复合酶提取（精选5篇）
复合酶提取 篇1
洋葱为百合科葱属两年生草本植物Allium cepa L.的鳞茎或全草, 又名玉葱、葱头、圆葱、荷兰葱等[1]。该属植物于20世纪引入我国[2], 现广泛分布于甘肃、新疆、内蒙古、山东等地。其性温, 味甘辛, 具有温胃消食、温中下气、解毒杀虫等功效, 适用于宿食无消、小儿蛔虫、皮肤溃疡、痢疾等疾病的治疗[3]。现代医学研究证明, 洋葱含有多糖、黄酮、挥发油等生物活性物质, 具有降血压、降血脂、抗菌等多种生物活性, 对高血压、高血脂、冠心病、动脉粥样硬化等有一定的治疗和辅助治疗作用[4]。目前, 关于洋葱的研究报道, 无论是成分提取还是药效研究都集中在挥发油成分上, 而对于多糖的研究较少, 且关于复合酶热水组合提取工艺尚未见报道。为进一步研究洋葱多糖, 本文考察了复合酶热水组合最佳提取工艺, 以提取率为评价指标, 以期为洋葱多糖的提取提供参考。。
传统热水提取法是利用高温使洋葱细胞壁破裂而使有效成分渗出, 安全、无毒且成本低, 但提取率低, 长时间的提取也会对多糖的生物活性造成影响。酶提取法具有效率高、条件温和、活性保留较好等优势[5]。本文采取组合提取法, 将酶法提取与热水提取结合, 提取率比郭梅等[6]传统热水提取法高11.7%, 比傅冬和等[7]酶法提取高6.46%, 现报道如下。
1 仪器与试药
1.1 仪器
UV-1800紫外可见光光度计 (日本岛津) ;SK5200LH超声波清洗器 (上海科导超声仪器有限公司) ;AB204-N型精密分析天平 (Mettler, Toledo上海衡器公司) ;HH-4数显恒温水浴锅 (江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司) ;TF16D粉碎机 (哈尔滨纳诺医药化工设备有限公司) 。
1.2 试药
冻干洋葱片经鉴定为百合科葱属两年生草本植物Allium cepa L.的鳞茎干燥片。纤维素酶 (和氏璧公司, 3万U/g) 、果胶酶 (和氏璧公司, 5万U/g) 、浓硫酸 (西陇化工股份有限公司, 分析纯) 、苯酚 (分析纯) 、D- (+) -葡萄糖 (批号为110833-9501, 中国食品药品检定研究院) 。
2 方法与结果
2.1 标准曲线制备
准确称取105℃烘干至恒重的D-无水葡萄糖10mg, 加适量水溶解, 转移至100mL容量瓶中, 稀释至刻度线, 配制成0.1mg·mL-1葡萄糖标准溶液, 备用。分别准确移取葡萄糖标准溶液0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL置于干燥具塞试管中, 加水至2mL, 加入5%苯酚1mL, 摇匀, 然后迅速加入5mL浓硫酸, 充分摇匀, 室温放置15min后, 置于40℃水浴保温10min, 取出流水冷却。以2.0mL蒸馏水做空白, 在波长490nm处测定吸光值, 空白对照以蒸馏水代替糖溶液。
以D-葡萄糖浓度 (X) 对其吸光度 (A) 进行回归处理, 得回归方程:A=6.610 6X-0.013 8, R2=0.991 6。线性范围为10~100μg。取样品溶液按标准曲线制备项下方法测定其吸光度, 每隔0.5h测定1次, 结果表明, 样品溶液在2h内稳定性良好。
2.2 洋葱多糖制备和含量测定
准确称量10g洋葱冻干片样品, 加入一定比例的纤维素酶、果胶酶和蒸馏水, 用磷酸盐缓冲液调节pH=5, 50℃水浴条件下提取。将提取液过滤备用, 残渣加入同比例蒸馏水, 100℃水浴提取, 过滤, 合并两次提取液, 浓缩至一定体积, 加入4倍体积的无水乙醇静置过夜, 离心后得到沉淀用丙酮、正丁醇洗涤, 50℃减压真空干燥, 即为洋葱粗多糖。
多糖提取率=6 (A+0.6.1001638) ×m×X1×100%
式中:A为吸光度;X1为稀释倍数;m为原料质量。
2.3 单因素试验
通过前期的试验研究得知, 洋葱多糖量与洋葱冻干片的粉碎度、提取时间、加酶量、加酶比例、物料比等有关, 因此首先通过单因素实验考察洋葱多糖的提取工艺条件。
2.3.1 提取时间与多糖提取率的关系
准确称取洋葱冻干片10.0g, 在1%纤维素酶, 0.3%果胶酶, pH=5.0, 加入30倍蒸馏水, 50℃水浴条件下提取不同时间 (0.5、1h) 。将提取液过滤备用, 残渣加入蒸馏水, 100℃水浴条件下提取不同时间 (0.5、1、1.5、2h) , 取提取液过滤, 合并两次提取液。得到提取时间与多糖提取率的关系见图1。
一般情况下, 多糖提取率随提取时间增加而增加, 复合酶法提取1h时提取率高于0.5h。热水提取时, 1h提取效果优于0.5h, 但少于1.5h和2h。随着时间的增加, 多糖水解为单糖或寡糖, 在醇沉时不易沉淀, 提取率下降。因此, 最佳提取时间为复合酶解提取1h, 热水提取1h。
2.3.2 酶添加量与多糖提取率的关系
