脐血造血细胞（精选8篇）
脐血造血细胞 篇1
摘要：目的:比较多种分离方法分离脐血造血细胞的效率。方法:依据随机方法将133例脐血标本分为3组, A组选择HES法, B组选择Ficoll法, C组选择明胶法。所有标本均进行CD34+细胞检测, 同时进行造血祖细胞体外培养。结果:A组CD34+细胞产率明显高于B组, C组CD34+细胞产率明显高于B组, A组CD34+细胞产率明显C组, 组间两两比较差异有统计学意义 (P<0.05) ;A组CFCs产率明显高于B组, C组CFCs产率明显高于B组, A组CFCs产率明显C组, 组间两两比较差异有统计学意义 (P<0.05) 。结论:在分离脐血造血细胞过程中, HES法的分离效率高于HES法、明胶法。
关键词：脐血造血细胞,HES法,Ficoll法,明胶法,效率
脐血造血细胞分离是脐血移植过程中的重要环节, 也是脐血库建立的关键性步骤, 对血液病患者的疾病治疗有着重要的作用。目前, 最常见的脐血造血细胞分离方法为HES法、Ficoll法、明胶法, 其中HES法的分离效率较高, 其体积浓缩效果较好。本研究将133例脐血标本分为3组, 3组分别应用HES法、Ficoll法及明胶法, 比较3组的分离效果, 现报道如下。
1材料与方法
1.1材料
本研究共133例脐血标本, 均由我市某医院妇产科提供, 脐血标本采集量50.2-140.5ml, 平均81.7ml。标本采集后保存于4℃的温度条件下, 保存时间控制在24h之内。依据随机方法, 将133例脐血标本分为3组, A组45例, B组44例, C组44例。
1.2方法
1.2.1 HES法
A组45例标本选择HES法, 即在整份脐血中加入25%的羟乙基淀粉60g/L, 混合均匀后进行500r/min离心处理, 时间控制在5min, 之后去掉红细胞, 再进行1200r/min离心处理, 时间控制在13min, 将部分血浆去掉, 确保体积浓缩至25ml左右, 最后将白细胞重悬在剩余的血浆中。
1.2.2 Ficoll法
B组44例标本选择Ficoll法, 即选择Ficoll 10ml, 相对密度为1.077, 将其置于离心管 (50ml) 中。每例标本取10ml脐血, 并置于液面上, 之后进行1800r/min离心处理, 时间控制在10min, 选择白细胞层重悬在RPMI 1640培养液10ml中。
1.2.3明胶法
C组44例标本选择明胶法, 即从44例标本中顺利取出20ml, 并放置于离心管 (50ml) 与30g/L明胶 (20ml) 中, 混合均匀后, 进行30min沉降处理, 之后将上清液置于另一个离心管 (50ml) 中, 添加50% 30g/L明胶, 进行30min沉淀处理, 保留上清液。
1.2.4 CD34+细胞检测
抗体主要选择美国Pharmigen公司生产的抗人CD34抗体, 同时选择美国Becton Dick-inshon公司生产的流式细胞仪进行检测。将抗体20μl置入脐血100μl中, 混合均匀后在4℃温度条件下进行30min孵育, 选择氯化铵裂解红细胞, 时间控制在30min, 之后进行两次PBS洗涤, 选择多聚甲醛进行固定后再实施检测, 同时开淋巴细胞窗。
1.2.5造血祖细胞体外培养
选择体外培养方法, 培养体系主要选择甲基纤维素半固体培养基, 其包括四个成分, 即白细胞介素-3 (10ng/ml) 、粒细胞集落刺激因子 (200ng/ml) 、干细胞因子 (50ng/ml) 、红细胞生成素 (1U/ml) 。选择2×105个有核细胞, 将其置于2ml培养体系中, 并在体积分数保持在5% CO2、温度保持在37℃基础上进行14d的培养, 之后分别计数BFU -E、CFU -GM以及CFU -Mix, 同时准确计算出三者之和, 即CFCs[1]。
1.3统计学方法
选择SPSS10.0软件进行统计分析, 计量资料用均数±标准差 (x±s) 表示, 选择ANOVA与Bonferroni两两比较方法进行分析, 当P<0.05时表示差异有统计学意义。
2结果
2.1 CD34+细胞产率
A组分离前CD34+细胞为 (8.81±1.90) ×107, 分离后CD34+细胞为 (8.67±1.67) ×107, 产率为 (98.15±5.68) %;B组分离前CD34+细胞为 (1.08±0.40) ×107, 分离后CD34+ 细胞为 (0.36±0.01) ×107, 产率为 (32.85±4.77) %;C组分离前CD34+细胞为 (2.17±0.69) ×107, 分离后CD34+细胞为 (2.08±10.36) ×107, 产率为 (81.46±5.93) %。A组CD34+细胞产率高于B组, C组CD34+细胞产率高于B组, A组CD34+细胞产率高于C组, 组间两两比较差异有统计学意义 (P<0.05) 。
2.2 CFCs产率
A组分离前CFCs为 (2.41±0.31) ×106, 分离后CFCs为 (2.20±0.33) ×106, 产率为94.56%;B组分离前CFCs为 (3.07±0.40) ×105, 分离后CFCs为 (9.57±0.86) ×104, 产率为30.87%;C组分离前CFCs为 (5.88±0.81) ×105, 分离后CFCs为 (5.22±0.58) ×105, 产率为78.49%。A组CFCs产率高于B组, C组CFCs产率高于B组, A组CFCs产率高于C组, 组间两两比较差异有统计学意义 (P<0.05) 。
3讨论
脐血是临床医学中重要的造血干细胞来源, 其可以替代骨髓实施造血干细胞移植, 在血液疾病治疗中发挥重要的作用。在脐血移植及脐血库建立中, 脐血干细胞分离技术起着积极性的作用, 科学、 有效的分离技术可以快速分离脐血中的有核细胞, 为脐血库的建立奠定基础[2]。
Ficoll法、明胶法、HES法是目前科研中广泛应用的脐血干细胞分离方法, 不同的分离方法, 其对造血细胞回收所产生的影响也有所不同, 分离效率也不尽相同。运用Ficoll法进行分离, CD34+细胞损失超过60%以上, 干细胞丢失严重, 且每次仅可分离出较少的脐血量, 在脐血库建立中存在一定的局限性。应用明胶法分离时, CD34+ 细胞损失率低于Ficoll法, CFCs损失率也比较低, 对脐血库建立非常有利, 但经明胶分离后, 终体积所占的比率比较大, 约为原体积的75%。HES法具有操作简单、用时少、分离效率高、体积浓缩效果好等多种优点, 其CD34+细胞损失率通常不超过5%, CFCs损失率通常不超过10%, 且其分离后终体积所占的比率比较小, 通常不超过原体积的25%。本研究将133例脐血标本分为3组, A组应用HES法, B组应用Ficoll法, C组应用明胶法, 结果显示, A组CD34+细胞产率及CFCs产率均高于B组、C组, 证实HES法分离脐血造血细胞的效率高于Ficoll法、明胶法。
综上所述, 在分离脐血造血细胞中, HES法分离效率较高, 其分离效果优于Ficoll法与明胶法, 有助于脐血库建立, 是分离脐血造血细胞首选的方法, 值得推广。
参考文献
[1]王颖超, 殷楚云, 冯磊, 等.三种不同方法分离脐血造血干细胞的效果比较[J].实用儿科临床杂志, 2012, 27 (10) :766-768+794.
[2]陈林, 张坤, 邵文陶, 等.脐带血造血干细胞分离冻存方法优化[J].重庆理工大学学报 (自然科学) , 2014, 28 (12) :82-86.
