长链非编码RNA（共5篇）
长链非编码RNA 篇1
摘要：肝癌是常见的恶性肿瘤之一,发病率和死亡率高,目前缺乏有效的治疗方法 。长链非编码RNA(lnc RNA)是转录本超过200个核苷酸且不能编码蛋白的RNA分子。lnc RNA在肝癌的发生、发展中起重要作用,能影响肝癌的增殖、凋亡、侵袭转移及预后。本文结合国内外在该领域的最新研究进展概述了lnc RNA在肝癌中的异常表达情况,介绍了其通过基因转录调节、表观遗传、稳定蛋白质和mi RNA海绵作用方式影响肝癌发生、发展过程的作用机制,分析了其作为肝癌预后和诊断标志物的重要依据,表明lnc RNA在肝癌的临床应用中具有广阔的前景。
关键词：长链非编码RNA,肝癌,分子机制
原发性肝癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一,发病率位于恶性肿瘤第六位且逐年上升。在我国,2015年肝癌新发病例和死亡病例均在40万例以上,严重威胁人类的身体健康[1]。肝癌患者发现时大多已属于晚期,而手术切除及肝移植等治疗方法仅对早期肝癌具有良好的治疗效果[2],目前亟需找到能够有效治疗肝癌方法的新靶点。最近研究表明,基因组中的长非编码RNA(long noncoding RNA,lnc RNA)在肿瘤发生、发展中扮演着重要角色,其在肝癌演变分子生物学机制的深入研究以及肝癌生物标志物的发现,有助于肝癌的预防、早期诊断以及有效治疗[3]。本文对lnc RNA在肝癌发生、发展中的最新研究进展作简要综述。
1 lnc RNA概述
哺乳动物基因组序列中可产生编码蛋白序列的转录本不到2%,大部分基因不能编码蛋白质,被统称为非编码RNA(non-coding RNAs,nc RNAs),其中长度超过200个核苷酸的被称为lnc RNA。lnc RNA是RNA聚合酶Ⅱ转录的副产物,缺乏有效的开放阅读区,起初被认为是基因组中的“暗物质”,但最近的研究表明,lnc RNA具有非常重要的功能和多种分子机制,能在多种生命活动中发挥重要作用[4]。lnc RNA主要是以RNA的形式从表观遗传学、转录及转录后水平参与X染色体沉默,基因组印记以及染色质修饰,转录激活,转录干扰,核内运输等一系列细胞的重要功能调控。lnc RNA与疾病的发生、发展有密切联系,为了解疾病的发病机制提供新的可能性,有望成为疾病诊断、预后的生物学标记或直接的治疗靶点[5]。
2 lnc RNA在肝癌中的异常表达
自从lnc RNA的生物学功能被关注以来,其在肿瘤中的差异表达与肿瘤发生机制的关联性研究也逐渐开展和深入。已有一些lnc RNA被证实在肝癌发生、发展中发挥着重要的功能,且与肝癌复发转移、预后相关,如HULC(hepatocellular carcinoma up-regulated long non-coding RNA)、H19、HOTAIR(HOX transcript antisense RNA)和MEG3(maternally expressed 3)等。HULC在肝癌组织中显著高表达,与患者的TNM分期、肝内转移、复发及预后相关,能够通过上调SPHK1(sphingosine kinase 1)的表达促进肿瘤血管生成[6]。H19属于印记基因,在人胚胎阶段高表达,在出生后的多数器官中表达下调,但在肝癌组织中呈高表达,其影响肝癌发生、发展的机制仍未阐明[7]。HOTAIR在肝癌组织中较癌旁组织高表达,能够下调SETD2(SET domain-containing protein 2)促进肝癌干细胞恶性生长[8]。MEG3在肝癌中低表达,可以促进P53的转录活性,改变P53靶基因的表达,抑制肝癌生长[9]。
3 lnc RNA在肝癌中的作用机制
3.1 lnc RNA调节基因转录
基因的转录由转录因子和染色质修饰因子进行调节。lnc RNA可以靶向作用于转录因子、RNA聚合酶等影响基因转录过程,调节基因转录和表达。lnc RNA通过顺式作用或反式作用调节转录激活因子或抑制因子,从而正向或负向调节基因的表达。细胞水平实验证明,lnc RNA URHC(up-regulated in HCC)能够通过顺式方式作用于下游基因ZAK(zipper containing kinase AZK),失活ERK/MAPK通路,促进肝癌细胞增殖、抑制凋亡[10]。Lin C00152在肝癌组织中显著高表达,在转录水平调控Ep CAM(epithelial cell adhesion molecule)的表达,进而活化m TOR信号通路,促进肝癌增殖生长[11]。
