红细胞微核

红细胞微核（精选8篇）

红细胞微核 篇1

氟是主要工业及环境污染之一,影响广泛,仅在我国就涉及29个省市自治区[1]。国内外学者围绕“氟与疾病”进行了大量的研究。有大量的文献报道了禽类氟病[2,3,4],禽类对氟的耐受力较大,鸡的饲料性氟中毒往往是慢性的、潜在的,但造成的损失却是巨大的[5]。近年来氟化物对染色体毒作用方面,由于采用的载体细胞、氟化物剂量及作用途径、时间等不同,至使结果各异。往往出现氟化物在体外活化系统中,有致畸作用,而在活体染毒时却又呈阴性结果的情况[6]。氟化物是否对鸡机体细胞染色体有毒作用还不明确,骨髓嗜多染的细胞(PCE)微核率是确定氟化物对鸡染色体毒作用的主要指标之一。我国在《食品卫生安全性毒理学评价程序》及《新药审批办法》中[7],以将其列为化学试剂致突变试验的首选方法。为了确定氟化物对鸡机体细胞染色体具有毒性作用,我们使用氟化钠对鸡进行染毒,观察氟化钠是否影响鸡骨髓细胞微核率,确立氟化物是否对鸡机体细胞具有毒性作用,并建立相关方程模型,为今后实验提供剂量依据。

1 材料方法

1.1 材料

1.1.1 主要仪器:

低速离心机、电子天平、生物显微镜、计数器。

1.1.2 主要试剂:

pH7.2[8]PBS液(磷酸缓冲液)[9]、甲醇(分析纯)、氟化钠(分析纯)、Giemsa染液(Giemsa原液用pH6.8 PBS液以1∶9稀释)。

1.1.3 实验动物:

1日龄罗曼褐公鸡36只(购于内江鸡场)。

1.2 方法

1.2.1 确定LD50:

采用简化几率单位法[10]。

1.2.2 病理模型复制:

将所购罗曼褐公鸡完全随机分组,分为6组,每组6只。其中取1～5组为实验组,分别饮水饲喂不同剂量的氟化钠:第一组氟化钠浓度2.5 mg/mL(该浓度为113LD50);第二组氟化钠浓度1.25 mg mL;第三组氟化钠浓度0.625 mg/mL;第四组氟化钠浓度0.312 5 mg/mL;第五组氟化钠浓度0.156 3 mg/mL。取第六组为对照组,饮水中不加氟化钠。于普通养殖环境中饲养3个月。

1.2.3 实验步骤:

股骨、胫骨取材用pH7.2 PBS液0.8 m L冲洗骨髓腔,然后用注射器接24号针头加入pH7.2 PBS液反复抽打,分散细胞,制成骨髓细胞悬液;1 000 rpm离心10 min,弃上清液,复加与细胞沉淀块等量的pH7.2 PBS液,再次制成骨髓细胞悬液;推片,充分干燥(静置1～2 h);甲醇固定5 min,自然干燥;Giemsa染色10～20 min,用pH7.2 PBS液洗净,风干后观察;一只鸡计数一片,计数嗜多染红细胞,并计算含微核的嗜多染红细胞的千分率。

2 结果判定

2.1 微核判定

嗜多染红细胞经Giemsa染色呈灰蓝色,细胞核呈紫红色或蓝紫色。正染红细胞染色后呈桔红色。微核完全游离于细胞浆中,染色及形态与主核一致,体积小于主核的1/3[10]。每只动物计数1 000个嗜多染红细胞,观察含有微核的嗜多染红细胞数,计算其微核率,以千分率表示。嗜多染红细胞出现一个以上微核,仍按一个细胞计数。

2.2 鸡红细胞微核率测定结果(表1)

由表1可知,0.156 3 mg/mL剂量组与对照组相比较,无显著性差异(P>0.05);其他4组与对照组比较,差异极显著(P<0.01),而且呈明显剂量效应关系。

2.3 相关结果分析

实验氟剂量与鸡红细胞微核之间的相关关系为r=0.9(P<0.01),二者之间存在极显著的正相关。

3 结论与讨论

在实验过程中,各加氟组鸡有了不同程度的中毒表现,说明成功地复制了不同程度的氟中毒模型。

微核是有染色体,染色单体的无着丝粒断片或纺锤损伤后滞或染色体在细胞分裂中未被包与主核中形成[12]。微核形成的自然发生率1‰～5‰的情况下是细胞受毒物后的一种遗传学终点。本试验结果表明,0.156 3 mg/mL剂量组微核发生率在正常范围内并与对照组无明显差异,而其他4组微核发生率明显与正常切与对照组差异极显著,呈显著正相关。说明当机体摄入氟量高出一定值,将导致微核发生率异常并呈现显著的剂量—效应关系。分析原因如下:

3.1 氟抑制DNA的合成

DNA合成受抑制导致染色体和纺锤体联结发生障碍或纺锤体功能受损失染色体分离异常,导致细胞分裂时诱发不分离现象,或产生非整倍体子代细胞,同时使1条或多条染色体残留于细胞中央的赤道附近形成滞后染色体,滞后染色体在子代细胞形成时,不能被包于核中,而优离与细胞浆中形成微核[13]。氟抑制DNA合成机制推测如下:(1)蛋白质是氟作用的主要靶子,抑制蛋白质合成从而抑制DNA合成;(2)氟直接通过钙离激活腺苷酸环化酶。使CAMP生成增加。而细胞内CAMP的水平增加可抑制DNA合成;(3)氟通过干扰微量元素代谢影响DNA,RNA合酶的活性;(4)氟直接的与原生质作用[14]。

