RNA干扰论文

RNA干扰论文（共9篇）

RNA干扰论文 篇1

RNA干扰 (RNA interference, RNAi) 是多种生物体内由双链RNA (double stranded RNA, ds RNA) 介导同源m RNA降解的现象。这种现象广泛存在于生物界, 是生物体抵御病毒或其它外来核酸入侵以及保持自身遗传稳定的保护性机制, 以其高效率、高特异性等特性, 较反义核酸、核酶、三链RNA等基因沉默技术显示了独特优势及广泛的应用前景。本文就其发现、分子机制及其应用等方面的研究进行综述。

1 RNAi的发现

1990年, Napoli等把已知色素基因置于强启动子后, 导入矮脚牵牛花中, 试图加深牵牛花的颜色, 结果却发现花的颜色全部或部分变白。这就提示, 导入的基因和牵牛花内源的着色基因都被抑制, 也正因为如此, 当时把这种现象称“共抑制” (co-suppression) 。相似的现象也在线虫中发现, 称为“静息作用” (quelling) 。1995年, 康乃尔大学的Guo等曾经尝试用反义RNA去阻断线虫的par-1基因表达, 结果发现反义RNA的确能阻断目的基因的表达, 但作为对照的正义RNA, 虽不能与活性RNA结合, 也照样能引发抑制。1998年, Fire和Tabara首次将双链RNA (double-strand RNA, dsRNA) —正义链与反义链的混合物注入线虫, 结果表现出比单独注入单链要强得多的沉默, 并且导致子一代同源基因的沉默, 这也是人们第一次应用RNAi技术。随后Hammond还发现, 不仅在线虫中, 在果蝇中也存在dsRNA诱导的基因沉默, 而且在它们的后代中依然表现沉默, 并将这种现象称为RNAi。

2 RNAi的分子机制

虽然真正的分子机制尚未完全明了, 但通过遗传学及生物化学等探索, 已初步认识了RNAi可能的分子机制:内源或外源性dsRNA在细胞内被RNAaseⅢ-在果蝇中被称为Dicer (首先形成二聚体) 识别, Dicer有以下结构域:1个与Argonaute家族同源的PAZ结构域, 2个RNAase活性结构域, 1个dsRNA结合结构域, 1个DEAH/DCHXRNA解旋酶活性结构域, 识别可能在Argonaute蛋白协助下发生, 识别dsRNA的Dicer二聚体4个复合活性结构域中的2个失活, 故Dicer对dsRNA的降解将每隔一定间隔进行, 对Dicer家族而言, 此间隔为22个nt。Dicer结构微小的改变均会引起这种催化中心的间隔改变, 故不同物种产生si RNA长度略有差异, 从而dsRNA被切割成21～23nt有5’磷酸化和3’悬端 (overhang) 的小干扰RNA (small interference RNA, si RNA) 。si RNA随即与RISC (RNA诱导的沉默复合物) 结合, 现有研究表明RISC包含有Argonaute (Ago) 蛋白家族的多个成员, 可能有转运si RNA到RISC上的功能, Hannon等在果蝇S2细胞的提取物中也检测到Dicer与Argonaute的相互作用。在ATP作用下RISC利用解毒旋酶 (如QDE3, MUT6, MUT 14) 解旋, 变为约100kD的RISC活性形成 (RISC) , RISC的核酸部分起靶向作用, 蛋白质部分起降解作用, 可使si RNA解旋、解链, 并通过碱基互补配对原则识别靶基因转录的m RNA并与之结合, 然后si RNA与m RNA换位, 再由RISC将靶m RNA切割成21～23nt片段, 这些片段由于缺少Poly A尾巴及特定的头部而很易被降解, 导致翻译受阻, 产生转录后基因沉默效应 (PTGS) 。换位后的si RNA可继续充当起始诱导物, 重复参与PTGS过程, 产生级联放大效应, 同时si RNA可在RdRp (RNA依赖的RNA聚合酶) 作用下大量扩增, 并且转运出细胞, 扩散至整个机体。si RNA还可作为一种特殊的引物, 利用RdRp以靶m RNA为模板, 合成新的dsRNA, 后者又被RISC降解成为新的si RNA, 新合成的si RNA又进入上述循环, 这一过程被称为随机降解PCR反应 (random degredative PCR) 。

对哺乳动物细胞中的RNAi进行研究发现, 在哺乳动物细胞中存在两种竞争dsRNA的途径:大于30nt的长双链RNA可激活两种酶, 一种为无活性蛋白激酶, 激活后使翻译起始因子e LF2a磷酸化;另一种为无活性2’, 5’寡腺苷酸合成酶, 激活后使RNAase L激活, 两者均可导致非特异性抑制作用, 降解所有m RNA及抑制所有蛋白质合成, 从而引起细胞死亡, 而长dsRNA降解产生的si RNA则可产生序列特异性RNAi, 只高度特异性降解特异靶m RNA。

此外, 科学家们还发现了RNA介导的同源DNA甲基化 (RdDM) 现象, 即在RNAi的PTGS机制中产生了引导同源m RNA降解的si RNA, 与此引导RNA序列互补的短至30nt的DNA序列可被甲基化, 位点是DNA序列中的胞嘧啶, 现认为RdDM可能在启动或维持基因沉默中起作用, DNA甲基化障碍将导致PTGS缓解, 并且由于si RNA可进入细胞核激发核内的RdDM, 从而扩大了原有甲基化效应, 进一步加强了基因沉默。如甲基化发生于编码区, 则转录正常进行, 产生PTGS;若发生于启动子区则阻断转录而发生TGS (转录水平基因沉默) 。RdDM的可能机理为si RNA可能接近解链DNA, 形成RNA-DNA异二联体和单链DNA环或RNA-DNA-RNA三分子螺旋, 从而吸引DNA甲基转移酶 (MTase) 靠近, 催化DNA甲基化。亦有研究表明si RNA指导的RdDM可能通过一类梳状蛋白实现。

3 RNAi的应用

3.1 抗病毒方面的应用

加州大学洛杉矶分校和加州理工学院的研究人员开发出使用RNAi技术来阻止艾滋病病毒进入人体细胞。这个研究小组设计合成的lenti病毒载体引入si RNA, 激发RNAi使其抑制了HIV-1的coreceptor-CCR5进入人体外周T淋巴细胞, 而不影响另一种HIV-1主要的coreceptor-CCR4, 从而使以lenti病毒载体为媒介引导si RNA进入细胞内产生了免疫应答, 由此治疗HIV-1和其他病毒感染性疾病的可行性大大增加。RNAi还可应用于其它病毒感染如脊髓灰质炎病毒等, si RNA已证实介导人类细胞的细胞间抗病毒免疫, 用si RNA对Magi细胞进行预处理可使其对病毒的抵抗能力增强。在最近全世界约30个国家和地区散发或流行的严重急性呼吸综合征 (severe acute respiratory syndrome, SARS) 的防治研究中, RNAi也受到了重视。si RNA在感染的早期阶段能有效地抑制病毒的复制, 病毒感染能被针对病毒基因和相关宿主基因的si RNA所阻断, 这些结果提示RNAi能胜任许多病毒的基因治疗, RNAi将成为一种有效的抗病毒治疗手段。这对于许多严重的动物传染病的防治具有十分重大的意义。