3.2 lnc RNA参与表观遗传调节
表观遗传的改变如DNA甲基化、组蛋白修饰和基因印记等是包括肿瘤在内的许多人类疾病的发病因素。近年研究证明,lnc RNA直接结合PRC1(polycomb repressive complex 1)和PRC2、染色质修饰蛋白如Co REST(corepressor of RE1 silencing transcription factor)和JARID1C(jumonji AT-rich interaction domain 1C),引导染色质修饰复合物发挥改变表观遗传的特异性效应。lnc RNA TUG1能够募集并结合PRC2,抑制KLF2(Kruppel-like factor 2)的转录促进肝癌细胞增殖、克隆形成、肿瘤发生和抑制凋亡[12]。lnc RNA HOTAIR(HOX transcript antisense RNA)位于染色体12q13.13HOXC基因座上,能够结合PRC2复合体到HOXD基因座上,通过促进PRC2基因组定位和H3K27甲基化调节基因的表达[13]。lnc RNA SRHC(greatly-reduced in HCC)在肝癌组织中甲基化,显著低表达,且与血清中甲胎蛋白(AFP)水平和组织分化程度相关,能够抑制肝癌细胞增殖和克隆形成[14]。
3.3 lnc RNA稳定蛋白质和蛋白复合体
很多lnc RNA通过与蛋白质和蛋白复合体直接相互作用作为支架、变构激活剂或抑制剂发挥致癌作用,如HOTAIR参与HBXIP(hepatitis B X-interacting protein)/HOTAIR/LSD1的构建[3]。体内外实验证明,高表达lnc RNA PVT1(plasmacytoma variant translocation1)通过稳定NOP2(nucleolar protein 2)能够促进肝癌增殖和细胞周期进展[15]。lnc RNA PCNA-AS1(proliferating cell nuclear antigen-antisense 1)在肝癌组织中高表达,通过与PCNA结合形成RNA杂交稳定PC-NA的表达,抑制肿瘤的生长[16]。
3.4 lnc RNA发挥mi RNA海绵吸附作用
近年来研究发现,lnc RNA可以通过结合mi RNAs作为竞争性内源RNA(ce RNAs)机制发挥海绵吸附作用,干扰mi RNAs对靶基因的影响。许多lnc RNA通过这种方式参与肿瘤的发生、发展过程。lnc RNA-ATB(lnc RNAs-activated by TGF-β),通过竞争性结合mi R-200家族诱导肝癌细胞上皮间质化转换和侵袭[17]。通过细胞水平实验证明,lnc RNA CCAT1(colon cancer associated transcript-1)能够竞争性结合mi R-NA let-7,抑制其靶基因HMGA2(High Mobility Group A2)和c-Myc的表达,促进肝癌细胞增殖和侵袭转移[18]。lnc RNA GAS5(growth arrest-specific transcript 5)能够通过抑制mi R-21,上调mi R-21的靶基因PDCD4(programmed cell death 4)和PTEN(phosphatase and tensin homolog deleted from chromosome1)的表达,进而抑制肝癌细胞侵袭转移[19]。lnc RNA-UCA1(urothelial carcinoma-associated 1)直接结合并抑制mi R-216b的表达,上调FGFR1(fibroblast growth factor receptor 1)表达,抑制ERK信号通路促进肝癌进展[20]。
4 lnc RNA作为肝癌诊断标志物