准确称取洋葱冻干片10.0g, 按纤维素酶、果胶酶用量1∶1比例考察酶加入量 (1.2%、1.4%、1.6%、1.8%、2%) , pH=5.0, 固液比 (1∶30) 加入蒸馏水, 50℃水浴条件下提取1h。将提取液过滤备用, 残渣加入蒸馏水, 100℃水浴条件下提取不同时间1h, 取提取液过滤, 合并两次提取液。得到酶添加量与多糖提取率的关系见图2。
分析图2可知, 酶添加量在1.2%~1.6%之间, 多糖提取率增长, 随着酶浓度增大, 底物与酶充分反应, 使提取率增加。酶添加量在1.6%~2.0%之间, 多糖提取率趋于平缓。到达一定阶段, 酶处于饱和状态, 增添酶量已不能提高提取率。因此酶的最佳添加量为1.8%。
2.3.3 复合酶比例与多糖提取率的关系
准确称取洋葱冻干片10.0g, 考察纤维素酶、果胶酶用量比例 (1∶1、2∶1、1∶2) , 酶加入量1.8%, pH=5.0, 加入30倍蒸馏水, 50℃水浴条件下提取1h。将提取液过滤备用, 残渣加入蒸馏水, 100℃水浴条件下提取1h, 取提取液过滤, 合并两次提取液。得到复合酶比例与多糖提取率的关系见图3。
根据图3分析, 增加纤维素酶的用量有助于提高多糖提取率, 因此选择纤维素酶与果胶酶用量比例为2∶1。
2.3.4 料液比与多糖提取率的关系
准确称量洋葱冻干片10.0g, 纤维素酶、果胶酶用量比例2∶1, 酶加入量1.8%, pH=5.0, 考察料液比 (15、20、25、30、35倍) , 加入蒸馏水, 50℃水浴条件下提取1h。将提取液过滤, 备用, 残渣加入蒸馏水, 100℃水浴条件下提取1h, 取提取液过滤, 合并两次提取液。得到提取时间与多糖量的关系, 见图4。
如图4所示, 随着料液比增大, 多糖提取也增加, 30倍料液比时达到最高提取率。35倍料液比时, 一方面酶浓度降低, 反应不完全;另一方面, 物料比增大, 有助于多糖水解。因此, 提取洋葱多糖最佳物料比为30倍。
2.3.5 粉碎度与多糖提取率的关系
准确称取洋葱物料10.0g, 考察不同粉碎度, 纤维素酶、果胶酶用量比例为2∶1, 酶加入量为1.8%, pH=5.0, 加入30倍蒸馏水, 50℃水浴条件下提取1h。将提取液过滤, 备用, 残渣加入蒸馏水, 100℃水浴条件下提取1h, 取提取液, 过滤, 合并两次提取液。得到粉碎度与多糖量的关系, 见图5。
由图5可看出, 样品的粒度对多糖提取率的影响很显著。粉碎度为40目的冻干洋葱粉提取率高于直接用冻干洋葱片 (3mm×3mm) 提取, 当洋葱冻干物料目数增大, 即粒度减小、粉碎程度增大时, 多糖提取率都会增大。但通过本实验发现, 药材粉碎过筛越细, 多糖提取率并没有随之提高, 可能是由于样品太细, 过滤时损失造成的。因此提取洋葱多糖粉碎度为40目最佳。
2.4 最佳工艺条件
2.4.1 正交试验设计
通过以上的单因素实验结果, 以多糖提取率为评定指标, 选择提取时间 (A) 、酶加入量 (B) 、物料比 (C) 、粉碎度 (D) 为考察因素, 每个因素选择3个水平, 选用L9 (34) 正交试验表, 实验安排见表1。
2.4.2 正交试验结果准确称取洋葱样品10g, 按照表1正交设计进行试验, 并准确计算多糖提取率。结果见表2。
通过SPSS软件对实验结果进行方差分析, 结果见表3。
注:a, R, Squared=0.993, (Adjusted, R, Squared=0.973) 。
通过极差分析可以看出, 4个因素影响大小依次为:D>C>A>B, 因素B相对于其他三个因素影响非常小, 所以将B作为误差项, 从而再进行方差分析, 由方差分析可知, 因素A、C、D差异有显著性意义 (P<0.05) 。各因素K值大小分别为:A因素为A2>A1>A3, B因素为B2>B3>B1, C因素为C3>C2>C1, D因素为D2>D3>D1, 最佳提取工艺为A2B2C3D2, 即组合提取时间为1h, 1h, 复合酶加入量为1.8%, 加入35倍水, 粉碎粒度为40目。
2.4.3 验证工艺
为了更准确地选择最优条件, 分别采用正交试验结果中测定结果最高组合A1B2C2D2和通过直观分析和SPSS软件分析得到的最佳组合A2B2C3D2, 进行三次验证试验, 按照“2.2”项下方法进行含量测定, 并计算提取率, 结果见表5。
验证试验表明, A2B2C3D2组合提取效率比A1B2C2D2较高, 所以选择最优组合为A2B2C3D2。即组合提取时间为1h, 1h, 复合酶加入量为1.8%, 加入35倍水, 粉碎粒度为40目。
3 讨论
本试验在单因素试验基础上, 采用正交试验设计对洋葱多糖提取进行优化, 并利用统计学方法对该模型进行显著性检验, 得到洋葱多糖的最佳提取工艺为:组合提取时间为1h, 1h, 复合酶加入量为1.8%, 加入35倍水, 粉碎粒度为40目, 在此工艺下多糖提取率为16.24%。验证试验表明洋葱多糖的提取工艺科学可行, 为后续开发利用奠定了基础, 具有一定的理论和实际应用价值。
参考文献
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[7]傅冬和, 李适, 蔡汶莉, 等.纤维素酶提取洋葱多糖工艺研究[J].湖南农业科学, 2012 (23) :80-83.
