蜂胶的指纹图谱研究

蜂胶的指纹图谱研究（共11篇）

蜂胶的指纹图谱研究 篇1

川牛膝为苋科杯苋属植物川牛膝 (Cyathula officinalis Kuan) 的干燥根, 是著名的川产道地药材之一, 具有逐瘀痛经, 通利关节, 利尿通淋的功效[1]。川牛膝始见唐代蔺道人的《仙授理伤续断秘方》。在功效上, 目前全国的一些权威著作一致认为“怀牛膝和川牛膝的功效基本相同, 但是前者偏于补肾强筋骨, 而后者偏于活血化瘀” [2]。现在药理学研究表明, 川牛膝不仅能活血化瘀, 还有很好的调节免疫系统功能的作用。

目前国内对川牛膝的研究主要集中在其化学成分及药理研究方面, 缺乏综合评价药材品质的方法和标准, 且川牛膝在长期的应用和栽培的过程中, 种内产生很大的变异, 出现伦理较多的类型, 同时由于加工、储存等方法的不同, 药材质量存在较大的差异, 造成目前药材质量不稳定和市场药材质量无法评价的局面。本研究通过采用HPLC法建立川牛膝药材指纹图谱, 为控制川牛膝药材的综合质量提供参考依据。

1 试验材料、试药、试剂与仪器

1.1 试验材料、试药、试剂

川牛膝药材:经成都中医药大学峨眉学院王书林教授鉴定为苋科植物川牛膝 (Cyathula officinalis Kuan.) 的干燥根, 符合2005年版《中国药典》规定, 见表1。

对照品:杯苋甾酮 (cyasterone) 由四川省中医药研究所提供。试剂:甲醇 (色谱纯) , 水为重蒸水, 其它试剂均为分析纯。

1.2 仪器

Waters2996-2695型高效液相色谱仪;Waters Empower化学工作站;KQ3200型超声波清洗器 (40KHZ, 120W) , 昆山市超声仪器公司;BP-211D型电子分析天平 (Max:210g, d=0.1mg) , 北京赛多利仪器系统有限公司) 。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱:Symmetry® C18 (5μm, 4.6×250mm, Waters公司) ;流动相:甲醇-水二元梯度洗脱, 如表2;流速:0.9ml/min;柱温:35℃;检测波长:266nm;进样量:20μl;运行时间:35min。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备

取杯苋甾酮对照品适量, 精密称定, 加甲醇制成每1ml含60μg溶液, 即得。

2.2.2 样品溶液的制备

取川牛膝药材细粉 (批号7#) 5g (过四号筛) , 精密称定, 置于100ml锥形瓶中, 精密量取甲醇50ml, 振摇, 回流提取1h, 放冷, 加甲醇补足损失的重量, 摇匀, 水浴挥干, 残渣加甲醇使溶解, 定容至10ml, 0.45μm微孔滤膜滤过, 取续滤液, 即得[3,4,5,6]。

2.3 方法学考察

2.3.1 精密度试验

精密吸取对照品溶液20μl, 重复进样5次, ≥5%总峰面积的各共有峰相对峰面积的RSD在1.3263%～2.1634%之间, 表明精密度良好。

2.3.2 重复性试验

取同一批次的川牛膝药材6份, 按上述样品测定方法分别测定, ≥5%总峰面积的各共有峰相对峰面积的RSD在2.3013%～2.8706%之间, 表明方法重现性良好。

2.3.3 稳定性试验

取同一供试品溶液, 分别在0, 2, 4, 8, 12, 24h分别进样20μl, ≥5%总峰面积的各共有峰相对峰面积的RSD在2.1181%～2.5066%之间, 表明样品在24h内稳定。

2.4 指纹图谱相似度分析

2.4.1 共有峰的标定

根据18批次供试品测定结果所给出的峰数, 对峰值和峰位等相关参数进行分析、比较, 川牛膝药材高效液相色谱可分离出20多个色谱峰, 经与杯苋甾酮对照品对照, 并比较所有记录的色谱图, 选取11个共有峰作为指纹图谱的特征峰, 其中9号峰为杯苋甾酮。

2.4.2 共有图谱模式的建立

根据《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求 (暂行) 》, 以参照物峰 (S) 的相对保留时间和相对峰面积为1, 计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。杯苋甾酮为川牛膝药材中的主要有效成分, 且其峰面积在图谱中相对较大, 保留时间适中, 故选择杯苋甾酮为参考峰 (S) , 以其保留时间和峰面积为1, 计算各样品共有峰的相对保留时间和相对峰面积。

2.4.3 图谱相似度分析

根据18批样品的相对保留时间及指纹图谱的整体谱峰特点对峰进行匹配, 以相对方面积的平均值建立共有模式, 见图2, 以相关系数法对样品的相似度进行评价, 各样品相似度结果见表3, 结果表明, 大多数样品之间相似度良好, 都达到0.90以上, 平均相似度为0.906。

3 讨论

本课题首次将HPLC法运用到川牛膝药材的鉴定与质量评价中, 能更加有效地解决药材化学成分的多样性与复杂性的质量评价技术难题。本实验采用二极管阵列检测器对指纹图谱的检测进行了选择, 结果表明在检测波长266nm处, 色谱图所包含的信息量更大。从相似度分析结果来看, 18批川牛膝药材相似度均在0.9以上, 表现出良好的相似性。在川牛膝药材指纹图谱的共有特征峰中, 整体分离度较好, 能充分反映出川牛膝药材醇溶性物质的化学成分特征, 可用于川牛膝药材鉴定及内在质量评价。在本实验建立的川牛膝药材指纹图谱分析方法中, 杯苋甾酮的保留时间适中, 与相邻色谱峰达基线分离, 分离度良好。

本实验所建立的方法, 精密度、稳定性和重复性均符合指纹图谱研究的技术要求, 为进一步制订川牛膝质量评价标准提供了科学依据。

摘要：目的:采用HPLC法构建川牛膝药材的化学指纹图谱。方法:采用Waters2695高效液相色谱仪, 色谱柱为Symmetry (C18 (5μm, 4.6×250mm, Waters公司) ;流动相为甲醇-水二元梯度洗脱;流速为0.9ml/min;柱温为35℃;检测波长为266nm。结果:测定基地产及市场上流通的样品共18批次, 标示了11个共有峰, 其指纹图谱相似度均在0.9以上, 指纹图谱整体面貌基本一致。结论:该方法简便、快速、准确、重现性好, 为川牛膝药材的定性鉴别和药材内在质量评价提供了依据。

关键词：川牛膝,指纹图谱,HPLC

参考文献

[1]中华人民共和国卫生部药典委员会.中华人民共和国药典 (一部) [S].北京:人民卫生出版社, 2005:26.

[2]《全国中草药汇编》编写组.全国中草药汇编 (上册) [M].北京:人民卫生出版社, 1996:217～229.

[3]陈幸, 黎万寿, 朱久武.等.RP-HPLC法测定川牛膝中杯苋甾酮的含量[J].重庆中草药研究, 1999, (40) :69～71.

[4]马英, 毕开顺, 王玺等.HPLC法测定川牛膝中杯苋甾酮的含量[J].中草药, 2000, 31 (6) :427～428.

[5]黎万寿, 陈幸, 李彬.等.正交法优选酒炙川牛膝最佳炮制工艺[J].现代中药研究与实践, 2005, 19 (4) :54～56.

[6]黎万寿, 陈幸, 李彬.等.正交法优选盐炙川牛膝最佳炮制工艺[J].时珍国医国药, 2005, 16 (12) :1205～1206.

蜂胶的指纹图谱研究 篇2

【摘 要】 目的：建立紫金龙药材HPLC指纹图谱分析方法，为紫金龙药材的质量评价提供依据。方法：采用RP-HPLC色谱法，Inertsil ODS-SP（4.6mm×150mm，5μm）色谱柱，以甲醇-0.2%磷酸水溶液（三乙胺调pH为7.0）为流动相梯度洗脱，柱温35℃，流速1.0ml/min，检测波长采用波长切换，0～40min为230nm，40～90min切换至285nm，进样量10μl；数据使用中药色谱指纹图谱相似度评价系统研究版（2012A） 进行处理。结果：在选定的色谱条件下确定10个峰构成紫金龙药材的特征共有峰，各批次药材均具有上述特征，但特征峰的相对含量分布差异导致色谱概貌存在一定差异。结论：该方法简便、精密度高、重现性好，可为紫金龙药材的质量评价提供依据。

【关键词】 白族药；紫金龙；特征图谱；HPLC

【中图分类号】R284.1 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2016）04-0001-03

Abstract：Objective To establish the HPLC fingerprint of Dactylicapnos scandentis radix and to research the quality of Dactylicapnos scandentis radix.Methods The gradient elution and multiple wavelength mode was applied in chromatographic separation，and chromatographic fingerprint similarity evaluation software（2012A） was used to analyse data.Results 10 peaks were identified as the characteristic fingerprints of Dactylicapnos scandentis radix. All samples tested contained the same 10 peaks， but the content of each peak showed great difference among the samples，which resulted in the differences on their chromatograms.Conclusion This method is simple，accurate with good reproducibility，and can be used for the quality control of Dactylicapnos scandentis radix.