3.2 抗肿瘤方面的应用

肿瘤的发生是一种多基因协同作用的结果, 利用RNAi技术可同时阻断多个癌基因的转录表达, 从而有效抑制肿瘤的生长, 达到治疗肿瘤的目的。尿激酶型纤溶酶原激活剂 (uPA) 是一种在肝癌细胞中高表达的蛋白, n参与机体的多种生理和病理过程, 其表达水平与患者的生存呈负相关。Salvi等用RNAi技术沉寂肝癌细胞中u PA的表达, 结果转染靶向uPA的si RNA的肝癌细胞其侵袭、转移和增殖能力显著下降。Pardridge等以人表皮生长因子受体 (hEGFR) 为靶点, 应用RNAi技术干扰其表达从而抑制颅内肿瘤的生长。cyclinE是细胞增殖周期中一种重要的正向调节蛋白, 用靶向于原癌基因cyclinE编码区的si RNA明显抑制了HCC细胞相应蛋白的表达, 抑制率达90%, 并促进HCC细胞的凋亡、阻断该细胞增殖。肿瘤的生长具有血管依赖性, 血管内皮生长因子 (VEGF) 是一种重要的血管生长因子。Hang等报道用RNAi技术研究分析了血管内皮生长因子 (VEGF) 5种同型异构体基因功能, 进一步对血管生成基因进行敲除治疗癌症, 并显示了较好的治疗结果。ras基因是一种在肿瘤细胞内高表达的癌基因, 并常常在12、13、61氨基酸残基位点发生突变, 使之长期出于激活状态, 导致肿瘤的发生。Brummelkamp等建立了突变体Kras V12的si RNA表达系统p SUPERK ras V12, 将其转染人胰腺癌CAPAN 1细胞系, 结果p SUPER Kras V12显著降低Kras V12的m RNA表达水平, 并明显抑制细胞克隆的生长, 裸鼠成瘤能力显著下降, 表明si RNA具有明显抑制肿瘤生长作用。ras与其传导通路的下游信号raf的N端结构域结合可使其激活, 通过受体酪氨酸激酶RPTK (receptor protein tyrosine kinases, RPTK) 信号传导途径使许多转录因子活化, 促进c fos, c jun的表达, 传递细胞增殖信号, 最终导致细胞的恶性转化。Gong等构建针对野生型和突变型Hras基因的逆转录病毒载体, 转染卵巢癌T80H细胞和SKOV3细胞, 结果使G0/G1期细胞和凋亡细胞增多, 并抑制裸鼠肿瘤的生长。因此, 用RNAi技术沉默肿瘤发生发展过程中过表达的癌基因可抑制肿瘤的生长。RNAi还可用于研究与肿瘤细胞生长分化相关的信号传导通路, 并通过干扰细胞信号传导途径中关键蛋白的表达, 达到抑制肿瘤生长的作用, 为恶性肿瘤的基因治疗提供了新的技术方法。

RNAi技术作为一种沉寂目的基因表达的高效特异方式, 必将推动人类后基因组计划的快速发展, 并在研究基因功能、特定基因在细胞信号传导中的作用和抗肿瘤、抗病毒感染的治疗等方面发挥重要作用。

RNA干扰论文 篇2

SUMO-1小干扰RNA的构建及其干扰效果检测

目的:构建小泛素相关修饰物-1(SUMO-1)基因的小干扰RNA(siRNA),并检测其对SUMO-1基因表达的.干扰效果.方法:根据SUMO-1基因序列设计一条合理的SUMO-1 siRNA,并将其克隆到pSliencer2.1-U6 neo载体中,转化大肠杆菌DH5α,挑取阳性菌落进行酶切和测序鉴定;将构建的SUMO-1 siRNA重组质粒单独转染或与带HA标签的SUMO-1表达载体共同转染人胚肾293T细胞,收集细胞裂解物,以抗HA和SUMO-1的抗体用Westem印迹检测siRNA的干扰效果.结果:构建了SUMO-1 siRNA重组质粒,干扰效果可达80%以上.结论:构建的SUMO-1 siRNA为进一步进行蛋白质SUMO-1化修饰的研究奠定了基础.

作 者：任雯 韦玮 叶棋浓 REN Wen WEI Wei YE Qi-Nong  作者单位：军事医学科学院,生物工程研究所,北京,100850 刊 名：生物技术通讯  ISTIC英文刊名：LETTERS IN BIOTECHNOLOGY 年，卷(期)：2010 21(2) 分类号：Q78 关键词：SUMO化   SUMO-1   小干扰RNA   表达载体  

RNA干扰论文 篇3

1 材料

1.1 质粒与菌株

pCDNA3.1(+)、pIRES-Neo、pEGFP-N2和pSV40,购自Clontech公司;转染效率校准载体pIREs-RFP、对照载体pattB-ins-cubc-EGFP-GHPA、PMCS等质粒,由河北农业大学动物遗传学实验室构建并保存; PK15细胞系,由河北农业大学动物科技学院宋勤叶老师惠赠;人基因组模板,由252医院惠赠;HDV序列、烟草花叶病毒发夹状核酶序列(HHR和HHF)及PCR引物,均由上海生工生物工程有限公司合成;无内毒素质粒提取试剂盒,购自天根生化科技(北京)有限公司;脂质体2000,购自Invitrogen公司。

1.2 合成的基因及引物(见表1和表2)

2 方法

2.1 RNAi载体的构建

HDV核酶序列由上海生工生物工程有限公司合成。将该序列以SacⅠ和BamHⅠ双酶切插入pcDNA3.1(+)载体的CMV启动子下游, 得到载体pcD-NA-HDV 将合成的序列HHF和HHR经退火互补后形成HRZ核酶编码序列,插入pcDNA-HDV载体的XbaⅠ和XhoⅠ之间形成pcDNA-HDV-5HRZ,将用BetaGPSup和BetaGPSlow引物扩增获得的人Beta球蛋白基因3′侧翼序列中的减速序列。扩增PCR反应体系:模板1 μL,10×Buffer 2.5 μL,2.5 mmol/L dNTP 2 μL,引物BetaAGPSup、BetaAGPSlow各1 μL,5 U/μL Taq DNA聚合酶0.5 μL,加灭菌水至总体积25 μL。PCR反应条件见表2。通过ApaⅠ和PmeⅠ插入pcDNA-HDV-5HRZ的载体中形成pcDNA-HDV-5HRZ-ACTP;再用XbaⅠ和XhoⅠ将pIREsNeo载体中的牛生长激素基因加尾信号序列添加到该载体中形成pcDNA-HDV-5HRZ-BGHPA-ACTP载体;用NheⅠ和XhoⅠ切割pcDNA-HDV-5HRZ-BGHPA-ACTP,将第2个HRZ添加其中形成pcDNA-HDV-5HRZ-BGHPA-3HRZ-ACTP;用SalⅠ切pMCS(补平),再用BglⅡ切pMCS作为载体,将用BglⅡ和PmeⅠ切割pcDNA-HDV-5HRZ-GHPA-3HRZ-ACTP获得的外源片段插入切好的载体中得到pMCS-CMV-HDV-5HRZ-GHPA-3HRZ-ACTP;用EcoRⅠ和NotⅠ将pEGFP-N2载体中的EGFP基因切下,并插入pMCS-CMV-HDV-5HRZ-GHPA-3HRZ-ACTP载体的EcoRⅠ和NotⅠ之间得到试验载体pMCS-CMV-HDV-EGFP-5HRZ-PA-3HRZ-ACTP。载体结构见190页彩图1A,试验用对照载体和转染校准载体结构见190页彩图1B和彩图1C。

2.2 细胞的转染及荧光观察

使用购自天根生化科技(北京)有限公司的无内毒素质粒提取试剂盒按说明书提供的方法提取转染用质粒DNA,按照脂质体2000说明书提供的方法将试验质粒、对照质粒分别与转染效率校准质粒按7∶1的比例混合共转染PK15细胞,转染48 h后,于倒置荧光显微镜下观察荧光情况,并拍照记录结果。

2.3 细胞质RNA的提取及cDNA第一链的合成

反转录合成cDNA第一链的反应体系及条件为:取细胞质RNA 1.5 μg放入PCR管中,加入0.05 μg/μL的Oligo(dT)18 2 μL或GFPlow(分别用于不同分析),加水补足到12 μL,混匀后离心;70 ℃加热10 min;取出立即放在冰上冷却5 min;短暂离心后依次加入M-MLV 5×Buffer 4 μL,dNTP(10 mmol/L)2 μL,RNasin(40 U/μL)1 μL,M-MLV(200 U/μL)1 μL,混匀,加DEPC水补足20 μL;42 ℃反应1 h;70 ℃加热15 min;短暂离心;-80 ℃保存,备用。

2.4 细胞质中EGFP mRNA的检测

以GFPlow为模板进行PCR检测,反应体系为:模板1 μL,10×Buffer 2.5 μL,2.5 mmol/L dNTP 2 μL,引物GFPup、GFPlow各1 μL,5 U/μL Taq DNA聚合酶0.5 μL,加灭菌水至25 μL。PCR反应条件见表2。

2.5 半定量最佳PCR循环次数的确定

PCR扩增反应最初是以指数递增,但随着酶活下降和溶液中反应物的消耗,反应达到平台期。在平台期低水平表达的基因会增加到与高水平表达的基因相同的浓度。最佳循环数选定在持家基因GAPDH和目的基因EGFP产物均在指数增长期内。本试验从第20个循环开始依次增加2个循环,到第34个循环结束,然后通过电泳及应用软件Bio-1D进行分析(具体方法见软件说明书),确定最佳PCR循环次数。PCR反应体系:模板1 μL(对于GAPDH使用Oligo (dT)18引物反转录产物为模板,对于EGFP则以GFPlow为引物反转录产物为模板,两者起始的总RNA量相同),10×Buffer 2.5 μL,2.5 mmol/L dNTP 2 μL,GAPDHup、GAPDHlow或GFPup、GFPlow引物各1 μL,5 U/μL Taq DNA聚合酶0.5 μL,加灭菌水至总体积25 μL。PCR反应除反应循环数外的其他参数见表2。