脐血代骨髓腐朽化神奇 篇2
50多年后，人类白细胞抗原（HLA）的发现与研究，为骨髓移植和其他器官移植提出了成败的关键所在。
十多年前，科学家们在新生儿脐带血中发现了造血干细胞，这又意味着什么？
小女孩得了再生障碍性贫血
照片上这位站在医生旁边、小脸圆圆的女孩，名叫王 ，今年12岁。你看她，展示“胜利”标志的小手举得多高啊！
经脐血造血干细胞移植治疗，身患再生障碍性贫血、生命一度垂危的她，终于在上海市第一人民医院血液科无菌病房迎来了新世纪的第一道曙光。现在，她就要靠自己的双腿走着出院了，她怎能不开心？！
家住上海闵行的王 ，读小学四年级时因发现双下肢有出血点，最后确诊患有再生障碍性贫血。随着病情的加重，她再也没能返回课堂。头昏心慌、全身无力以及时而出现的出血倾向，使她成天与床相伴;
久困床塌导致双腿肌肉渐渐萎缩后，独立行走对她来讲都成了问题。
上海市第一人民医院血液科主任王椿教授告诉记者，再生障碍性贫血（简称“再障”）是一种因造血干细胞受损引起骨髓造血功能衰竭的血液病。造血干细胞是通过增殖和分化生成各种血细胞如红细胞、白细胞、血小板的原始细胞。一旦造血干细胞受损，将引起血细胞全线下降。红细胞减少引起贫血，白细胞减少容易感染，血小板减少则有出血倾向。王椿教授介绍说，“再障”病人大半因贫血或发现有出血现象前来就诊。病人若因急性再障或慢性再障而转为重型再障，预后就比较差，最后往往因颅内出血、心力衰竭、严重感染而死亡。
王 用了中药，西药，国产药，进口药，病情没能控制。她只有靠十天半月一次的输血维持着奄奄一息的生命。
听说上海市第一人民医院血液科主任王椿教授通过外周血移植治疗再生障碍性贫血获得成功，王 的父亲看到了一线希望。
去年底，极度虚弱的王 由父亲背着走进了上海市第一人民医院。
脐血移植扭乾坤
就目前来讲，临床上治疗重型再障最有效的治疗办法惟有移植造血干细胞。然而，从中华骨髓库查询的结果令人失望:没有与王 配型理想的骨髓。
望着小姑娘的病情一天天恶化，王椿教授的心一阵阵发紧。
能否采用非亲缘性脐血造血干细胞移植来挽救患者幼小的生命？
其实，此想法在他心中酝酿多时了。这位曾在加拿大留学的血液病专家告诉记者，1983年外国科学家爱德华首次在新生儿脐带血中发现了造血干细胞;1988年世界上第一例临床脐血移植在法国获得成功。到目前为止，全世界接受脐血造血干细胞移植治疗的儿童和成人患者已达1500例以上，国内也有几例成功的报道。
立即为王 寻找合适的脐血！
小姑娘十分幸运。她的资料上午传真到山东脐血库，下午就有好消息传回上海:在4000多份脐血样本中，白细胞抗原（HLA）完全符合(6个位点一致)的“缺”;5个位点相同且红细胞血型（ABO）一致的有两份。
王椿教授解释说，脐血是没有与外界接触的血，相对成人骨髓来讲要纯净得多，抗原性也弱。因此，移植后排异反应的发生率比骨髓移植要低得多;而且一旦出现排异反应，其程度也轻得多。这样一来，脐血移植的配型要求远不及骨髓那么严格，即使1～3个位点不合也能移植。但从理论上讲，当然是配型愈接近移植效果愈好。
“脐血中有核细胞数量的多与少是评判脐血质量、预测移植成功的重要依据。”王椿教授强调。造血干细胞存在于有核细胞之中;有核细胞数量愈多，意味着生成血细胞的“种子”愈多。因此，在两份5个位点都相同的脐血中，王椿教授果断选择了有核细胞数多的那份！
2000年12月16日，在做好充分的前期准备后，40多毫升的脐血通过静脉缓缓进入王 体内。与此同时，抗感染、重建免疫功能等一系列工作随之启动。
一个月、两个月、三个月，移植后所进行的一次次特殊检测表明:脐血中的造血干细胞如同一粒粒饱满的种子，在王 的骨髓中扎下根来。红细胞、白细胞、血小板的数量在她血液中全面提升……
小姑娘苍白的脸上渐渐出现了红晕，小腿也感到有劲了。她如同刚刚苏醒的小苗渴望阳光雨露那样，嚷着要吃东西了。她的父亲高兴地说，有时候，女儿自己非要跑去打饭呢！
王 从无菌室转入普通病房，身体在一天天恢复。
脐血何以这般神奇
众所周知，产妇正常分娩时，胎儿、脐带、胎盘依次逐渐离开母体。脐血即存在于脐带之中的血。
上海妇产科专家王德芬说，通常作为丢弃物的胎盘、脐带，人们对其价值早就有所认识。如在我国传统医学中，胎盘经特殊处理后能制成具有滋补功效的中药。但人类对自身的了解还是很有限的。随着科学技术的进一步发展，胎盘、脐血中的很多“宝贝”将不断被揭示出来。如果通过一定的技术方法利用这些“宝贝”造福人类，是件功德无量的事。
上海市血液中心副主任、输血研究所所长高峰研究员介绍说，当一个人因某种原因（包括原因不明的或肿瘤病人放疗、化疗后）引起骨髓造血功能衰竭后，移植造血干细胞是目前最行之有效的治疗方法。试想一下，若把曾经当作污秽物丢弃的脐血采集下来，从中把造血干细胞分离出来、冷冻起来，该会为多少需要造血干细胞的患者带来转机啊！
接着，高峰研究员介绍了造血干细胞先是在骨髓、胎儿肝、外周血中发现，后来才在脐血中发现的研究轨迹。他说，前三个来源均受到不同程度的限制，惟有脐血来源充足广泛。他强调指出，脐血不仅来源充足，而且可以将其中的造血干细胞保存在液氮－196℃中随时备用，不像骨髓捐献那样受到这样那样的限制。更何况脐血的配型成功概率比骨髓的要高出10倍以上。因此，脐血是大有可为的！
王椿教授则从临床工作中深感脐血移植意义重大。他说，非亲缘性造血干细胞为临床提供了越来越广泛的用途，如治疗血液病，许多儿童和成人因此获得长期生存甚至痊愈。我国的骨髓移植，过去主要在患者的同胞兄弟姐妹中寻求，但在如今以及未来的、以独生子女为主的环境中，谁向患者提供？含有大量造血干细胞的脐血，正好弥补了这个不足。可以说，变废为宝的脐血为我们攻克再生障碍性贫血、白血病等血液病提供了一个常备武器。
脐血样本怎么产生的
脐血库，全称为脐带血造血干细胞库。据了解，近年来我国有好几家脐血库正在筹建之中，卫生主管部门将对脐血库进行统一验收。
王椿教授介绍说，欧洲、北美及日本、澳大利亚的脐血库已经联网，目前共有3万多份脐血样本。
最近有报道称，英国一家“脐血银行”即将开张。具体来说，就是开展新生儿脐带血干细胞储存业务:父母交600英镑，“脐血银行”将把他们孩子脐带血中的干细胞分离出来保存至少20年。一旦孩子今后出现健康上的麻烦，如患了糖尿病、帕金森病等，造血干细胞说不定就能派上大用场。
变废为宝的脐血有化腐朽为神奇之功，它究竟是怎么采集的呢？
带着这个问题，记者走访了几家医院。医护人员介绍说，当一个健康孕妇产下一个健康足月的新生儿时，助产士按常规方法进行断脐。待胎盘娩出后，专业人员按要求（如消毒、无菌操作等）在脐带静脉中采集脐血。一滴、两滴，脐血流进一只含有50毫升保养液的脐血采集袋中。通常一次采集的脐血量平均70～80毫升，多则100毫升左右。整个过程对产妇、新生儿无任何影响。
据悉，上海正在筹备脐血库，记者便追寻到上海市血液中心打探消息。原来，脐血库的主要工作是由该中心的临床输血研究室担任。据这里的科研人员介绍:采集的脐血在分娩后24小时内送到实验室后，立即接受一系列检测分析筛选;合格的转入低温保存袋中。据记者观察，每份合格的脐血样本约50毫升。科研人员先将它们冷冻在－80℃的冰箱中;2小时后，移至液氮罐中超低温保存。而每份样本的具体资料如白细胞抗原（HLA）、红细胞血型（ABO）等，则被输入专门的软件中以备查询。
每一份静静等候在液氮中的脐血样本，就是一袋造血的“种子”，一旦符合患者的需求，它便“义无反顾”地捐献出自己的全部。这些“种子”移植到患者体内如星星之火，将点燃患者的生命之灯。
后记
●说来有趣，记者在最近一次采访上海市第一人民医院血液科主任王椿教授时，恰好有一女士来到血液科办公室。当她听到我们俩关于脐血造血干细胞移植救治再障患者的对话后，立即表示:“如果我的身体合格，我很愿意将我的脐血献给脐血库。”这时，我才仔细打量她，原来她是一个“准妈妈”。
我想，如果每一个健康产妇都像这位女士那样，在明白了脐血变废为宝的道理后欣然同意捐献脐血，我国脐血库的建立、发展就会有一个良好的基础，成千上万的患者就有了新生的希望。