Keywords：Traditional Bai Medicine；Dactylicapnos Scandentis Radix；Fingerprint；HPLC

白族药滋坚伦（白语：Zixjieilht）为罂粟科植物紫金龙Dactylicapnos scandens （D.Don） Hutch.的根，别名串枝莲、碗豆七，夏秋采集其根，晒干后入药。其味苦、性凉，有毒，具有消炎、止痛镇痛、止血、降压的功效，白族民间用于胃痛、神经性头痛、牙痛、外伤肿痛、外伤出血、高血压等。在我国西南地区民间广泛用于牙痛、神经性头痛、胃痛和止血，临床表明具有较好的镇痛作用[1-5]。紫金龙含有多种生物碱，主含普罗托品、异紫堇定等[6-8]。中药材指纹图谱是近年来被国际公认的控制中药或天然药物质量的有效方法，其优点在于较全面反映中药复杂的化学成分及其相对比例。研究采用反相高效液相色谱法建立紫金龙药材的特征指纹图谱，为该药材的质量评价提供依据[9]。

1 仪器与材料

1.1 仪器 安捷伦1200高效液相色谱仪（包括自动进样器、DAD紫外检测器、HP 色谱工作站等）；GWA-UN2-C30纯水器；CQ-250超声波清洗仪；岛津AND GH-252电子天平。

1.2 材料 紫金龙药材经大理州食品药品检验所杨怀镜主任药师鉴定为罂粟科植物紫金龙Dactylicapnos scandens（D.Don）Hutch.的干燥根，所测样品见表1；原阿片碱（批号：110853-200402，中国药品生物制品检定所）；近视乐眼药水（市场抽样合格制剂）；甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱为Inertsil ODS-SP（4.6mm×150mm，5μm）；流动相A相为0.2%磷酸水溶液（三乙胺调pH为7.0），B相为甲醇，梯度洗脱，见表2；柱温：35℃；流速：1.0ml/min；检测波长：0～40min波长为230nm，40～90min切换至285nm；进样量：紫金龙（1～12）进样10μl，原阿片碱对照品进样5μl，近视乐眼药水参照物溶液进样5μl。

2.2 对照品溶液制备 精密称取原阿片碱对照品5.46mg置10ml量瓶，加甲醇定容至刻度，摇匀，微孔滤膜过滤后作为对照品溶液，进样5μl，见图1；取近视乐眼药水2ml用水稀释至50ml的容量瓶中，摇匀，微孔滤膜过滤后作为参照物溶液进样5μl，记录色谱图，见图2。

2.3 供试品溶液制备 精密称取60℃干燥至恒重的紫金龙粉末2g（过40目筛），置具塞锥形瓶中，加入氨水将其润湿，放置30min，加甲醇和氯仿（1∶1）混合溶液20ml，超声提取30min，放冷后，滤过，蒸干，残渣用甲醇分次溶解，转移至10ml量瓶中并稀释至刻度，摇匀，用0.45μm微孔滤膜过滤后进样10μl，记录色谱图，见图3。

中药材指纹图谱的研究概况 篇3

关键词：中药材,指纹图谱,研究进展

中药指纹图谱已作为一种重要的中草药质量控制技术,它是指通过对中药材、中药材提取物或中药制剂等采用一定的处理方法和分析手段,得到的能够标示其化学特征的色谱图或光谱图。中药指纹图谱的研究已经从测定方法、构建模式等等多方面进行了较深入的研究,在建立中药化学成分系统研究模式、评价中药材、中药材中间品以及中药制剂质量的真实性、安全性、优良性和稳定性等方面表现出很好的作用,逐步成为一种药材或成药新的质量控制的手段和方法。目前,对中药材指纹图谱的研究较多,本文就中药材指纹图谱的建立方法等进行了较全面的综述。

1 DNA指纹技术在中药材鉴别中的应用

随着DNA鉴别技术如DNA指纹技术、PCR指纹分析法等的发展和应用,指纹图谱技术也逐步发展起来,中药材中均含有蛋白质、核酸等生命物质,因而DNA指纹技术成为中药材的鉴定有效手段之一。马小军等[1]采用扩增酶切片段多态性(AFLP)方法研究5种农家类型,结果5种人参农家类型多态位点仅46%,说明各农家类型之间的遗传差异性很小,但长脖的AFLP有相对较高的多态性,说明长脖类型内部有更多的杂合态个体,更接近野生人参;同时,他们[2]分析山参遗传多样性及其遗传特性,采用随机扩增多态DNA(RAPD)标记方法对7个来源地不同的山参和1个园参样品进行遗传多样性检测和遗传分析,结果用14个10mer寡聚核苷酸引物共检测111个位点,其中多态位点76个,占67.6%,远大于园参内的遗传变异,因此山参在人参育种上有很大利用价值。聚类分析表明,山参之间及其与园参之间的遗传变异,没有超出与近缘种西洋参之间的遗传差异;遗传因素在人参形态变异上的作用小于环境因素,这一结果为“山参”的培育提供了理论依据。王培训等[3]采用随机扩增引物DNA(RAPD)法,筛选适于鉴别南、北五味子的随机引物,结果总共筛选了80条随机引物,得到一条引物S429能准确区分南、北五味子,并且其重复性非常高,可利用随机引物S429通过RAPD准确区分南、北五味子。

2 高效液相色谱法(HPLC法)构建中药材指纹图谱的应用

高效液相色谱法法因其分离效能高、速度快等特点已成为指纹图谱应用最多的分析方法,同样也广泛应用于中药材指纹图谱的建立。张聪等[4]对同一组中国红参和高丽红参进行指纹谱(HPLC FPS)比较研究。刘丽娟等[5]研究了不同来源的刺五加药材,采用HPLC指纹图谱分析法,建立3个刺五加药材样品的指纹图谱。陈蕴等[6]采用HPLC法分析检测8个蝎毒样品,结果获得了蝎毒的指纹图谱。周晓英等[7]用高效液相色谱法建立红花的指纹图谱分析方法。潘馨等[8]应用RP-HPLC(DAD)对三七药材进行指纹图谱研究,该方法简便,重现性好,对三七的质量控制有很好的实际应用价值。

3 气相色谱法(GC法)构建中药材指纹图谱的应用

GC法也同样因为具有分离效能高、速度快等特点,尤其适用于含有挥发性成分中药材的分析。近来的研究中,GC法常与MS法联用用于中药和中药材的指纹图谱构建。高广慧等[9]建立了羌活挥发油指纹图谱测定方法,为含羌活中药制剂制定指纹图谱奠定基础,采用水蒸气蒸馏法提取不同产地羌活的挥发油,用毛细管气相色谱技术测定指纹图谱(GC FPS),选用聚类法分析比较,结果该方法灵敏度高,稳定性、重现性的RSD<3%,该气相色谱指纹图谱分析法与聚类分析可作为羌活药材的质量控制方法。魏刚等[10]采用GC-MS法对不同采集期石牌藿香,以及同基地栽培的高要、湛江藿香挥发油进行主成分比较分析,结果以11个主要共有峰为评价指标,GC-MS色谱条件的精密度、稳定性、重现性良好,固定产地的石牌藿香稳定性好,不同采收期主成分基本相同,其中广藿香酮的含量随种植时间的延长而明显增高,与同地栽培的高要、湛江藿香相比,广藿香酮、广藿香醇等含氧组分以及不含氧的倍半萜烯类主成分的相对含量均有明显差异,从而建立了石牌广藿香挥发油GC-MS分析色谱条件,初步拟定了石牌藿香挥发油特征指纹图谱指标成分群,阐明石牌藿香的道地特性。叶崇义等[11]采用程序升温毛细管气相色谱法,分析挥发油成分,建立了术类药材气相色谱保留指数(GC-RI)指纹谱,并根据色谱峰的重叠率和含量特征图分析对比,以此对术类药用植物种缘关系进行探讨,试图为生药品种鉴定、内在质量评价及药用植物分类学研究开辟一条新途径。

4 核磁共振法(NMR法)构建中药材指纹图谱的应用

秦海林等[12]对苦皮藤的1HNMR指纹图进行解析,采用硅胶柱色谱法分离苦皮藤根皮CGEA的化学成分,鉴定单体化合物的结构并对其进行1HNMR研究,结果不同来源的苦皮藤样品,其1HNMR指纹图有很好的重现性和高度的特征性,说明苦皮藤根皮的1HNMR指纹图可用于其基源鉴定,并主要显示了以上3个化合物的特征共振信号。王思宏等[13]研究长白山地区野生和栽培高山红景天核磁共振特征图谱,采用赵天增总提取物通用方法,用液-质联机作比较,同时以长白红景天作对比,结果采用赵天增总提取物通用方法,薄层层析后都可以得到有效成分红景天苷特征明显的核磁共振特征图谱,长白红景天有效成分红景天苷特征不明显的核磁共振特征图谱,根据野生和栽培高山红景天核磁共振特征图谱,可以成为高山红景天真伪鉴别的依据。

5 红外光谱法(IR法)构建中药材指纹图谱的应用

倪力军等[14]提出简便易行的对指纹图谱间相似程度进行量化评价的方法并开发用户友好的应用软件,对9个丹参提取物的红外图谱的相似度分析结果与实际情况分析其红外指纹图谱。结果红外图谱之间有很好的相似程度。周红涛等[15]首次运用傅里叶变换红外光谱技术对不同产地芍药根部的混合化学体系进行了全组分快速分析,对所获得的指纹图谱进行特征峰指认和对比分析,结果赤芍野生品与栽培品的红外吸收频率、吸收峰的相对强度都存在比较大的差异,多伦赤芍(道地药材)的红外吸收峰形状也有一定的特异性。