肿瘤分子预测因子是肝癌早期诊断、个体化治疗的必要因素。通过使用RNA免疫沉淀、测序技术、微阵列芯片和实时定量PCR等技术可以在人体血液中探测到lnc RNAs,证明其可以作为肿瘤诊断的非侵入性标志物。Yang等[21]收集了179例肝癌手术后患者和同样数量健康志愿者的外周血样本,运用荧光定量PCR方法检测各组血浆lnc RNA HEIH(hepatocellular carcinoma up-regulated EZH2-associated long noncoding RNA)表达水平,证实肝癌患者血浆lnc RNA HEIH表达水平显著高于健康对照组,血浆lnc RNA HEIH表达水平与肝癌发病风险显著正相关,说明lnc RNA HEIH可以作为早期诊断肝癌的检测指标。Xie等[22]收集了30例肝癌患者和20例健康人血浆进行PCR检测,证明lnc RNA HULC表达水平比健康人要高,且与患者Edmondson分期和HBV感染风险相关。Konishi等[23]在肝癌手术后患者、肝脏疾病患者和健康人血浆检测发现lnc RNA MALAT1在肝癌患者中高表达,且与患者肝损伤程度、肝癌预后相关。因此在将来,与肝癌相关的lnc RNA分子机制的进一步研究会为以lnc RNA为靶向治疗提供重要依据。
5 lnc RNA判断肝癌预后标志物
研究证实,有部分lnc RNA在肝癌中特异性表达且与肝癌生存期相关,可能成为肝癌判断预后的指标。有研究者通过组织微阵列芯片测序发现,lnc R-NA-UFC1在肝癌组织中高表达,且与门静脉血栓、肿瘤大小、疾病分期和总生存期、无病生存期相关[20]。lnc RNA CCAT1在肝癌组织中高表达,且与患者的肿块大小、微血管侵袭、AFP值和预后相关[18]。HOTAIR高表达的肝癌患者比低表达患者具有更差的预后[13]。lnc RNA AOC4P(amine oxidase,copper containing 4,pseudogene)在肝癌组织中显著低表达,且与吸烟、肝被膜受侵、血管浸润和病理分期、整体生存期相关[24]。lnc RNA GAS5(growth arrest-specific transcript 5)在肝癌组织中低表达,且与肝癌患者的生存期相关[19]。
6 lnc RNA对肝癌治疗的临床应用前景
lnc RNA和肿瘤发生机制之间关系的研究是近些年的热点,然而临床治疗的应用还很遥远。以lnc RNA为靶点的实验性治疗方法在快速发展。lnc RNA能以多种方式作为治疗靶点,如si RNA、小分子抑制剂、天然转录反义物(NATs)及反义寡核苷酸等。lnc RNA可以通过特定的小RNA(si RNA)结合RISC(RNA-induced silencing complex),结合靶基因特定序列能靶向抑制lnc RNA的表达[25]。小分子抑制剂能够阻碍lnc RNA与其靶向蛋白质之间的相互作用,相比RNA干扰、反义寡核苷酸等治疗方法,小分子抑制剂容易摄取和管理,为研究者以lnc RNA为靶点治疗肿瘤带来很好的方向[26]。NATs(natural antisense transcripts)是一种lnc RNA,抑制NATs可以增加正义m RNA转录水平,NATs拮抗剂已被应用来上调特定正义m R-NA的表达[27]。反义寡核苷酸(antisense oligonucleotide,ASO)治疗是使用合成的寡核苷酸沉默基因的表达,在细胞核中能够结合内源性RNA靶标,引导核糖核酸酶到达细胞核降解目标lnc RNA[28]。这些实验性治疗方法为lnc RNA在临床的早日应用带来希望。
7 小结
随着新一代测序和高通量基因芯片技术的应用,许多报道说明,lnc RNA可以影响肝癌的发生、进展和治疗。如上述,lnc RNA在肝癌发生、发展中起重要调节作用,它们的紊乱表达与肿瘤发生的各种生物过程相关。虽然HULC、HOTAIR、H19和MEG3等lnc RNA已被证实与肝癌相关,但详细的机制仍不清楚,人们普遍认为lnc RNA可以为肝癌诊断治疗带来新办法。随着基因组学、蛋白组学、生物信息学的发展,越来越多的lnc RNA被证实与肝癌早期诊断、更好的预后评估和有效治疗靶点相关,有望应用于临床。
长链非编码RNA 篇2
1 资料与方法
1.1 研究对象
SLE患者40例,分类依据美国风湿病分类标准[9]。通过SLE疾病活动指数2000的评分,评定疾病的活动度[10]。其中,20例为非活动期[≤10.0分,(4.24±2.67)分]为S1组,20例处于活动期[≥10.0分,(20.36±4.61)分]为S2组。年龄范围为19~49岁(平均29.1岁)。健康对照组(NC)20例,年龄和性别与疾病组相配。
1.2 RNA提取
抽取受检人群的外周抗凝血5 m L,使用淋巴细胞分离液分离PBMC,加入Trizol裂解,按试剂盒的说明书提取总RNA,采用紫外吸收测定法测定A值,凝胶电泳检查确定样品总RNA量和质量。合成ds-cDNA。