复合酶提取 篇2
关键词：复合酶 低次烟叶 化学成分 感官评吸
中图分类号：TS761.2 文献标识码：A文章编号：1672-5336（2014）20-0075-03
我国是烟草生产大国，其中废次烟末以及劣质烟叶等占烟叶比重的大部分。废次烟末以及劣质烟叶中的纤维素含量高，糖碱等成分较低，含有的蛋白质等大分子物质使低次烟叶的杂气多而重，香气吃味又不足[1]。由于缺乏适当的调制方法，每年都有大量的低次烟叶被废弃。因此，在目前卷烟原辅材料价格大幅度上涨的情况下，对废次烟末以及劣质烟叶进行处理，提取有效致香成分应用于烟草以及卷烟纸中，不仅能降低生产成本，还可以降低焦油含量，减小健康风险。而且在卷烟纸中添加劣质烟叶提取到的有效致香成分还可以增加卷烟香气，为提升烟草品质做出贡献，因此低次烟叶的合理加工非常重要。
随着近年来生物技术的发展进步，在烟草的加工处理过程中利用现代生物技术已成为当前科技工作者关注的热点，主要目的是用于改善烟叶和烟丝的品质。纤维素酶和果胶酶可将部分细胞壁物质降解，使纤维素和果胶质等细胞壁物质含量均有所降低，细胞壁的降解可以加快有效致香物质的充分释放[2]。将淀粉酶、蛋白酶、糖化酶、纤维素酶和果胶酶等进行配比后添加到烟叶中，可加速烟叶总糖、总氮、烟碱和总挥发碱含量的降解，同时香味物质总量增加，感官质量明显提高，醇化时间缩短[3]。在烟丝中施加转化酶，增加卷烟香气，提高卷烟感官质量，具有较广阔的应用前景[4]。
本文将筛选出复合酶组合用于低次烟叶的处理，探讨其对低次烟叶化学成分及提取有效致香成分应用于卷烟纸中评吸质量的影响，为后续的低次烟叶加工方法选用提供依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
低次烟叶为广东中烟工业有限责任公司某卷烟牌号的加工用低次烟叶，糖化酶、纤维素酶、蛋白酶购买于和氏璧生物技术有限公司。
1.2 试验设计
本试验将糖化酶、纤维素酶、蛋白酶3种酶进行复合配比，将3种复合酶以字母A、B、C表示，每种复合酶设3个水平，具体为：A1、A2、A3复合酶用量分别为0.01%、0.05%、0.10%（w/w）；B1、B2、B3分别为0.01%、0.05%、0.10%（w/w）；C1、C2、C3分别为0.01%、0.05%、0.10%（w/w）；以不加酶的处理为对照，共10个处理，3次重复。
1.3 低次烟叶处理工艺条件
量取配制好的一定量的酶制剂溶液，用自制加料设备以加料方式均匀地喷加到实验烟叶上，把烟叶放入恒温恒湿箱中，在50℃烟叶含水率30%的条件下酶解12h处理后的烟叶在120℃条件下灭活，切丝备用。取灭活后的低次烟叶1kg50℃烘干，粉碎过60目筛，所得粉末即为样品，用于化学成分分析。将化学成分含量和协调性表现最好的处理用于低次烟叶，处理后的烟叶进行提取致香成分，采用过滤袋—陶瓷膜—超滤膜三级提纯工艺，对提取物进行分离纯化，获得烟叶中的致香物质[5]，将所得提取物添加运用到卷烟纸中。
1.4 低次烟叶化学成分分析
烟叶样品50℃烘干，碎后过60目筛，所得烟粉用于烟叶化学成分含量测定，采用烟草行业推荐标准YC/T159～162、173─2002规定的方法测定烟叶样品的还原糖、总糖、烟碱和总氮含量，采用烟草行业推荐标准YC/T35─1996测定总挥发碱含量，并计算氮碱比、糖碱比、糖氮比和两糖差。
1.5 低次烟叶提取物应用在卷烟纸中感官评吸方法
将复合酶处理的烟叶提取物以液体状加到卷烟纸中并卷制成卷烟，对卷烟样品分别从香气质、香气量、烟气浓度、杂气、刺激性、余味、劲头几当面进行感官评价。各指标0-9分之间打分：香气质、香气量、烟气浓度越高，分数越高；杂气、刺激性、劲头越小、余味越干净得分越高。
2 结果与分析
2.1 复合酶处理对低次烟叶化学成分的影响
本研究的质量评定主要参照烟叶的化学成分分析。一般认为烟叶的主要化学成分中，总氮适宜范围是1.5%～3%；烟碱含量适宜范围是1.5%～3%，抽吸品质最好；还原糖含量适宜范围是15%～25%和总糖含量适宜范围是20%～30%，此时的烟叶的品质较好；挥发碱含量0.3%～0.6%，一般来说其值越低越好；而总糖与还原糖之差则是较低比较适宜；氮碱比1：1较好，烟叶品质较好；糖碱比和糖氮比10～15：1比较适宜，以接近10：1最好。
由表1可知：各处理低次烟叶的总糖含量均高于对照，B2，B3均在适宜范围之内；各个处理总糖含量的具体大小顺序为B3>B2>B1>A3>A2>C3>A1>C2>C1，以B3处理为最高，其次是B2、B1。
各处理低次烟叶的还原糖含量均高于对照，且均低于适宜范围之内；各个处理还原糖含量的具体大小顺序为A3=C3>B3>A2=C2>A1=C1>B1，以A3、C3处理为最高，最接近适宜范围，其次是B3、A2、C2。
C3处理的烟碱含量高于对照，A1、C2处理的烟碱含量与对照相同，其余处理的烟碱含量均低于对照，各个处理的烟碱含量均低于适宜范围的下限，C3处理最接近适宜范围。