浅谈脐血干细胞的临床应用 篇3
关键词：脐血干细胞,临床应用,研究
我们通常所说的脐带血就是婴儿做完脐带结扎以后, 残留在胎盘和脐带上的血液。这种血液因其来源广泛, 不会对提供者产生不良影响而且不具备传染病毒的风险, 而被人们广泛应用。从脐带血中提取干细胞已经在欧美等发达国家广泛应用, 据研究显示, 这种干细胞具有相当好的应用前景。
一、脐血干细胞临床应用的发展现状
我们从近几年的研究中发现, 脐血干细胞的应用非常广泛。因为早在一九九六年, 经过卫生部的认真研究, 就已经批准北京、上海、天津等大城市设立脐带血造血干细胞库, 并且到现在这些细胞库也都得到了很好的利用, 其在治疗肝硬化和股骨头坏死方面具有非常大的优势。作为一种能够自我更新、多系分化而且增殖快的非特异性细胞, 它能够在特定的条件下分化出如肝脏细胞、心肌细胞和骨细胞等具有特定功能的细胞。而且, 其在组织细胞再生领域的作用也是相当显著的。
下面笔者将以脐血干细胞在肝硬化患者身上的临床试验为例, 就脐血干细胞在恢复细胞损伤方面的应用进行综合阐述。
二、脐血干细胞在治疗肝硬化方面的临床应用
(一) 病例选择
经有关组织的批准, 我们将从某院选择9名肝硬化患者, 并且在保证这9名患者都签署了《知情同意书》后, 送到输血科进行化验和抽血。
(二) 临床用干细胞制剂与输注
在这一过程中, 我们要建立脐带干细胞制剂的分离纯化程序, 还要建立相关申请, 例如临床干细胞治疗体外的申请以及移植后是否有不良反应的回馈。科室在手术前还准备了质量手册、程序文件以及记录各种信息的表格。除此之外, 患者还要做好手术前的各项准备, 待干细胞制剂准备完毕之后, 立即移植到患者身上, 从而发挥脐血干细胞在细胞治疗中的作用。
(三) 脐血干细胞制剂的分离制备与输注
对于这一程序, 我们需要准备来自本院足月产妇的脐血, 孕妇在经过剖腹产之后, 迅速将胎盘取出, 并在清洁状态下进行脐血采集。然后将采集好的脐血放置百级层流实验室。在经过常规检查合格后, 送进手术室, 由消化内科的主治医生将脐血干细胞制剂由动脉或者静脉注射到患者体内。
(四) 观察疗效
肝硬化患者在经过注射脐血干细胞之后, 要进行一段时间的观察。在这段时间内, 医生要观察患者的临床症状有哪些, 是否出现乏力、腹胀等现象。如出现上述症状, 医生就要做出改善情况及不良反应的措施, 从而使患者平稳渡过。
(五) 数据分析
在经过这段时间的治疗, 我们发现各项数据显示正常, 且P<0.05, 这对于我们的研究来说具有显著性的意义。
(六) 实验结果
1. 数据测试结果
进行实验的11份脐血标本完全合格, 均是通过剖腹产的方式取得, 且无菌足量。在实验室进行检测的过程中, 所有数值全部正常, 也未发现有细菌或者真菌的感染。
2. 临床疗效
肝硬化病例患者在经过治疗后, 症状均有所改善, 出现了食欲增强、体力好转的现象。至今未发生死亡的现象。其中有7例效果更为明显, 1例在术后血清Ab发生了明显变化。
三、脐血干细胞应用的未来展望
在多年的研究中, 我们发现我们的疾病谱也在发生着改变, 儿科传染病与其他传染性疾病正在逐渐减少, 而其他难治愈的疾病却在逐渐增多。除了在治疗肝硬化和股骨头坏死方面有显著疗效, 在治疗儿童疾病方面, 例如儿童白血病、恶性肿瘤等疾病的作用也不容小觑。经过一系列的实验, 脐血干细胞在基因治疗方面也在发挥着作用, 因其具有外源性基因导入率高、表达稳定等特点, 它已经成为一种基因载体, 人们将这种载有基因的脐血干细胞移植到患儿体内, 从而能够抑制患儿体内恶性肿瘤的发展, 而且它还可以有效减轻血液病给患病儿童带来的痛苦, 除此以外, 在根治某些遗传性疾病, 例如地中海贫血这样难治愈的疾病, 脐血干细胞也在发挥着作用。并且经过一系列的研究和实验, 某些领域已经取得了初步成功。如此可以看出, 现在脐血干细胞正在成为人们研究的热点和发展方向。相信在未来科技不断发展的前提下, 脐血干细胞将会展现出更多诱人的优势和应用前景, 它将会越来越受到人们的重视。
四、结论
通过以上的临床试验研究, 我们知道脐带血干细胞同骨髓一样, 都可以作为造血干细胞的来源, 它作为一种辅助治疗手段, 在很多方面还有待开发。所以在今后的研究中, 我们要客观分析脐血干细胞的临床作用和医学价值, 让更多的患者通过脐血干细胞的治疗来减轻病痛, 从而更好地造福人类。
参考文献
[1]潘红霞, 黄雪霞.脐血干细胞移植治疗肝硬化的护理研究进展[J].健康之路, 2016, 05:11.
[2]脐血干细胞的临床应用:局限和掣肘[J].中国组织工程研究与临床康复, 2010, 14:2621-2622.
脐血造血细胞 篇4
CD+34干细胞主要存在于骨髓和脐带血中,因其具有自我更新、多种分化能力和广阔的应用前景而备受关注[1,2]。bFGF等细胞因子诱导CD+34脐血干细胞分化,对神经系统损伤等疾病治疗的动物实验研究和临床应用也有报道[3]。但迄今为止,人们对bFGF诱导CD+34干细胞分化后细胞的生物学性状、功能调控等方面的认识尚不足,有待深入研究[4,5]。本研究利用干细胞基因芯片技术,对bFGF诱导脐血CD+34干细胞前后的相关基因变化进行研究,为进一步明确CD+34脐血干细胞的生物学特性、推动干细胞基础研究和临床应用的发展打下基础。
1 材料与方法
1.1 材料
DMEM/F12为Hyclone公司产品;淋巴细胞分层液购自天津市津脉基因测绘技术有限公司;碱性成纤维细胞生长因子(b FGF)购自北京双鹭药业股份有限公司;TriZol为Invitrogen公司产品;重组人干细胞因子(rhSCF)为Peprotech公司产品;B27为GIBCO公司产品;CD34-FITC购自BD公司;磁性细胞分选系统(magnetic activated cells sorting,MACS)和CD34单抗免疫磁珠(CD34microbeads)为德国Miltenyi Biotec公司产品。
1.2 方法
1.2.1 脐血的收集
选取健康足月分娩产妇,HBV、HCV、HIV等检测指标正常。无菌收集50 m L脐静脉血,抗凝,迅速低温运输至实验室。
1.2.2 脐血单个核细胞的分离
将脐血用等量PBS液稀释,轻柔地将其加在Ficoll-Paque淋巴细胞分离液(比重1.077)液面上,使其形成清晰界面,2 500r/min离心20 min,吸取界面上的单个核细胞层,并用PBS洗2遍。
1.2.3 CD+34细胞的分选
用缓冲液重悬单个核细胞,使最终体积为300μL,按照CD34分选试剂操作说明依次加入100μL Fc R Blocking Reagent和100μL CD34microbeads,混合后置4~8℃反应30min,缓冲液洗涤。将细胞重悬于500μL缓冲液中,加入到预处理过的MACS-LS柱中(事先置于磁力架上),使液体自然流出,并用缓冲液洗3遍;将LS柱从磁场移出,5 m L缓冲液加压冲洗,收集该冲洗液,即为CD+34细胞。上流式细胞仪检测CD+34细胞纯度和获率,CD+34细胞获率(%)=分选后CD+34细胞数/分选前单个核细胞总数×100%。
1.2.4 b FGF对CD+34细胞的诱导
用含有20 ng bFGF、20 ng SCF和1︰50稀释B27的DMEM/F12(体积分数1︰1)营养液调整CD+34细胞浓度为5×105/m L,37℃5%二氧化碳饱和湿度培养,根据细胞生长情况2、3 d半量换液,细胞生长至4、5代时,收集细胞。
1.2.5 CD+34细胞培养前后总RNA提取
分别取1×106个CD+34培养前和培养后细胞,加入Trizol试剂(Invitrogen life technologies),提取总RNA,使用NanoDrop R ND-1000和变性琼脂糖凝胶电泳测定RNA浓度和纯度。
1.2.6 干细胞基因芯片杂交和化学发光检测