1.3 双链cDNA合成及基因芯片杂交
标记所提取总合成的ds-cDNA,浓缩标记样品,采用Human lncRNA Microarray Service进行lnc RNA芯片杂交。所用芯片为Arraystar公司lnc RNA芯片,该芯片覆盖所有来自Refseq(2009)、UCSC Known Gene(2009)、NRED(2009)、RNAdb(2006)、Fantom3等多个权威数据库注释为lncRNA的转录本,并在此基础上收录相关文献报道中的lncRNA,是目前覆盖最为全面的lncRNA芯片。
1.4 图像扫描和数据分析
使用Genepix 4000B芯片扫描仪扫描芯片的荧光强度,使用635 nm激发,图像存成TIF文件;通过分位数标准化以及Nimble Scan软件将表达数据进行规范,然后采用Genepix Pro 6.0软件读取原始数据。
数据原始值通过减去扫描仪得到的背景值做修正,再用中值标准化修正值,即标准值。把扫描获得的格式化微阵列文本数据上传到Agilent Gene Spring软件(Version 11.0)中进一步进行分析,设置归一化基准、数据滤过的比值倍数等,获取差异表达基因,实验结果用EXCEL数据表示出来。根据fold-change>2判定差异表达基因。
1.5 荧光定量RT-PCR验证
挑选出6个lnc RNA,由上海康成生物技术有限公司设计并合成上下游引物。基因名称和上、下游引物序列以及退火温度和产物长度见表1。SYBR Green荧光实时定量RT-PCR反应在ABIPRISM 7000序列检测仪上进行。各样品的目的基因和管家基因分别进行Real-time PCR反应。根据绘制的梯度稀释DNA标准曲线,各样品目的基因和管家基因的浓度结果直接由机器生成。每个样品的目的基因浓度除以其管家基因的浓度,即为该样品受检基因校正后的相对含量。
2 结果
2.1 样本RNA抽提结果
RNA的质量判断标准是有清晰的28S与18S条带,无降解,且肉眼观察28S条带亮度是18S的1~2倍。看到清晰的28S和18S核糖体RNA条带非常浓而亮,且密度28S大约是18S条带的2倍。见附图。
紫外吸收测定法检测双链cDNA结果,OD260/OD280比值介于1.8~2.1,OD260/OD230值均大于1.8,表明质量良好,可用于芯片实验。见表2。
2.2 芯片检测结果
2.2.1 SLE-1与对照组芯片结果
利用芯片比较分析SLE-1组与对照组的lncRNA表达谱,共检测出3 677个差异表达lncRNA(fold-change>2),占总lnc RNA 18.1%(3 677/20 293)。其中941个lnc RNA差异表达上调,占4.6%;2 736个lnc RNA差异表达下调,占13.5%。见表3。
1:对照组;2:SLE-1;3:SLE-2
2.2.2 SLE-2组与对照组芯片结果
利用芯片比较分析SLE-2组与对照组的lncRNA表达谱,共检测出4 296个差异表达lncNA(fold-change>2),占总lncRNA 21.2%(4 296/20 293)。其中1 075个lnc NA差异表达上调,占5.3%;3 221个lnc RNA差异表达下调,占15.9%。见表4。
2.2.3 SLE-1与SLE-2芯片结果
利用芯片比较分析SLE-2组与SLE-1组的lnc RNA表达谱,共检测出1 398个差异表达lnc RNA(fold-change>2),占总lnc RNA 6.89%(1 398/20 293)。其中641个lnc R NA差异表达上调,占3.16%;757个lnc RNA差异表达下调,占3.73%。见表5~7。
3 讨论
非编码RNA广泛参与疾病的发病过程,如microRNA已经证实参与狼疮的发病并与疾病的严重程度相关[11]。在表达谱芯片检测实验结果中,笔者发现了许多lncRNA在系统性红斑狼疮活动组和稳定组中均出现了差异表达。这些lnc RNA与代谢、免疫作用、信号转导、神经生物学等过程有关,在此只讨论一些笔者感兴趣的lncRNA及其有关的生物学过程。结合从UCSC数据库、Refseq数据库、KEGG数据库查询相关差异表达lncRNA基因注释信息,挑选出可能与SLE发生及其疾病活动性相关的lncRNA,为进一步研究提供了思路。