2.6 细胞质总RNA中EGFP mRNA含量的半定量PCR检测

利用GFPlow反转录后的cDNA,用已建立的最佳半定量PCR反应条件,通过半定量PCR对对照组和试验组细胞质中EGFP的mRNA含量进行分析,同时以Oligo (dT)18为引物反转录产生的cDNA第一链为模板,以建立的最佳半定量PCR反应条件进行半定量PCR检测,对照组和试验组细胞质中GAPDH的mRNA的含量用于作为两组初始反转录反应中胞质总RNA用量的校准,反应体系与半定量PCR条件建立时相同。

3 结果与分析

3.1 载体构建结果

载体pMCS-CMV-HDV-EGFP-5HRZ-PA-3HRZ-ACTP结构中实际起去除转录产物中的5′帽子和3′polyA结构作用的分别是HDV核酶和5HRZ发夹核酶,而该结构中设置的3HRZ发夹核酶和减速序列只是为了使转录及时终止,并不妨碍转录产物的polyA结构的形成,因此如果5HRZ发夹核酶切割不完全,可通过Oligo(dT)18引物反转录合成含EGFP cDNA第一链的cDNA产物,这种产物用跨越5HRZ切割位点的引物应该能够扩增产生相应的DNA产物,如该核酶自切割完全就不会有相应的DNA条带产生。

3.2 荧光观察结果

转染后48小时观察荧光情况并拍照,记录结果,见190页彩图2。 从荧光观察结果来看,两组共转染的发红色荧光的阳性细胞数量基本相同,说明两组在转染效率上基本一致。pattB-ins-cubc-EGFP-GHPA载体大小为8.3 kb,pMCS-CMV-HDV-5HRZ-EGFP-GHPA-3HRZ-ACTP载体大小为7.1 kb,理论上说载体越大转染效率越低,因此pMCS-CMV-HDV-5HRZ-EGFP-GHPA-3HRZ-ACTP载体的转染效率只能比对照组pattB-ins-cubc-EGFP-GHPA载体转染效率高,而对照组有很多的发绿色荧光的阳性细胞,试验组没有察到发绿色荧光的阳性细胞。试验组转录产物可能停留在核中未转移到细胞质中,因而未合成绿色荧光蛋白或者绿色荧光蛋白表达水平非常低,但试验组的细胞质中是否存在EGFP的mRNA还需要使用更为灵敏的RT-PCR方法进行分析。

3.3 RT-PCR分析

3.3.1 细胞质RNA的提取 结果见图3。

1.试验组;2.对照组。

结果说明获得了高质量的细胞质RNA。

3.3.2 检测细胞质中EGFP基因mRNA的RT-PCR 结果见图4。

M.1 kb Ladder Marker;1.试验组;2.对照组。

由图4可以看出,无论试验组还是对照组细胞质中都存在EGFP mRNA,因此需要进一步鉴定试验组和对照组中EGFP mRNA的水平是否存在差异及2个核酶的切割效果,以确定所设计的结构的效果。

3.3.3 半定量PCR条件的建立

以GFPup、GFPlow及GAPDHup、GAPDHlow为引物,以反转录产物(Oligo (dT)18或GFPlow为模板建立半定量PCR条件,结果见图5、图6。

M.1 kb Ladder Marker;1～8.34,32,30,28,26,24,22,20个循环。

M.1 kb Ladder Marker;1～8.34,32,30,28,26,24,22,20个循环。

电泳完毕后应用Bio-1D图像分析软件进行分析,最佳PCR循环次数选择GAPDH和EGFP目的基因产物均在以线性递增的指数增长期内,见表3。

注:Marker为1 kb Ladder Marker 的500 bp 带的Volume值。

由表3可见,在20,22,24个循环的Volume值接近线性增长,这与PCR扩增产物在线性递增规律接近,因此最终选定为24个循环作为半定量PCR分析时的循环参数。

3.3.4 半定量RT-PCR分析细胞质中EGFP RNA的相对含量

在最佳半定量PCR条件下,分别用GFPup、GFPlow和GAPDHup、GAPDHlow为引物进行半定量PCR分析,每个样品重复3次,将扩增产物进行凝胶电泳并应用Bio-1D软件分析条带的Volume值代表EGFP和GAPDH在2个组细胞质中的相对含量。电泳及分析结果见图7、图8。

M.1kb Ladder Marker;1.对照组;2.试验组。

M.1kb Ladder Marker;1.对照组;2.试验组。

应用Bio-1D定量软件进行了半定量分析,结果见表4,5。

注:Marker为1 kb Ladder Marker 的500 bp 带的Volume值。

注:此组数据的计算方法为用GFP基因引物带的Volume值除以内参基因引物扩增带的Volume值,然后以每个样品的3个重复的该值求平均数。这组数据表示单位细胞数中mRNA的相对含量。

以上半定量数据分析结果表明,试验组细胞质中GAPDH mRNA水平没有明显差距,因此认为进行半定量分析时试验组和对照组总RNA量是一致的,如果EGFP的相对含量有差异是其在总RNA中所占比例不同所致。对胞质中EGFP的mRNA相对含量分析,将表5中两组的相对含量值按(试验组/对照组)×100的公式进行计算,结果表明,与对照组相比,试验组下降了46.1%。此结果表明转录后的RNA没有完全被封闭在细胞核内,但达到了延迟RNA出核的目的。

4 讨论

在本试验中,从荧光观察结果来看,两组共转染的发红色荧光的细胞数基本上没有明显差异,说明两组在转染效率上也不存在明显差异。对照载体大小为8.3 kb,干扰载体大小为7.1 kb,2个载体大小相差1.2 kb。在正常情况下,干扰载体的转染效率应该比对照载体高,即载体越大转染效率越低。在对照组有很多发出绿色荧光的细胞的情况下,如果干扰载体不起作用,它应该会比对照组有更多的发出绿色荧光的细胞出现,在本试验中试验组没有观察到发出绿色荧光的细胞,此结果说明本研究设计的干扰载体达到了预期的效果。为了进一步证实EGFP mRNA是否进入了细胞质,试验采用了更为灵敏的RT-PCR分析方法进行了进一步分析,结果表明,有EGFP mRNA进入了细胞质。通过半定量RT-PCR分析,试验组干扰载体表达的EGFP mRNA虽然有一部分被从细胞核转移到了细胞质中,但从试验组和对照组细胞质中EGFP mRNA的水平来看,试验组比对照组下降了46.1%,说明这一结构至少达到了减缓RNA出核的目的,这为Dicer酶在核内切割长双链RNA成小RNA提供了时间;因此,该载体如果用于长双链RNA的表达,由于细胞核中Dicer酶的及时切割可以避免长双链RNA出核,从而避免其出核引起的干扰素反应,其切割产生的小双链RNA进入细胞质可有效发挥小干扰RNA的作用,因此该结构可能是有效的。当然,该载体的有效性还有待于进一步验证。

参考文献

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RNA干扰论文 篇4

RNA干扰(RNA interference,RNAi)是双链RNA(dsR-NA)介导的序列特异靶基因转录后基因沉默的过程.RNAi天然存在于各种生物体中,如果蝇、线虫、原生动物、脊椎动物、高等植物等,在保持基因组的纯洁、抵抗病毒的`入侵、控制生物发育、染色体的异染色质化等方面都具有非常重要的作用.自Fire等[1]首次将RNAi现象定义为转录后基因沉默(PTGS)后,应用RNAi技术进行基因功能的研究迅速在各种生物中开展起来.本文就RNAi技术及其在寄生虫领域中的研究结果作一综述.