首先将总RNA进行反转录,合成c DNA,再分别用True Labeling-AMPTM线性RNA扩增试剂盒、SuperArray ArrayGrade c RNA纯化试剂盒、Biotin-16-UTP(Roche)进行c RNA标记与合成。将TrueLabeling-AMP试剂盒制备的生物素标记的c RNA样品置0.75 m L预热的GEAhyb杂交液中,利用Oligo GEArrayR芯片进行芯片杂交,采用化学发光检测试剂盒Chemiluminescent Detection Kit(SuperArray Bioscience)进行化学发光检测。基因芯片分析由上海康成生物工程公司有限提供。
1.2.7 图像采集和数据分析
通过X胶片和台式扫描仪获得化学发光的芯片图像。使用网上提供的综合型GEArray表达分析配套软件(GEArray Expression Analysis Suite)进行完整的芯片数据分析。
2 结果
2.1 脐血CD+34细胞的分选纯度和收获率
对10份脐血进行CD+34细胞分选,FACS检测分选CD+34细胞纯度为(77.52±5.06)%,收获率为(2.74±1.59)%。
2.2 bFGF诱导CD+34细胞的形态学变化
新分选出的CD+34细胞呈球形,胞体饱满;经SCF和bFGF培养15 d后,多数细胞形态未发现显著变化,细胞数量增多,部分细胞出现贴壁生长,体积增大、扁平,可见突起和梭形细胞,见图1。
2.3 RNA质量
紫外吸收测定法检测结果O.D.A260/A280ratio分别为1.88和1.83(应在1.8~2.1之间),O.D.A260/A230ratio分别为1.98和2(应大于1.8),RNA量分别为2236 ng和1 796 ng;电泳结果如图2。
2.4 CD+34细胞培养前后干细胞相关基因的变化
化学发光芯片图像如图3。干细胞基因芯片共检测263个基因,其中脐血CD+34培养后比培养前表达显著上调的基因10种,下调基因20种,见表1、2。上调基因涉及干细胞特异性标志4种,干细胞分化标志4种,干细胞生存重要信号途径基因5种;下调基因涉及干细胞特异性标志13种,干细胞分化标志3种,干细胞生存重要信号途径基因4种。
3 讨论
基因芯片技术是由20世纪90年代中期的DNA微列阵芯片发展而来,目前主要包括表达谱芯片和功能分类芯片两类。表达谱芯片几乎涵盖细胞全部基因的分子图像,功能分类基因芯片上通常只有几百个或更少的基因,因为它剔除了众多不相关的基因,把感兴趣的相关基因进行局部聚焦和放大,比表达谱芯片具有更强的针对性和准确性[6,7]。李群良等[8]对脐血CD+34干细胞基因表达谱进行了分析,在所检测的588个基因中,发现63个基因具有显著的表达水平,其中18个基因强表达,主要涉及造血干细胞增殖、分化、应激响应、凋亡、转录调节以及细胞周期等。
本文所采用的芯片属功能分类基因芯片,涉及干细胞特异性标志、干细胞分化标志和干细胞相关重要信号途径的263个基因,利用该芯片对bFGF诱导前后CD+34细胞基因的变化进行分析,国内外文献尚未见报道。研究结果显示,bFGF诱导后10个基因表达显著上调,20个基因表达显著下调。在干细胞特异性标志中,干细胞自我更新的标志、干细胞对称和不对称分裂以及细胞-细胞间信号传递类基因调节标志在培养前后未见显著变化;与干细胞特异性标志相关的53种细胞周期和染色质调节因子中,只有AXIN1表达上调,下调基因包括CCNA2、CCND2、CDC2、CDC42、CDK6、PTEN、RHOB和GCN5L2。
AXIN1基因编码由862个氨基酸组成的蛋白Axin(Axis formation inhibitor,体轴发育抑制因子),Axin是一个控制个体发育、细胞增殖及癌变等过程的重要蛋白,普遍表达于脑、胸腺、心脏、肺、肝、脾和肾等多种组织[8]。诱导后AXIN1基因表达增高,提示CD+34干细胞在培养过程中开始向多种组织细胞分化。CDC基因是细胞分裂周期(cell division cycle)基因,控制着细胞周期启动和各时相转换,其中以cdc2基因最重要,编码分子量34 kD的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,p34CDC2激酶的活化是细胞分裂的增殖信号,它具有启动DNA复制和诱发有丝分裂的双重作用,有研究表明,cdc2基因在多种恶性肿瘤中高表达,在神经干细胞分化中表达量降低[10]。CCNA2基因编码细胞周期蛋白cyclinA2,后者与细胞周期蛋白依赖性激酶2(CDK2)结合后激活CDK2,可启动S期及M期相关基因的转录,促使细胞由G1期进入S期,同时促使细胞由G2期进入M期,导致细胞增殖。高表达的CCND2(CyclinD2)加速细胞由G1向S期的转换;RHOB和CDC42都是GTP结合蛋白,具有GTP酶活性,在基因转录和细胞周期调控中发挥作用;PTEN具有蛋白酪氨酸、丝氨酸、苏氨酸磷酸酶活性,通过对蛋白质的脱磷酸作用,负调节细胞周期。GCN5L2具有组蛋白乙酰转移酶活性,有对蛋白氨基酸的乙酰化作用,调节PolⅡ增强子的转录。本研究中,上述几种与细胞周期相关的基因在bFGF诱导培养时表达下调,可能与细胞的分化和避免细胞过度增殖,阻止细胞癌变有关。
在检测的47种与干细胞特异性标志相关的细胞因子和生长因子中,只有SPP1表达增高,GDF3表达降低。SPP1能调节骨髓血细胞分化,促进T细胞的增殖和Th1型免疫反应,还具有抗凋亡作用、细胞黏附和整合作用。GDF3(Growth differentiation factor 3)具有促进细胞生长和维持细胞生存的作用。
干细胞相关的重要信号途径有Notch途径和Wnt途径。Notch信号传导途径主要介导细胞的分化抑制信号,参与造血、T细胞发育、血管生成等重要生理过程,并与肿瘤形成和某些神经系统疾病有密切关系。Wnt通路对造血干细胞增殖分化具有调节作用,控制神经前体细胞的生长以及细胞增殖与分化的平衡。本研究结果显示:与信号途径相关的ADAM17、DTX2、AXIN1、CSNK1A、MAP3K7表达上调,CREBBP、DTX1、GCN5L2、MFNG表达下调。
CD+34干细胞可在不同细胞因子的作用下进行分化[11],本研究利用SCF和bFGF诱导CD+34细胞分化结果显示:造血细胞系的标志中CD19、CD3D表达下调,TFRC表达上调;间叶细胞系标志中PPARG、SPP1表达上调;神经细胞系标志中S100B表达上调;其他分化标志中,FLT3表达下调。说明CD+34造血干细胞在bFGF诱导下向间叶细胞和神经细胞分化的趋势增强。代谢相关基因FGFR1表达上调,CXCR4、FLT1、UTF1表达下调。
通过本研究,可一次性快速获得大量基因表达水平上的信息,有助于较全面掌握bFGF诱导分化条件下干细胞特征,对认识干细胞的发育和调控具有重要意义,为优化体外培养和改善临床应用提供理论基础。
参考文献
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脐血造血细胞 篇5
1.1 脊髓损伤模型的建立
应用NYU打击器, 采用Allen′s法。取清洁级健康成年SD大鼠[中国军事医学科学院实验动物中心提供, 雌雄各半, 体重 (220±20) g]192只, 制备T10～11段脊髓损伤模型。
1.2 分组及处理
将造模成功大鼠随机分为A、B、C 3大组, 每组48只, D、E组各24只。运动区头皮表面投影区电针刺激组 (A组) :A1组电针刺激+脐血干细胞移植, A2组只进行电针刺激;损伤局部电针刺激组 (B组) :B1组电针刺激+脐血干细胞移植, B2组只进行电针刺激;运动区头皮表面投影区电刺激+局部电刺激组 (C组) :C1组电针刺激+脐血干细胞移植, C2组只进行电针刺激;损伤模型组 (D组) :只作脐血干细胞移植不进行电针刺激;E组不移植, 也不进行电针刺激。
1.3 脐血干细胞移植
人脐血干细胞 (HUCB) 由首都医科大学组胚实验室提供。按分组对移植组大鼠 (A1、B1、C1、D组) 脊髓损伤造模成功后第10天进行干细胞植入。进针点在大鼠头侧、尾侧共2点, 每点注入2 μl, 每点分4层, 每层0.5 μl, 每层注射后均留针5分钟。共注入4 μl细胞混悬液 (含人脐血干细胞2.5×105个) 。