各处理低次烟叶的总氮含量均高于对照，但均低于适宜范围的下限；各个处理总氮含量的具体大小顺序为C3>C2>C1>B3>A3>B2>A2>A1>B1，以C3处理为最高，其次是C2、C1。
各处理低次烟叶的挥发碱含量均高于对照，但均低于适宜范围的下限；各个处理挥发碱含量的具体大小顺序为C2>C1=B1=B3>A2>A1=A3=B2=C3，以C2处理为最高，最接近适宜范围。
综合各处理低次烟叶的总糖、还原糖、烟碱、总氮、总挥发碱含量来看，C3处理的上述化学成分的含量综合表现最好，其次是B3和C2。
2.2 复合酶处理对低次烟叶化学成分协调性的影响
结果可知：除B1、B2、B3处理后的两糖差高于对照外，其它各处理低次烟叶的两糖差均低于对照；各个处理两糖差的具体大小顺序为B3>B1>B2>A1>A3>A2>C3>C2>C1，以C1处理为最低，最为适宜，其次是C2、C3、A2、A3。
各处理低次烟叶的氮碱比均高于对照。各个处理氮碱比的具体大小顺序为C3>C1>C2>B2=B3>A2>A3>B1>A1，以C3处理为最高，最为适宜，其次是C1、C2、B2、B3。
各处理低次烟叶的糖碱比均高于对照，并且都在适宜范围内；各个处理糖碱比的具体大小顺序为A2>C2>B2>B1>A1>C1>B3>C3>A3。
低次烟叶的糖氮比除去处理C1、C2、C3略低于对照，其他处理均高于对照，并且都在适宜范围内；各个处理糖氮比的具体大小顺序为C3>B3>C2>A3> A2>B2>A1>B1>C1，以C1处理为最低，其次是B1、A1、B2、A2、A3。
综合各处理低次烟叶的两糖差、氮碱比、糖碱比、糖氮比来看，C1处理的上述化学成分含量的协调性指标综合表现最好，其次是C3。
综合各处理低次烟叶的总糖、还原糖、烟碱、总氮、总挥发碱含量以及两糖差、氮碱比、糖碱比、糖氮比来看C3处理（0.10%的复合酶C）的上述化学成分含量以及相互间的协调性指标综合表现最好。
采用相同方式将0.10%的复合酶C处理后的低次烟叶提取物与常规水蒸馏的低次烟叶提取物添加到卷烟纸中进行感官评吸，以没添加任何提取物的卷烟纸进行比较，探讨复合酶处理对低次烟叶感官质量的影响。
2.3 低次烟叶提取物添加到卷烟纸中的感官评吸影响
由感官评吸结果可以看出，未用复合酶处理的低次烟叶提取物加香到卷烟纸后评吸，除去余味没有发生改变外，香气质、香气量、浓度、杂气、劲头、刺激性得分和总评分数均有不同程度的提高；其中香气质得分增幅最大，为24.61%；其它依次是杂气、香气量、劲头、浓度、刺激性。从以上结果可以看出，在添加未用复合酶处理的低次烟叶提取物的前提下，低次烟叶提取物的主要作用体现在明显改善香气质，减少抽吸时杂气和提高香气量。
由评吸结果可以看出，复合酶处理后的低次烟叶提取物加香卷烟纸的评吸，香气质、香气量、烟气浓度、杂气、刺激性、余味、劲头得分和总评分数均有不同程度的增幅；其中余味得分增幅最大，为37.38%；香气质增幅也高达37.38%，其它依次是刺激性、杂气、香气量、劲头和烟气浓度，分别为16.30%、13.36%、8.47%、2.07%、1.66%。从以上数据结果可以看出，经复合酶处理的低次烟叶，加香后的主要作用体现在明显降低余味和刺激性，改善香气质、杂气和香气量。
3 小结
3.1 复合酶处理后低次烟叶化学成分及其协调性的表现
不同复合酶处理后低次烟叶化学成分的含量中，总糖、还原糖、总氮、总挥发碱含量均增加；C3处理的烟碱含量高于对照，A1、C2处理的烟碱含量与对照相同，其余处理的烟碱含量均低于对照。各处理低次烟叶的两糖差均低于对照；糖碱比、氮碱比均高于对照；糖氮比除去处理C1、C2、C3略低于对照，其他处理均高于对照，并且都在适宜范围内。这说明，复合酶处理总体上有利于改善低次烟叶的化学成分含量和相互间的协调性。
综合各处理低次烟叶的总糖、还原糖、烟碱、总氮、总挥发碱含量以及两糖差、氮碱比、糖碱比、糖氮比来看，C3处理（0.10%的复合酶C）的上述化学成分含量以及相互间的协调性指标综合表现最好。
3.2 复合酶处理后低次烟叶提取物添加到卷烟纸后感官质量效果
在添加未用复合酶处理的低次烟叶提取物的前提下，低次烟叶提取物的主要作用体现在明显改善香气质，减少抽吸时杂气和提高香气量。经复合酶处理的低次烟叶，加香后的主要作用体现在明显降低余味和刺激性，改善香气质、杂气和香气量。利用复合酶的提取物加入卷烟纸中与常规提取物加入卷烟纸中相比较，余味和刺激性都有了非常明显的降低，香气质和杂气有小幅度的提高，劲头、浓度以及香气量没有发生太大变化。因此复合酶酶解得到的提取物主要作用体现在明显降低刺激性和余味，改善香气质和杂气。
因此，0.10%的复合酶C处理后低次烟叶的化学成分含量和相互间的协调性、感官质量均得到明显改善。
参考文献
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复合酶提取 篇3