3.2 氟直接损伤DNA合成

DNA受损诱发染色断裂,当断裂不发生重接或重接不在原处,即可出现染色体结构异常并拌有无着丝粒断片,细胞分裂后期,染色体分裂为两条子染色体,附着于端粒的纺锤丝向两极移动,从而牵引染色体移动到子代细胞中,但无着丝粒断片在细胞分裂期无纺锤丝的牵引,不能向细胞的两极运动,而是残留在细胞中央的赤道附近,当子代细胞形成时,不能被包于子核中,而游离于细胞浆中形成微核[16]。氟损伤DNA机制推测如下:(1)氟点负性强,是氧化剂,直接引起DNA单链断裂;(2)氟使脂质过氧化作用增强,产生的过氧化物攻击而产生大量的自由基,自由基与DNA作用链断裂;(3)氟与尿嘧啶和酰胺有很强的亲和力,强的N-H-F-H-H引起A—T碱基氢键断裂,造成DNA结构变化,干扰其合成,增加DNA复制过程碱基配对错误频率;(4)干扰细胞分裂[14]。

由于上述两种因数共同作用DNA而诱发微核形成,客观地证实过量的氟对机体具有毒性,氟化物为潜在的诱变剂。

mg/mL、个、‰

注:*表示差异显著;**表示差异极显著

相关研究

鸡对饲料中氟的耐受力

Huyghebaer等认为,肉鸡对饲料中氟的耐受量在200～300 mg/kg以上,400 mg/kg可以引起增重减慢,但对死亡率无影响。Caleir认为(1～4周龄)肉鸡饲料中含氟达600 mg/kg时,对其增重及死亡率均无影响。Gunter报道,700 mg/kg氟能降低母鸡产蛋量,但与对照组和低氟组没有明显差异。刁有祥等报道,饲料中氟含量为308 mg/kg时,AA肉鸡死亡率为40%,症状以软脚、瘫痪为特征。李西峰研究认为,生长肉鸡对氟的最大安全限量为200～400 mg/kg。

影响因素

1作用时间

动物随着年龄的增长,对氟的耐受性增强,呈现时间-效应关系。赵贵元等、Sut-tie等都曾报道过动物随年龄增长,对氟的耐受力提高。一定浓度时,鸡接触氟时间越长,则体内蓄积的氟含量越高,引起氟中毒的可能性越大。

2营养因素

影响较多的是矿物元素。Marier指出,氟中毒是镁缺乏的一个重要表现,当水中镁降低时,饲料中低水平的氟也能表现出毒性作用。另外某些常量元素如钙、磷及微量元素如锌、锰、铜、硒等的缺乏,也易引起骨胳疾病。当饲料中缺乏这些元素时就降低肉鸡对氟的耐受力,容易发生氟中毒并加重了氟骨病的发生。

摘要：为研究氟化物对鸡红细胞微核形成的影响,选用36只1日龄罗曼褐公鸡,随机分为6组,每组6只,第六组为对照组,第一到第五组为实验组,在饮水中添加不同水平的氟化物,使水中氟的含量分别为2.5、1.25、0.625、0.3125、0.1563mg/mL,试验期为3个月。生物统计结果表明,0.1563mg/mL剂量组,红细胞微核细胞率与对照组无明显差异,其他各组微核细胞率随氟剂量的增高而升高(P<0.01)。结果表明氟化物为潜在的诱变物。

关键词：氟,微核实验,红细胞,毒性

红细胞微核 篇2

通过由加速器产生的0.8MeV单能中子和60Coγ射线照射洋葱萌发种子,观察在根尖细胞中微核诱发率,从而更好地了解中子相对生物效能(RBE).洋葱萌发种子照射单位剂量0.8MeV单能中子和60Coγ射线后,根尖细胞中的微核诱发率分别为111±6.7(10-2Gy-1)和3.59±0.19(10-2Gy-1).因此,以60Coγ射线为参考辐射时,0.8MeV单能中子在洋葱根尖细胞诱发微核的相对生物效能(RBE)值为31.0±2.5.与252Cf裂变中子的.RBE比较,0.8 MeV单能中子照射在洋葱根尖细胞中诱发微核的RBE值要高.

作 者：张文艺 焦玲 星正治 Zhang Wenyi Jiao Ling Hoshi Masaharu 作者单位：张文艺,焦玲,Zhang Wenyi,Jiao Ling(中国医学科学院中国协和医科大学放射医学研究所,天津,300192)

星正治,Hoshi Masaharu(日本广岛大学原爆放射线医科学研究所,日本广岛,734-8553)

红细胞微核 篇3

关键词：小鼠,烟草提取液,嗜多染红细胞,微核率

微核是有害因素作用于细胞,使细胞的染色体发生断裂,在细胞分裂过程中丧失着丝粒的染色体断片不能随有丝分裂进入子细胞核,而在细胞浆中形成直径小于主核的,嗜色与主核一致,完全与主核分开的圆形或椭圆形微小核,其大小一般为主核的1/12～1/3,故称微核(micronucleus,MN)。纺垂丝结构异常,在细胞分裂过程中可使整条染色体或几条染色体行动滞后,在分裂末期不能进入主核,也可形成微核。细胞浆中可形成1个或数个微核。