作 者：姚利晓 林矫矫 蔡幼民 作者单位：姚利晓(中国农科院上海家畜寄生虫病研究所农业部动物寄生虫学重点实验室,上海,32;中国农业科学院研究生院,北京,100081)

林矫矫,蔡幼民(中国农科院上海家畜寄生虫病研究所农业部动物寄生虫学重点实验室,上海,200232)

RNA干扰论文 篇5

RNA干扰是一种自然发生的细胞核中遗传信息向细胞内蛋白生产机制传递时受到干扰的现象。自1998年发现该现象以来, 科学家一直在试图利用它来关闭人体中的基因, 特别是那些失效的能导致癌症等疾病的基因。RNA干扰法成功的关键是寻找到一种安全且有效地传递RNA短片段 (short strands of RNA) 的途径, 这些RNA短片段能够绑定并摧毁携带细胞核指令的信使RNA (m RNA) 。

麻省理工大学大卫科赫综合癌症研究所的生物医学工程师丹尼斯·安德森和同事相信, 最好的途径是将具有干扰能力的RNA短片段包裹着名为利匹哆异德 (lipidoid的音译) 的脂质分子层中, 该分子能穿过细胞多脂肪的外膜。利用利匹哆异德分子, 科学家一次能够成功地将5个RNA短片段传递到目的地。安德森认为, 利匹哆异德拥有同时传递20个RNA短片段的潜能。

为了实现传递RNA短片段的目的, 麻省理工大学和奥尼兰姆制药公司的科学家合作, 开发出了快速生成、组合和筛选不同利匹哆异德分子的方法, 这使得他们有能力从获得的分子中挑选最有效的分子。

在过去的研究中, 科学家获得了1000多种利匹哆异德分子。新近他们挑选出最有效的分子并用独特的化学反应产生出拥有126个类似分子的分子库, 然后将注意力放在其中最有潜力的被称为C12-200的分子上。利用该分子, 科学家发现, 能够有效地关闭基因的剂量为每千克溶剂中RNA短片段量低于0.01毫克。如果用于人体, 那么只需1毫升的注射量就可以关闭一个基因;而用过去的制剂, 需要数百毫升才能达到相同目的。

RNA干扰论文 篇6

关键词：慢病毒,载体,RNA干扰

慢病毒 (Lentivirus, LV) 是逆转录病毒科的病毒成员。慢病毒感染细胞后, 在自身逆转录酶的作用下以病毒基因组RNA为模板逆转录形成双链DNA中间体, 然后整合到宿主细胞染色体DNA上, 作为细胞基因组的一部分, 随着细胞基因组的复制和细胞分裂传递下去, 并且在宿主RNA聚合酶的作用下转录形成新的子代病毒。慢病毒载体较逆转录病毒载体有更广的宿主范围, 慢病毒能够有效感染非周期性和有丝分裂后的细胞。慢病毒作为siRNA的携带者, 不但具备特异的使基因表达沉默的能力, 而且还能充分发挥慢病毒载体自身所具备的优势, 为基因功能的研究提供强而有力的工具。

1 慢病毒载体的特点、构建及产量

慢病毒载体是以人类免疫缺陷Ⅰ型病毒 (HIV-1) 为基础发展起来的基因治疗载体, 对分裂期细胞和非分裂期细胞均具有感染能力。

1.1 慢病毒载体的特点

慢病毒经过改造成为慢病毒载体, 改造的目的主要是提高生物安全性及增加外源基因的表达效率。各种慢病毒载体的结构和作用机制基本相同。

慢病毒载体的最大特点是在感染分裂期细胞的同时, 还可以感染非分裂期细胞, 并可在宿主体内长期表达, 且不易诱发宿主免疫反应, 安全性好。此外, 由于慢病毒有强大的包装能力, 一般认为可达8~10 kb, 因此适用于多基因表达系统。慢病毒在整合时并不倾向于转录的起始位点, 而是在基因的整个转录区域都可以整合, 整合的慢病毒对启动子的激活机会会更低。因此, 与其他致癌逆转录病毒载体相比, 慢病毒载体更不易引起插入突变。

1.2 慢病毒载体的构建及产量

慢病毒基因组结构复杂, 除了含有gag、pol、env 3个逆转录病毒共同具备的结构基因及5′端和3′端LTR结构外, 还包括4个辅助基因vif、vpr、nef、vpu和2个调节基因tat和rev。质粒一携带了gag/ pol编码序列及RRE;质粒二包含了编码rev的序列;质粒三是载体质粒;质粒四表达env。4个质粒系统包装的病毒大部分转录失活, 即使在病毒基因组发生重组的情况下, 病毒基因组的复制也会受到限制, 从而其安全性显著提高并且对细胞转导效率无影响。慢病毒载体的构建要尽可能除去反式功能基因序列, 并以外源基因来代之, 同时保留或部分保留病毒本身的LTR及病毒的包装信号ψ。包装细胞可以为缺陷型病毒提供所需要的各种蛋白, 带有目的基因的重组慢病毒载体转染包装细胞虽然自身不能表达所必需的病毒蛋白, 但此载体含有完整的包装信号, 在包装细胞提供包装蛋白的情况下可以包装成缺少病毒gag、pol、env蛋白编码基因的重组病毒颗粒, 该病毒颗粒只能感染并整合宿主细胞, 不能在宿主细胞内再产生子代病毒, 这样增强了安全性, 但载体与包装前病毒DNA的简单重组可能会产生野生型病毒。基于以上的不足, 将gag、pol及env基因分别组装在两个质粒之中, 即一个表达gag和pol, 另一个表达env, 其基因组都不含包装信号ψ、LTR等。

目前, 慢病毒载体生产体系产量偏低, 为了适应规模化应用的需求, 利用并改造Moss发明的VV/T7瞬时表达系统, 以获得高拷贝数的慢病毒载体。该系统蛋白质表达迅速, 产量高, 原因在于T7RNA聚合酶由痘苗病毒指导合成, 慢病毒载体的RNA由T7RNA聚合酶指导合成, 使得慢病毒载体的生产不依赖慢病毒天然复制途径, 充分发挥痘苗病毒表达系统瞬时高效的特点, 避开细胞障碍的限制, 提高慢病毒载体效价。此外, 痘苗病毒表达不依赖于宿主细胞, 不涉及RNA从胞核到胞质的转运, 这样可以完全去除rev蛋白编码序列和RRE元件, 只保留HIV-1来源的gag-pol蛋白编码序列, 最大限度地减少了病毒源性序列, 使系统表达效率提高, 进而有利于产量的提高。

2 慢病毒介导的RNA干扰

2.1 RNA干扰的作用机制

RNAi (RNA interference) 即RNA干扰, 也称RNA干涉, 是由外源或内源性的双链RNA (dsRNA) 导入细胞而引起的与dsRNA同源的mRNA降解, 进而抑制其相应的基因表达。RNAi是一种序列特异性的转录后基因沉默 (PTGS) 机制, 它通过一段dsRNA导致同源mRNA降解从而使目的基因失去表达。现已阐明RNAi发生机制的大致模型: ①启动阶段。 由RNA病毒入侵, 转座子转录, 基因组中反向重复序列转录等所产生的dsRNA分子在细胞内被Dicer核酸酶剪切成21~23 nt siRNA。②效应阶段。RNAi特异性的核酸外切酶、核酸内切酶、解旋酶、辅助识别同源序列蛋白和其他一些蛋白与siRNA结合形成RNA诱导沉默复合体——RISC (RNA inducing silence complex) , 识别靶mRNA, 其中反义链与靶mRNA互补结合, 正义链则被置换出来, 然后RISC中的RNaseⅢ (可能是Dicer) 在靶mRNA与siRNA结合区域的中间将其切断。③级联放大阶段。在RNA依赖性RNA聚合酶 (RdRP) 的作用下, 以mRNA为模板、siRNA为引物扩增产生足够数量的dsRNA, 并将dsRNA作为底物提供给Dicer酶产生更多的siRNA, 从而使效应阶段反复发生。

2.2 慢病毒RNA干扰的表达载体

目前, 慢病毒被广泛应用于表达RNAi的研究中。采用事先在体外构建并能表达siRNA的载体, 然后转移到细胞内转录siRNA, 从而使脂质体有效转染的细胞种类增加, 其对基因表达的抑制效果不逊于体外合成siRNA, 在长期稳定表达载体的细胞中甚至可以发挥长期阻断基因表达的作用。在所构建的siRNA表达载体中, 是由RNA聚合酶Ⅲ启动子来指导RNA合成的, 这是因为RNA聚合酶Ⅲ有明确的起始和终止序列, 并且合成的RNA不会带polyA尾。

慢病毒载体介导的RNA干扰, 就是将慢病毒载体高效感染和整合的特性与RNA 干扰特异性抑制同源基因表达的作用结合起来。慢病毒RNA干扰的表达载体有两类:一类分别转录有义RNA和反义RNA, 两条链在细胞内互补结合生成siRNA;另一类则转录短发卡RNA (shRNA) 。后者较常用, 其结构主要由慢病毒载体骨架和shRNA表达框组成。shRNA表达框主要包括:RNA聚合酶Ⅲ (PolⅢ) 依赖的启动子、shRNA结构序列及终止子。慢病毒感染细胞后, 将此shRNA表达框整合到宿主细胞基因组中。shRNA在宿主细胞被转录后, 两段互补序列碱基配对结合, 中间序列则成为茎环结构。茎环结构可被Dicer酶识别并切除, 产生的siRNA将执行RNA干扰。