1.4 电针刺激方法
除D、E组, 其余各组在造模后第3天开始进行每天1次电针刺激治疗, 选择穴位:A组, 运动区头皮表面投影区上2/5;B组, 双侧肝俞、脾俞、环跳穴, 后三里穴;C组, 运动区头皮表面投影区上2/5、双侧肝俞、脾俞、环跳穴, 后三里穴。电针选连续波2Hz刺激强度, 以大鼠后肢轻微颤动为度, 每日1次, 每次通电20分钟, 10日为1疗程。
1.5 检测指标
各组于造模后1、2、3、4、8及12周取材。免疫组织化学荧光染色检测生长相关蛋白 (GAP-43) 及MAB1281抗人核抗体 (标记HUCB细胞) 。所获图像经LEICA QWin图像处理与分析系统处理, 通过对阳性表达面积 (μm2) 平均灰度值的分析, 测定GAP-43的阳性表达量。
1.6 统计学分析
采用Excel 2003 和SAS 6.12统计软件进行方差分析。
2 结果
2.1 不同电针刺激对植入的脐血干细胞在大鼠受损脊髓内存活的影响
本实验在移植HUCB细胞1周时移植组脊髓损伤区可见大量红色标记MAB1281特异性人细胞核阳性表达的HUCB细胞存在, 在损伤区的远、近端分布比较均匀, 不呈堆聚状;移植HUCB细胞3周时在治疗组脊髓损伤区仍可见红色标记抗人核细胞阳性表达的HUCB细胞, 但较1周时减少且分散。移植HUCB细胞8周时脊髓损伤A1、B1、C1组在损伤区均可见到少量的红色标记人核阳性表达, 12周时移植组均未找到红色标记的人核阳性细胞表达。
2.2 实验各组受损脊髓组织中GAP-43的表达
见表1。
各组与E组比较P均<0.01;各电针刺激组与D组比较P均<0.01;各电针刺激+脐血组与单纯电针刺激组比较P均<0.013 结论
GAP-43是在神经元的发育和再生过程中, 伴随着轴突生长大量合成, 是轴突生长的一种标记物[1]。本实验结果显示, 脐血干细胞移植对损伤后促进神经元生长、分化、修复及神经功能恢复有益, 电针刺激对干细胞移植有显著协同作用;电刺激对脊髓损伤后神经元修复与神经再生及神经功能恢复的影响是独立的, 不依赖于是否进行干细胞移植。4周时除D、E组外余各组达峰值, 8周时各组灰度值开始下降, 12周时仍处于高水平表达。提示这一时期轴突生长特别迅速, 突触塑形正在进行, 与功能及区域结构重建的潜力有关。随着再生期的延续, 由神经元胞体合成的GAP-43沿轴突转运至受损及再生部位, 在远段含量逐渐增高, 轴突及其终末可能部分再生完成, 反应强度随之减弱。对GAP-43的作用机制尚需后期实验更加深入研究。
参考文献
脐血造血细胞 篇6
1 材料与方法
1.1 主要试剂
细胞和质粒:慢病毒表达载体穿梭质粒pGC-FU Vector (含EGFP基因)和慢病毒结构质粒pHelper1.0及慢病毒包膜蛋白质粒pHelper2.0(Genechem公司);感受态大肠埃希菌DH5a,LIGHT基因表达质粒PCD DNA-LIGHT;人胚肾上皮细胞系293T细胞,人脐血间质干细胞;试剂和引物:限制性内切酶AgeⅠ(NEB公司);In-Fusio Kit (BD公司);Taq polymerase (Takara公司);Primer (上海吉凯基因技术有限公司);BSA (上海捷倍思基因技术有限公司):Lipofectamine2000 (Invitrogen公司);Plasmid抽提Kit (QIAGEN公司);PCR提取Kit (大连宝生)。
1.2 引物设计与合成
根据pGC-FU Vector的要求在引物中加入AgeⅠ酶切位点ACCGGT用于PCR扩增LIGHT基因,F:5'-CAGGATCCCCGGGTACCGGTCGCCACC ATGGAGGAGAGTGTCGTACGGC-3':R:5'-TCACCATGGTGGCGACCGGTACCACCATGA AAGCCCCGAAG-3',产物大小为769bp。PCR鉴定目的基因重组连接的阳性克隆菌落,其中F:5'-CAAGAGCGAAGGTCTCAC-3',R:5'-CGTCGCCGTCCAGCTCGACCAG-3’,产物大小为550bp。LIGHT基因引物,F:5’-TGACAAGCCTGTAGCCCAT-3',R:5’-CGTCGCCGTCCAGCTCGACCAG-3’,产物大小为128bp。内参GAPDH基因引物,F:5'-AACAGCCTCAAGATCATCAGCAA-3',R:5'-GACTGTGGTCATGAGTCCTTCCA-3',产物大小为111bp。引物设计与合成由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
1.3 重组慢病毒载体质粒的构建
采用PCR技术从PCD DNA-LIGHT中扩增目的基因(LIGHT),PCR反应条件:94℃变性30秒后,按下列参数循环20次:即94℃变性30秒,60℃退火30秒,72℃延伸2分钟,最后再于72℃延伸10分钟。AgeⅠ酶分别酶切载体pGC-FU Vector和上述PCR产物,琼脂糖电泳分离纯化。将酶切回收载体DNA、酶切回收的PCR产物、In-Fusio交换酶及buffer与ddH20加入反应体系于23℃反应15分钟,再于42℃反应15分钟制备克隆交换液,转化DH5a。PCR鉴定细菌阳性克隆,命名为pGC-FU-LIGHT,送往上海生工基因公司测序。
1.4 病毒的包装、收集和病毒滴度的测定
1.4.1 病毒的包装,收集:
LB培养液扩增转化菌DH5a,Plasmid抽提Kit提取pGC-FU-LIGHT、pHelper1.0、pHelper2.0。转染前24小时,用胰蛋白酶消化对数生长期的293T细胞,以含10%血清的培养基调整细胞密度为6.0×108/L,重新接种于15cm细胞培养皿,37℃、5%CO2培养箱内培养。24小时待细胞密度达70%～80%时即可用于转染。转染前24小时将细胞培养基更换为无血清培养基。慢病毒三质粒,按Invitrogen公司Lipofectamine2000使用说明进行共转染包装细胞293T细胞,转染后8小时更换为完全培养基,培养48～72小时后观察出现强绿色荧光并有细胞融合现象时收集含慢病毒颗粒的细胞上清液,对其浓缩后得到高浓度的慢病毒浓缩液,分装后保存在病毒管中,-80℃长期保存。
1.4.2 病毒滴度的测定:
取10μl病毒液进行生物学滴度测定。分别取10倍比稀释的病毒液100μl。4天后,抽提RNA准备做RT-PCR。并收取细胞进行后续滴度测定。实时荧光定量PCR检测病毒滴度:抽提细胞总RNA,逆转录获cDNA。以GFP基因引物:F:5'-TGCTTCAGCCGCTACCC-3',R:5’-AGTTCACCTTGATGCCGTTC 3',Actin基因引物F:5'-GTGGACATCCGCAAAGAC-3’,R:5'-AAAGGGTGTAACGCAACTA-3’,两步法行实时荧光定量,预变性95℃,15秒,之后每一步95℃变性,5秒,60℃退火延伸,30秒,共40个循环,制作熔解曲线。
1.5 重组慢病毒pGC-FU-LIGHT在脐血间质于细胞中的表达
1.5.1 脐血间质干细胞采用10%胎牛血清的低糖DMEM细胞培养基(Gibco)置于37℃,5%CO2饱和湿度的孵箱中培养,细胞长到80%融合时用0.25%胰酶消化,将脐脐血间质干细胞接种于6孔板,每孔细胞数为5×104,待细胞融合度达到30%,换液加入2ml培养液,10mg/ml的polybrene1μl,感染复数(MOI值)为10的重组慢病毒10μl,72小时后观察荧光。实验组为带有LIGHT基因慢病毒感染的UCBMSCs(pGC-FU-LIGHT组),对照组分别为未携带任何目的基因慢病毒感染的UCBMSCs (pGC-FU-EGFP,空载体对照组)以及未经感染的UCBMSCs(空白组)。