成熟的向日葵盘中富含15-25%的天然低酯果胶, 所以它具有很大的利用价值。目前向日葵盘这的果胶的提取方法有酸法、草酸铵法、六偏磷酸盐法、微波法等。果胶是细胞壁的主要成分之一, 它与纤维素、半纤维素和蛋白质交互关联使织物细胞壁具有一定的机械强度。利用纤维素酶、半纤维素酶和蛋白质酶将细胞壁破坏, 可释放出果胶。酶法是一种环境友好的绿色方法, 不会产生对环境有害的废水, 随着消费者对食品要求的提高, 酶法可作为一种可替换的提取方法, 为绿色食品的开发做出贡献。
本文以向日葵盘为原料, 研究利用纤维素酶、半纤维素酶和木瓜蛋白酶提取低酯果胶的方法。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
向日葵盘 (山西) , 柠檬酸、柠檬酸钠、咔唑、D-半乳糖醛酸、无水乙醇、氢氧化钠、盐酸等 (均为分析纯) , 工业酒精。
纤维素酶 (3万u/g, 上海蓝季科技发展有限公司) , 半纤维素酶 (1万u/g, 上海蓝季科技发展有限公司) , 木瓜蛋白酶 (10万u/g, 南宁庞博生物工程有限公司)
1.2 仪器与设备
SHA-B数显水浴恒温振荡器, AL204分析天平, 电热真空干燥箱, UV757紫外分光光度计, LG10-2.4A高速离心机, 万能药物药物粉碎机, SHZ-D (Ⅲ) 循环水式真空泵, AX超纯水机 (阿修罗) 。
1.3 实验方法
1.3.1 向日葵盘前处理
将向日葵盘上的梗和籽粒除去, 清水 (室温) 漂洗后, 在60℃烘干后, 粉碎, 过60目筛, 室温保存。
1.3.2 果胶提取
将向日葵盘粉按照一定的固液比加入去离子水, 于室温下搅拌一定时间, 脱除色素及小分子物质, 过滤, 分离向日葵盘泥, 再在一定提取条件下提取果胶后, 离心, 取上清液加入到2.5倍提取液体积的4℃酸化乙醇中, 过滤得果胶。再用乙醇洗涤3次, 于60℃烘干, 得果胶产品。
1.3.3 果胶得率的计算
采用咔唑硫酸比色法测定果胶中半乳糖醛酸 (GA) 含量。
最终获得果胶的半乳糖醛酸 (GA) 含量与干向日葵盘质量的比值百分数为果胶的得率, 按下式 (1) 计算:
2 结果与分析
2.1 单一酶加酶量对果胶得率的影响
在料液比 (1:25) 、酶解时间2 h、酶解温度60℃、p H=5的条件下, 分别考察纤维素酶、半纤维素酶及木瓜蛋白酶的加酶量对果胶得率的影响。
对于纤维素酶、半纤维素酶及木瓜蛋白酶, 当加酶量分别为2.0%、1.5%、0.5%时, 获得的相应的最大得率分别为9.98%、7.83%、6.64%。当加酶量达到一定值时, 果胶得率的降低有两方面的原因。一方面, 纤维素、半纤维素及木瓜蛋白的降解物的大量存在使果胶的溶解变的困难;另一方面, 许多杂质进入萃取液增加了溶液的粘度, 传质阻力变大, 扩散速度变慢, 最终果胶的溶解减少。当用木瓜蛋白酶时, 小分子的蛋白质还会对果胶成分产生包埋效应, 对果胶的溶解产生阻力作用。
2.2 复合酶加酶量的正交实验优化
在2.1的基础上, 通过L9 (3) 4的正交实验设计来获得最佳的复合酶量。实验在料液比 (1:25) 、酶解时间2 h、酶解温度60℃、p H=5的条件下进行 (如表1) 。
结果显示, 这三种酶对果胶得率的影响程度依次为:纤维素酶>半纤维素酶>木瓜蛋白酶。最佳组合是A2B1C2 (1.0%纤维素酶、1.0%半纤维素酶、0.5%木瓜蛋白酶) , 得率为11.45%。在较低的加酶量下 (总加酶量为2.5%) , 就可获得较高的得率, 可能是因为半纤维素酶和木瓜蛋白酶可提高纤维素酶的利用率, 从而快速将果胶从细胞壁这释放出来。
2.3 复合酶法的单因素实验
在复合酶量正交试验的基础上, 选取1.0%纤维素酶、1.0%半纤维素酶、0.5%木瓜蛋白酶作为复合酶量。
2.3.1 料液比对果胶得率的影响
在酶解时间2 h、酶解温度60℃及p H=5的条件下, 分别控制料液比为1:15~1:35时, 研究料液比对果胶得率的影响。
随着料液比的增大, 果胶得率增长较快, 达到一定值后, 有轻微的降低, 料液比 (1:25) 时, 获得11.45%的最大提取率。在较低料液比下, 即使果胶被提取出了, 但已经达到了该温度下果胶的溶解限, 致使果胶不能被完全溶解。在较高料液比时, 溶液中的酶浓度较低, 在有限的时间内, 果胶未能完全提取出来。
2.3.2 酶解时间对果胶得率的影响
在料液比 (1:25) 、酶解温度60℃及p H=5的条件下, 分别控制酶解时间为0.5 h~2.5 h, 研究不同酶解时间对果胶得率的影响。
酶解时间增长, 果胶得率越大, 达到一定值后, 有轻微的降低, 酶解时间2 h时, 可获得最大提取率11.45%。这是由于酶解时间越长, 水解产物越多, 产生的小分子物质及杂质与果胶互相竞争, 使果胶得率有了些微减小。
2.3.3 酶解温度对果胶得率的影响
在料液比 (1:25) 、酶解时间2 h及p H=5的条件下, 分别控制酶解温度为45℃~70℃, 研究不同酶解温度对果胶得率的影响。