微核率是单位细胞中的微核数,通常使用微核千分率(一千个细胞中含微核的细胞数)。已经证实,微核率的高低与致微核物质的剂量和毒害作用的强弱呈正相关,所以通过微核率的高低就可以判断致微核物质的遗传毒害作用的强弱。各种类型的骨髓细胞及外周血等有核细胞中都可形成微核,但有核细胞的胞质少,微核与正常核叶及核的突起难以鉴别,而嗜多染红细胞是分裂后期的红细胞由幼年发展为成熟红细胞的一个阶段,此时红细胞的主核已排出,因胞质内含有核糖体(含RNA),姬姆萨染色呈灰蓝色,成熟红细胞的核糖体已消失,被染成淡桔红色。骨髓中嗜多染红细胞数量充足,微核容易辨认,而且微核自发率低,因此,骨髓中嗜多染红细胞成为微核试验的首选细胞群。

微核试验是检测染色体损伤的重要方法,已广泛应用于遗传、食品、药物、环境等多领域的遗传毒性评估,以及作为有害职业和在有害环境人群遗传损害的生物标志物。不少学者已用微核试验检测出多种物质的致突变作用。如黄海雄等[1]检测出高浓度的装修材料挥发物对实验动物有致突变作用;梁子安等[2]研究证实高浓度汽车尾气使小鼠骨髓红细胞的微核率增高,汽车尾气对动物细胞具有明显的遗传毒理作用,且尾气的浓度越大细胞毒性越大。众所周知,吸烟对人体有害,本研究利用微核试验检测烟草提取液能否诱导小鼠骨髓细胞微核形成,从遗传角度再次证明吸烟对人体健康有害。现将研究结果报道如下:

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

KM小鼠20只,雌雄各半,身体健康,体重20～25g,由南华大学实验动物学部提供,实验动物生产许可证号为SCXK(湘)2004-0009,实验动物使用许可证号为SYXK(湘)2003-0002。1.1.2实验用试剂(1)烟草提取液:烟草从郴州卷烟厂购买。将烟草称取500g研碎,然后加入10倍体积的蒸馏水浸泡24h,加热至100℃煎煮30min,用双层纱布过滤;滤渣再加入5倍体积的蒸馏水,加热至100℃煎煮30min,经双层纱布过滤,把两次所得的滤液加热浓缩至100ml,使溶液质量浓度为5g/ml,所得溶液即烟草提取液原烟草提取液稀释液,即使用液。(2)环磷酰胺溶液:从医院购买环磷酰胺,200mg/瓶。先取生理盐水将其稀释至成10ml(浓度为20mg/ml)的溶液,然后取1ml稀释后的溶液再加9ml生理盐水稀释成2mg/ml的溶液,即为2mg/ml环磷酰胺稀释液。(3)0.9%生理盐水。(4)无菌小牛血清:小牛血清由湘南学院动物实验室提供。使用前需将小牛血清进行灭活(将小牛血清解冻,然后将小牛血清倒入干净试管中放在56℃恒温水浴锅中灭活30min),灭活的小牛血清保存于冰箱冷冻室。(5)10%Giemsa染液。

1.2 实验方法

1.2.1 小鼠分组

小鼠共分五组,分别为环磷酰胺的阳性对照组,生理盐水的阴性对照组,实验组根据烟草提取液最终使用浓度分三组(即:30mg/kg,40mg/kg,50mg/kg的三个浓度组)。每组需用4只体重相当身体健康的小鼠。

1.2.2 小鼠染毒

分别称出每组每只小鼠的体重并记录,根据每个实验组的最终使用浓度和小鼠的体重计算出每只小鼠的染毒量,然后采用30小时给受试物法[3],按烟草提取液最终使用浓度,分别给每只小鼠灌喂烟草提取液使用液,24h后用相同剂量相同方法再灌喂一次,于第二次灌喂后6h脱臼处死小鼠。小鼠处死后检测小鼠骨髓嗜多染红细胞微核率。阳性对照组和阴性对照组采用类似方法,分别灌喂环磷酰胺和生理盐水。除上述处理外,提供每组小鼠正常饲料和水分,保证小鼠自由取食,自由饮水,各组小鼠分开饲养(饲料相同),饲养环境相同。

1.2.3 小鼠的解剖及骨髓细胞玻片标本制作

脱臼处死小鼠后,采用常规法解剖小鼠,取两根股骨,剔净肌肉,用纱布擦掉附在股骨上的血污及股肉,剪掉股骨头,露出骨髓腔。用6号针头的注射器吸取小牛血清1ml,将针头插进骨髓腔少许,用小牛血清将骨髓冲洗入离心管内,用吸管轻轻吹打成细胞悬液,以1000r/min离心3～5min,然后用细头滴管吸弃上清液,留下沉淀并加入1滴小牛血清,用细头滴管吹打混匀。吸取细胞混悬液一小滴于载玻片的一端,按常规涂片法制片(约2～3cm),自然晾干后用甲醇溶液固定5min,晾干后用10%Giesma染液染色10min,细自来水冲去多余染料,自然晾干玻片(注:每只小鼠制两片玻片)。

1.2.4 镜检

在显微镜油镜下嗜多染红细胞被染成灰蓝色网织状,成熟红细胞呈桔红色。微核呈圆形及椭圆形,边缘光滑整齐,嗜碱性与核质一致,呈紫红色或蓝紫色,大小约为细胞核的1/12～1/3(图1)。每张玻片计数500个嗜多染红细胞,记下出现微核的细胞数(细胞中有多个微核,只计数一次)。每组小鼠共计数4000个嗜多染红细胞,再求出每组小鼠平均微核率(‰)。

2 结果

阳性对照组嗜多染红细胞微核率为23.75‰;阴性对照组微核率为1.75‰;实验组中的30mg/kg浓度组微核率为22‰、40mg/kg浓度组微核率为31‰、50mg/kg浓度组微核率为38‰(见表1)。