6 其他方法构建中药材指纹图谱的应用

目前,其他一些方法如薄层扫描法(TLCS)、高效毛细管电泳法(HPCE)等也应用到中药材的指纹图谱的研究中,还有一些是多种方法的综合应用。

王东等[16]为鉴别生熟地黄及考察熟地黄饮片质量的稳定性和一致性,建立了薄层色谱指纹图谱,采用乙酸乙酯∶丙酮∶甲酸∶水(3∶5∶1∶1)为展开剂,苯胺-二苯胺-磷酸溶液为显色剂,85℃加热至斑点显色清晰,色谱图谱及全通道扫描结果显示10批清蒸和10批酒炖样品间的相似程度较高,饮片质量比较均一、稳定,薄层色谱方法操作简单,图谱特征明显,可比性强,是一种可以快速鉴别药材真伪及考察药材质量是否稳定、一致的有效手段。

林文津等[17]建立了中药枇杷叶的高效毛细管电泳(HPCE)指纹图谱,采用正丁醇超声提取法制备品种、批次不同的枇杷叶供试液,以熊果酸对照品为内参考物,运用高效毛细管区带电泳法测定指纹图谱,并用相似度评价软件分析其相似度,结果所测定的13个品种枇杷叶样品,其指纹图谱相似度0.9以上有11个,0.9~0.8之间1个,0.8~0.7之间1个,指纹图谱整体面貌基本一致的,所建立的枇杷叶高效毛细管电泳指纹图谱稳定、可靠,可作为枇杷叶的特征指纹图谱。

苏娴等[18]建立了黄芪的RRLC/UV-MS指纹图谱分析方法,采用Agilent Zorbax Extend C18色谱柱(2.1 mm×100mm,1.8μm),以乙腈-0.1%甲酸为流动相进行梯度洗脱,流速0.3 m L.min-1,进样量0.5μL,柱温30℃,检测波长254 nm,结果建立了黄芪药材RRLC UV-MS指纹图谱分析方法,对11批样品进行了分析,其相似度均达到0.92以上。

7 构建中药材指纹图谱模式的研究

指纹图谱标准模式构建方面,有根据不同的方法构建指纹图谱的识别模式,都具有一定的可行性和科学性,而这些标准模式的建立正催化规范的、广泛适用的标准指纹图谱模式的出现。

尚刚伟等[19]提出中药“指纹-药剂学”方法论,意在为中药现代化提供一种具科学性、先进性、可行性及实用性的方法,在中药的研究过程中,采用现代科学方法和分离分析手段,在药物(复方、单方)、有效成分群和有效成分三个层次上进行研究工作,密切结合药效学研究与临床。

余杰等[20]提出研究中药材质量分析与评价的新方法,运用科学计算可视化原理,建立了仪器分析数据可视化技术,通过主成分分析和空间投影变换方法对药材的红外光谱分析数据进行预处理,实现特征提取和高维数据空间的降维,进而采用二维灰度图对变换后的数据进行可视化处理,获取中药材质量的特征指纹图谱,对野生、栽培桑白皮及其伪品共42个样品进行了测定,结果表明样品鉴别的准确率达到90.5%,从而说明该方法是一种具有重要发展意义的中药材质量鉴定新技术。

安金兵等[21]针对中药色谱指纹图谱中色谱峰面积值存在较大变异性的问题,从拟分布函数的角度介绍了一种新的分析方法,采用秩变换将色谱峰面积值转化为相对秩次,然后通过一系列变换将原数据转换成拟分布函数的形式,再利用柯尔莫哥洛夫检验实现不同类别样品的色谱指纹图谱之间的相似性分析,通过对北马兜铃和南马兜铃样品的比较,说明了该方法有较好的灵敏度和稳健性。

蜂胶的指纹图谱研究 篇4

利用随机多态扩增DNA(RAPD)分子标记对53个墨西哥落羽杉无性系的研究表明:31个随机引物共扩增出了241条谱带,其中118条谱带在无性系间呈现多态性,多态位点占48.96%;用POPGENE软件对无性系进行遗传分析,得出无性系间的`遗传距离为0.271～0.537,说明无性系间的遗传差异相对较大.通过聚类分析将53个优良无性系分为两大类,同时利用RAPD分子标记构建了53个无性系的指纹图谱,可对墨西哥落羽杉优良无性系进行区分和鉴定.

作 者：周玉珍 李火根 张燕梅 滕士元 黄敏仁 ZHOU Yu-zhen LI Huo-gen ZHANG Yan-mei TENG Shi-yuan HUANG Min-ren  作者单位：周玉珍,ZHOU Yu-zhen(北京林业大学园林学院,北京,100083;吴江苗圃有限公司,江苏,苏州,215222)

李火根,张燕梅,黄敏仁,LI Huo-gen,ZHANG Yan-mei,HUANG Min-ren(南京林业大学森林资源与环境学院,江苏,南京,210037)

蜂胶的指纹图谱研究 篇5

关键词：紫杉醇;提取方法;HPLC检测;曼地亚红豆杉

中图分类号： R284.2 文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2015）04-0296-03

收稿日期：2014-05-11

基金项目：江苏省农业科技自主创新基金[编号：CX（12）2014]。

作者简介：李乃伟（1983—），男，山东聊城人，硕士，助理研究员，主要从事生物技术研究。E-mail：linaiwei8828@163.com。

紫杉醇是红豆杉属（Taxus）植物特有的药物成分，在植物体中含量很低，并与多种类似物共存，而且提取时常带有很多色素、树胶等杂质。得率高、重复性好的提取方法和高效液相色谱（HPLC）检测方法，是进行紫杉醇含量调控研究的首要条件。目前，已有很多关于紫杉醇提取纯化的报道[1-4]，然而，这些方法适用于检测纯度较高的紫杉醇成品和半成品，在产业化生产中应用时存在一定缺陷。国内紫杉醇提取往往采用粗提方法，而不采用成本太高的工艺程序。笔者比较了不同提取方法和不同色谱条件对紫杉醇粗提液HPLC检测的影响，以期筛选一种简便提取、精确检测紫杉醇的方法。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料为江苏省中科院植物所（南京中山植物园）实验苗圃内引种栽培的曼地亚红豆杉。11月取样，采取当年生枝条，置于40 ℃烘箱7 d。烘干后粉碎，置于干燥器中密闭保存。

1.2 药品与试剂

紫杉醇提取所用试剂均为分析纯，HPLC检测所用紫杉醇对照品购自安徽尔塔医药科技有限公司。标准品用甲醇溶解，配成浓度为0.12 mg/mL的溶液。

1.3 提取方法

采用4种不同方法提取样品材料中的紫杉醇。 （1）精确称取样品5 g，甲醇回流（70 ℃）提取3次：第1次，100 mL甲醇，2 h;第2次，50 mL甲醇，1 h;第3次，50 mL甲醇，1 h。将浸提掖浓缩至100 mL后，加等体积正己烷，萃取4次，每次100 mL，然后，取甲醇相浓缩定容至25 mL。 （2）提取过程同方法（1），在正己烷萃取除杂后进行C18过柱处理，进一步除杂。 （3）提取过程同方法（1），用水代替甲醇浸提，回流温度为100 ℃，用三氯甲烷代替正己烷进行萃取。 （4）提取过程同方法（3），在三氯甲烷萃取除杂后进行C18过柱处理，进一步除杂。

1.4 紫杉醇HPLC检测条件

采用以下3種方法对紫杉醇粗提液进行HPLC检测的比较。 （1）参照王文芝的HPLC方法[5]改进。采用Agilent-1100高效液相色谱仪，DAD监测器，检测波长为228 nm。选用Kromasil ODS-C18分析柱（250×4.6 mm，5 μm），柱温 30 ℃，流速0.8 mL/min，流动相梯度条件：乙腈 ∶ 水（0.4%磷酸液，pH值3.5）为48 ∶ 52。 （2）完全参照美国药典中的HPLC方法[6]。采用Agilent-1100高效液相色谱仪，DAD监测器，检测波长为227 nm。选用五氟苯基Curosil-PFP分析柱（250×4.6 mm，5 μm），柱温30 ℃，流速 2.6 mL/min。流动相梯度条件，梯度洗脱：0～35 min保持乙腈-水（体积比35 ∶ 65）;35～60 min乙腈从35%升至80%，水从65%降至20%;60～70 min乙腈从80%降回35%，水从20%升回65%;70～80 min，保持乙腈-水（体积比35 ∶ 65）。 （3）参照美国药典的HPLC方法进行改进，采用Agilent-1100高效液相色谱仪，DAD监测器，检测波长为227 nm。选用Curosil-PFP分析柱（250×4.6 mm，5 μm）;柱温30 ℃;流速2.6 mL/min。流动相梯度条件：0～35 min保持乙腈-水（体积比30 ∶ 70）;35～60 min乙腈从30%升至50%，水从70%降至50%;60～61 min乙腈从50%降回30%，水从50%升回70%;61～70 min，保持乙腈-水（体积比30 ∶ 70）。

2 结果与分析

2.1 不同提取方法对紫杉醇HPLC检测的影响

采用王文芝的HPLC改进方法，对不同方法提取的紫杉醇粗提液进行检测。图1至图4为不同方法的紫杉醇粗提样品HPLC图谱。从各图谱中紫杉醇峰面积的大小可以看出，通过甲醇/正己烷萃取的紫杉醇得率（图2、图3）明显高于氯仿/水（图4、图5）提取得率。过柱除杂（图3、图5）与未过柱（图2、图4）的紫杉醇提取方法，对HPLC检测结果影响并不显著。

