸-乙腈为流动相, 检测波长287 nm, 得到其LC-MS (n) 特征图谱, 同时对图谱中7种主要化合物进行了精确归属, 初步探讨丹酚酸成分的ESI-MS (n) 规律。
徐曼[14]等还应用对照品对照和高效液相色谱-质谱联用技术对丹参注射液中的主要成分进行了定性分析, 测定了18个不同厂家生产的丹参注射液的HPLC-UV指纹图谱以及代表性厂家注射液的HPLC-DAD-MS图谱, 指认了其中的15个酚酸类成分, 研究结果显示, 18个不同厂家生产的丹参注射液在所含化学成分的数目和含量上差异显著。该方法可用于测定不同来源的丹参注射液的色谱指纹图谱, 并为丹参注射液的全面质量评价和生产工艺监控提供了可行的方法。
2 丹参水溶性成分指纹图谱建立方法试验
2.1 供试品溶液的制备
原药材质量标准研究主要是为了更好地控制制剂的质量, 因而在药材指纹图谱的研究中, 应充分考虑药材指纹图谱控制与制剂质量之间的相关性, 故在供试品溶液的制备时, 我们参考了制剂的制备工艺, 即以一定浓度的碱水进行提取。
2.1.1 丹参药材的粉碎
丹参药材需粉碎成细粉后进行提取, 粉碎前如药材含水量较高, 则应将药材低温干燥, 根据《中国药典》2010版丹参含量测定项下规定, 药材粉碎成过三号筛的药材细粉即可, 但我们在粉碎时发现有少量药材纤维难以粉碎过三号筛, 该部分应尽量粉碎后加入药材细粉混匀, 再称取样品, 以保证取样的均匀。
2.1.2 提取方式及溶剂的选择
考虑到丹参注射剂制剂的制备工艺采用水提醇沉和碱水解的工艺, 本药材提取方法拟采用碱水提取。首先对提取方式及提取溶剂进行了优选:称取药材粉末1.0 g, 共6份, 按表1进行提取, 提取时间为1 h, 各提取液滤过, 取续滤液5 m L, 加入等体积甲醇, 摇匀, 滤过, 取续滤液, HPLC分析。
结果显示, 以0.1%Na2CO3水溶液回流提取, 效果较好, 与中间体及制剂的色谱图相对吻合, 提示该提取溶剂较为适合。
为了更进一步地优选适宜的提取溶剂, 以0.1%Na2CO3为参考, 考察了多个不同浓度的Na2CO3水溶液:称取药材粉末1.0 g, 共8份, 按表2进行回流提取, 提取时间为1 h, 各提取液滤过, 取续滤液5 m L, 加入等体积甲醇, 摇匀, 滤过, 取续滤液, HPLC分析。
结果显示, 以0.08%Na2CO3水溶液回流提取, 样品色谱峰与半成品及制剂的指纹图谱吻合度相对较好, 因此, 最终选择提取方式为0.08%Na2CO3水溶液回流提取。
2.1.3 提取时间的选择
考察了不同的提取时间对图谱的影响:称取药材粉末1.0 g, 共3份, 精密加入25 m L 0.08%Na2CO3溶液回流提取, 提取时间按表3进行, 提取结束, 取续滤液5 m L, 加甲醇5 m L, 混匀, 滤过, 取续滤液, HPLC分析。
药材回流提取1 h及2 h, 色谱峰差异较小, 指纹图谱的吻合度较好, 考虑到节约时间, 选择提取回流时间为1 h。
药材供试品溶液的制备确定为:称取丹参药材粉末 (过三号筛) 1.0 g, 置具塞圆底烧瓶中, 加0.08%Na2CO325 m L, 称定重量, 加热回流1 h, 放冷, 加0.08%Na2CO3补足失重, 滤过, 精密量取续滤液5 m L置10 m L量瓶中, 甲醇定容, 摇匀, 滤过, 取续滤液, 即得。
2.2 检测方法选择
考虑到药材提取液中主要含水溶性的酚酸类成分, 并参考了丹参注射剂等制剂有效成分的检测条件, 选用HPLC-UV法进行分析, 具体的测试条件、方法考察如下:
2.2.1 仪器和试剂
HPLC仪器:Agilent 1100 G1311A Quart Pump, VWD紫外-可见检测器, 全自动进样器, Agilent LC色谱工作站。
溶剂:甲醇为色谱纯 (汉邦科技有限公司) , 乙腈为色谱纯 (Tedia company) , 三氟乙酸、冰醋酸均为色谱纯, 水为亚沸蒸馏水, 其余试剂均为分析纯。
2.2.2 流动相选择
(1) 甲醇:酸水系统; (2) 乙腈:酸水溶液系统。
试验优选了两种系统的流动相条件 (甲醇为流动相A, 乙腈为流动相B, 酸水溶液为流动相C) , 试验结果如表4~表8所示。
试验结果表明, 在乙腈-酸水溶液系统下该制剂中整体色谱峰能呈现良好的分离, 0.1%三氟乙酸水与0.5%冰醋酸水效果相当, 考虑到大部分丹参制剂含量测定中使用的酸水为0.5%冰醋酸水, 因此指纹图谱流动相条件最终确定为梯度 (5) 的方法。
2.2.3 测定波长选择