1.5.2 RT-PCR检测:分别抽提三组细胞总RNA,按RT-PCR试剂盒说明书操作,加入GAPDH基因引物作为内参,同时加入LIGHT基因引物行RT-PCR反应以及灰度分析,以检测各组UCBMSCs中LIGHT基因在mRNA水平的表达情况。每组随机读取5次灰度分析数据,取二者比值平均值为结果行独立样本t检验(independent samples test),取α=0.05。
1.5.3 Elisa检测:收集三组细胞上清液行LIGHT蛋白检测,按Elisa试剂盒说明书操作,检测不同浓度LIGHT标准品及各组细胞上清液在450nm可见光的吸光度值,根据吸光度值计算各组上清液LIGHT。
2 结果
2.1 慢病毒载体表达质粒pGC-FU-LIGHT构建
目的基因(LIGHT)琼脂糖凝胶电泳图谱(图1);PCR鉴定细菌阳性克隆(图2);测序结果显示pGC-FU-LIGHT中LIGHT序列与GenBbank中正常NM_000594序列完全一致。
2.2 包装细胞293T细胞转导pGC-FU-LIGHT质粒后GFP的表达
将pGC-FU-LIGHT质粒转导入293T细胞后,其LIGHT蛋白的表达与GFP的表达是一致的。将pGC-FU-LIGHT质粒和包装质粒pHelper1.0、pHelper2.0共同转染293T细胞12小时后,在荧光显微镜下可以看到GFP的表达呈阳性(图3)。
A:荧光显微镜下293T(×200),B:光镜下293T细胞(×200)
2.3 携带重组慢病毒的包装和病毒滴度测定
三质粒共转染293T细胞,成功包装表达LIGHT基因和EGFP基因的慢病毒pGC-FU-LIGHT收集、浓缩病毒后逐孔稀释滴度测定法测定其滴度为2×108TU/ml (图4)。
A实验组(×200),B空载体对照组(×200),C空白组(×200)
2.4 慢病毒感染人脐血间质干细胞表达情况
2.4.1 绿色荧光蛋白在人间质干细胞中的表达情况:
病毒感染人脐血间质干细胞72小时后荧光显微镜观察发现实验细可见绿色荧光,分布于胞膜位置,荧光随着细胞传代可持续。空载体对照组见较强绿色荧光,空白组未见绿色荧光表达(图5)。
2.4.2 RT-PCR分析三组细胞RNA的表达:
分别提三组细胞总RNA,以GAPDH基因引物为内参行RT-PCR,2%琼脂糖凝胶电泳检测后做灰度分析并统计学分析得出结果:与空载体对照组及空白组相比,实验组的电泳条带灰度值较高,差异均有统计学意义(P<0.01),空载体对照组与空白组之间差异无统计学意义(P>0.05)(图6)。
M:Marker;①实验组;③空载体对照组;⑤空白组;②、④、⑥GADPH
2.4.3 Elisa检测三组上清液LIGHT浓度:
空白组0.94 ng/ml,实验组1.81 ng/ml,空载体对照组组0.72ng/ml;实验组较空白组及空载体对照组差异均有统计学意义(P均<0.01),空白组与空载体对照组之间差异无统计学意义(P均>0.05)。
3 讨论
Zhai等[3]将LIGHT基因转染至乳腺癌MDA-MB-231细胞,发现对细胞的生长有明显抑制效应,动物实验也发现,MDA-MB-231/LIGTH细胞可显著地抑制MDA-MB-231肿瘤细胞在无胸腺裸鼠和SCID鼠中的生长,且对机体无明显的副作用。在裸鼠体内MDA-MB-231/LIGHT细胞则只形成小的残留灶,瘤灶可用现广泛的坏死;而对照组MDA-MB-231细胞则可形成大的实体瘤且无淋巴细胞浸润。Akira等[4]运用腺病毒携带IFN-β基因感染BMSCs(BMSC-IFN-β)经动脉注射证实能够构成脑胶质瘤间质并局部高浓度释放IFN-β起到有效抗肿瘤效果。应用携带LIGHT基因重组慢病毒感染脐血间质干细胞,可以将外源性人LIGHT靶向到达胃癌间质近距离释放LIGHT达到杀伤胃癌的目的,为胃癌的生物治疗增加新的探索。
LIGTH可通过3个不同的受体LTβR、TR2/HVEM以及TR6而发挥不同的生物学效应,包括阻断HVEM依赖的HSV1感染、诱导和调节肿瘤细胞凋亡以及刺激T淋巴细胞的增生。外,LIGHT参与了DC介导的细胞免疫反应,它在启动和活化T淋巴细胞的早期起作用且不依赖于CD28信号传导途径。Tamada等[5]证实,LIGHT可增强机体对不表达其受体的P815肿瘤细胞杀伤,其共刺激作用的程度与B7-CD28信号传导途径相当且不依赖于CD28,因此,LIGHT就有了抗肿瘤的双重作用。
慢病毒载体是一种以HIV-1为基础构建的新型载体系统,慢病毒载体既能感染分裂活跃期细胞,又能高效率感染分裂缓慢或非分裂期的细胞;它能够携带较大及多个外源性基因,转染后对转录沉默作用有较强的抵抗力,能长期稳定表达目的基因,不易诱发宿主免疫反应等优点[6]。因此,慢病毒可以成为外源性LIGHT基因的可靠载体。
肿瘤的生长需要间质的支持,其可提供信号促使间质干细胞定向趋动到肿瘤部位,人间质干细胞(hMSC)具有多向分化的潜能,可以构成间质,因而以MSC作为肿瘤治疗效应物质的一种载体[7,8,9]。hMSC来源广泛,多数学者以骨髓来源作为研究对象,而脐血间质干细胞其形态和生物学特点与骨髓源性间充质干细胞相似[10,11],而且具有易于采集保存,供者无痛苦,不涉及伦理问题,传播疾病的几率低,干细胞免疫原性弱,具有免疫调节作用,同时其更为原始,扩增能力更强,含有的干细胞丰富等优点,故脐血间充质干细胞可作为骨髓间充质干细胞的替代细胞,用于各系统疾病的细胞移植、基因治疗以及移植发挥其免疫抑制作用以减少移植后移植物抗宿主病的发生[12]。我们前期研究也表明人脐血间质干细胞也可以趋向肿瘤组织构成间质[2]。因此,人脐血间质干细胞可作为LIGHT基因的载体。
本实验成功地构建了LIGHT基因的新型慢病毒载体,以慢病毒携带LIGHT基因感染人脐血间质干细胞,其感染率为90%以上,感染效率高,通过RT-PCR验证实验组(pGC-FU-LIGHT)较其他两组能较高的表达mRNA,Elisa证实实验组(pGC-FU-LIGHT)较其他两组能够较高水平的表达LIGHT蛋白,说明慢病毒以及脐血间质干细胞作为基因治疗载体大的优越性,为UCBMSCs作为载体携带LIGHT靶向到达胃癌间质近距离分泌LIGHT,达到杀伤胃癌目的提供理论基础。
摘要：目的构建带有人LIGHT基因的慢病毒载体,观察其在人脐血间质干细胞中的表达。方法通过逆转录聚合酶链反应从PCD DNA-LIGHI、质粒中获得人LIGHT基因,利用infusion技术重组构建慢病毒载体质粒pGC-FU-LIGHT,在脂质体lipofectamine 2000介导下与结构质粒pHelper1.0及包膜蛋白质粒pHelper2.0共转染293T细胞包装生产慢病毒。将人脐血间质干细胞分为实验组(pGC-FU-LIGHT)、空载体对照组(pGC-FU-EGFP)及空白组(脐血间质干细胞),分别用重组慢病毒、空载慢病毒、PBS感染后,采用RT-PCR以及Elisa检测IIGHT表达情况。结果所获LIGHT基因经测序后与Gene Bank报道序列完全一致;重组慢病毒载体质粒pGC-FU-LIGHT经鉴定正确;三质粒共转染293T细胞成功,收集、浓缩病毒后测定其滴度为2×107TUJ/L,感染UJCBMSCs后RT-PCR、Elisa检测各组细胞均有LIGHT的表达,其中试验组pGC-FU-LIGHT组更大最表达LIGHT,与其余2组(pGC-FU-EGFP、UJCBMSCs)比较差异具有统计学意义。结论成功构建带有LIGHT基因的慢病毒载体并实现在脐血间质干细胞中的表达,为间充质干细胞移植治疗胃癌的应用奠定了基础。
关键词：慢病毒载体,人LIGHT基因,人脐血间质干细胞
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脐血造血细胞 篇7
关键词：神经系统疾病,脐血干细胞,腰椎穿刺 (蛛网膜下腔注射) ,护理