3 讨论

根据以上实验结果,30mg/kg环磷酰胺阳性对照组嗜多染红细胞的微核率为23.75‰,生理盐水阴性对照组的微核率1.75‰,30mg/kg、40mg/kg、50mg/kg烟草提取液实验组的小鼠骨髓细胞微核率分别为22‰、31‰、38‰。三组烟草提取液微核率均明显高于生理盐水阴性对照组(P<0.01);30mg/kg烟草提取液与30mg/kg环磷酰胺比较微核率差异不明显。但40mg/kg和50mg/kg烟草提取液微核率比环磷酰胺对照组比较微核率高,差异极显著(P<0.01)。其中烟草提取液微核率随随浓度升高。本研究证明烟草提取液染毒小鼠会导致严重的遗传毒害作用。

人类吸烟虽不像饮食烟草提取液产生那么大的遗传毒害作用,但已有研究证明烟草燃烧时释放的烟雾中含有多种有毒物质,其中包括一氧化碳、尼古丁等生物碱、胺类、腈类、醉类、酚类、烷烃、醛类、氮氧化物,多环芳烃、杂环族化合物、羟基化合物、重金属元素、有机农药等。高志刚等[4]从吸烟者口腔脱落上皮细胞微核率的研究中发现,吸烟者脱落的口腔上皮细胞微核率高于未吸烟者;吸烟群体患肺癌等肿瘤比例高于不吸烟人群,都证明香烟的遗传毒害作用。长期吸烟,有毒物质逐渐积累,对人体产生不同程度的致突变和致癌作用,导致肺癌等肿瘤,可谓吸烟即吸毒,吸毒而致命。

笔者根据前人研究及本文研究结果,谨重建议如下:(1)现没吸烟者不要受人诱惑,永远不吸咽。(2)吸烟者尽早戒烟或少吸烟,吸烟时不要吸到尽头,在公共场合不要吸烟,做到不要影响他人身体健康。(3)生产香烟的企业进行技术改革,减少香烟的毒性。如增加香烟的过滤嘴长度,减少香烟的长度;也可通过添加某些物质降低香烟毒性。例如,嵇庆等[5]用不同对香烟烟雾水溶物诱导蚕豆根尖细胞微核形成,结果表明亚硒酸钠、烟酰胺、绿茶浸出物和维生素C均能显著降低由香烟烟雾水溶物引起的微核率,上述物质可能具有减轻吸烟引起的遗传毒性损伤的作用。总之,生产企业生产出毒性低的香烟,以满足那些烟瘾大而不愿戒烟的人。(4)政府相关行政机关加大监督力度,扩大无烟区。

参考文献

[1]黄海雄,余淑宛,康莉,等.室内装修材料挥发物的小鼠微核试验[J].职业与健康,2003,19(10):55-56.

[2]梁子安,王小立.汽车尾气对小鼠骨髓嗜多染红细胞微核率影响的研究[J].湖北民族学院学报(自然科学版),2002,20(1):4-6.

[3]刘秀英,胡怡秀,易传祝,等.苦瓜醇提取物对小鼠的急性经口毒性和遗传毒性试验研究[J].癌变畸变突变,2007,15(5):381-383.

[4]高志刚,李少英,王凤玲.吸烟者口腔脱落上皮细胞微核观察[J].上海医学,1996,19(8):483-484.

红细胞微核 篇4

1 材料与方法

1.1 试验动物

健康昆明小鼠78只, 体重为25～30 g, 雌雄各半, 购自沈阳农业大学实验动物中心, 动物状态良好, 皮毛光泽, 进食与活动正常。

1.2 药品及试剂磺胺喹

啉原粉 (纯度≥99.0%) , 购自湖北远成药业有限公司。

标准胎牛血清, 购自中国医学科学院生物工程研究所;酵母试剂, 购自Oxiod公司;Hank’s液, 购自杭州四季青生物工程有限公司;肝素钠, 购自中国医药集团上海化学试剂公司;淋巴细胞分层液, 购自美国Sigma公司;环磷酰胺, 购自山西泰盛制药有限公司。

1.3 动物分组及给药

试验根据王进峰[2]报道的半数致死量 (LD50) , 将42只小鼠随机分成7组 (见表1) , 每组6只, 分笼饲养, 连续灌胃给药2次, 间隔时间为24 h, 于第2次灌胃6 h后处死小鼠检测骨髓微核率。将剩余36只小鼠分成6组 (除无阳性组外其余同表1) , 每日灌胃1次, 2周后眼球采血检测红细胞免疫功能。

1.4 骨髓微核试验[5]

将小鼠脱颈椎处死, 取小鼠两侧股骨, 剔去肌肉及碎片, 剪去两端骨骺, 用约0.05 mL胎牛血清冲洗骨髓腔数次;将冲洗物滴到载玻片上, 推片, 在酒精灯上短时烘烤、干燥, 甲醇固定7.5 min, 取出晾干;用1∶10的吉姆萨-磷酸缓冲液 (pH值6.4) 染色18 min;用纯化水冲洗, 干燥, 再放入二甲苯透明6 min;取出后趁湿滴上适量中性树脂, 盖上盖玻片, 镜检。每只小鼠计数1 000个嗜多染红细胞 (PCE) , 并计算嗜多染红细胞微核率。计算公式:嗜多染红细胞微核率=含微核的嗜多染红细胞总数/检查嗜多染红细胞×1 000‰。

1.5 红细胞C3b受体酵母花环试验[6]

1.5.1 C3b致敏酵母细胞悬液的制备

将酵母试剂用Hank’s液洗1次 (1 000 r/min离心10 min) , 配成浓度为1×108个/mL的酵母细胞悬液;然后加等量新鲜豚鼠血清, 混匀, 37 ℃水浴20 min, 清洗2次, 恢复原浓度, 即为C3b致敏酵母细胞悬液。酵母试剂用Hank’s液洗涤后配成浓度为1×108个/mL的悬液, 即为非致敏酵母悬液。