2.2 不同检测方法对紫杉醇HPLC检测的影响

对通过正己烷/水萃取的未过柱紫杉醇粗提样品，进行3

种不同条件的HPLC检测。图6至图11显示了不同检测方法对样品分离与峰形的影响。3种方法中，参照王文芝的HPLC方法进行改进的HPLC检测图谱（图7），各样品分离效果最差。参考美国药典的HPLC检测图谱（图8、图9），各样品分离度高，但进样速度过大，柱压太高对分析柱损伤很大。改进后的美国药典HPLC检测方法，流速降低，柱压减小，检测图谱（图10、图11）显示，虽然出峰时间延迟，但峰形及分

nlc202309051143

离度未受影响。采用C18分析柱检测的紫杉醇峰面积大于采用五氟苯基Curosil-PFP分析柱检测的峰面积（即美国药典HPLC方法及其改进方法），但是前者图谱（图7）的紫杉醇临近峰数量少于后者（图11）。推测原因是，采用C18分析柱检测的方法分离度低，检测出的紫杉醇峰可能为重叠峰，该色谱条件下无法分开一些与紫杉醇结构相似的化合物。而五氟苯基分析柱及梯度洗脱，可以将化合物结构相近的重叠峰分开。

3 结论

通过对不同提取方法与检测方法的比较，筛选出曼地亚红豆杉枝叶粗提紫杉醇的方法为：甲醇回流（70 ℃）提取3次：第1次，100 mL甲醇，2 h;第2次，50 mL甲醇，1 h;第3次，50 mL甲醇，1 h。将浸提液浓缩至100 mL后，加等体积正己烷，萃取4次，每次100 mL，然后，取甲醇相浓缩定容至 25 mL。色谱条件为：采用Agilent-1100高效液相色谱仪，DAD监测器。选用五氟苯基Curosil-PFP分析柱（250×4.6 mm，5 μm）;柱温30 ℃;流速2.6 mL/min;检测波长为227 nm。0～35 min保持乙腈-水（体积比30 ∶ 70）;35～ 60 min 乙腈从30%升至50%，水从70%降至50%;60～ 61 min 乙腈从50%降回30%，水从50%升回70%;61～ 70 min，保持乙腈-水（体积比30 ∶ 70）。该提取方法和检测条件可以用在栽培红豆杉紫杉醇的含量调控研究中。

参考文献：

[1]阎家麒，范金城，王九一. 紫杉醇提取纯化工艺[J]. 中国医药工业杂志，1996，27（12）：531-534.

[2]张志强，田桂莲，冯小黎，等. 从红豆杉树皮浸膏中提取紫杉醇初分离工艺的研究[J]. 中国生化药物杂志，1999，20（2）：58-61.

[3]李春斌，佟憬憬，范圣第. 东北紅豆杉紫杉醇的提取纯化与HPLC检测[J]. 大连民族学院学报，2005，7（5）：22-25.

[4]乔亮杰，满瑞林，倪网东，等. 曼地亚红豆杉枝条中紫杉醇的提取纯化研究[J]. 中国中药杂志，2009，34（8）：973-976.

[5]王文芝. 西藏红豆杉中紫杉醇及相关紫杉烷含量的高效液相色谱分析[J]. 色谱，1997，15（3）：76-78.

[6]The United States Pharmacopeial Convention Inc. United States pharmacopeia/national formulary：USP28-NF23[M]. Philadelphia，USA：National Publishing，2005：1456-1457.

中药指纹图谱技术的研究进展 篇6

1 指纹图谱技术的形成及发展

在19世纪末20世纪初,出现了“指纹”鉴定这个概念,最初指纹鉴定运用于法医和犯罪领域里,是根据每个人的手纹的结构有着绝对唯一的差别,来区分个体身份的。也因此“指纹”技术也成了当时一个标志性的词汇。后来随着仪器和分子生物学的快速发展,在生命科学的研究领域里也开始使用指纹分析技术来进行研究,之后发展了蛋白组学指纹分析技术,即利用种群和种群间的共性以及种群内部个体间的差异,来进行物种的鉴定的。随着技术的迅速发展,中药指纹图谱技术也应运而生。早在上个世纪70年代,就开始有学者用薄层色谱法指纹图谱技术对中药的定性鉴定分析进行了研究。发展到上世纪90年代的时候,《中华人民共和国药典》中很多中药品种都已经收录了用薄层色谱指纹图谱的方法用于其品种的鉴定,特别是薄层扫描仪、成像系统、自动点样器和数据处理系统的出现和发展更使得TLC指纹图谱的运用不在是幻想。到了21世纪,指纹图谱可以运用在生物、食品、环境、石油、化学等很多领域的研究中,特别是在中药和食品质量的控制方面,有时还结合一定的分子生物学的知识。有学者通过吸收面积和体积排阻色谱(高效液相色谱法)分离蛋白质组分面积的百分比值显示与品质性状显著相关性,说明质量特性与蛋白质的分子量分布的关联[2]。伴随着更多更新的仪器的出现和发展,中药指纹图谱技术开始向纵向快速发展,技术种类越来越多,应用范围越来越广。日趋完善的中药指纹图谱技术包括:TLC法指纹图谱技术、GC法指纹图谱技术、HPLC法指纹图谱技术、NMR法指纹图谱技术、XRD法指纹图谱技术、IR法指纹图谱技术、HSCCC法指纹图谱技术、HPCE法指纹图谱技术等。其中色谱法比较流行,而色谱法中的HPLC法应用最为广泛。

2 中药指纹图谱的国内外研究进展

2.1 国内研究进展

中药是多组分的复杂体系,化学成分种类丰富,同时又会受到中药品种,产地,运输,加工等诸多方面的影响,所以对中药及其制剂的质量控制的研究一直是中药及其制剂现代化和走向国际的瓶颈,一直是中药及其制剂研究的一个重中之重,同时也是一个难点。而中药指纹图谱技术现在是国际社会公认的用来鉴别中药品种和质量控制的最有效,最准确,最直接的方法手段。近年来,国内外医药相关领域为了解决中药的质量评价方面的问题,对中药指纹图谱技术进行了大量深入的研究,也取得了很多值得祝贺的成绩。杜程芳和屠鹏飞[3]以不同产地的白鲜皮药材为材料,运用反相高效液色谱梯度洗脱法建立了白鲜皮药材的HPLC指纹图谱,结果该指纹图谱可以用来评价白鲜皮药材的质量;王斌等人利用在SGE 30QC3石英毛细管柱优化色谱条件和分离测定条件的基础上建立了鱼腥草和金银花包括这两种中药的下游制剂鱼金注射剂的的挥发性成分GC指纹图谱,同时对其图谱的各共有峰进行了相似性评价,并对其中出现的问题进行了讨论[4]。石荣等以已经建立的大豆异黄酮HPLC指纹图谱的方法为研究方法,选择5个极性各异的代表样品,在不同的仪器上进行测定,研究了大豆异黄酮指纹图谱中保留时间飘移及其校正的工作[5]。魏刚研究利用气相色谱和质谱联用技术对石菖蒲的挥发油成分进行了指纹图谱的研究,得到了具有详细数据信号的特征性指纹图谱,并将其用到石菖蒲制剂的质量判断方面,同时还建立了广藿香挥发油的气相色谱与质谱联用的特征性指纹图谱[6]。杨东风等2007年建立了商洛GAP基地丹参水溶性和脂溶性成分的高效液相色谱指纹图谱,并对不同产地,西藏产丹参的指纹图谱进行了研究和比较,他所建立的丹参指纹图谱专属性强,能准确的反映丹参的真实质量,为GAP基地的建设和丹参的质量控制提供了参考[7]。梁倩发表的文献报道称已经用气相色谱建立了金银花的挥发油成分的指纹图谱,所建立的指纹图谱专属性和稳定性都较强,同时比较了不同产地的金银花指纹图谱的差异,为金银花的质量控制提供一些依据[8]。经过长期的研究发展,中药指纹图谱技术在中药质量评价方面的作用和地位得到了业界广泛的共识,是否能将指纹图谱技术用在中药的质量标准方面成为衡量一个企业是否有好的技术水平和好的管理水平的重要标志之一。

近年来,随着中药现代化和国际化的要求,国内对中药进行指纹图谱技术的研究范围越加广泛,越加深入成熟。截止目前已经建立了丹参、黄芪、天麻、三七等多种中药及其制剂的指纹图谱,尤其是建立了丹参的多元指纹图谱,更标志了中药质量控制的可控性已经达到中药现代化和国际化的要求,已经具有国际先进水平。

2.2 国外研究进展

目前,国外对植物药指纹图谱研究的成果较丰富,德国和法国最先将指纹图谱技术用到银杏叶标准制剂EGB761的质量标准里,该标准对总黄酮、总内酯、槲皮素以及异鼠李素以及它们之间的比例等内容都做出了明确规定,这让植物药在欧美的地位大幅度提高[9]。紧接着美国和加拿大的人参制剂也引入指纹图谱的方法对其原料药和标准提取物进行分析比较,从原料开始控制,以此来保证生产出来的人参制剂的品质,确保药品的稳定性,安全性和有效性。美国民间组织制定的美国草药药典(AHP)对已经流向市场的热点中药和植物药均进行了调查研究,制定了比较全面的,有较强参考价值的质量标准[10]。美国的FDA在植物药制品指导原则中也允许申报者可以提交产品的相关色谱指纹图谱的资料。英国草药典、欧共体草药质量指南和印度草药典都将指纹图谱用来鉴别草药的种类的真实和质量控制的一致。德国著名的生药学家Wagner教授已经建立了人参、黄芪等常用的不同产地的指纹图谱,为其质量控制提供科学的依据。Areias F M 2001年对葡萄牙北部产的薄荷叶中的酚类物质进行了研究,建立了其酚类物质的指纹图谱,结果说明薄荷叶的酚类物质的指纹图谱可以用来鉴别薄荷的不同种,同时可以真实的反应出薄荷的质量。Gulnur Toker 2001年通过对从葡萄籽中提取出的黄酮物质的指纹图谱的建立,说明黄酮指纹图谱可以用来控制葡萄籽提取物的质量[10]。随着技术的不断革新,中药指纹图谱技术的研究无论是国内还是国外,无论是在技术上还是在应用领域里都会有更好的发展,在将来也会有更多的技术手段被应用到中药指纹图谱的技术当中。S

参考文献

[1]王永刚,吴忠,魏凤环,方铁铮.中药指纹图谱研究的现状与未来[J].中药材,2003,26(11):820-825.