SLE相关基因与染色体的脆性位点有关,因此笔者从这些热点区域结合芯片数据挑选出32个可能与SLE疾病发生相关的lncRNA,其中26个表达上调,5个表达下调。其中uc001wco、uc001wft、uc001wgf、uc001wer位于14q11.2,基因座为T细胞受体,是所有T细胞的特征性表面标志。使用小分子物质增强T细胞受体信号通路的分子能显著缓解狼疮小鼠的病情[12,13]。LncRNA CD688298、DA676375、uc010jsn、uc010gdp、NR_024240、uc003obo分别位于16p13.13、6p21.33、20p11.1、6p21、6p21.32SLE易感位点[14],有可能作为SLE特殊标志物之一。LncRNA BC050642内含于编码ENO1基因之中,ENO1可作为一种多功能蛋白质与许多疾病如自身免疫性疾病及肿瘤的发生、发展有重要关系,其与疾病相关作用主要来自它的致免疫活性、DNA结合能力和纤维蛋白溶解受体等功能[15]。
挑选出30个可能与SLE疾病活动性相关的lncRNA,其中11个表达上调,19个表达下调。uc009wim内含于NOTCH2NL基因,NOCTCH信号转导通路与蛋白尿、肾小球硬化症、肾脏功能有关[16,17]。uc004arr与自身免疫性疾病有关,小鼠中该基因的同源基因变异会导致自身免疫性疾病,类似于人类的系统性红斑狼疮。这些lnc RNA有可能与SLE疾病活动性密切相关,进一步分析有利于更深入了解SLE发生发展的病理机制。
Arraystar lncRNA芯片设计探针为60mer的长寡核苷酸,该长寡核苷酸探针在高严谨杂交条件下,可得到高灵敏度及高特异性的实验结果。lncRNA芯片还覆盖最新的Refseq数据库中所有mRNA(protein coding)的转录本。在一次杂交实验中,可以同时检测m RNA和lncRNA的表达水平,并根据相关的mRNA表达水平变化将鉴定出的lncRNA和已知的信号通路联系起来。鉴于笔者所采用的全基因组表达谱芯片技术,能够在全基因组的水平上筛选SLE差异表达基因,结果也表明笔者确实得到了许多差异表达基因,有些还可能是参与疾病发生、发展的重要基因,说明该方法的高通量筛选效率是其他方法难以比拟的。
本实验采用全基因组表达谱芯片技术筛选SLE差异lncRNA表达,在全基因组的水平上纵览了SLE相关lncRNA表达的情况,得到一批相关lncRNA。在SLE外周血单个核细胞中,有些lncRNA表达明显上调,有些lncRNA表达明显下调,提示这些表达变化的lncRNA参与了SLE疾病发生及发展的分子调节过程。今后可再进一步从这些SLE相关的lncRNA中挑选出部分lncRNA作为后续实验的候选基因。至于这些lncRNA在SLE的发病及进程中的作用和机制还有待于进一步探索,同时也说明芯片技术用于筛选疾病相关基因是行之有效的。
摘要：目的 利用长链非编码RNA表达谱芯片技术筛选系统性红斑狼疮(SLE)患者的差异表达长链非编码RNA并对其进行分析,以进一步阐明系统性红斑狼疮发病的分子机制。方法 分采用利用长链非编码RNA表达谱芯片检测技术,筛查系统性红斑狼疮及健康对照组单个核细胞中的差异表达长链非编码RNA,并通过Rreal-time PCR对部分差异表达基因进行验证。结果 uc003ngn、uc010loq、uc003wbg、uc003wax、HM-lincRNA1145、uc010jsn、uc003wax、HMlincRNA1145等lncRNA在SLE患者外周血单个核细胞中显著上调,AK022005、uc010cik、uc010gdp、uc010nwn、uc010imt、HMlincRNA678等lncRNA在SLE患者外周血单个核细胞中显著下调。结论 多个长链非编码RNA在SLE患者外周血单个核细胞中异常表达,提示它们可能在SLE的发生发展中起着重要的调控作用。
长链非编码RNA 篇3
1 材料与方法
1.1 组织、细胞和主要试剂
肝癌及其癌旁组织标本来自武汉大学人民医院手术肝癌患者。人肝癌细胞和正常肝细胞由武汉大学人民医院中心实验室保存。SUMO1P3引物为5′-GAACTGGGAATGGAGGAAGA-3′和5′-TGAGAAAG-GATTGAGGGAAA-3′,购自武汉巴菲尔生物公司。SUMO1P3小干扰RNA(si RNA)购自广州市锐博生物公司,序列:5′-TGGCCCTGATGTTCTAGCATGT-GAT-3′。