对丹参样品进行了全波长 (190~400 nm) HPLC测试, 结果显示, 在281 nm测定波长下整体色谱峰较好, 有效成分能够充分体现, 因此选择测定波长为281 nm。
2.3 色谱柱选择
(1) C18柱:Hedera C18 (250 mm×4.6 mm, 5μm) , 江苏汉邦科技有限公司; (2) C18柱:Kromasil C18 (250 mm×4.6 mm, 5μm) , 大连依利特公司; (3) C18柱:Phenomenex C18 (250 mm×4.6 mm, 5μm) , 菲罗门公司。
在上述条件下, 3支以上规格C18色谱柱样品的HPLC色谱图均能达到分离要求, 考虑简便、经济的因素, 我们选择江苏汉邦科技公司的Hedera C18色谱柱。
2.4 延时测试
丹参药材供试液指纹图谱延时测试, 延长测试时间1倍至2 h, 药材色谱图中未见明显的成分滞后峰, 如图1所示。
2.5 精密度试验
同一批丹参药材供试液, 连续进样6次进行精密度测定, 测定结果如表9、表10所示。结果表明, 供试液中各共有峰的相对保留时间及主要峰的峰面积比值基本一致 (RSD%≤5%) , 符合指纹图谱的技术要求。
2.6 稳定性试验
同一批丹参药材同法制备供试液6份, 依法测定, 结果分别如表11、表12所示。结果表明, 供试液中各共有峰的相对保留时间及主要峰的峰面积比值基本一致 (RSD%≤5%) , 符合指纹图谱的技术要求。
注:表中S为参照峰、t R为保留时间、ts为参照峰保留时间、A为峰面积、As为参照峰峰面积。
2.7 重复性试验
同一批丹参药材同法制备供试品液6份, 依法测定, 结果分别如表13、表14所示。结果表明, 供试品液中各共有峰的相对保留时间及主要峰的峰面积比值基本一致 (RSD%≤5%) , 符合指纹图谱的技术要求。
2.8 丹参药材指纹图谱测定
2.8.1 标准指纹图谱制备
取19批丹参药材, 依法制备, 分别精密吸取供试品溶液各10μL, 注入液相色谱仪, 测定19批丹参药材60 min指纹图谱, 发现石家沟的丹参药材图谱有较大差异, 所以将其舍去, 考察剩余18批丹参药材的相似度。
图谱采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版》软件对多批制剂指纹图谱进行处理:从中选择1张图谱为对照图谱, 对色谱峰进行自动匹配后生成“对照图谱”, 将该图谱作为本丹参药材的标准指纹图谱, 如图2所示。
2.8.2丹参药材指纹图谱测定
对以上各批丹参药材以标准指纹图谱为对照进行相似度评价, 采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004B版》软件进行处理:以标准指纹图谱为对照图谱, 自动匹配后, 进行相似度评价, 结果如表15所示。
结果显示, 以标准指纹图谱为对照, 18批药材与之相似度均大于0.960, 符合指纹图谱要求。
3 结语
杞菊地黄系列品种指纹图谱研究 篇7
关键词：杞菊地黄系列,特征图谱,高效液相色谱法,菊花,牡丹皮,山茱萸
杞菊地黄系列由六味地黄丸加枸杞子、菊花而成。八种药物配伍组合共同发挥滋阴、养肝、明目的作用。现代医学研究, 杞菊地黄丸可增强免疫功能, 抗衰老, 改善肝脏脂肪代谢, 促进肝细胞新生, 预防脂肪肝发生, 抗肿瘤、降血脂等作用[1]。目前对于杞菊地黄系列多采用薄层色谱法, 高效液相色谱法进行质量控制方法, 不能全面反映杞菊地黄系列品种的质量状况。同时由于目前杞菊地黄系列的生产厂家众多, 产品中所含化学成分的种类和含量也有较大差异, 所以开展杞菊地黄系列的特征图谱研究对于控制其质量具有重要意义。本文采用HPLC-DAD法, 建立了杞菊地黄系列的特征图谱分析方法, 评价了不同厂家杞菊地黄系列产品间的质量差异, 并对杞菊地黄系列的特征图谱与原料药材的特征图谱的相关性进行了分析[2,3]。
1 仪器与试药
Agilent 1200 Series高效液相色谱仪;色谱柱:Phenomenex Luna C18 (4.6×250 mm) 乙腈为色谱纯 (Fisher公司) ;磷酸为色谱纯 (Fisher公司) ;其他试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 溶液的制备
2.1.1 参照物溶液的制备
取芍药苷、马钱苷、木樨草苷对照品适量, 加70%甲醇制成每1 ml各含0.05 mg的溶液, 作为参照物溶液。
2.1.2 对照药材溶液的制备