2.3 慢病毒介导的RNA干扰特点

RNA干扰技术相对于传统的基因敲除技术具有投入少、周期短、操作简单等优点。 已被广泛应用于基因功能、信号转导和基因治疗等方面的研究中, 慢病毒载体介导的外源RNA干扰序列进入宿主细胞具有很多优势: (1) 相对于质粒载体介导的RNA干扰其产生的剔降作用持续而稳定; (2) 可感染分裂期细胞或非分裂期细胞; (3) 可感染啮齿类动物的受精卵并将其基因组整合到宿主染色体中, 从而获得特异性的剔降相关基因的转基因动物模型。

2.4 慢病毒介导的RNA干扰在动物病毒学中的应用

慢病毒载体与siRNA技术结合抑制特异基因的表达或敲除可能会成为制备抗病毒动物的有效方法。预计使用这种小的RNA不会影响动物的生理功能, 并且siRNA能在动物体内高效表达抑制致病病毒转录产物产生或表达。慢病毒与siRNA结合使用对于改良动物生长性状、提高饲料利用率和抗病能力都具有重要意义。特别是禽类受精卵产于体外时已经处于桑椹胚阶段, 采用慢病毒作为基因转移的载体具有很大的优越性。慢病毒载体法具有转染率高和转基因高表达的特点, 已成为转基因动物方法学上的一个新突破。

RNA干扰论文 篇7

1998年Fire等[1]将反义RNA和正义RNA同时注入秀丽隐杆线虫体内, 发现由正义链和反义链组成的双链RNA能够抑制线虫体内同源基因的表达而使基因沉默, 并将这一现象命名为“RNA干扰 (RNA interference, RNAi) ”。随着对RNAi技术研究的不断深入, 它的机制也被人们熟知。RNAi的机制主要有两种:大于30nt的长链RNA的非特异效应和21~23nt的短链RNA的特异效应。RNAi特异效应发生在三个水平:转录后水平、转录水平、翻译水平。前两者由si RNA (short interfering RNA) /sh RNA (short hairpin RNA) 介导, 翻译水平由micro RNA介导。

2 RNAi在肝癌治疗领域的应用

肝癌的发生涉及多种致病原因和危险因素。目前, 原癌基因、抑癌基因、凋亡基因等癌症相关基因的过度表达被认为是肝癌发生的主要原因。而HBV、HCV的长期感染所导致的肝硬化被认为是肝癌发生的主要危险因素。应用RNAi技术, 抑制上述基因及HBV、HCV在体内的过度表达, 将为肝癌的预防及基因治疗提供可能。

2.1 RNAi抑制HBV的表达

RNAi抑制HBV的表达, 最关键的是选择有效作用位点。HBV是双链DNA病毒, 有4个开放阅读框架, 分别编码S、C、P、X蛋白。迄今为止, RNAi靶位点主要集中在HBV核心区和表面抗原编码区。

最早关于RNAi抑制HBV的研究始于Shlomai[2], 他们针对HBV核心区和X区构建了sh RNA表达载体p SU-PER-core和p SUPER-X, 并与1.3倍HBV基因组拷贝的HBV表达载体一起转染到Huh T肝癌细胞中, 结果显示p SUPER-core和p SUPER-X均可抑制HBV蛋白的表达。

近期, Morissey[3]经过试验证明, 经过修饰的si RNA在体内会产生强力且持久的抗HBV效应。他们首先将si R-NA所有的2’-OH缺失, 并用2’-氟代, 2’-O-甲基化, 2’-硫酸酰化处理, 很好地抑制了体内核酸酶对si RNA的降解, 与未经修饰的si RNA相比, 其抗病毒作用提高了1.5log10倍。随后, Morissey等又将经化学修饰的si RNA用新型生物材料进行包裹, 并研究其在小鼠体内的药效学、免疫刺激反应和不良反应。结果表明, si RNA-SNALP不会引起免疫刺激反应, 且在给药后3、7天均观察到对HBV持续、高效的抑制作用。Morissey等的实验很好地解决了si RNA在肝脏组织中定位和稳定表达的问题。免疫刺激反应和不良反应的观察为si RNA的使用提供了安全保障, 为RNAi用于临床奠定了基础。

2.2 RNAi抑制HCV的表达

HCV是一条正链RNA, 包括一个大的开放阅读框 (ORF) 和两侧的5’、3’非编码区 (UTR) 。作为一种RNA病毒, HVC的复制和翻译都在胞浆中进行, 非常有利于RNAi技术发挥作用。HCV5’-UTR是病毒基因组中唯一的翻译启始位点, 全长的UTR对病毒复制是必须的, 所以很长一段时间内都是RNAi作用的靶位点。较早的一篇研究[4]表明, 针对5’UTR区化学合成的si RNA和载体表达的sh RNA均能有效抑制HCV的表达和复制。而Takigawa[5]在最近实验中证明, 针对NS3-1和NS5B的sh RNA比针对5‘UTR时抑制效果更好。

针对HCV的逃逸问题, Wilson JA[6]通过研究发现, 用2个或更多个si RNA同时作用于HCV会显著抑制突变逃逸。Scot D.Henry[7]在针对HCV逃逸实验中, 认为通过抑制HCV复制所必须的细胞因子 (CD81) 可以避开HCV的高突变率对RNAi的逃逸。结果还显示, 含有针对HCV多个靶位的sh RNA慢病毒载体与含有同时针对HCV和CD81的sh RNA慢病毒载体都比只表达单一sh RNA的慢病毒载体抑制效果好。

2.3 RNAi抑制肝癌相关基因的表达

肝癌的发生是多基因参与的结果, 因此, 只要利用RNAi技术抑制这些基因的表达, 就可能抑制肝癌的发生和发展。一些研究表明, 可以用RNAi技术抑制原癌基因, 突变的抑癌基因, 细胞周期相关基因, 抗凋亡相关基因等的表达来抑制肝癌的发生和发展。随着肝癌分子机制研究的不断深入, 可成为RNAi技术靶位点的基因也越来越多。PTTG是一种新发现的原癌基因, 它通过影响细胞的分裂、凋亡和DNA修复而在多种癌症的起源中扮演重要角色。用针对PTTG1的重组腺病毒载体表达的sh RNA转染细胞, 发现其能够抑制PTTG1的表达, 同时导致p53激活, 进而导致p21表达升高, 促进凋亡的增加, 抑制癌症的发生。Salvi[8]选择u-PA作为靶基因, 进行研究, 结果显示sh RNA的稳定表达能有效抑制u-PA, 进而导致肝癌相关产物的减少。这预示着RNAi技术下调u-PA的表达, 可能成为肝癌基因治疗的手段。

2.4 micro RNA与肝癌

mi RNA是近几年才发现的小分子RNA。许多研究表明它与肿瘤发生密切相关。它既可作为原癌基因促进肿瘤的生成, 又可作为抑癌基因抑制肿瘤的发生。研究还发现mi RNA可做为致癌病毒的产物参与肿瘤的发生。另外, 体内自身的mi RNA可通过调控病毒表达来调控肿瘤发生。

Mi RNA-122是肝脏特异性表达调控因子。他在肝脏大量表达, 约占肝脏总mi RNA的70%。它是第一个被确认与HCV复制有关的mi RNA。它通过影响HCV RNA的5’UTR区域使病毒RNA表达增高[9]。Jing Yang[10]通过microarray的方法分析59个RNA在肝癌及其相邻的正常组织中表达的变化, 发现了3种RNA在两种组织中表达有差异。它们分别是mi RNA-106b、mi RNA-192、mi RNA-7a-2。这提示它们可能与肝癌的发生有关。

mi RNA与肝癌相关性研究为以RNAi为基础的肝癌的基因治疗提供了新手段。我们可以mi RNA作为靶位点, 上调或下调其表达, 进而抑制癌症的发展。

4 结语

RNAi技术以其独有优势为肝癌的基因治疗带来了希望。正是因为这点, 它吸引了人们极大热情, 在短短几年内就取得飞速发展。尽管这项技术在肝癌领域的研究还处于发展阶段, 也面临许多问题, 但人们有理由相信随着肝癌发生机制研究的深入以及RNAi技术本身的不断进步, 这项技术会在肝癌的基因治疗领域发挥重要作用, 为肝癌的治愈带来曙光。

摘要：在全球范围内, 肝癌是第5大常见的恶性肿瘤, 也是导致人类死亡的主要因素之一。目前, 几乎没有针对肝癌的有效治疗手段。因此, 发展一种新手段意义重大。RNA干扰技术 (RNA interference, RNAi) 作为一种基因沉默技术, 能高效且特异地抑制相关基因的表达, 为肝癌的基因治疗提供了新的手段和希望。对近几年RNAi技术在肝癌领域的应用进行综述。

关键词：RNA干扰技术,肝癌,基因治疗

参考文献

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[3]MORRISSEY DV, LOCKRIDGE JA, SHAW L, et al.Potent andpersistent in vivo anti-HBV activity of chemically modifi ed siR-NAs[J].Nat Biotechnol, 2005, 23:1002-1007.