1.2 细胞培养、转染及分组
Hep G2细胞加入5 m L RPMI 1640培养液,放于5%CO2、37℃恒温细胞培养箱中进行培养。选取生长状态良好的细胞,以5×105个/孔的密度接种于6孔板,待细胞生长到60%~80%融合时使用无血清培养液进行转染。转染后6 h换成含10%胎牛血清的培养液继续培养。分为si-NC组和si-SUMO1P3组。
1.3 CCK8法绘制细胞生长曲线
将各组Hep G2细胞分别以4×103个/孔接种于96孔板,转染后0、24、48、72、96 h每组取6孔,加入CCK8 10μL/100μL,37℃培养2 h后用全波段酶标仪检测波长450 nm处的吸光度(A)值。
1.4 流式细胞仪检测细胞凋亡
在转染后48 h的Hep G2中加入500μL缓冲液,5μL Annexin V-FITC和10μL的PI混匀,使用流式细胞仪测定细胞凋亡率。
1.5 划痕实验
用10μL白色枪头在转染后的6孔板细胞底面进行划痕,加入无血清1640培养基继续培养,在0 h和24 h照相,测各组划痕宽度,取平均值计算迁移抑制率。
1.6 Transwell侵袭实验
Transwell上室铺用Matrigel基质胶600μL,将200μL转染后的细胞悬液(5×104/L)加入上室,下室加600μL低血清的培养液培养24 h。结晶紫染色30 min后在显微镜下拍照,最终以穿膜细胞的数目代表Hep G2细胞的侵袭能力。
1.7 统计学方法
采用SPSS 20.0统计学软件进行数据分析,计量资料数据用均数±标准差(±s)表示,两组间比较采用t检验;以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 Lnc RNASUMO1P3在肝癌组织和肝癌细胞株中表达情况
采用RT-PCR技术检测40例肝癌与癌旁标本SUMO1P3表达水平,发现40对标本中有29对(72.5%,29/40)标本中肝癌比癌旁组织SUMO1P3高表达,肝癌和癌旁组织SUMO1P3表达差异有统计学意义(P<0.05)(图1)。培养人肝癌细胞系和正常肝细胞,使用RT-PCR技术检测SUMO1P3表达水平,发现其在肝癌细胞系中显著高表达(图2),其中在Hep G2细胞中表达最高,故后续实验选择使用Hep G2细胞。
BEL7402、Hep G2、Huh7、SMMC7721与LO2比较,P值分别为0.0092、0.002、0.0047、0.0013,*P<0.05;Hep3B与LO2比较,P值为0.3306
2.2 si RNA对肝癌细胞内SUMO1P3表达的影响
在肝癌细胞株Hep G2中进行si RNA转染,siSUMO1P3组细胞内SUMO1P3表达降低,为si-NC组的(24.33±3.15)%,两组差异有统计学意义(t=25.01,P<0.05),见图3。表明转染SUMO1P3 si RNA可下调Hep G2细胞内SUMO1P3的表达。
与Si-Nc比较*P<0.05
2.3 下调SUMO1P3对细胞增殖的影响
转染si RNA SUMO1P3后,Hep G2细胞的生长明显受到抑制,见图4。转染24、48、72、96 h后,si-NC组吸光度值分别为(0.5117±0.0035)、(1.0336±0.0097)、(1.3263±0.0081)、(1.6853±0.0073);si-SUMO1P3组吸光度值分别为(0.4533±0.0041)、(0.8446±0.0065)、(1.0512±0.0096)、(1.2363±0.0102);两组吸光度值比较差异均有统计学意义(P<0.05)。
2.4 下调SUMO1P3对细胞凋亡的影响
转染48 h后,流式细胞术测得si-NC组细胞凋亡率为(13.59±1.36)%,si-SUMO1P3组细胞凋亡率为(38.28±3.41)%,两组比较差异有统计学意义(P<0.05),见图5。
2.5 下调SUMO1P3对细胞迁移的影响
转染48 h,si-NC组细胞划痕迁移率为(13.69±0.15)%,si-SUMO1P3组细胞划痕迁移率为(36.92±0.43)%,两组比较差异有统计学意义(P<0.05),见图6。
A:线图;B:柱状图;与si-NC组比较,*P<0.05
A:细胞凋亡流式图;B:细胞凋亡柱状图;与si-NC组比较,*P<0.05
A为si-NC组0 h;B为si-NC组24 h;C为si-SUMO1P3组0 h;D为si-SUMO1P3组24 h;与si-NC组比较,*P<0.05