[2]Ohm J B,.Ross A S,Peterson C J,Morris C F.Relationships of Quality Characteristics with Size-Exclusion HPLC Chromatogram of Protein Extract in Soft White Winter Wheats[J].Cereal chemistry,2009,86(2):197-203.

[3]杜程芳,屠鹏飞.白鲜皮药材的指纹图谱研究[J].中国天然药物,2003,1(2):94.

[4]王斌,王燕,徐丹,梁振辉,孙文基.鱼金注射剂指纹GC图谱的研究[J].中成药,2004,25(4):365.

[5]石荣,王少云,侯准,桑立红.大豆异黄酮指纹图谱中保留时间漂流的校正研究[J].色谱,2006,24(1):65.

[6]魏刚.广藿香GC-MS特征指纹图谱’数字化”在药材鉴定中的应用模式研究[J].中成药,2007,29(3):322.

[7]杨东风.丹参药材HPLC指纹图谱及其质量评价的研究[D].西北农林科技大学,2007:14-50.

[8]Liang qian,Liang zong suo.Essential oil composition of salvia miltiorrhiza flower[J].Foal chemistry2009,113,592-594.

[9]戴玉梅.中药指纹图谱技术发展概况[J].江西医药,2007,42(6):574-575.

苦碟子注射液指纹图谱的研究 篇7

关键词：苦碟子注射液,指纹图谱,高效液相色谱法,木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷

随着对中药注射剂的日益关注, 急需建立简便、实用、全面、有效的质量评价体系, 中药材从其化学成分角度来讲, 是一个具有多种结构类型成分的化合物库, 因此仅仅通过控制某一指标性成分的含量而评价成品的整体质量是不充分的。中药指纹图谱技术作为控制和评价中药材、半成品和成品质量的一个有效方法, 近年来成为中药质量控制研究的热点, 是国际上公认的控制中药材质量的有效手段之一。苦碟子注射液现行国家药品标准采用高效液相色谱法测定腺苷的含量, 其中重要的有效成分黄酮类, 仅采用紫外分光光度法测定了总黄酮的含量。根据文献报道, 苦碟子主要含有三萜、黄酮、倍半萜内酯、核苷、香豆素等成分, 其中木犀草素、芹菜素类成分, 具有明显扩张冠脉回流量及降低冠脉血管阻力的良好作用, 因此, 建立以黄酮类化合物为参照的指纹图谱方法, 可有效控制产品的内在质量, 具有良好的现实意义。苦碟子注射液的有效成分为黄酮类, 其中已确定为活性成分的木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷已分离出单体 (我所与企业合作) , 并确定了结构, 另外经查阅文献, 苦碟子中含有较多有机酸类成分, 故我所筛选了一些黄酮类和有机酸类对照品作为参照进行实验, 摸索建立以黄酮类化合物为特征峰的指纹图谱测定方法。

1 仪器与试药

岛津LC-20A高效液相色谱仪;色谱柱:Phenomenex Luna C18 (4.6×250mm) 。乙腈为色谱纯 (Fisher公司) ;磷酸为色谱纯 (Fisher公司) ;甲醇为色谱纯 (Fisher公司) 。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 参照物溶液的制备

取绿原酸、咖啡酸、阿魏酸、木犀草苷、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、菊苣酸对照品适量, 加50%甲醇制成每1ml各含0.05mg混合溶液, 即得。

2.1.2 标准提取物溶液的制备

取本品约0.1g, 置25ml量瓶中, 加50%甲醇溶解并稀释至刻度, 摇匀, 即得。

2.1.3 供试品溶液的制备

取样品30批, 华夏药业提供的小样4批 (编号100621hx、100622hx、100623hx、100624hx) , 作为供试品, 双鼎制药提供了企业自制的标准提取物 (简称标提物) 。供试品溶液的制备:取本品适量, 用0.45μm滤膜滤过, 即得。标准提取物制备:取约0.1g, 精密称定, 至25ml容量瓶中, 加50%甲醇至刻度, 摇匀, 作为标准提取物溶液。

2.2 色谱条件

色谱条件:色谱柱Phenomenex Luna C18 4.6mm×250mm, 5μm;流动相A为乙腈, B为0.4%磷酸溶液 (ml/min) , 按表1程序进行梯度洗脱, 流速0.9ml/min;检测波长为327nm;柱温40℃。

2.3 测定波长的选择

观察样品各个波长的色谱图, 在327nm的色谱图, 两个主峰的峰高均较高, 两峰比例适中, 检出的峰较多, 基线比较平整, 并且327nm为有机酸的最大吸收峰, 故选择327nm为测定波长。

2.4 方法学考察

2.4.1 精密度试验

取一份样品按照供试品溶液制备方法制备供试品, 在上述色谱条件下连续进样6次。结果共有峰相对保留时间的RSD值均小于2.0%, 相对峰面积比值均小于3.0%, 表明此方法精密度良好。

2.4.2 重复性试验

依供试品溶液方法平行配制6份供试品溶液, 在上述色谱条件下进行测定。结果表明, 各共有峰相对保留时间的RSD值均小于2.0%, 各共有峰相对峰面积的RSD值均小于3.0%, 表明本方法重复性良好。

2.4.3 稳定性试验

取同一份供试品溶液, 分别在0、2、4、8、12、24h进行测定。结果表明, 各共有峰相对保留时间的RSD值均小于2.0%, 各共有峰相对峰面积的RSD值均小于3.0%, 表明本方法稳定性良好。

2.5 指纹图谱测定

测定方法:精密吸取上述各类供测溶液, 注入高效液相色谱仪, 测定。

2.5.1 保留时间的匹配

取上述各类供测溶液的高效液相色谱图, 分析及统计, 结果在10~90min, 34批供试品共出峰13个, 80%以上样品所具有的峰规定为共有峰, 共有10个以此作为特征峰, 其中对照品相对应的有6个, 其余4个相对保留时间分别为0.184±1%、0.279±1%、0.40±1%、1.15±1%处。

2.5.2 相对保留时间匹配

以木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷为参比峰, 分别计算供试品、参照物、标准提取物中各峰与标准峰保留时间的比值 (相对保留时间) , 结果, 30批供试品和4批华夏小样匹配良好, 各特征峰的相对保留时间差距极小, 34批样品最小、最大值之差最大仅为0.003, 相同时间段的参照物、标准提取物的相对保留时间也在此范围内。对最小、最大值与均值之差相对于均值的百分率进行了统计, 最大偏移仅为1.087%。

3 结论

将供试品液相色谱图导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统 (2012.1版本) , 截取保留时间5~90min图谱, 以供试品指纹图谱为参照图谱, 设置全谱匹配参数为0 (即峰面积占总峰面积的0%以上的峰参加匹配) , 以2、8、9号峰多点校正, 全谱峰匹配, 时间窗宽度0.3, 原始图谱见图1, 匹配后图谱见图2, 生成对照指纹图谱。结果以参照图谱为对照, 相似度为0.826~0.998 (详见表2) , 以对照指纹图谱为对照, 相似度为0.919~0.998。

注:计算校正峰组数:0组, 时间窗:0.3, 生成对照图谱的方法:平均数

暂定供试品液相色谱图 (图3) 中, 以对照品液相色谱图 (图4) 为对照, 应检出绿原酸、咖啡酸、阿魏酸、木犀草苷、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、菊苣酸, 并且以木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷为标准峰, 分别在相对保留时间为0.184±1%、0.279±1%、0.40±1%、1.15±1%处检出峰。将供试品液相色谱图导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统 (2012版本) , 截取保留时间5~90min图谱, 设置全谱匹配参数为0 (即峰面积占总峰面积的0%以上的峰参加匹配) , 以2、8、号峰多点校正, 全谱峰匹配, 时间窗宽度0.1, 计算相似度, 不得低于0.90。

(3绿原酸, 5咖啡酸, 6阿魏酸, 7木犀草苷, 8木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷, 9菊苣酸)

参考文献

[1]彭缨, 张梅, 宋少江.抱茎苦荬菜药材中木犀草素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的分离与测定[J].沈阳药科大学学报, 2006, 23 (8) :518-520.

[2]袁汀, 刘蕊, 黄晓玲.苦碟子研究进展[J].实用药物与临床, 2004, 7 (4) :44.