1.5.2 红细胞悬液的制备

各试验组小鼠眼球采血, 肝素抗凝, 取适量抗凝血用Hank’s液洗3次, 将洗涤后的红细胞用Hank’s液稀释成浓度为1.25×107个/mL的悬液, 即为红细胞悬液。

1.5.3 检测方法

取C3b致敏酵母细胞悬液和红细胞悬液各50 μL, 混匀, 于37 ℃水浴40 min后取出, 轻轻摇动;加0.25%戊二醛溶液20 μL, 固定5 min;用适量Hank’s液稀释, 涂片, 干燥, 甲醇固定;用姬姆萨染液染色, 高倍镜检查, 以1个红细胞黏附2个或2个以上酵母细胞为1个花环, 计数200个红细胞, 求出花环率。

1.6 红细胞免疫复合物 (IC) 酵母花环试验

除酵母细胞不致敏外, 其余同红细胞C3b受体花环试验。

1.7 血液中红细胞的检测

采用临床常规检验方法进行检测。

1.8 数据分析

采用SPSS12.0统计学软件对试验数据进行单因子方差分析, 用LSD进行多重比较, 所有试验数据均用平均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 磺胺喹

啉对小鼠骨髓嗜多染红细胞微核率的影响

镜下成熟正染红细胞 (NCE) 呈红色, 嗜多染红细胞呈灰蓝色。阳性组与阴性组比较有统计学意义 (P<0.01) , 试验可行。与阴性组比较, 磺胺喹啉1/5 LD50组和1/2 LD50组微核率极显著升高 (P<0.01) , 1/10 LD50组显著升高 (P<0.05) , 并呈现出一定的剂量-效应关系。具体见表2和图1。

2.2 磺胺喹

啉对小鼠红细胞及红细胞免疫功能的影响

注:与阴性组比较, 数据肩标a表示差异显著 (P<0.05) , A表示差异极显著 (P<0.01) ;与阳性组比较, b表示差异显著 (P<0.05) , B表示差异极显著 (P<0.01) 。

红细胞C3b受体花环率和IC花环率均是以1个红细胞黏附2个或2个以上酵母细胞为1个花环 (如图2中箭头所示) 。

小鼠红细胞及红细胞免疫功能的变化见表3和图3～5。与阴性组比较, 磺胺喹啉1/5 LD50组和1/10 LD50组C3b受体花环率均显著降低 (P<0.05) , 并呈现出一定的剂量-效应关系。红细胞免疫复合物花环试验结果与阴性组比较没有统计学意义 (P>0.05) 。随着给药剂量的增加红细胞数量有降低的趋势, 其中1/5 LD50组和1/10LD50组显著低于阴性组 (P<0.05) , 说明磺胺喹啉剂量过大可能会抑制小鼠红细胞的免疫功能。

3 讨论

自2005年起, 农业部把畜产品中磺胺类药物的残留情况作为继盐酸克伦特罗之后的又一个重点予以监控, 并规定磺胺类药物的总残留量不得超过300 ng/mL, 欧盟、日本、美国等西方发达国家制定的残留标准是100 ng/g[7]。中国加入世界贸易组织 (WTO) 后, 世界各国均制定了相对严格的兽药残留标准。国外对我国出口的肉类产品提出了新的要求, 在原有的10种磺胺类药物的检测基础上新增添了对磺胺喹啉的检测要求[2]。美国食品与药品管理局 (FDA) 规定鸡的磺胺喹啉休药期为10 d, 并规定母鸡在产蛋期内禁用磺胺喹啉。而在国内, 目前磺胺喹啉是我国农业部规定可以作为药物饲料添加剂使用的4种磺胺类药物之一, 在畜牧业生产中使用量非常大, 所以在动物性食品中残留情况也比较严重。

红细胞微核 篇5

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

仪器OLYMPUSBX 51光学显微镜、甲醇固定液, 生理盐水, 瑞-吉氏复合染色液。

1.2 方法

1.2.1 乙醇现场固定法口腔脱落细胞玻片制备

受试者清水漱口, 用一次性木质压舌板轻刮一侧颊黏膜2次, 将2次刮物洗脱在滴有生理盐水的载玻片上, 细胞计数后自然风干, 滴无水乙醇固定, 自然风干, 装盒。在另一侧颊黏膜重复上述步骤。

1.2.2 常规法口腔脱落细胞玻片制备

受试者清水漱口, 一次性的木质压舌板从侧面轻刮2例颊黏膜, 将2次刮取物用2ml缓冲液 (0.01mol/L Tris·HCl、0.1mol/L EDTA、0.02mol/LNaCl) 冲洗到5ml离心管内, 轻轻吹打、混匀后, 1000r/min (离心半径=13cm) 离心10min, 弃去上清液重复1次, 然后将细胞稀释到 (1～2) ×106个/L。取1滴在载玻片上, 风干, 无水乙醇固定1min。

1.2.3 口腔脱落细胞微核试验

用上述2种方法制备的口腔脱落细胞玻片分别于4、8、24、30h后进行Giemsa染色, 高倍镜下读取每例1000个胞膜、核膜完整的颊黏膜上皮细胞, 记录微核数。核判断标准:与主核完全分开, 直径小于主核的1/3, 呈圆形或椭圆形, 边缘光滑, 微核染色和折光率与主核一致, 位于胞质内。选择制片中部胞核胞质完整的转化的淋巴细胞, 每例观察1000个, 计数淋巴细胞微核数, 以千分率表示。