2.6 下调SUMO1P3对细胞侵袭的影响
转染48 h后,si-NC组细胞穿膜个数为(119.00±8.53)个,si-SUMO1P3组细胞穿膜个数为(54.00±7.12)个,两组比较差异有统计学意义(P<0.05),见图7。
与si-NC组相比较,*P<0.05
3 讨论
原发性肝癌是人类常见的恶性肿瘤,其目前的治疗手段有手术切除、放化疗、靶向治疗及生物治疗等[7],但由于肝癌发现时大多已属于晚期,治疗效果不理想,总体5年生存率较低[8]。Lnc RNA是长度大于200个核苷酸的非编码RNA,是RNA聚合酶Ⅱ转录的副产物,起初被认为是基因组转录的“噪音”,不具有生物学功能[9]。然而,大量研究表明,lnc RNA参与了X染色体沉默、基因组印记以及染色质修饰[10]、转录激活、转录干扰等多种重要的调控过程[11]。已有一些lnc RNA被证明可作为肝癌的标志物或预后因子[12],如肝癌高表达基因(HULC)[13]、同源异形盒基因(HOX)转录反义RNA(HOTAIR)[14]、肺腺癌转移相关转录子1(MALATl)[15]、母系表达基因3(MEG3)[16]、H19等[17]。Lnc RNA种类繁多,作用方式多样化,近期研究发现Linc RNA UFC1能够通过结合稳定Hu R m RNA从而活化β-Catenin,抑制肝癌细胞增殖[18]。Lnc RNA-ATB在被TGF-β活化后可以促进EMT发生,进而促进肝癌细胞侵袭转移[19]。而Lnc RNA-HO-TAIR通过下调SETD2能够促进肝癌肿瘤干细胞增殖,导致化疗耐药的发生[20]。即使如此,当前关于Lnc RNA在原发性肝癌中的认知仍然非常有限。
SUMO1P3是小泛素样修饰蛋白1假基因3(small ubiquitin-like modifier 1 pseudogene 3)。已被证实SUMO1P3在胃癌组织中较对应的癌旁组织显著高表达,其表达水平与肿瘤大小、组织分化、淋巴结转移和侵袭等临床病理特征相关,表明SUMO1P3有可能是胃癌诊断的标志物之一[5]。Zhan等[6]研究证实,SUMO1P3在膀胱癌组织显著高表达,表达水平与组织分级和TNM分期相关,在膀胱癌细胞中下调SUMO1P3能够抑制癌细胞增殖和侵袭,促进癌细胞凋亡。目前尚无关于SUMO1P3在肝癌中的研究。本研究利用RNA干扰技术干扰肝癌Hep G2细胞中SUMO1P3的表达,可见下调SUMO1P3能显著抑制Hep G2细胞的增殖和侵袭转移,并促进细胞凋亡,提示内源性SUMO1P3在肝癌细胞恶性生物学行为中起着关键作用,SUMO1P3可能成为肝癌诊断和预后的监测指标及治疗靶点。
长链非编码RNA 篇4
关键词：非小细胞肺癌,长链非编码RNA,XIST,HIF1A-AS1,肿瘤标志物
肺癌是病死率最高的人类肿瘤之一, 美国2012年新增病例为226 000例。肺癌患者中有超过85%患者属于非小细胞肺癌 (non-small-cell lung cancer, NSCLC) , 其5年生存率不到10%[1,2,3]。尽管最近几年NSCLC患者的临床治疗手段取得重大突破, 但该疾病的总生存率未得到明显改善。导致该现象的主要原因为缺乏有效的分子标志物, 最近报道较多的生物标志物, 例如micro-RNAs[4]和环加氧酶[5]均属于经典的肿瘤标志物, 通常用于检测NSCLC患者疾病发展。但由于缺乏较高的诊断灵敏性和特异性而不能用于NSCLC疾病的早期诊断, 因此临床上急需寻找高灵敏性和特异性的生物标志物用于NSCLC患者的早期诊断。本研究通过检测XIST和HIF1A-AS1在NSCLC组织和血清中的表达, 评估其作为NSCLC患者疾病早期诊断标志物的潜在价值, 现报道如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料
32例NSCLC肿瘤组织和癌旁组织样本均采集自2012年3月至2014年9月我院呼吸科收治的NSCLC患者, 所有患者入组前未接受任何治疗且均为原发性病例。血液样本均为空腹静脉采用, 组织样本均在术中采集并立即置于液氮中。本研究通过我院伦理委员会审批, 患者及家属知情同意并签署知情同意书。
1.2 NSCLC肿瘤组织中lnc RNA表达谱检测
采用上海生物芯片有限公司提供的生物芯片, 根据操作说明进行NSCLC肿瘤组织中lnc RNA表达谱检测。