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[5]TAKIGAWA Y, NAGANO-FUJII M, DENG L, et al.Suppressionof hepatitis C virus replicon by RNA interference directed a-gainst the NS3 and NS5B regions of the viral genome[J].Micro-biol Immunol, 2004, 48:591-598.

[6]WILSON JA, JAYASENA S, KHVOROVA A, et al.RNA interfer-ence blocks gene expression and RNA synthesis from hepatitis Creplicons propagated in human liver cells[J].Proc Natl Acad SciUSA, 2003, 100:2783-2788.

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[8]SALVI A, ARICI B, ALGHISI A, et al.RNA interference againsturokinase in hepatocellular carcinoma xenografts in nude mice[J].Tumour Biol, 2007, 28:16-26.

[9]HEIKE V, UTA D, FALKO S, et al.Microarray Gene Expressionof Hepatitis C Virus Hepatocellular Carcinoma[J].Hepatology, 2008, 47, 1223-1232.

RNA干扰论文 篇8

乙型肝炎是一类严重危害人类健康的疾病。目前临床治疗这类疾病的措施主要是干扰素, 核苷类似物等。但这些药物并不能直接清除人体内的病毒, 并且由于撤药后复发及长期使用逃避基因的出现而限制了这些药物的临床应用。为此, 寻找新的抗病毒治疗方法成为当前临床工作中急需解决的重要问题。近年发现的RNA干扰 (RNA interference, RNAi) 是动、植物抵抗外来病毒感染, 抑制病毒复制的一种重要细胞保护机制。体外试验表明, RNAi能特异、高效地阻断HBV病毒复制相关基因的表达, 以RNAi为手段的抗HBV病毒基因治疗新近受到相关学者的极大关注。本文就相关RNAi在HBV中的研究作一综述。

1 RNAi及RANi 抑制病毒复制的分子基础

1.1 RANi的发展

所谓RNAi是指外源或内源性的双链RNA进入细胞后引起与其同源的mRNA特异性降解, 因而抑制相应基因表达, 表现出特定基因缺失表现的现象。早在1990年, 生物科学家就在植物中发现了RNAi现象, 在牵牛花中发现的一种转基因能同时抑制相应内源基因以及自身表达的基因沉默现象, 当时称其为共抑制[1], 1994年, 在真菌中也发现了此现象, 在野生型粗糙链胞霉中转入胡萝卜素基因时, 发现在部分试验中, 内源性与转入基因序列相同的基因表达水平反而减弱, 称此现象为基因压制[2] 。1995年, Guo和Kemphues发现用反义RNA能阻断线虫par-1基因的表达, 但是奇怪的是, 作为对照的正义链RNA也同样阻断了该基因的表达。1998年, Fire等[3] 解释了这一现象, 正义RNA对基因表达的抑制以及过去利用反义RNA技术对基因表达的阻断, 都是由体外转录制备的RNA (包括正义RNA和反义RNA) 中污染的微量双链RNA (double-strandedRNA, dsRNA) 所引起。并首次将dsRNA (正义链和反义链的混合物) 注入线虫, 结果诱发了比单独注射正义链或反义链都要强的多得基因沉默, 将此现象称为RNA干扰 (RNAi) 。随后, RNAi在许多生物中被发现, 到1999年哺乳动物中也发现存在RNAi现象。因此, 人们断定RNAi是一种生物体内广泛存在的基因调控机制。

1.2 RNAi机制

RNAi的机制尚未完全清楚, 目前, 大量的研究表明RNAi是特异性地降解相应的mRNA, 使目的基因表达关闭, 整个过程包括三个阶段:起始阶段, 效应阶段, 循环放大阶段。起始阶段是由外源导入或病毒感染等各种方式进入机体的dsRNA, 在细胞内与核酸内切酶RNaseIII家族的Dicer结合, 逐步将外源dsRNA切割成21-23nt的小片段, 即siRNA。

RNAi的效应阶段是在siRNA引导下由效应复合物RISC (RNA诱导的沉默复合体, RNA-induced silencing complex) 将内源的靶mRNA降解成21-23nt的片段, RISC具有核酸酶的作用, 但RISC平时是以相对分子质量为250kDa的前体形式存在, 在有siRNA存在和ATP的作用下相对分子质量变为10kDa的有活性的RISC。siRNA与活性RISC结合而解旋成为单链的siRNA。单链siRNA通过碱基互补配对的原则识别与自身有同源序列的内源mRNA, 并与之结合, 然后具有活性形式的RISC将内源mRNA切割, 这样内源mRNA就被降解。具体见图1。

循环放大阶段, siRNA可以类似于PCR的机制使mRNA转变成dsRNA, 新的dsRNA被降解, 在消除靶mRNA同时又产生更多的siRNA, 如此构成一个循环, 所以RNAi的特点之一是高效性, 极少量的dsRNA就足以引起整个机体的基因沉默。

1.3 RNAi分子特点

RNAi有5个重要特征:①RNAi是转录后水平的基因沉默;②高度特异性, 能够非常特异的降解与之序列相应的单个内源基因的mRNA;③高效性, 相对少量就可以抑制基因表达, 使表型达到缺失突变;④浓度、时间双重依赖性。干扰效应通常出现在注射后6 h, 可持续72 h以上;⑤传递性, 可在细胞间, 生物体间传递。

1.4 靶序列选择原则

靶序列的选择好坏是RNA干扰作用的关键, 在选择靶序列时应遵循下列原则:①避免选择启动子起始部位下游50~100nt内的区域或终止子上游50-100nt内的区域;②选择GC含量在50%左右的mRNA区域;③避免超过3个G或3个C重叠。多聚G或多聚C序列能产生堆积形成类聚物而干扰siRNA沉默机制;④选择以两个AA开始的序列, 这将使合成siRNA更加容易, 更加经济和创建一格队核酸酶更有抵抗力的siRNA;⑤保证靶序列与其他基因没有同源性, 通过BLAST查询是否具有同源基因, 以避免产生同以序列的基因干扰。

1.5 siRNA的来源

导入细胞的siRNA主要来源有3种:化学合成、体外转录和构建siRNA表达质粒, 在细胞内转录。化学合成要首先指导目的基因序列, 然后合成相应的siRNA导入细胞, 此法存在不稳定、成本高、易污染等不足。体外转录siRNA时, 先转录出正义和反义RNA, 将两者退火, 形成siRNA, 再用脂质体法转入细胞, 此法也有诸多缺点, 如抑制时间短等, 但效率高。在体外构建表达siRNA的载体, 将载体转移到细胞内, 在细胞内合成siRNA, 此法有一定的优越性, 如时间长, 目前普遍使用此方法。

1.6 siRNA的导入

随着RNAi研究的深入, 可用于siRNA的导入途径也在不断的被尝试和发展, 目前研究比较活跃的主要有以下途径:①脂质体或电穿孔途径 此途径可以导入体外直接合成或通过质粒载体携带的siRNA;②病毒携带途径 目前逆转录病毒的siRNA哺乳动物表达载体已经获得, 其可在培养细胞系中长期稳定表达, 但该载体只能转染分裂细胞。虽然病毒载体近期成为研究的热点, 但其安全性问题有待提高;②细胞渗透多肽 (cell-penetratingpeptides, CPPs) 协助途径 这种生物活性多肽是借鉴病毒蛋白细胞融合结构域特点稽核定位信号的氨基酸规律而设计, 其可以与核酸分子形成稳定的非共价复合物而进入细胞浆或细胞核。[4]

2 RNAi在抗HBV中的作用研究

2.1 HBV的结构特点

HBV基因组为双链环状DNA, 其中有一段仅为单链, 约为全基因组长度的50%-99% (随各亚型而异) 。较短的一段为正链, 长链则为负链。负链含有HBV全部基因, 有4个开放读码框, 共转录4种mRNA, 分别编码S (表面抗原) 、C (衣壳蛋白) 、P (聚合酶) 和X (反式转录激活因子) 。