玛咖HPLC指纹图谱研究 篇8

目前玛咖种植地广泛, 颜色众多, 市售产品混乱, 真伪产品难以区分, 且研究玛咖时缺乏活性成分对照品。玛咖与其他天然植物一样成分复杂, 中药指纹图谱技术能提供丰富的鉴别信息, 较为全面地反映植物药所含化学成分的种类与数量, 进而对药品质量进行整体描述和评价[4]。金文闻[5]对玛咖的红外指纹图谱、薄层指纹图谱以及气相指纹图谱进行了研究, 指出了其图谱特征。HPLC具有操作简便、图谱稳定性和可靠性高的特点, 采用其对玛咖进行分析目前尚未见报道。本试验以原产地秘鲁玛咖为对照, 研究了秘鲁、丽江、会泽、格萨拉 (四川攀枝花) 四个产地的HPLC图谱, 并与形态和功效与玛咖相似的植物材料 (圆根萝卜和西洋参) 进行对比, 初步建立玛咖的HPLC指纹图谱, 并在此基础上对市售无商标的10批玛咖进行指纹图谱分析。

1 材料与试剂

1.1 仪器

P200-高效液相色谱仪 (大连依利特分析仪器有限公司) ;SHIMADZU-UV-1700型紫外可见分光光度计 (日本岛津) , SY360超声波提取器 (上海宁商超声仪器有限公司) ;Millipore超纯水器 (美国MILIPORE公司) ;ESJ120-4电子天平 (沈阳龙腾电子有限公司) 。

1.2 药品与试剂

秘鲁黄玛咖购自上海中智科技应用发展公司 (秘鲁玛咖进口商) ;丽江黄玛咖购自丽江格林恒信生物科技开发有限公司 (产地丽江) ;会泽黄玛咖购自云南禾农食品开发有限公司 (产地会泽) , 格萨拉黄玛咖购自和润农业开发有限公司 (产地格萨拉) ;西洋参购自一心堂医药公司;圆根萝卜采自盐边县格萨拉乡农田。此外, 从昆明、成都、攀枝花市场上购买不同产地的商品玛咖。

色谱甲醇 (成都科龙化工有限公司) , 实验用水为超纯水, 其余试剂为分析纯 (成都科龙化工有限公司) 。

2 方法

2.1 供试品溶液制备

精密称取秘鲁、丽江、会泽、格萨拉黄玛咖, 西洋参和圆根萝各1g (过60目) , 加入甲醇30mL, 超声提取30min (40Hz, 40℃) , 共提取3次, 过滤, 定容至100mL。

2.2 色谱条件

色谱柱:CS-120-5-C18-AP (5μm, 4.6mm×50mm) ;流动相:甲醇-水 (25∶75) ;流速:0.8mL/min;柱温:25℃;检测波长:210nm;进样量:20μL;时间:30min。

2.3 实验方法建立

2.3.1 检测波长选择

分别以甲醇、95%乙醇、水为溶剂, 按照“2.1”项下提取秘鲁玛咖, 得到的溶液在紫外分光光度计上进行波长扫描, 对190~800nm范围内的色谱图进行分析比较, 结果在210nm波长下峰数最多, 峰型较好, 因此确定检测波长为210nm。

2.3.2 提取溶剂选择

以甲醇、95%乙醇、水为溶剂制备供试品溶液, 以“2.2”项下色谱条件进样测定。结果以乙醇为提取溶剂, 得到的指纹图谱各峰分离度差、基线不平稳。水为提取溶剂的指纹图谱峰数少;以甲醇为提取溶剂得到的峰数多、峰面积大, 各峰分离良好, 因而确定提取溶剂为甲醇。

2.3.3 流动相选择

笔者先以乙腈和水作为流动相, 不论如何调整比例, 均得不到个数较多的色谱图。换为甲醇和水后, 随水的比例增大, 色谱峰变多, 但峰型拖尾, 加入适量磷酸后峰型变好, 最后确定流动相为甲醇-水 (25∶75) , 磷酸调节pH=4.8。

3 方法学考察

3.1 精密度实验

取同一批秘鲁玛咖供试品溶液, 在“2.1”项下色谱条件下连续进样6次, 记录指纹图谱。结果表明各色谱峰相对保留时间RSD<0.2%, 相对峰面积RSD<1.7%, 符合指纹图谱的要求。

3.2 稳定性实验

取同一批秘鲁玛咖供试品溶液, 分别于放置0、2、4、8、12、24h后进样, 记录指纹图谱。结果表明各色谱峰相对保留时间RSD<0.2%, 相对峰面积RSD<3.0%, 表明供试品溶液在24h内稳定。

3.3 重现性实验

取同一批秘鲁玛咖供试品6份, 按照“2.1”项下制备方法, 分别制取供试品溶液, 进样测定指纹图谱。结果表明各色谱峰相对保留时间RSD<0.2%, 相对峰面积RSD<4.0%。

4 结果

4.1 玛咖指纹图谱共有峰、参照峰标定

按照上述优化的条件, 对6个样品提取液进样测定, 得到各自的指纹图谱, 见图1。将6个指纹图谱数据输入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统 (2004A版) 》, 确定玛咖共有峰18个, 其占总峰面积91.43%;4个玛咖样品的指纹图谱及图谱数据显示, 保留时间tR=12.46~12.50min的色谱峰 (标记为S) 为各种玛咖的共有峰, 也是区别于圆根萝卜和西洋参的特征峰;其中S峰面积最大, 与相邻色谱峰分离良好, 可作为玛咖的参照峰;结果还显示4种产地的玛咖指纹图谱相差不大。

4.2 相似度

计算各个样品的相似度, 数据处理采用Waters Pater Sach相似度软件, 计算原理为夹角余弦法[6]。以共有峰的峰面积计算相似度, 其中4个产地的玛咖相似度为95.5%~98.7%, 与西洋参和圆根萝卜的相似度相差很大, 可作为玛咖具有专属性的指纹图谱。

4.3 玛咖指纹条形码建立

由相似度计算结果可知:当以4个产地的玛咖样品共有峰面积均值为对照时, 4个玛咖样品的相似度均大于0.9, 表明整体上相似, 故可以4个样品共有峰为基础采用均值法建立玛咖的对照指纹图谱。绘制对照品指纹图谱时, 以参照峰S为基准, 以各共有峰的相对保留时间为横坐标, 以相应峰号的相对峰面积为纵坐标, 绘制玛咖对照指纹条形码, 见图2。

4.4 适用性考察

采用本试验优化的提取方法和测定条件, 结合建立的玛咖指纹条形码, 对市场上购买的10批产品进行检验, 结果见表1。由表1中可知, 一级和二级商品玛咖块根或切片, 无论是何种产地、何种皮色, 其相似度都在90%以上;四级黄玛咖块根和黄玛咖须根的相似度只有72.1~83.8%;玛咖叶的相似度只有65.3%;市场上的玛咖粉末相似度在80%以下。品质越好的玛咖相似度越高, 品质越差的玛咖和玛咖须根、玛咖叶的相似度越低。建议在质量标准中确定相似度阈值不低于80%为合格产品, 高于90%为优质产品。

5 讨论

有文献[7]报道了玛咖活性成分, 如玛咖酰胺、玛咖烯、生物碱等, 但因含量低, 目前尚缺乏活性成分对照品, 给玛咖质量标准研究带来困难。我国玛咖产业都致力于生产粗加工产品以获取短期利润, 目前市场充斥着大量以玛咖为原料的保健食品, 成分明确、疗效明显的玛咖深加工产品较少[8]。同时, 我国玛咖种植地广泛, 颜色众多, 厂家参差不齐, 市售产品混乱, 质量无法得到保证。因此玛咖质量标准建立尤为重要。

本试验对供试品溶液制备、色谱条件进行优化, 建立玛咖指纹图谱。结果表明, 玛咖指纹图谱中主要峰群整体一致, 与西洋参和圆根萝卜相差很大, 同时标定玛咖特征峰。以共有峰的峰面积计算相似度, 4个产地的玛咖相似度大于0.9, 表明不同产地的玛咖差异不大。本试验还考察了方法的适用性, 对市场上购买的10批产品进行检验, 根据结果建议玛咖等级的制定标准, 相似度>0.90可判定为优质玛咖, 相似度<0.80为不合格产品。

本试验首次建立的商品玛咖HPLC指纹图谱分析方法具有较好的精密度、稳定性和重复性, 符合指纹图谱研究的技术要求。同时标定的玛咖特征峰S附近杂峰少, 峰面积大, 纯度高, 下一阶段实验可进一步分离提取, 有望鉴定其结构, 制备标准品, 为玛咖质量标准建立提供依据。

参考文献

[1]OCHOA C, UGENT D.Maca (Lepidium meyenii Walp.;Brassicaceae) :A nutritious root crop of the central Andes[J].Economic Botany, 2001, 55 (3) :344-345.

[2]余龙江, 金文闻, 吴元喜, 等.玛咖的植物学及其药理作用研究概况[J].天然产物研究与开发, 2002, 14 (5) :71-74.

[3]肖培根, 刘勇, 肖伟.玛咖——全球瞩目的保健食品[J].国外医药·植物药分册, 2001, 16 (6) :236-237.

[4]李强, 杜思邈, 张忠亮, 等.中药指纹图谱技术进展及未来发展方向展望[J].中草药, 2013, 44 (22) :3095-3104.

[5]金文闻.药食两用植物玛咖 (Lepidium meyenii) 的功效物质研究[M].武汉:华中科技大学, 2006.

[6]刘欣, 胡芳弟, 封士兰, 等.大黄药材指纹图谱研究[J].分析测试技术与仪器, 2004, 10 (3) :140-144.

[7]余龙江, 金文闻, 李为.南美植物玛咖的研究进展[J].中草药, 2003, 34 (2) :7-9.