1.2.4 外周血微核试验

采用Wusnhou方法[2], 取受检者外周血1ml于37℃恒温下培养72h, 常规方法收获细胞 (收获前不加秋水仙素) 。用0.075mol/LKCl低渗液37℃下处理3min后, 加入新配制的甲醇∶冰醋酸3∶1固定液1ml, 预固定一二分钟。然后1000r/min离心3min, 去上清液, 加固定液固定二三分钟。滴片, 自然干燥, Giemsa染色。

1.2.5 2种口腔脱落细胞制片方法保存时间的比较

统计学分析3种试验方法, 在不同保存时间的微核率均不呈正态分布, 并且经变量变换亦不能转为正态分布, 故采取秩和检验比较各组中不同保存时间的微核率的差异, 并进行两两比较。

2 结果

2.1 乙醇现场固定法

每侧刮取的细胞数达到600个, 2张玻片的细胞能够满足观察1000个细胞的要求。

2.2 乙醇现场固定

见表1。口腔脱落细胞在0、4、8、24、30h后进行微核试验与常规法口腔脱落细胞微核试验及外周血培养法微核试验的结果比较, 在0h 2种方法的微核率差异无统计学意义 (P>0.05) ;与外周血培育法结果差异也无统计学意义 (P>0.05) 。乙醇现场固定法口腔脱落细胞在30h细胞出现变形, 肿胀, 可观察的细胞减少, 微核率下降 (1.45±0.27) , 与常规法口腔脱落细胞微核率及外周血培养法微核率差异均有统计学意义 (P<0.05) 。而常规法口腔脱落细胞在4h后微核率下降 (2.45±0.26) , 差异无统计学意义 (P>0.05) , 8h微核率明显下降 (1.32±0.28) , 差异有统计学意义 (P<0.05) 。30h后由于多数细胞肿胀变形, 无法进行有效观察。

注:与常规法口腔脱落细胞微核率Oh比较, #P<0.05;与外周血培养法微核率比较, *P<0.05。

3 讨论

微核试验创建于20世纪70年代中期[3,4], 因其快速、简便, 易于操作, 广泛用于职业人群的细胞遗传损害的健康监护及对一些遗传毒性物质的研究中[5]。

在本次研究中, 我们使用了Giemsa染色, 微核试验还常用荧光染色[6], 但是荧光染料保存时间短, 且需要荧光显微镜才能进行观察。一些常用的荧光染料能快速进入活细胞中与DNA结合, 具有遗传毒性。同时, Giemsa染色在微核检测的特异性及清晰程度上与荧光染色类似, 封片以后便于保存。

目前, 常用微核检测方法是人外周血淋巴细胞, 在人群研究中, 血液采集由于其创伤性而难度较大, 而口腔脱落细胞的无创取材增加了人群研究的依从性, 特别对于一些需要重复多次取样的研究尤为突出。在需要到现场进行取样的情况下, 由于现场条件有限, 常规的试验方法无法实施, 特别在夏季炎热气候条件下, 如何延长样本的保存时间显得尤为重要。本研究发现使用无水乙醇现场固定口腔脱落细胞制片的标本在24h后仍然能够进行有效的微核试验, 其微核率与常规检测法及外周血培养法微核试验差异无统计学意义。可见, 利用无水乙醇现场固定口腔脱落细胞可以在现场完成制片工作并保存, 提供了一定的时间回到实验室再进行后续试验, 为现场研究提供了条件。

摘要：目的建立乙醇现场固定口腔脱落细胞进行微核试验的方法。方法利用无水乙醇现场固定口腔脱落细胞, 保存0～30h后进行微核试验与常规口腔脱落细胞微核试验、外周血淋巴细胞微核试验进行比较。结果乙醇现场固定法的口腔脱落细胞在4、8、24h后的微核率与常规口腔脱落细胞微核率和外周淋巴细胞法微核率 (Oh) 差异无统计学意义 (P>0.05) , 而常规法口腔脱落细胞在保存4h后则出现微核率下降, 与外周血培养法的微核率差异有统计学意义 (P<0.05) 。结论无水乙醇现场固定口腔脱落细胞能够有效延长保存时间, 微核试验结果稳定, 适合用于现场采样。

关键词：口腔脱落细胞,无水乙醇固定,微核试验

参考文献

[1]范卫, 王玮兰, 丁晟.口腔脱落细胞微核技术在丙烯腈接触人群中的应用.中华劳动卫生职业病杂志, 2006, 24 (2) :106-108.

[2]Wusnou PC, Tsai MS, Hwang JS, et al.Followup in the micronucleus fre-quencies and its subsets in human population With chronic low dose Y irradiation exposure.Mutat Res, 1999, 428:99-105.

[3]Heddle A.A rapid in vivo test for chromosomal damage.Mutat Res, 1973, 18:187-190.

[4]Schmid W.The micronucleus test.Mutat Res, 1975, 31:9-15.

[5]蒋东方.微核实验在职业人群接触危害评价应用中的研究.中国职业医学, 2000, 27 (4) :43-44.