酶解温度对果胶提取的影响, 是通过温度影响酶的活性, 从而影响果胶的提取。随着温度的升高, 果胶得率先增大后减小, 60℃时达到最大11.45%, 故60℃为最佳提取温度。
2.3.4 p H对果胶得率的影响
在料液比 (1:25) 、酶解时间2 h及酶解温度60℃的条件下, 分别控制p H为, 研究不同p H对果胶得率的影响。
p H是影响酶活性的又一重要因素, 果胶得率随p H的增大, 先增大后减小, p H=5时达到最大值11.45%。
2.4 复合酶法的正交试验优化
在1.0%纤维素酶、1.0%半纤维素酶、0.5%木瓜蛋白酶的加酶量下, 根据单因素试验结果, 对料液比、酶解时间、酶解温度、p H值这四个因素进行正交试验优化。
结果显示, 这四个因素对果胶得率的影响程度依次为:p H>酶解时间>温度>料液比。最佳组合为A1B2C2D2, 即在料液比为1:25、酶解时间2 h、酶解温度60℃、p H=5时, 果胶得率为11.45%。各因素对果胶得率的影响程度与单因素试验的结果基本一致。
3 结论
采用1.0%纤维素酶、1.0%半纤维素酶和0.5%木瓜蛋白酶组成的复合酶提取向日葵盘中的果胶, 在料液比1:25、提取时间2 h、温度60℃及p H=5的最优条件下, 可获得提取率为11.45%的果胶。
酶法提取条件温和, 是一种环境友好的绿色方法。本文的研究旨在为绿色食品的研发提供一种选择和依据。虽然现阶段比较昂贵, 但随着酶制剂价格的减低, 它将会为绿色食品的开发做出贡献。
参考文献
[1]张磊, 柳红东, 刘忆冬, 等.向日葵盘果胶的提取工艺条件研究[J].化工技术与开发, 2008 (6) :33-35.
[2]王琨, 华霄, 杨瑞金, 等.正交试验优化向日葵盘果胶的提取和基本分析[J].食品科学, 2013 (14) :1-5.
复合酶提取 篇4
冷却肉(chilled meat)是严格按照宰前检验和宰后检疫,在宰后24 h内迅速降至0℃-4℃,并在随后的加工、冷藏、运输及销售等环节中始终保持在0℃—4℃范围内的生鲜肉[1]。但是,冷却肉在0℃—4℃条件下,并不能完全抑制微生物的生长繁殖,涂膜保鲜对肉类中微生物繁殖和脂肪氧化等可起到抑制作用,从而有效可以延长冷却肉的货架期[2]。
壳聚糖(chitosan)是甲壳素脱乙酰基的降解产物,具有良好的成膜性,它作为天然和安全肉类防腐保鲜剂的开发已成为国内外肉品保鲜剂的研究热点[3]。然而,壳聚糖只具有较强的抗菌活性,对于肉类保鲜,必须增加其抗氧化活性。目前最常用的抗氧化剂为BHA和BHT,虽然这些人工合成抗氧化剂因其稳定性高、高效、价廉等优点被广泛应用。随着人民生活水平的提高和安全营养食品的兴起,人们越来越强调食品的纯天然和安全性。所以,开发利用天然生物物质代替人工合成物质已成为当今食品科学的发展趋势[4,5,6]。薄荷(Menthahaplocalyx Briq.)为唇形科植物薄荷的地上干燥部分,其提取液除具有一定的抑菌作用外,还具有较强的抗氧化能力。薄荷提取液的主要抗氧化成分为黄酮类、酚类及其衍生物,可以作为强有力的自由基清除剂,显示出它在食用油脂抗氧化方面的巨大潜力[7]。
本文以壳聚糖为原料,加入薄荷提取液制备复合保鲜剂,对冷却肉进行涂膜处理,测定细菌总数、挥发性盐基氮(TVB-N)、汁液流失率、硫代巴比妥酸反应物值(TBARS值)和pH值等指标,为延长冷却肉的货架期提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与设备
新鲜猪肉(屠宰后12 h以内)购于昆明理工大学白龙校区农贸市场;薄荷,新鲜采摘;壳聚糖,脱乙酰度96%,青岛奥福隆生物科技有限公司;其它试剂均为分析纯。
RW20 digital型数显机械搅拌器,德国IKA公司;TU—1901紫外可见分光光度计,北京普析通用仪器有限责任公司;TGL—16G型高速冷冻离心机,北京海诚中仪科技有限公司;HH—2型恒温水浴锅,金坛市杰瑞尔电器有限公司;SHZ—D(Ⅲ)型循环水式真空泵,巩义市予华仪器有限责任公司。
1.2 实验方法
1.2.1 薄荷提取物的制备
称取20 g新鲜薄荷叶,35℃真空干燥后粉碎过筛,加入200 m L蒸馏水,85℃搅拌提取2 h,过滤,4℃下储藏备用。
1.2.2 壳聚糖薄荷提取液复合保鲜剂的制备
称取一定量的壳聚糖,溶于体积分数为2%的乙酸溶液中,形成壳聚糖溶液;将薄荷提取液于室温搅拌下逐渐加入壳聚糖溶液中,充分混合均匀后,真空脱气30 min,制得壳聚糖薄荷提取液复合保鲜剂。
1.2.3 猪肉涂膜处理
将猪肉分割成100 g 1份,浸泡于保鲜剂中1 min,捞起沥干。涂膜处理后,用PE保鲜膜包装,置于4℃冰箱内贮藏,每2 d测定猪肉各项指标的变化[8]。壳聚糖薄荷提取液复合保鲜剂涂膜实验分组设计见表1。
1.2.4 贮藏期间各指标的测定