难治性神经系统疾病具有疾病的复杂性和难治性的特点[1], 患者受神经系统损伤而导致了自身不同程度的功能障碍, 严重影响病人的生活质量, 且疾病的病程长、反复发作、无有效的药物治疗, 给病人、家属及社会都带来了沉重的负担。近年来, 新型的诊断及治疗手段的孕育, 为神经疾病患者带来了福音, 神经干细胞 (neural stem cells, NSCs) 移植是目前研究的热点, 自20世纪90年代成功培养出人NSCs, NSCs移植为中枢神经系统性疾病的治疗带来了希望, 开拓了治疗的新途径[2]。NSCs移植的临床治疗已应用于成人帕金森病[3]、多发性硬化[4]、颅脑创伤[5]、骨髓损伤[6]等方面。我院2010年5月至2011年5月为9例难治性神经系统疾病患者进行NSCs移植术, 疗效显著, 现将护理介绍如下。
1 一般资料
本组9例神经系统疾病患者, 男4例, 女5例。年龄11～73岁, 均为我院神经内科住院治疗的病人。其中多系统萎缩2例, 线粒体脑肌病1例, 遗传性共济失调3例, 视神经脊髓炎患者3例。9例患者均伴有不同程度的感觉、运动、语言、肌张力、植物神经功能等障碍。根据江苏省干细胞治疗技术标准制定专家委员会核定的标准选择治疗的对象。脐血干细胞的来源为江苏北科生物科技有限公司提供, 9例患者及家属均了解NSCs移植的治疗方法及手术相关意外, 同意并签署了知情同意书。
2 移植疗法
通过腰椎穿刺鞘内注射和静脉注射联合移植的方法治疗难治性神经系统疾病患者, 每周1次, 4周为1个疗程。首次为静脉滴注, 细胞总量为4×107或2×107, 1 h内滴完, 输液泵控制, 输液前后均静脉点滴生理盐水50 ml。第2～4次为腰椎穿刺鞘内注射和静脉滴注, 细胞总量为2×107或1×107, 每次间隔3～7 d。为了预防过敏及免疫反应, 术前30 min静脉滴注甲强龙20 mg, 地塞米松2 mg鞘内注射后再行干细胞注射和静脉泵入干细胞。
3 结果
所有患者均顺利完成4个疗程的治疗, 9例患者神经系统症状、体征均得到不同程度改善。1例治疗后出现发热、血压下降, 给予对症治疗72 h内缓解。
4 术前护理
(1) 病房采用紫外线消毒30 min, 减少探视人数。 (2) 术前1 d至术日, 每天测体温4次, 测血压2～3次。提前1 h监测生命体征, 在生命体征平稳的情况下再操作。 (3) 前1 d完善各种检查如血尿常规、血生化、肝肾功能、心电图、肌电图及颅脑CT及MRI检查。 (4) 训练患者适应床上大小便。 (5) 对家属及患者的心理护理。患者和家属的心理问题主要来自于3个方面:①对干细胞移植疗效的期望值过高, 又因为大部分费用为自费, 所以更加加重他们对干细胞移植的关注态度。因此, 要向家属和病人介绍此次的治疗只是对难治疾病的一种挑战, 并非是特效药。②对干细胞移植的过程不了解, 他们认为这是一项新型的治疗项目, 对其的副作用担忧明显。针对这些, 除了对病人的心理护理, 使得病人能够平静接受外, 对家属的宣教非常重要, 向患者和家属反复宣传腰椎穿刺是局麻下进行的一种小型手术操作, 疼痛轻微、创伤小、时间短[7], 与神经系统常用的检查 (腰椎穿刺) 相似。③对干细胞移植的预后不了解, 告诉他们干细胞移植术后无需长期服用免疫抑制剂, 因而消除了长期大量服用免疫抑制剂所带来的一系列并发症、副反应及费用的压力。
接受治疗的均为神志清楚的患者, 针对这些可能发生的原因, 医护配合共同做好患者及家属的思想工作, 详细介绍与疾病有关的手术方法和效果好的病例资料, 使患者及家属对疾病的发生、治疗、护理、预后有所了解, 并积极配合治疗。我们请已经做过NSCs移植的患者及家属与其交流, 帮助并鼓励他们尽可能放松, 消除紧张、焦虑情绪, 积极配合手术。临床实践表明, 心理干预能有效缓解患者由于对所接受治疗缺乏了解所产生的心理恐惧和焦虑[8]。
5 术后护理
5.1 严密监测生命体征变化
NSCs注射完毕后要观察患者神志, 了解患者的感受并告诉其一旦有不适反应立即通知医护人员。去枕平卧6～8 h, 每30 min测量体温、脉搏、呼吸、血压的变化, 并认真记录。有文献报道行NSCs移植术后患者易在40～80 min内出现体温升高、寒战及一过性血压升高等症状。当体温不超过38 ℃时, 原则上不需要处理, 嘱患者多饮水即可[9];当体温超过38 ℃时, 可予物理降温或遵医嘱用药。一过性的血压升高, 精神完全放松情况下可自行缓解, 不必紧张。
5.2 术后并发症的护理
5.2.1 头痛、恶心、眩晕、低颅压症状
静卧, 必要的情况下遵医嘱用药, 对其进行心理安慰。
5.2.2 静脉炎的发生
如果发生静脉炎, 则行硫酸镁湿敷或使用康惠尔增强型透明贴。
5.2.3 腰痛
注意休息, 减少腰部剧烈运动。
随着对NSCs研究的不断深入, 应用脐血干细胞治疗中枢神经系统损伤的研究也取得了快速的发展。人脐血干细胞具有多项的分化潜能、活跃的增殖特性, 经定向诱导可分化为神经元及神经胶质细胞, 同时对受体自身的神经干细胞以及处于休眠状态或者受损神经细胞起到激活的作用, 从而改善临床症状[10]。作为临床护士需要不断地学习新的医学进展, 密切观察新技术给病人带来的副作用和不良反应, 以便更好地为病人服务。
参考文献
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脐血造血细胞 篇8
M S C具有多向分化潜能、支持和促进造血干细胞植入、调节免疫以及分离、培养时操作简便等特点[3]。脐血间充质干细胞(Human Umbilical cord blood mesenchymal stem cells,HUMSC)是从脐带组织中分离出来,较祖细胞更原始,有更强增殖分化能力[4];免疫原性较为幼稚,不易触发免疫反应或引起移植物抗宿主病;较骨髓MSC有更大应用潜能。
循环血液中干细胞归巢到缺血组织中是组织修复第一步,干细胞归巢第一步就是黏附于心脏微血管内皮细胞[5],因此提高移植干细胞向受损组织迁移及定植对提高干细胞治疗效果具有重要价值。黏附分子广泛存在于细胞表面及细胞外基质中,通过与受体结合,介导细胞与细胞或细胞与细胞外基质接触,并参与细胞活化与迁移[6]。在炎症、缺血性损伤及伤口愈合等过程中发挥重要作用。生理状态下充质干细胞少量表达血管细胞黏附分子-1(vascular cell adhesion molecule-1,VCAM-1),而明显表达细胞间黏附分子(intercellular adhesion molecule-1,ICAM)[7]。Segers等[8]研究发现,VCAM-1对BMMSCs黏附于心肌微血管内皮细胞具有重要作用,在加入VCAM-1抗体后可完全消除由肿瘤坏死因子(tumor necrosisfactor,TNF-α)预处理增强MSC对内皮细胞黏附性,而加入ICAM-1抗体则MSC对内皮细胞黏附能力却没有明显变化。所以本研究用采用TNF-α预处理HUMSC,通过迁移黏附能力、VCAM-1表达和左心室功能变化等检测指标,探讨其对心肌梗死大鼠治疗作用。
1 材料与方法
1.1 实验动物
雄性SD大鼠20只,清洁级,220~250 g用于心肌梗死造模,购自河南省实验动物中心,实验中对动物处置符合动物伦理学要求。
1.2 主要试剂和仪器
L-DMEM、胎牛血清(fetalbovine serum,FBS)购自美国Hyclone公司;0.25%胰酶、SDS-PAGE凝胶试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司;TNF-α购自美国Peprotech公司;PVDF膜购自美国Sigma公司;VCAM-1一抗购自美国Bioworld公司;β-actin、二抗购自北京中杉金桥生物技术有限公司;倒置显微镜Olympus BX41购自日本Olympus公司;二维多普勒超声仪购自美国Phillips公司。
1.3 脐血间充质干细胞分离和培养
脐血来自于郑州市妇幼保健医院产妇志愿捐献足月妊娠顺产婴儿,参照文献[9]采用密度梯度离心法获取HUMSC,将分离细胞以5×106/m L接种于含体积分数为20%胎牛血清DMEM/F12培养液中培养。取第3代细胞用于后续实验。