取牡丹皮对照药材0.2 g、山茱萸、菊花对照药材各0.5 g, 分别置具塞锥形瓶中, 精密加入70%甲醇25 ml, 称定重量, 超声处理 (功率250 W, 频率33 k Hz) 30 min, 用70%甲醇补足减失的重量, 摇匀, 作为对照药材溶液。
2.1.3 供试品溶液的制备
取本品小蜜丸或大蜜丸, 剪碎, 精密称取约2 g;或取水蜜丸或浓缩丸, 研碎, 精密称取约1.5 g, 置具塞锥形瓶中, 精密加入70%甲醇25 ml, 称定重量, 超声处理 (功率250 W, 频率33 k Hz) 30 min, 用70%甲醇补足减失的重量, 摇匀, 作为制剂供试品溶液。
2.1.4 阴性对照溶液的制备
按杞菊地黄系列品种的处方, 分别制成不含菊花、牡丹皮、山茱萸的阴性样品。按照“2.3”项下供试品溶液的制备方法制备阴性对照溶液。
2.2 色谱条件
Agilent 1200 Series高效液相色谱仪;色谱柱:Phenomenex Luna C18 (4.6×250 mm) ;检测波长:230 nm、346 nm;流速:1.0 ml·min-1;柱温:35℃;以A为乙腈, B为0.1%磷酸溶液, 洗脱程序为0~39 min, A为5%~9%;30~94 min, A为9%~24%;94~95 min, A为24%~70%;95~105 min, A为70%。运行时间105 min。理论板数按马钱苷峰计算应不低于5000。
2.3 精密度试验
取一份供试品溶液, 在上述色谱条件下连续进样6次。结果共有峰相对保留时间的RSD值均小于2.0%, 相对峰面积比值均小于3.0%, 表明此方法精密度良好。
2.4 重复性试验
依供试品溶液方法平行配制6份供试品溶液, 在上述色谱条件下进行测定。结果表明, 各共有峰相对保留时间的RSD值均小于2.0%, 各共有峰相对峰面积的RSD值均小于3.0%, 表明本方法重复性良好。
2.5 稳定性试验
取同一份供试品溶液, 分别在0、4、8、12、24 h进行测定。结果表明, 各共有峰相对保留时间的RSD值均小于2.0%, 各共有峰相对峰面积的RSD值均小于3.0%, 表明本方法稳定性良好。
2.6 样品特征图谱测定
取34个厂家的杞菊地黄大蜜丸及小蜜丸、19个厂家的杞菊地黄水蜜丸和27个厂家的杞菊地黄浓缩丸共80批供试品, 按上述方法制备供试品溶液, 在上述色谱条件下进样分析, 得样品的HPLC色谱图。另取上述牡丹皮、山茱萸及菊花对照药材溶液;阴性对照溶液及对参照物溶液也分别按上述条件进行测定。根据对80批杞菊地黄系列品种的特征图谱测定, 比较供试品的谱图, 在346 nm波长下, 供试品溶液的菊花特征图谱中, 应有5个共有峰, 以参照物相应的峰为S峰, 计算各特征峰与S峰的相对保留时间, 其相对保留时间均在规定值的±1%以内。各峰相对保留时间的规定值分别为0.473 (峰1) 、1.000 (峰S) 、1.124 (峰2) 、1.130 (峰3) 、1.218 (峰4) ;在230 nm波长下, 供试品溶液的牡丹皮特征图谱中, 应有3个共有峰, 以参照物相应的峰为S峰, 计算各特征峰与S峰的相对保留时间, 其相对保留时间在规定值的±1%以内。各峰规定值为1.000 (峰S) 、1.231 (峰1) 、1.478 (峰2) ;在230 nm波长下, 在供试品溶液的牡丹皮特征图谱中, 应有3个共有峰, 以参照物相应的峰为S峰, 计算各特征峰与S峰的相对保留时间, 其相对保留时间在规定值的±1%以内。各峰规定值为0.595 (峰1) 、1.000 (峰S) 、1.802 (峰2) 。按照上述条件对80批杞菊地黄系列样品的测定, 采用指纹图谱比对软件进行比对。从80批杞菊地黄系列样品的特征图谱分析结果可以看出来, 图谱中个色谱峰的相对保留时间匹配较好, RSD值均小于3.0%。
3 讨论
特征图谱法可以更加全面的控制中药复方制剂的质量, 可以克服由以前控制单一成分的含量来控制药品质量的缺陷。也提示可以运用特征图谱在控制投料药材及监控生产过程, 保证药品质量稳定方面。由于生产厂家不同, 特征图谱中各特征峰的峰面积存在较大差异。因此, 可以发现不同生产企业所生产的产品质量上存在着较大的差异。由于此次试验收集的每味药材只有5批, 不具有普遍的代表性, 因此, 未对各特征峰进行相对峰面积的要求。待日后进一步研究时再做各特征峰相对峰面积的控制。
参考文献
[1]中华人民共和国卫生部药典委员会.中华人民共和国药典:一部.中国医药科技出版社, 2010:244.
[2]李芸, 苗晓楼, 陶玉宝, 等.杞菊地黄丸 (浓缩丸) 质量标准的研究.兰州医学学报, 2001, 30 (3) :20-22.