2.2 HBV复制特点

HBV基因的复制过程有以下4 个环节:①在感染的细胞核内, 在内因性DNA多聚酶 (DNAp) 作用下首先形成双股链松弛DNA (rcDNA) , 继而形成共价键闭环DNA (cccDNA) .此系超螺旋结构DNA, 为HBV-DNA修复阶段;②以cccDNA为膜板, 经RNA聚合酶 (RNAp) 转录为mRNA, 再以3.5kb RNA为膜板逆转录成前基因组RNA并包涵于核心内。此为前基因组RNA合成阶段;③在核心内, 以前基因组RNA为膜板, 在聚合酶作用下合成引物寡核苷酸, 并进而逆转录合成 (-) 链DNA, 此为 (-) 链DNA合成阶段;④以前基因组RNA 5’末端的寡核苷酸为引物, (-) 链DNA为模板, 最后合成 (+) 链DNA。此为 (+) 链DNA合成阶段。在其复制过程中, 存在以RNA为模板合成DNA的逆转录现象, 这一过程在细胞浆中完成。因此, 只要阻断HBV RNA的表达, 就能干预HBV的复制。这为RNAi在HBV感染中的应用提供了依据。[5]

2.3 RNAi 对HBV复制的干扰作用

RNAi在哺乳动物细胞中有两种机制, 一是由大于30nt长双链RNA (dsRNA) 引起的非特异性效应;再者是21-23nt的短双链RNA (siRNA) 的特异效应。由于前者所产生的效应会导致细胞的死亡, 所以研究都集中在由siRNA 所产生的特异效应。siRNA可以在病毒生活周期的多个阶段干扰病毒复制, 如病毒进入细胞后, 转录前作用于病毒RNA;逆转录后而进入细胞核前作用于病毒RNA;整合后, 病毒mRNA在细胞质内被降解。同时, siRNA也可以作用于多个病毒mRNA 。但是目前都集中在抑制转录后的研究上。

2.3.1 针对C以及X区基因的研究

以色列学者Shlomai等[6] 用pSUPER质粒分别构建了发夹状X siRNA (1649位-1667位) 和core siRNA (2191位-2209位) 的表达载体, 实验中将pSUPERX-siRNA和HA-X载体 (表达X) 或pSUPERcore-siRNA和HA-core载体 (表达core) 共转染Huh7 细胞, 3 d后Northern杂交分析和Western印记法显示相应的HBV转录体和蛋白水平明显降低, Southern杂交分析显示所有复制形式的HBV DNA显著减少, X siRNA组HBV DNA减少约为95%, 而core siRNA组仅减少约40%。已转染含1.3*wtHBV基因质粒载体的Huh7细胞再被X-siRNA或core-siRNA转染后, core蛋白水平分别降低了89%, 63%, 转染X-siRNA的细胞中HBsAg降低60%, 但转染core-siRNA队HBsAg表达无明显影响 (X-siRNA干扰沉默了所有的病毒转录物, 而core-siRNA仅沉默3.5kb, 3.9kb的mRNA) 。

Ying等[7] 使用了两种不同的细胞株:一种是产生野生型HBV 的HepAD38 细胞株, 另一种是产生针对拉米夫定耐药HBV 的HepAD79 细胞株, 以两种不同剂量 (1.6 μg/ml、4 μg/ml) 注射针对核心区域的siRNA后, 利用实时定量PCR测定发现两种细胞株的病毒水平皆呈剂量依赖性的下降, HepAD38 细胞株为72%与98%;HepAD79 细胞株为75%, 89%。由此看出RNAI不仅对于野生型的细胞株有作用, 对于耐药的细胞株也同样起作用, 从而为临床上对耐药个体的治疗提供指导作用。

朱才等[8] 用含H1启动子的转录载体pSilencer3.1-H1 hygro质粒构建了两条相对于C区的表达载体, 与脂质体Metafectene以不同浓度共转染HepG2.2.15细胞, 在转染后不同时间检测试验组与对照组的HBsAg与HBeAg, 用免疫荧光法检测细胞内HBcAg的表达, 结果显示随着浓度与时间的增加与空白对照组相比, 实验组的对HBsAg和HBeAg抑制率明显增加。两组实验组在72 h之后细胞中HBcAg的表达抑制率分别为76%, 51%。此研究结果初步表明, RNAi体外能明显抑制HBV的复制, 为下一步的体内试验打下了良好的基础。

在体外试验的基础上, 吴莹等[9] 通过尾静脉注射1.3倍的HBV真核表达质粒pHBV1.3建立了小鼠急性乙型肝炎感染模型, 再将其与针对乙型肝炎病毒核心区的siRNA表达载体 (pSI-C) 共注射, 于注射后第6天取血测血清HBsAg (ELISA) , 做肝组织HBcAg免疫组化, 通过RT-PCR检测肝组织HBV C区mRNA转录子的水平。同时设立PBS对照组、无关干扰组与突变干扰组.结果转染后第6天血清HBSAg在pHBV1.3感染组中高表达 (A值为4.08~9.04, 平均值为 5.07±1.07, A值≥2.1 为阳性) , 肝内HBcAg阳性率为5%~10%;pSI-C干扰组HBSAg, HBcAg的表达均受到抑制, 血清HBsAg阴性, A值为0.04~1.5, 平均值为0.62±0.59, 与感染组相比有显著性差异 (P<0.01) , 肝内HBcAg几乎无表达, RT-PCR示肝内HBV C mRNA水平明显降低.而无关干扰pGFP及突变的干扰序列pSI-C mut则无此作用.结论 RNAi技术能特异, 高效地抑制小鼠体内HBV的复制和表达, 提示siRNA作为一种新型抗病毒药物的巨大潜能。

2.3.2 针对S以及P区基因的研究 Mc Carffrey等[10]

后来又用类似方法证实siRNA, 尤其是针对S、P区siRNA能有效抑制Huh7 细胞中转染HBV质粒表达HBsAg。他随后又将体外有效的发夹状HBV-siRNA表达质粒与含有1.3倍长HBV基因组的质粒一起分别注入免疫功能正常和免疫 功能缺陷的小鼠, 结果发现治疗组 (免疫功能正常组) HBV DNA下降77%-92%, 而复制组 (免疫功能缺陷组) HBV DNA下降90%以上, 血清HBsAg下降达85%, 免疫组化法检测发现HBcAg下降99%以上, 且未见严重复作用, 这有力说明siRNA在体内治疗HBV的可行性, 且对HBV复制的各环节均有抑制作用。

Konishi[11] 等通过化学合成siRNA的方法在一种能够持续产生HBV感染颗粒的肝癌细胞系中成功地抑制了病毒复制, 研究通过测定细胞分泌在培养液中HBsAg的滴度, 来评价RNAi抑制病毒的效率, 发现针对多聚酶区的siRNA为78%, 针对S区的siRNA的siRNA为42%, 而作为阴性对照的随机siRNA不能起到沉默RNA的作用, 因为RNAi在治疗HBV感染上发挥着有效的作用, 必须创建一种有效的递药系统, Moore等[12] 合成了与S区基因同源的siRNA, 将其插入到不致病的可以整个到细胞DNA的菌体系统内:原形泡沫病毒 (PFV) 和腺伴随病毒 (AAV) 。再将这两种带有siRNA菌体均分别转染入能够稳定表达HBsAg的293T.HBs细胞和能够分泌感染HBV病毒颗粒的HepG2.2.15细胞。结果显示:转染后7 d, 在293T.HBs细胞组HBsAg表达下降了90%;在HepG2.2.15细胞组及时病毒处在复制期, 其HBsAg表达也被抑制, PCR检测发现前基因组RNA, 转录C区, P区和HBsAg的mRNA, 。他们第一次证实了用病毒作为载体将siRNA导入细胞内在治疗慢性HBV感染有一定的可行性, 从而为在活体内使用病毒导入途径提供了基础。

国内学者刘家云等[13] 选择HBV 表面抗原编码区 (S区) 基因为靶序列, 用含H1启动子的转录载体pSUPER构建了能产生发夹结构siRNA的质粒, 转染入能稳定高效表达HBV的2.2.15细胞, 定量检测细胞上清中的HBsAg和HBeAg, RT-PCR检测靶基因mRNA抑制效果, 结果表明pSUPER-S1和pSUPER-S2均能明显抑制HBsAg和HBeAg的分泌 (P<0.01) , 抑制率分别为83%和78% , RT-PCR结果证实HBV的mRNA明显降低。

2.3.3 针对整个基因组

日本学者Hamasaki等[14] 将针对HBV前基因组RNA的siRNA和HBV DNA共同转染人肝癌细胞, 结果显示HBV前基因组RNA显著减少, HBV DNA的复制水平和相应蛋白水平明显降低。