1.4 细胞鉴定
将第3代HUMSC调整为1×106/L细胞悬液,用流式细胞仪进行细胞表面标志测定。细胞分别与鼠抗人FITC-CD90、PE-CD86、Fl TC-CD45,PE-CD19、FITC-CD105、PE-HLA-DR、FITC-HLA-ABC和PE-CD34抗体反应,在4℃暗室中放置30min。以鼠抗人PE/FITC-Ig G1为平行对照。数据用Cell Quest软件处理。
1.5 体外迁移实验
将第3代HUMSC浓度调整为5×106/m L,取100μL细胞悬液接种于8μm孔径24孔transwell小室上层,下层加入500μL含2%FBSL-DMEM培养基,实验组下层培养液中加入TNF-α使得其终浓度为10 ng/m L,对照组加入等体积PBS,置于细胞培养箱中继续培养。24 h后取出小室,用荧光倒置显微镜下观察并随即选取6个视野拍照后计数迁移至膜下表面细胞数目。
1.6 体外黏附实验
将第3代HUMSC长至80%融合时,实验组加入TNF-α(10 ng/m L)处理,培养24 h后,调整细胞浓度为1×106/m L,取1 m L细胞悬液经1200 r/min离心3min后重悬于250μLL-DMED中,然后接种于胶原包被24孔板,静置15 min后,用PBS洗两遍,去除未贴壁干细胞。显微镜下随机选取6个视野拍照后计数。
1.7 Western blot检测黏附分子蛋白表达
实验组加入TNF-α(10 ng/m L)处理,培养24 h后,调整细胞浓度为1×106/m L,加入上样缓冲液后100℃水浴变性5 min,10SDS-PAGE电泳,转移至PVDF膜上。封闭液封闭2 h,加一抗孵育12h,HRP标记二抗孵育2 h。洗膜后将增强化学发光液(ECL)涂于PVDF膜上,曝光并采集图像。Ge1-Pro analyzer 4软件分析蛋白条带,以β-actin表达量作为参照。
1.8 大鼠心肌梗死模型制备和细胞移植
麻醉大鼠后,接心电监护、气管插管并接上小动物呼吸肌,于心前区肋间隙进入胸腔并刺破心包,在与左心耳交界处下方0.2cm处缝扎左前降支动脉,可见心电监护ST段显著抬高。术后关胸常规肌注30万U青霉素,心肌梗死模型复制成功后1周,大鼠随机分为对照组和实验组各10只。对照组大鼠梗死局部心肌内注射HUMSC100μL(1×105个),实验组大鼠梗死局部心肌内注射第3代TNF-α预处理HUMSC100μL(1×105个),所有动物随后关胸并给予抗生素处理。
1.9 超声心动图检测大鼠心功能
移植后3周,大鼠麻醉后固定于鼠板上,二维多普勒超声仪检测大鼠左心室舒张末内径(left ventricular end-diastolic dimension,LVEd)、左心室收缩末内径(left ventricular end-systolic dimension,LVDs),按照公式:LVEF=[(LVDd)3-(LVDs)3]/(LVDd)3×100%计算射血分数(left ventricular ejection fraction,LVEF)。
1.1 0 统计学处理
采用Grah Pad Prism 5.0统计软件进行分析,数据以±s表示,两组间比较用t检验,a=0.05。
2 结果
2.1 脐血间充质干细胞分离培养
倒置显微镜下可见,培养初期胞体小且呈圆形(图1A),2d以后逐渐变为椭圆、胞体变大(图1B),7d(第3代)后向两级伸出凸起为长梭形(图1C)。
2.2 细胞检测结果
流式细胞仪检测结果显示CD34、CD45阳性率不足10%,提示大部分人脐带间充质干细胞不是造血干细胞。CD19和CD86阳性率少于10%,CD90、CD105阳性率高于70%,主要组织相容性复合体HLA-ABC阳性率为90%以上,HLA-DR阳性率低于5%,结果提示人脐带间充质干细胞和间充质干细胞细胞表型相似。
a:4h脐血干细胞形态(×100);b:2d脐血干细胞形态(×100);c:7d脐血干细胞形态(×100)
图1 不同时期脐血间充质干细胞形态
2.3 体外迁移能力
结果表明与TNF-α共培养24h后,TNF-α处理组从小室表面迁移到小室下表面细胞数目(26.4±2.8)明显多于PBS组(6.9±1.7),差异有统计学意义(P<0.05)。说明TNF-α可以增强干细胞体外迁移能力。(见图2a/b)
a:PBS组细胞数目(×100)b:TNF-α处理组细胞数目(×100)
图2 HUMSC体外迁移对比图
2.4 体外黏附能力
结果表明与TNF-α共培养24h后,TNF-α处理组黏附于培养板细胞数目(41.2±3.6)明显高于PBS组(7.8±1.3),差异有统计学意义(P<0.05)。说明TNF-α可以显著增强干细胞黏附能力。(见图3a/b)
a:PBS组细胞数目(×100)b:TNF-α处理组细胞数目(×100)
图3 HUMSC体外黏附对比图
2.5 黏附分子VCAM-1表达
用Western blot法检测转移至膜上蛋白含量,结果表明,PBS组VCAM-1表达较低,TNF-α处理组能显著诱导VCAM-1蛋白合成,约为对照组3倍,两组间差异具有统计意义(见图4)。
图4 Western blot检测VCAM-1表达
2.6 TNF-α预处理HUMSC对大鼠心功能影响
移植后3周,对照组(HUMSC)有2只大鼠死亡,实验组(TNF-α预处理HUMSC)有1只大鼠死亡。LVDd、LVDs、LVEF结果见表1,多普勒超声心动图结果显示,实验组LVEF明显高于对照组(P<0.05)。说明经TNF-α预处理HUMSC移植可以明显改善心功能。
表1 TNF-α预处理HUMSC对大鼠心功能影响(±s)
aP<0.05 vs对照组
3 讨论
MSC具有较强扩增能力,可分化成心肌样细胞和有助于血管形成血管平滑肌细胞以及血管内皮细胞,能参与心肌缺血引起心肌重构和血管再生,达到替代损伤心肌细胞,改善心功能目[10]。由于MSC缺少主要组织相容性复合体II,可参与免疫调控但具免疫豁免性,增强了异体细胞移植安全性,因此最有可能发展成标准化治疗,从而满足大部分人治疗需求[11]。很多研究者认为,干细胞可能是通过旁分泌而不是替代梗死心肌来发挥改善心功能作用[12,13],目前已发现多种干细胞因子以旁分泌产生作用[14,15]。
脐血中含有丰富间充质干细胞[16],是近年发现具有与骨髓干细胞细胞(BMMSC)相同多向分化潜能原始祖细胞,和其他来源干细胞相比,脐血来源广泛,脐血中淋巴细胞免疫功能不够成熟,免疫原性较弱,移植物抗宿主病发生率较低[17,18];HUMSC易于分离[19,20]为一种新可靠干细胞来源,在适当条件下具有向神经细胞、成骨细胞、心肌细胞等组织细胞多项分化潜能[21]。
目前,已有多种干细胞应用于MI临床治疗研究[22,23],但HUMSC移植治疗MI还比较少。干细胞移植治疗主要困难之一是移植干细胞只有很少一部分能存活和植入心肌中。所以如何提高干细胞移植存活率成为研究者首当其冲问题。Luo等[24,25]研究发现在梗死区边缘区注入高表达血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)干细胞,可以减少梗死区面积,增加梗死区周围心肌血管生成,促进冠脉结扎实验中心脏功能恢复。Ries等[26]研究发现提高BMMSC基质金属酶表达,可以促进细胞趋化和迁移。
心肌梗死后会释放大量炎症介质,这些介质一方面可以促进组织修复和增强心肌对缺血适应,但另一方面这些介质也可以促进心肌细胞凋亡和加快基质降解进而抑制和减低心功能[27,28,29]。以前研究重视干细胞移植后如何降低炎症因子表达,但新近有研究[30,31,32]证实用炎症因子处理过干细胞移植能明显改善心功能,促进心肌功能恢复。Herrmann等[33]研究发现,用TGF-a预处理24h BMMSC移植可以增加VEGF表达,进一步保护大鼠心肌和减少坏死区域面积。