洗洁精对蚕豆根尖细胞的微核诱导 篇6

由于大量新的化合物的合成,原子能应用,各种工业废弃物的排出,使人们需要一套高度灵敏、操作简单的测试系统来监视环境变化。只有真核的测试系统更能直接推测诱变物对人类或其他高等生物的遗传危害,在这方面,微核测试是一种比较理想的方法。

随着人们生活水平的不断提高,各种洗涤剂相继问世。人工合成的洗涤剂成本低,去污强,使用范围越来越广泛。但是洗涤剂可通过皮肤渗透到血液中,使细胞染色体畸变,此外,合成洗涤剂废水排入水体后也会对环境造成破坏。利用蚕豆根尖作为实验材料进行微核测试,可准确显示各种处理诱变的效果。

材料与方法

实验材料

蚕豆种子、洗洁精、纱布,甲醇、冰醋酸、醋酸洋红、盐酸和硫酸铜均为分析纯。

实验方法

1 诱导萌发

将蚕豆种子在自来水中浸泡2 d,使其充分吸胀。将吸胀的种子平铺在湿纱布上保湿培养2 d,待大部分初生根长至2 cm左右即可用来检测。

2 根尖处理

每组选取生长良好,根长一致的6粒种子,分别放入待测液为自来水(阴性对照)、稀释500倍的洗洁精溶液、稀释300倍的洗洁精溶液、稀释100倍的洗洁精溶液、硫酸铜溶液(阳性对照)的溶液中,浸没处理24 h。

3根尖恢复培养

将上述处理后的种子用蒸馏水冲洗3次,每次5 min,放入盛有自来水的培养皿中室温培养24 h。

4镜检

将恢复培养后的种子取根尖固定、酸解后用醋酸洋红染色并压片。每组取1个效果较好的根尖临时装片,每个根尖计数500个细胞中的微核数并进行记录。

结果与分析

洗洁精对蚕豆根尖的影响

从实验可以看出,洗洁精处理过的蚕豆,表皮和根尖颜色、形态都发生了不同程度的变化。表皮发黑、根尖发黄、变黑以及变软甚至腐烂。分析原因可能是蚕豆根尖经洗洁精诱变处理后,细胞发生脱水,从而导致根尖细胞死亡。

洗洁精对蚕豆根尖细胞微核率的影响

洗洁精对蚕豆根尖细胞微核率的影响结果见表1,由表1可知,不同浓度的洗洁精溶液对蚕豆根尖均具有一定的影响。浓度越高,微核率越高,危害越大。

讨论

实验过程

1实验材料

可以用洋葱或大蒜作为实验材料进行微核诱导,也可以不局限于植物材料,考虑使用动物材料,比如小鼠、家兔等。这样更接近于人类生活,有更大的实际研究价值。

2染色材料

染色材料不一定局限于一种,可以用其他生物染料来代替,比较染色效果,用染色效果最佳的一种染料。

3 染色时间

本次实验中,根尖染色时间略短,导致根尖制片后观察效果不佳,难以辨认微核。鉴于此实验现象及结果,建议可以适当延长染色时间,以便于观察。

4 制片方法

制作临时装片的技术方法可以有所改进,压片时一定要将根尖捣碎,使得细胞完全分散开来,以便于后期镜检。不一定完完全全的按照查找资料上的方法来进行,实验过程中头脑要保持灵活,不断思索,适当改进实验方法。

实验结果

红细胞微核 篇7

1 材料与方法

1.1 香烟烟雾提取液制备

用市售某品牌香烟去掉过滤嘴点燃, 以流水产生负压吸烟, 调节水流控制吸烟速度, 每支烟在10 min左右燃完。用10 % DMSO做为提取液, 以称量法测得提取液中提取物的含量, 用蒸馏水稀释备用。

1.2 动物处理

昆明种小鼠, 由包头医学院动物室提供, 雄性, 体重21±1 g, 鼠龄90 d。将动物在实验室饲养2周后, 选健康者随机分为3个观察组 (A、B、C) 、1个空白对照组和 1个溶剂对照组, 每组各10只动物。A、B、C观察组于每日晨1次按体重 (mg/kg) 分别腹腔注射50.0、25.0、12.5 mg香烟烟雾提取物 (溶于0.3 mL 10 % DMSO中) , 连续染毒5 d, 第5 d下午处死动物。溶剂对照组按观察组方法腹腔注射10 % DMSO, 每次0.3 mL;空白对照组小鼠与染毒组小鼠同时喂养, 但不作任何处理;两对照组动物与染毒组动物同时处死。在整个实验过程中, 各组实验同时进行, 所有动物的饲养条件均完全相同。

1.3 制片及观察方法

断髓处死小鼠, 取股骨, 制备骨髓涂片, 经染色后采用盲法阅片, 选择分散良好、形态清晰的骨髓嗜多染红细胞进行观察, 每只小鼠观察1 000个嗜多染红细胞, 记录出现微核的数量。

1.4 资料处理

全部实验数据均用SPSS/PC 12.0统计分析软件进行方差分析。

2 结果

空白对照组嗜多染红细胞微核率与溶剂对照组比较差异无统计学意义 (F=0.42, P>0.05) , 说明溶剂DMSO对嗜多染红细胞中微核的产生没有作用。观察组中的A、B、C三组与空白对照组比较, 嗜多染红细胞微核率差异均有统计学意义。见表1。

*与空白对照组比较P<0.05;**与空白对照组比较P<0.01

3 讨论

本实验结果显示, 空白对照组与溶剂对照组间小鼠嗜多染红细胞微核率间差异无统计学意义, 说明溶剂DMSO对嗜多染红细胞中微核的产生没有作用, 用DMSO做为溶剂不会影响或干扰香烟烟雾提取物诱发小鼠骨髓微核的产生情况, 本实验的方法可靠。用香烟烟雾提取物染毒的A、B、C三组嗜多染红细胞微核率与空白对照组比较, 微核率均高于空白对照组, 差异均有统计学意义, 说明3个剂量的香烟烟雾提取物均可诱发小鼠骨髓嗜多染红细胞产生微核。

微核被认为是染色体在外来因素作用下发生断裂而产生的染色体断片, 在细胞分裂期不能随染色体进入子细胞核, 遗留在胞质中形成的核性物质, 呈圆形或椭圆形, 着色与核一致或略浅。微核出现增多即意味着染色体发生了异常的断裂, 因此本实验中染毒香烟烟雾提取物后的小鼠, 其骨髓嗜多染红细胞微核率增高即说明香烟烟雾提取物具有损伤染色体的作用, 结合我们前期研究工作结果可以认为, 香烟烟雾提取物对体细胞、生殖细胞均具有遗传物质损伤的作用, 而且这种作用很可能与香烟烟雾提取物加剧小鼠体内过氧化作用有关。

参考文献

[1]吴玲, 陈晓东, 贾玉巧, 等.香烟烟雾提取物致小鼠生殖细胞的遗传学损伤[J].包头医学院学报, 2001, 17 (3) :173-174.