Ni等[15] 以HBV基因组为靶基因构建了12条 shRNA (pU6-siHBV5) , 将其转染入2.2.15细胞 (能够大量表达HBV病毒颗粒) , 同时设立无关干扰组 (转染pU6- siGFP) , 转染后在不同的时间内用酶联免疫吸附试验测定培养基中的HBsAg和HBeAg, 用多聚酶链反应 (PCR) 测定培养基中的HBV DNA。结果显示, 转染了pU6-siHBV5 4 d后HBsAg和HBeAg的表达分别下降了72.8± 5.4% (P= 0.00003) 和55.8 ± 6.2% (P=0.000026) 。转染6 d后HBV DNA复制的降低达到最大为1.9倍 (P=0.013) 。而在对照组HBsAg和HBeAg含量及HBV DNA的复制无改变。以上结果表明在2.2.15细胞中转染入与某段HBV基因序列相同的shRNA可以特异地抑制HBV蛋白的表达以及HBV DNA的复制。RNA干扰可能作为一种治疗乙肝病毒感染的新方法。

3 问题与展望

目前对于RNAi技术在乙肝中的应用研究还处在开始阶段, 而且大部分是集中在抑制病毒基因转录后的表达, 在转录前, 以及与病毒结合受体方面可以进行尝试。靶区域的选择在RNAi过程中起到了重要的作用, 但是目前来看, 尚无系统的方法能够有效地预测哪些靶位有效。在抑制HBV复制研究中最有意义的结果是:RNAi除了有效抑制活跃复制的HBV, 还能抑制非活跃复制的HBV, 这一点不同于核苷类似物, 因此, 有可能发展成为与拉米夫定, 阿德福韦等核苷类似物作用机制和位点不同的抗HBV药物联合用药。但要将RNAi技术真正应用于临床疾病治疗中, 还需要进一步的研究工作。

RNA干扰论文 篇9

RNA干扰 (RNA interference, RNAi) 现象是指双链RNA (double-stranded RNA, dsRNA) 分子阻断或降低同源基因表达的现象, 即dsRNA与细胞内的同源序列mRNA相结合并使之降解的, 是一种序列特异的转录后基因沉默, 是一项新兴的基因阻断技术, 其作用相当于基因剔除, 导致相应基因的表型缺失[1]。自1998年华盛顿卡耐基研究院Andrew Fire和马萨诸塞大学癌症中心Craig Mello首次发现的RNAi[2]以来, RNAi技术在其机制研究和应用方面均有惊人的进步。Andrew Fire和Craig Mello也因为在RNA干扰及基因沉默领域所作出的杰出贡献, 获得了2006年的诺贝尔生理学或医学奖。

1 RNAi的作用机制

RNAi是一种天然的监管过程, 控制转录后的基因表达, 这一过程需要ATP的参与。首先外源性或内源性的双链RNA (dsRNA) 在胞质内的dsRNA特异性核酸内切酶Dicer (dsRNA-specific endonuclease) 作用下, 被分解为21~23个碱基的双链RNA分子, 这种小的双链RNA分子被称为小干扰RNA (small interfering RNA, siRNA) [3,4,5]。之后siRNA同Agonaute2、核酸、外切酶、解旋酶等一些蛋白酶结合, 形成由RNA所介导的沉默复合物 (RNA-induced silenceing complex, RISC) 。该复合物通过碱基互补配对识别靶mRNA并介导其降解, 从而导致特定基因沉默产生RNAi现象[6]。新产生的siRNA再次形成RISC, 继续介导同源mRNA降解, 从而产生级联放大效应。

最近研究发现, 不仅外源导入siRNA可以触发RNAi抑制基因的表达, 生物体内还广泛存在另一种内源性的小分子非编码RNA-miRNA, 它与siRNA相似, 也具有降解特异靶mRNA或阻遏其转录后翻译的功能。miRNAs广泛存在于植物、线虫和人类细胞中, 可能是一类进化上属于保守、在生命中起着重要调控作用的分子[7]。miRNA是一种内源性的非编码RNA (noncoding RNA, ncRNA) , 由大约21~23 nt组成单链RNA分子。与siRNA一样, miRNA也可以引发RNAi现象, 它们能有效地抑制相关蛋白质的合成, 导致靶mRNA降解, 或以其他形式的调节机制来抑制靶基因的表达, 产生基因沉默。在miRNA生成过程中, 编码miRNA的基因首先转录产生几百至几千nt的初级产物 (pri-miRNA) , 在核内被核酸内切酶 (Drosha酶) 切割成70 nt左右的发夹状前体 (pre-miRNA) 。Pre-miRNA在Ran-GTP和转运蛋白Exportin-5的协同作用下转运出细胞核, 然后经Dicer酶切割成约22 nt的成熟miRNA。成熟miRNA可通过两种机制调控靶基因的表达:一种是结合到靶mRNA的3&apos;UTR部位抑制其翻译;另一种是与siRNA一样, 与靶mRNA结合促进其降解[8,9,10]。miRNA是抑制还是切割靶mRNA取决于miRNA与靶序列互补配对的程度, 互补配对高时可能进行切割, 而配对低时可能只是抑制。

2 RNAi在治疗SLE中的作用

目前RNAi已广泛应用于治疗肿瘤的研究, 作为一种转录后沉默技术, RNAi具有沉默效率高、特异性高、效果好、作用稳定等优点, 因此在免疫系统疾病诊治的研究中也具有无法比拟的优势。

2.1 改变炎性介质的表达

炎症是SLE的主要病理改变, 由趋化因子介导的白细胞活化是组织损伤的病变基础。趋化因子的异常表达会使白细胞大量增加, 对组织器官形成破坏性损伤。内源性的miRNA可以通过与靶mRNA的结合调节炎性介质的表达。赵遐等[11]通过在体外实验中过表达miR-125a证实, miR-125a通过调节转录因子KLF13的表达而调节参与狼疮发病的趋化因子RANTES的分泌。

TIPE2是一种新型的负性免疫调节蛋白, 在固有免疫反应和适应性免疫反应中均发挥负性调节作用[12]。李笛等[13]利用针对TIPE2特意靶点的siRNA转染入人单核细胞系THPI干扰TIPE2的表达后, 抗粘病毒1 (multisystem extension interface, MXI) 的表达降低, TNF-α的表达升高。MXI常用来代表IFN-1表达的总体水平, 提示TIPE2的低表达有可能不能有效地对机体进行负性调控, 使许多炎症因子的表达升高, 参与SLE的发病进程。

2.2 抑制致病基因

由于人类基因组计划的深入研究, 多种自身免疫病易感位点被发现。根据Becker等[14]的研究, 在16号染色体上存在自身免疫病共同致病基因。遗传流行病学及自发性SLE动物模型的遗传背景研究显示其易患性主要由遗传因素决定。OAZ (Olf1/EBF associated zinc finger protein) 基因定位于16q12, 多项研究表明OAZ与SLE的发病相关[15]。Xue等[16]发现OAZ的表达与SLE的活动度明显相关, 在抗DS-DNA、抗SM抗体阳性患者中明显升高, 利用siRNA技术使OAZ表达降低后细胞上清液中的Ig G、ANA、IFN-g、IL-10、IL-12、IL-21均降低, 上述因子均与SLE活动性相关。

2.3 寻找狼疮治疗中的潜在靶点

狼疮肾炎 (lupus nephritis, LN) 是SLE最常见的临床表现之一, 是由于自身抗体和免疫复合物导致肾小球肾炎的自身免疫性疾病。细胞因子在SLE及LN中的作用颇受关注, 多项研究表明TNF-α及其天然抑制物可溶性肿瘤坏死因子受体 (s TNFR) 和狼疮疾病活动相关[17,18]。TNF受体相关因子 (TNF-receptor-associated factor, TRAF) 是TNF-α信号传导途径的重要因子。已有研究表明在免疫复合物介导的LN中, TRAF-2的表达明显增加。Zhu等[18]利用siRNA技术抑制TRAF-2的表达后, 抑制了Aig G诱导的TRAF-2、IL-1β、IL-6升高, 减少了大鼠肾小球膜细胞rat MCs的增殖。从而发现TRAF-2可以成为免疫复合物介导的肾小球肾炎的一个治疗靶点。

Hu等[19]通过利用RNAi技术在MRL/lpr小鼠体内抑制SIRT1的表达, 结果发现组蛋白H3、H4的乙酰化水平暂时升高, 血清anti-ds DNA抗体水平, 肾脏Ig G沉积和肾脏病理指数, 特别是肾小管间质病变明显减轻。尿蛋白和血清ANA水平没有明显变化。Wang等[20]发现miRNA-146a以及miRNA-155可能参与了SLE的发病过程, 并且这两种miRNA可能作为SLE的新的生物标记, 有助于SLE的诊断。