细菌总数的测定:参照GB/T 4789.2—2010。评价标准:CFU小于4的为新鲜肉,CFU在4到6之间的为次鲜肉,CFU在6以上的为变质肉。
挥发性盐基氮(TVB-N)的测定:参照GB/T5099.44—2003,采用半微量扩散法。评价标准:TVB-N≤15 mg/100 g的为一级鲜度,TVB-N≤20 mg/100 g的为二级鲜度,TVB-N>20 mg/100 g的为变质肉。
汁液流失率的测定:汁液流失量/原料肉的重量=汁液流失率(%)。
硫代巴比妥酸反应物值(TBARS)的测定:准确称取融化均匀的油脂样品10 g,加入25 m L三氯乙酸振摇半小时,双层滤纸过滤。准确移取上述滤液5 m L置于25 m L比色管内,加入5 m L TBA溶液,混匀,加塞,置于90℃水浴内保温40 min,取出,冷却1 h,移入小试管内,离心5 min,上清液倾入25 m L纳氏比色管中,加入5 m L氯仿,摇匀,静置,分层,吸出上清液于532 nm波长比色。
p H值的测定:取10 g猪肉样品充分磨碎,加入100 m L蒸馏水,搅拌5 min混匀,振荡15 min,过滤,取滤液用酸度计测定[9]。评价标准:pH在5.8—6.2之间为新鲜肉,p H在6.3—6.6之间为次鲜肉,p H在6.7以上为变质肉。
2 结果与讨论
2.1 不同处理对冷却肉细菌总数的影响
壳聚糖有很好的抑菌效果,且能与天然物质中的成分组成多因子的协同作用[10],而薄荷提取物有一定的抗氧化性,在贮藏期间能够延缓冷却肉的氧化,起到更佳的保鲜作用。
从图1可以看出,不同实验组的细菌总数在贮藏初期显示下降趋势,随后又随着贮藏时间的增加而增大。对照组的细菌总数在贮藏期内一直增加。贮藏到第3 d时,其菌落总数已达到次鲜肉标准(4.03 CFU/g);贮藏到第21 d时其菌落总数已经超过了腐败水平(6.18 CFU/g)。实验期间,各实验组均未超过腐败水平,贮藏到第12 d时,实验组1达到次鲜肉标准(4.07 CFU/g);贮藏到第15 d时,实验组2达到次鲜肉标准(4.01 CFU/g);贮藏到第21 d时,实验组3、4才达到次鲜肉标准(4.32 CFU/g,4.28 CFU/g)。实验组与对照组之间差异显著(p<0.05),且壳聚糖薄荷提取液复合保鲜剂的抑菌能力随薄荷提取物浓度的增大略有增加。
2.2 不同处理对冷却肉TVB-N的影响
冷却肉贮藏过程中,在酶和细菌的作用下,由于肉类的蛋白质分解会产生氮及胺类等碱性物质,导致TVB-N值的升高。从图2可以看出,各组的TVB-N值随着贮藏时间的增加而增加。其中空白对照组贮藏到第6 d已经变成二级鲜度(15.48 mg/100 g),第21 d已经超过变质肉标准(21.03 mg/100 g)。各实验组对样品的TVB-N值的增长均有一定的抑制作用,在储藏期间均为变质。贮藏到第12 d时,实验组1、2达到二级鲜度(15.14 mg/100 g,15.08 mg/100 g),贮藏到第15 d时,实验组3、4达到二级鲜度(15.03 mg/100 g,15.07 mg/100 g),且随着薄荷提取物含量的增加,TVB-N的变化幅度减小。
2.3 不同处理对冷却肉汁液流失率的影响
冷却肉汁液流失的原因在于蛋白质胶体发生了不可逆的变化,该变化导致不能继续保持凝胶结构中的水分,从而使之流出组织。由图3可以看出,空白对照组冷却肉的失重率较严重,贮藏第12 d时已超过3%,贮藏到第21 d时,空白对照组达到4.32%,而实验组的汁液流失率仍在3%以下,分别为2.28%,2.04%,2.16%和1.96%。贮藏期间各组的汁液流失率均呈上升趋势,实验组的差距并不明显,总的来说,汁液流失率随着薄荷提取物浓度的增加呈下降趋势。结果表明,添加了薄荷提取物的壳聚糖膜一定程度上减小了冷却肉的水分蒸发,能减少失重。
2.4 不同处理对冷却肉TBARS值的影响
TBARS值是评价油脂的氧化程度最常用的方法。氧化的油脂多生成丙二醛,一分子的丙二醛可同两分子的硫代巴比妥酸(TBA)作用生成有色化合物,该化合物在532 nm左右有吸收,因此,可通过测丙二醛的量来评价油脂的氧化程度[11]。从图4可以看出,在贮藏期内,随着贮藏时间的延长,TBARS值呈上升趋势,其中,空白对照组的TBARS值增长较快,第15 d时已经达到2.73 mg/kg;第21 d达到3.11 mg/kg。实验组的TBARS值相对较小且增长缓慢,且随薄荷提取物浓度的增大而增大,说明试验用复合膜具有一定的抗氧化作用,能有效控制TBARS值的上升。
2.5 不同处理对冷却肉p H值的影响
贮藏过程中乳酸菌可能会引起p H值的变化,随着贮藏时间的延长,其他微生物的生长占优势,分解蛋白质导致pH提高。由图5可知,在整个贮藏期内,pH值呈先略微下降后上升的变化趋势,对照组与各实验组的变化趋势相同,但对照组的p H值较实验组偏高,这说明保鲜剂可以控制产品的p H值的升高,这是由于壳聚糖能有效抑制细菌和真菌的生长和繁殖,与一般抑制剂相比,它具有抑菌活性高、广谱、杀灭率高等优点[12]。从结果上看,实验组2、3、4的pH值相对较低,说明添加了薄荷提取物的壳聚糖复合保鲜剂能更有效的降低冷却肉的p H值,且随薄荷提取物含量的增加效果更明显。