蜂胶的指纹图谱研究 篇9

目前, 对艾纳香药材的质量控制还没有形成系统的方法, 前期已有卫亚丽[7]、夏稷子[8,9]、方灿[10]等做了初步研究。本实验在参考相关文献的基础上, 以左旋龙脑为对照品, 采用毛细管色谱柱对不同时期采集的艾纳香药材中的挥发性油成分进行指纹图谱分析, 为其质量评价提供客观依据。另外, 应用中药色谱指纹谱相似度计算软件进行数字化处理, 使分析结果更加准确地反映不同批次药材间的内在质量差异。

1 仪器与试剂

GC-2010Plus型气相色谱仪 (日本岛津公司) , RTX-WAX色谱柱 (250℃, 30m×0.25mm×0.25μm) , HA-300氢空一体机 (北京宜丰瑞普科技有限公司) , 国家药典研制的中药指纹图谱相似度评价系统 (2004版) , TB-11型电子天平 (d=0.1mg, 美国denver丹佛) , 左旋龙脑 (美国Sigma公司, 货号为420247) , 石油醚 (60~90℃) 、甲醇、正己烷、乙酸乙酯等溶剂均购于广州化学试剂厂, KQ-300VDE超声波清洗器 (昆山市超声仪器有限公司) 。

实验所需艾纳香药材8批, 均采集于贵州省黔南州罗甸县。详见表1。

2 实验方法与结果

2.1 对照品溶液制备

精密称取左旋龙脑标准品0.10g, 用分析级乙酸乙酯完全溶解并定容至50mL, 配成质量浓度为2.0mg/mL的左旋龙脑对照品溶液, 过0.45μm有机滤膜, 待用。

2.2 供试品溶液制备

参考《中国药典》2015年第1部的方法[11], 精密称取2.0g原药材粉末 (过80目) , 置于50mL锥形瓶中, 精密加入25.0mL分析级乙酸乙酯, 超声提取30min, 冷却至室温后过滤, 于通风橱中挥干原溶剂, 最后使用5.0mL的乙酸乙酯对其复溶, 过0.45μm有机滤膜, 待用。

2.3 GC色谱条件

RTX-WAX色谱柱 (30m×0.25mm×0.25μm) , 升温程序:初始温度100℃, 以7℃/min升温至170℃, 再以3℃/min升温至200℃, 并保持20min, 共计40min, 进样量为0.6μL, 载气为高纯氮气 (≥99.999%) , 流速为1.0mL/min, 分流比10∶1, 检测器温度250℃, FID温度280℃。

2.4 方法学考察

2.4.1 精密度试验

取新制备的同一供试品溶液, 按“2.2”项下条件, 连续进样5次 (从上至下依次为1、2、3、4、5) , 记录各色谱图, 测定共有峰25个, 以左旋龙脑为参考峰, 计算各峰的相对保留时间和相对峰面积。结果表明, 各色谱峰的相对保留时间的相对标准偏差为0.05%~0.73%, 相对峰面积的相对标准偏差为0.78%~4.69%, 且各色谱图相似度均在0.99以上, 表明仪器精密度良好。

2.4.2 稳定性试验

取新制备的同一供试品溶液, 按“2.2”项下条件, 分别于0、2、4、6、8、24h时进样 (从上至下依次为1、2、3、4、5、6) , 记录各色谱图, 测定共有峰25个, 以左旋龙脑为参考峰, 计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果表明, 各共有峰的相对保留时间的相对标准偏差为0.01%~4.26%, 相对峰面积的相对标准偏差为1.53%~4.92%, 且各色谱图相似度均在0.99以上, 表明样品溶液在24h内稳定。

2.4.3 重复性试验

取S2 (20151201) 批次的艾纳香原药材5份, 按照“2.2”项下的方法制备供试液, 再按“2.3”项下条件依次进样 (从上至下依次为1、2、3、4、5) , 记录各色谱图, 测定共有峰25个, 以左旋龙脑为参考峰, 计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果表明, 各色谱峰的相对保留时间的相对标准偏差为0.02%~4.73%, 相对峰面积的相对标准偏差1.44%~4.87%, 且各色谱图相似度均在0.99以上, 表明此法的重复性良好。

2.5 GC指纹图谱建立

2.5.1 参照峰选择

据文献报道, 左旋龙脑是艾纳香药材挥发油中的有效成分, 在这8批次样品指纹图谱中, 其色谱峰分离度良好, 峰面积较大, 并且所有峰共有, 故将其定为参照峰, 以其色谱峰的保留时间和峰面积为参考, 计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。

共有峰的标定:采用国家药典委员会颁布的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统” (2004A版) 对8批不同时期采集的艾纳香药材GC指纹图谱进行分析, 以平均数法生成对照图谱, 时间窗宽度为0.10min, 共选择25个色谱峰, 对这25个色谱峰进行多点校正和自动匹配, 并确定这25个峰为艾纳香药材挥发性成分的共有峰。

2.5.2 指纹图谱相似度评价

将所得的8批艾纳香药材挥发性成分的GC图谱以AIA格式依次导入国家药典委员会研制的中药色谱指纹图谱相似度评价系统 (2004A版) , 以S2 (20151201) 批药材图谱作为参照图谱进行指纹匹配, 建立了艾纳香药材挥发性成分的气相指纹图谱, 见图4, 并进行了不同批次艾纳香药材挥发性成分的气相指纹图谱的相似度计算, 见表4、表5。

3 讨论

本实验选用了4种不同型号 (RTX-1、RTX-WAX、OP-TIMA-1、OPTIMAI-WAX) 毛细管柱进行分析比较, 结果以极性色谱柱RTX-WAX得到的色谱峰数目较多, 各峰基本都达到基线分离且分离度良好, 方法较稳定, 在40min内可使样品全部色谱峰流出, 符合指纹图谱的分析要求。因此选用该色谱柱作为艾纳香药材挥发性成分的气相指纹图谱分析的色谱柱。

本实验还考察了不同溶剂 (甲醇、乙酸乙酯、石油醚) 超声萃取原药材中的挥发性成分, 结果发现三种不同极性所萃取得到的挥发性成分种类分布有所不同, 甲醇和乙酸乙酯萃取成分种类基本一致, 但甲醇萃取所得极性成分含量稍高, 而乙酸乙酯萃取的中等偏下极性部分的成分含量较高;石油醚萃取所得整体成分含量都很低, 在保证原药材挥发性成分整体性的同时, 又兼顾各成分的高含量, 因此乙酸乙酯的提取效果最佳, 因此本实验选择乙酸乙酯为原药材供试液制备溶剂。

用中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版软件进行指纹图谱相似度的计算, 数据处理过程简便快速, 在定性对比多张色谱指纹图谱时具有优势, 为药材质量的评价提供了更可靠的依据。

从图5可知, 此次收集的8批药材, 共有峰的保留时间基本相似。从表5中各色谱图的相似度评价图中可知, S2、S7批次中某些成分在峰面积上表现出较大的差异, 而其他批次药材的图谱相似度都在0.90以上。因此不同时期采集的艾纳香药材含量上有一定的差异, 本实验建立的指纹图谱操作性强、信息量较大, 能够客观地反映出艾纳香原药材的质量, 可用于贵州艾纳香药材的鉴别与品质评价。

(min)

参考文献

[1]王远辉, 田洪芸, 何思佳, 等.不同方法提取艾纳香叶挥发性成分的气相色谱—质谱分析[J].食品工业科技, 2012, 33 (12) :97-105.

[2]王嵩, 赵永恒, 周毅生, 等.艾纳香的研究进展及其研究价值探讨[J].中国现代中药, 2014, 16 (11) :953-956.

[3]庞玉新, 胡雄飞, 王凯, 等.艾纳香叶片干燥前后的左旋龙脑含量比较[J].中国药房, 2014, 25 (39) :3673-3675.

[4]郝小燕, 余珍, 丁智慧.黔产艾纳香挥发油化学成分研究[J].贵阳医学院学报, 2000, 25 (2) :121-122.

[5]许碧莲, 王宗锐, 何康, 等.樟脑对烟酰胺和双氯芬酸钠透皮吸收作用的研究[J].中国医院药学杂志, 1999, 19 (7) :398-400.

[6]段震, 周英.艾纳香化学成分及药理研究进展[J].中华现代临床医学杂志, 2006, 4 (21) :1941-1945.

[7]卫亚丽, 汤洪敏, 莫珊凤, 等.不同产地黔艾纳香中左旋龙脑含量测定[J].中华中医药杂志, 2015, 30 (1) :278-280.

[8]夏稷子, 彭金咏, 赵智, 等.气相色谱法测定艾纳香中左旋龙脑的研究[J].中成药, 2011, 33 (12) :2188-2190.

[9]夏稷子, 彭金咏, 赵智, 等.不同产地艾纳香药材的GC指纹图谱研究[J].中国药事, 2011, 25 (12) :1191-1194.

[10]方灿, 陈琳.气相色谱法测定艾纳香油中左旋龙脑的含量[J].中国医院药学杂志, 2006, 26 (9) :1166-1167.