红细胞微核 篇8

1 材料与方法

1.1 水样采集。

在平顶山市区沿湛河选择18个流入湛河的排污口采集水样, 实际采水深度按国家环境保护总局公布的水和废水监测分析方法:当水深大于1m时, 在表层下1/4深度处采水;当水深小于或等于1m时, 在水深的1/2处采水[4]。

1.2 蚕豆根尖微核试验。

采用市售优质蚕豆 (Vicia faba) ;参考卢龙斗等方法[5], 以蒸馏水作对照。本实验每个处理统计3条根尖, 每个根尖观察1000个分散良好、质核清晰的间期细胞, 测定MCN‰和PI值。

1.3 数据统计及分析。

将18个样点和对照组MCN‰进行F检验, 检验不同样点水样对蚕豆根尖细胞的处理所得微核率的差异性。然后用LSD法中的梯形比较法对18个样点与对照组之间的差异性进行检验。

2 结果与分析

湛河18个采样点的MCN‰和PI见表, 18个样点与对照组MCN‰的F检验表明, 不同样品对蚕豆根尖细胞的处理所得微核率的差异达极显著水平。

3 结论和讨论

3.1 以微核千分率为指标的湛河污染状况。

本研究监测的湛河18个采样点其微核千分率均明显高于对照组, 说明采样点水质受到不同程度的致突变因子污染;多重比较 (梯形比较法) 结果显示, 11、16、17、8、6、12、18、5和9号样点与对照组相的差异性达到了极显著水平, 4号样点与对照组相比达到显著水平。其余各样点 (14、13、10、7、3、2、1、15) 与对照组比较差异不显著。18个采样点的水质污染情况可分为四类:一是重污染区包括湛河路荟文街排水口、朝阳路湛河污水口、湛河诚朴路污水口、湛河车电厂西侧排污口、湛河开发区二路桥下北污水口、开发二路湛河桥下南污水口、湛河开发路桥下;二是中污染区包括建设西路乌江河桥下北侧清真寺旁、凌云路南端湛河排污口、湛河新华路污水口、湛河新华路桥下、湛河大铁路桥南岸东侧排污口、湛河大铁路桥西侧橡胶坝下排水口;三是轻污染区包括北渡乡苗候村白龟山水库大坝下;四是基本无污染区为焦店矿局疗养院、新南环路乌江河桥54km处、光明路湛河桥下、湛河大铁路桥西侧橡胶坝上50m。污染的主要是由于沿河工业废水和生活污水的直接排入造成的[6]。因此, 对湛河的水污染治理应从达标排放入手, 以切实保障人民的身体健康和保护生态环境。

3.2 本研究的不足之处。

微核试验作为检测技术用于检测环境中的遗传毒物有很大的潜力, 但要作为日常检测项目还有许多需要完善之处。如本研究中虽然检测出湛河水质受到致突变因子的污染, 却不能确定污染物种类组成和含量, 并且含量是多少也不能准确测出。因此, 在用该方法进行污水监测时, 应和其它监测方法联合使用, 以确保监测结果的准确可靠。同时, 污染物诱发的微核率只是在一定范围内存在着剂量-效应关系。

除此之外, 微核技术监测方案的标准化工作也有待开展, 以便不同实验室之间的监测数据进行比较。

致谢:河南城建学院2006级冯仁超、翟英哲和王宁宁同学协助采集水样, 在此致以衷心感谢。

摘要：利用蚕豆根尖细胞微核试验检测湛河水体中是否存在致突变因子污染, 在平顶山市区选取18个有代表性的采样点, 采集各样点排出的废水作为水样。通过测定湛河各样点水样的微核千分率 (MCN‰) 以及污染指数 (PI值) 来判断污染程度, 并F检验各水样的MCN‰的差异显著性。试验结果表明, 各样点的MCN‰有显著性差异。湛河18个样点中水质属重度污染的有7点, 占全部的38.9%, 水质属中度污染的有6点, 占全部监测点的33.3%。该实验表明湛河水质受到较严重的致突变性的污染。

关键词：湛河,蚕豆,微核试验,微核千分率,污染指数

参考文献

[1]DEGRASSIF, et al.The utilization of mi-cronucleus test in Vicia faba root tips to de-tect mutagen damage on fresh water pollution[J].Mutation Res, 1982, 9 (7) :203.

[2]陈瑞娇, 李均祥.蚕豆根尖微核试验在环境致突变物检测中的应用[J].韶关学院学报 (自然科学) , 2006, 27 (9) :42-43.

[3]臧宇.蚕豆根尖微核试验的应用与发展[J].癌变·畸变·突变, 1999, 11 (3) :158.

[4]国家环保局.环境监测技术规范[S].北京:中国环境科学出版社, 1991.

[5]卢龙斗, 常重杰.遗传学实验技术[M].北京:科学出版社, 2007:34-38.