3 结论
通过上述实验研究表明,壳聚糖薄荷提取物复合保鲜剂可以明显提高冷却肉的保鲜效果。复合保鲜剂能有效的降低冷却肉的细菌总数、TVB-N值,控制样品pH值的上升,并且随着薄荷提取液浓度的增加,保鲜效果略有增强。与空白对照组相比,添加壳聚糖的实验组1,至少可延长货架寿命8 d左右,添加壳聚糖薄荷提取液复合保鲜剂的实验组2、3、4,尤其是添加了8%薄荷提取液的实验组4,至少可延长货架寿命10 d以上。薄荷来源较广、成本低、具有一定的抗氧化性,本实验中使用薄荷提取液与壳聚糖复合制成保鲜剂,对冷却肉有良好的保鲜效果,能有效延长货架期。
参考文献
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复合酶提取 篇5
1 材料与方法
1.1 试剂与仪器
1.1.1 试验材料与试剂。
酸枣仁, 购自安徽亳州中药饮片场, 产自安徽亳州。酸枣仁皂苷A与皂苷B标品, 购自上海顺勃生物工程技术有限公司;乙腈、甲醇为色谱纯, 其余试剂均为分析纯。纤维素酶、果胶酶购自天津市利华酶制剂厂。
1.1.2仪器。
岛津LC-10A制备型高效液相色谱仪 (日本岛津公司) , RE-5002旋转蒸发仪 (北京瑞成伟业仪器设备有限公司) , 精密电子天平 (上海君鹰衡器有限公司) 。
1.2 试验设计
1.2.1 酸枣提取前不同方法预处理试验。
将同产地同批次酸枣仁随机分为3组, 2 kg/组, 分别采用对流干燥、微波干燥和微波-对流干燥3种方式进行干燥预处理[4]。对各组处理后的酸枣仁进行脱脂干燥, 计算酸枣仁脱脂后收率, 以确定酸枣仁提取前的最佳干燥预处理方式。
1.2.2 生物复合酶酶解正交试验。
以酶解温度、酶的p H值、纤维素酶与果胶酶复合比及酶解时间为变量, 进行了L9 (34) 设计正交试验, 以酸枣仁中皂苷A与皂苷B得率为指标, 进行多指标综合评分, 优化酸枣仁酶法提取工艺条件。在设计复合酶比例时, 固定纤维素酶用量为30 U/g, 正交试验因素水平设计见表1。
注:复合比表示纤维素酶与果胶酶活力单位之比。
1.3 试验方法
1.3.1 酸枣仁提取物制备。
酸枣仁预处理后进行粉碎, 用石油醚脱脂, 收集石油醚提取液, 对所得滤渣在60℃干燥4 h, 然后称取50 g酸枣仁脱脂后的滤渣, 按表1进行正交试验, 提取液经压浓缩回收溶剂, 并干燥[5]。
1.3.2 供试品与对照品溶液制备。
对照品溶液的制备方法为:分别精密称取酸枣仁皂苷A和皂苷B对照品各12.50、13.25 mg, 分别置于25 m L容量瓶中, 加甲醇溶解并定容至刻度, 得到浓度为0.50、0.53 mg/m L的酸枣仁皂苷A、酸枣仁皂苷B对照品溶液。供试品溶液制备方法同对照品溶液, 即取酸枣仁提取物, 按对照品溶液制备方法制备即可。
1.3.3 酸枣仁皂苷A、皂苷B的含量测定。
采用高效液相色谱法 (HPLC) 检测不同生物复合酶酶解条件下酸枣仁中皂苷A、皂苷B的含量。色谱条件为色谱柱, VP-ODS色谱柱 (150 L×4.6μm) ;流动相, 乙腈∶水=31∶69;流速0.8 m L/min;检测波长200 nm;柱温20℃;理论塔板系数≥2 000。
2 结果与分析
2.1 酸枣仁提取前干燥预处理试验结果
不同干燥方式对酸枣仁的干燥时间、颜色变化及提取率的影响见表2。
根据表2中各组酸枣仁干燥预处理方案的研究结果可知, 微波-对流干燥预处理的效果最为理想。
2.2 生物复合酶酶解正交试验结果
生物复合酶酶解正交试验结果见表3。从表3分析可知, 以综合评分为标准, 在所选因素水平范围内, 影响酸枣仁提取效果各因素的主次关系为:酶解温度>纤维素酶与果胶酶复合比>酶解时间>酶解p H值。温度对酸枣仁提取效果影响最大, 是主要影响因素, 纤维素酶与果胶酶的复合比影响较小, 提取时间与酶解液p H值对酸枣仁提取效果影响最小, 因此酶法提取的最佳工艺条件为A1B3C3D2, 即温度40℃、p H值5.0, 纤维素酶与果胶酶用量均为30 U/g生药, 酶解时间为5 h[6,7]。
3 结论与讨论
根据酸枣仁提取前干燥须处理试验, 得出微波-对流干燥须处理方法为最佳预处理方式。采用正交试验分析法对酸枣仁中皂苷A、皂苷B的生物酶提取工艺研究的工艺参数进行优化, 将酶解温度、酶的p H值、纤维素酶与果胶酶复合比及酶解时间4个因素作为主要影响因素, 最终确定最佳工艺条件为温度40℃、p H值5.0, 纤维素酶与果胶酶用量均为30 U/g生药, 酶解时间为5 h, 在此条件下酸枣仁中皂苷A、皂苷B的提率最高。
参考文献
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