中药材多维指纹图谱新技术建立等 篇10

由中科院长春应化所、吉林大学、中国农科院特产所共同承担的吉林省科技发展计划项目“龙胆草等长白山道地中药材多维指纹图谱研究”，近日通过吉林省科技厅组织的专家组鉴定。专家认为，该项目为中药的质量控制提供了新的技术和方法，其实验手段和技术达到国际先进水平。

中药指纹图谱是一种能够全面反映中药材及其制剂中所含化学成分、种类与数量，进而对中药材及药品质量进行整体描述和评价的技术手段。

科研人员从开拓中药指纹图谱新技术、新方法，为中药质量控制提供有力技术支撑的目标出发，以我国“天然药库”长白山道地中药材为载体，于2006年开始了龙胆草、五味子、淫羊藿、黄芪和甘草5种中药材的多维指纹图谱的研究，取得了具有我国自主知识产权，国内领先、国际先进的系列创新成果：针对中药质量控制中对整体性、特征性、系统性的需求，建立了龙胆等中药材多指标成分分析的液相色谱质量控制方法及主要成分结构确认的质谱分析方法；建立了龙胆等5种中药材及其饮片的质谱特征指纹图谱分析方法和质谱特征指纹相似度的分析系统，以及用于药材产地区分、品种鉴定、采收期识别、生长年限区分等质谱指纹图谱化学模式识别方法；建立了龙胆等5种中药材的近红外指纹图谱和应用光谱计量学方法构造快速分析道地药的方法，以及用于中药材产地、生长年限等区分的近红外指纹图谱化学模式识别方法。

这种新开拓的质谱、近红外光谱中药材指纹图谱新技术，与传统的色谱指纹图谱技术相比，具有建立方法简捷、特征性强、灵敏度高、分析时间短等优点。

“可利用太阳能与回收电能电梯”研制成功

近日，我国第一台“可利用太阳能与回收电能电梯”在青岛精工电梯制造有限公司研制成功，经过国家电梯质量监督检验中心的检验，与传统电梯相比，这种电梯省电可达60.1％以上。

青岛市质量技术监督局特种设备检验所总工程师刘衍胜介绍，国家电梯质量监督检验中心的实验报告显示，这是国家电梯检验中心实验的第一台“可利用太阳能与回收电能电梯”整机产品。

刘衍胜介绍，和普通电梯相比，这种电梯有三个明显的特点：

一是电源可自动切换。“可利用太阳能与回收电能电梯”开发的专用供电电源(简称LPS)能够在电网停电或断电0.2秒后自动向电梯供电，保障电梯继续运行2小时以上，当电网恢复供电时，这种电源又能够自动切回电网供电。

二是采用了光网互补新技术。可以把太阳能和电梯运行中产生的电能储存在特定的蓄电池内，达到一定参数后，不需电网继续供电，而是自动切换成蓄电池供电状态，这就充分利用了太阳能和回收再利用电能。根据国家电梯质量监督检验中心测试，回收再利用电能的利用率可达22％，加上太阳能的叠加利用，总体节电可达60.1％。

三是利用太阳能为电梯供电，突破了传统电梯供电方式。随着转换太阳能技术水平的不断提高，有望在不远的将来，实现不需电网供电、只需依靠太阳能供电的新型电梯供电方式，为现代环保电梯提供强有力的技术支撑。

蜂胶的指纹图谱研究 篇11

关键词：三棱,成分指认,指纹图谱,高效液相色谱法,质量控制

三棱系黑三棱科黑三棱属植物黑三棱 (Sparganium stoloniferum Buch.-Ham.) 的干燥块茎, 冬季至次年春采挖, 洗净, 削去外皮, 晾干, 以块茎人药。此中药味苦、性平, 入肝、脾经。具有破血行气、消积止痛等功能, 是活血化瘀的中药[1]。三棱的化学成分复杂, 目前已分离的化合物种类有挥发油类, 黄酮类, 有机酸类, 苯丙素类和甾体类[2,3,4,5]。现代药理研究表明, 三棱具有抗血小板聚集和抗血栓作用, 同时还具有抗炎镇痛、抗肿瘤, 保肝等药理活性[6,7,8]。三棱在民间主治气血凝滞、经闭、产后淤血腹痛、饮食积滞、跌打损伤等病症[9,10,11]。然而, 其化学成分和临床应用之间的关系仍未阐明。本研究首次建立了三棱的HPLC指纹图谱, 并对其主要成分进行了指认, 为谱效关系探索和药材科学质量控制提供了依据。

1 仪器与材料

Agilent 1100高效液相色谱仪;色谱柱:Agilent Poroshell 120SB-C18色谱柱 (4.6 mm×100 mm, 2.7μm) (安捷伦科技) ;中药图谱相似度软件由国家药典委员会推荐版本。三棱对照品购自上海华谊生物, 乙腈为进口色谱纯;其余试剂均为分析纯;水为Millipore超纯水。

对羟基苯甲酸, 香草酸, 1-O-阿魏酸-3-对香豆酸甘油酯和香兰素由本实验室分离纯化得到, 原儿茶酸, 咖啡酸和对香豆酸购自上海华谊生物, 纯度>98%。三棱二苯乙炔亦由本实验室分离获得, 但由于结构的特殊性导致不稳定, 纯度约为80%, 杂质主要为小极性物质。从全国各地药店及药材市场先后收集20批三棱药材, 均由上海中医药大学崔亚君教授鉴定, 对照药材购自中国药品生物制品检定所, 见表1。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱为Agilent Poroshell 120 SB-C18柱 (4.6 mm×100mm, 2.7μm) , 在线过滤器为Agilent Poroshell 120 SB-C18 (4.6μm×0.2μm) , 流动相A-乙腈, B-0.1%甲酸;二元梯度洗脱:0~13 min, 10%~17%A;13~22 min, 17%~33%A;22~33 min, 33%A;32~34 min, 33%~35%A;34~45 min, 35%A;45~60 min, 35%~100%A;体积流量:0.6 mL/min;柱温:25℃;进样量:10μL;检测波长:300 nm。

2.2 对照品溶液的制备

精密称取对羟基苯甲酸, 原儿茶酸, 香兰素, 咖啡酸和对香豆酸适量, 配制成0.02 mg/mL的溶液;精密称取香草酸, 三棱二苯乙炔和1-O-阿魏酸-3-对香豆酸甘油酯适量, 配制成0.01 mg/mL的溶液, 作为对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备

三棱药材粉碎后过80目筛, 精密称取药材粉末2.0 g, 加入50 mL甲醇, 80℃加热回流提取1 h, 药液减压蒸干后定容至5 mL, 经滤膜 (0.22μm) 滤过, 即得。

2.4 方法学考察

2.4.1 精密度试验

同一份供试品溶液按“2.1”项色谱条件连续测定6次, 测得各主要色谱峰的相对保留时间RSD均<0.3%, 相对峰面积RSD均<2.5%, 表明本方法精密度良好。

2.4.2 重现性试验

同一批药材样品6份按“2.3”项方法平行制备, 按“2.1”项色谱条件测定, 测得各主要色谱峰的保留时间RSD均<0.2%, 相对峰面积的RSD均<3.0%, 表明本方法重现性良好。

2.4.3 稳定性试验

取同一份供试品溶液, 置室温条件下, 按“2.1”项色谱条件, 分别于0、2、4、8、11、24 h进行测定, 测得各主要色谱峰的相对保留时间RSD均<3.0%, 相对峰面积的RSD均<1.0%, 表明样品在24 h内稳定。

2.5 指纹图谱的建立及相似度评价

2.5.1 共有峰的标记

对21批三棱进行指纹图谱分析, 以对香豆酸作为参考峰, 以峰的共有率>80%为依据, 标定了13个共有峰, 分别是1号 (9.227 min) 、2号 (10.041 min) 、3号 (11.008 min) 、4号 (13.365 min) 、5号 (14.208 min) 、6号 (14.961 min) 、7号 (20.363 min) 、8号 (24.778 min) 、9号 (29.869 min) 、10号 (30.889 min) 、11号 (31.679 min) 、12号 (40.087 min) 、13号 (41.414 min) 。

2.5.2 化合物的指认

8个标准品的液相色谱图和紫外光谱图如图1所示, 其化学成分如表2所示。图1中化合物1为原儿茶酸, 化合物2为对羟基苯甲酸, 化合物3为香草酸, 化合物4为咖啡酸, 化合物5为香兰素, 化合物6为对香豆酸, 化合物7为1-O-阿魏酸-3-对香豆酸甘油酯, 化合物8为三棱二苯乙炔。

2.5.3 相似度计算

将21批从不同产地收集的三棱药材分别按“2.3”方法制备, 按“2.1”项色谱条件测定并建立指纹图谱。将所得图谱导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”软件分析, 经校正及色谱峰匹配, 得出各样品指纹图谱与对照药材的相似度, 结果见表3。从各批药材的HPLC图谱与相似度系数可以看出, 不同批次三棱药材无显著差异。

2.5.4 聚类分析

经SPSS数据统计软件将21个样品的共有峰数据, 采用组间对比 (between groups linkage) 进行聚类, 用余弦法 (cosine) 计算样品相似度, 聚类结果见图3。从树状聚类图中看到, 21个样品大体上聚为2类, S11, S18, S21为一类, 其余为第二类。S11, S18, S21批次药材的香兰素和三棱二苯乙炔成分含量较高。

2.5.5 样品主成分分析 (PCA)

把21批样品的指纹图谱导入SPSS软件, 进行主成分分析。如图4所示, S11, S18, S21, S20四个产地样品与大部分三棱样品存在差异。

3 讨论

3.1 提取方法的考察

考察了加热回流法, 超声提取法和微波萃取法, 结果发现:超声提取和微波萃取两种方法效果相同, 但均没有加热回流提取法收率高。同时对提取溶剂甲醇、乙醇、石油醚、乙酸乙酯、氯仿、正己烷和水进行了考察, 发现以甲醇为提取溶剂的热回流法收率最高。

3.2 色谱条件的优化

筛选多种流动相体系, 乙腈-水, 乙腈-磷酸水和乙腈-醋酸水, 甲醇-水, 甲醇-磷酸水体系。结果表明, 乙腈-0.1%醋酸水体系分离效果较好。分析时采用梯度洗脱, A相为乙腈, B项为0.1%醋酸水, 经比较洗脱条件, 最后确定梯度程序为:0~13 min, 10%~17%A线性洗脱;13~22 min, 17%~33%A线性洗脱;22~33 min, 保持33%A;32~34 min, 33%~35%A线性洗脱;34~45 min, 保持35%A;45~60 min, 35%~100%A线性洗脱, 每次运行后平衡色谱柱10min。在此条件下, 各个色谱峰分离度较好, 保留时间适中。