1.3 定量PCR检测
采用Trizol溶液 (Invitrogen, CA, 美国) 和Prime Script RT-polymerase试剂盒 (宝生物, 大连, 中国) 提取组织和血清样本总RNA并进行逆转录, 将逆转录产物作为底物进行定量PCR检测, 采用ABI 9700型定量PCR仪进行扩增, 内参基因选择GAPDH, 采用2-ΔΔCt方法进行计算, 进行相对定量, 反应体系和条件参考文献[1,2]。引物序列见表1。
1.4 统计学方法
本研究所有数据均采用SPSS20.0软件处理, 计量资料采用独立双尾t检验, 分类资料采用双尾χ2检验, 采用KaplanMeier方法计算总生存率, 单一变量分析则采用秩和检验。多重变量分析则采用Cox比例风险模型, 均以P<0.05为差异显著。
2 结果
2.1 NSCLC肿瘤组织中lnc RNA表达谱检测
为寻找参与NSCLC发展的潜在lnc RNAs, 本研究首先采用lnc RNA表达谱和层序聚类分析对3例NSCLC组织和相应的非肿瘤组织进行分析, 结果发现超过30种lnc RNAs在NSCLC肿瘤组织中表达异常, 芯片分析结果表明共有19种lnc RNAs在NSCLC组织中过表达, 12种lnc RNAs为显著低表达, 本研究最终将研究目标锁定在XIST和HIF1A-AS1上 (图1) 。
2.2 NSCLC组织和血清中XIST和HIF1A-AS1表达检测
采用定量PCR方法检测32对NSCLC肿瘤组织和癌旁样本XIST和HIF1A-AS1表达情况, 结果表明肿瘤组织中XIST和HIF1A-AS1表达量显著高于癌旁样本 (P<0.05, 图2A和2B) , 为检测NSCLC相关的lnc RNAs是否能够在外周循环系统中检测到, 本研究采用定量PCR方法检测64份血清样本 (NSCLC患者32例, 正常对照样本32例) 。如图2C和2D所示, NSCLC患者血清中XIST (P<0.05) 和HIF1A-AS1 (P<0.05) 表达显著高于正常对照组。二者表达与患者临床病理学特征关系见表2。
A:NSCLC组织中XIST相对表达量;B:NSCLC组织中HIF1A-AS1相对表达量;C:NSCLC血清中XIST相对表达量;D:NSCLC血清中XIST相对表达量。
2.3 NSCLC患者组织和血清中lnc RNAs表达相关性分析
为检测NSCLC患者肿瘤组织和血清中lnc RNAs表达水平是否存在相关性, 本研究检测同一患者的组织和血清样本。如图3A和3B所示, 组织和血清中XIST (r=0.826, P<0.001, 图3A) 和HIF1A-AS1 (r=0.806, P<0.001, 图3B) 呈正相关关系。结果提示血清lnc RNAs检测可以作为NSCLC患者疾病预后的标志物。
A:XIST线性分析;B:HIF1A-AS1线性分析。
2.4 NSCLC患者术前血清XIST和HIF1A-AS1表达水平与术后比较分析
由于循环系统中lnc RNAs主要来源于肿瘤细胞, 实施肿瘤切除治疗可使其表达水平可以逆转。本研究检测了术前和术后14 d NSCLC患者血清XIST和HIF1A-AS1表达水平, 结果表明术后血清XIST和HIF1A-AS1表达水平较术前显著下降 (图4A和4B) 。
2.5 NSCLC患者血清XIST和HIF1A-AS1表达作为肿瘤标志物的可行性分析
为进一步探讨NSCLC患者血清XIST和HIF1A-AS1表达作为肿瘤标志物的可行性, 对纳入研究的NSCLC患者进行ROC和AUC分析, 包括32例NSCLC患者和30例正常对照。ROC曲线证实NSCLC患者于对照组存在较大差异, XIST的AUC值为0.834 (95%CI:0.726~0.935;P<0.001, 图5A) , HIF1A-AS1的AUC值为0.876 (95%CI:0.793~0.965;P<0.001, 图5B) 。更为重要的是, 统计结果表明联合检查XIST和HIF1A-AS1能显著提高NSCLC的筛查效率, 其AUC值为0.931 (95%CI:0.869~0.990;P<0.001) , 显著高于两项指标单独检测的结果 (图5C) 。
A:术前术后XIST表达分析;B:术前术后HIF1A-AS1表达分析。
A:单独检测XIST;B:单独检测HIF1A-AS1;C:联合检查XIST和HIF1A-AS1。
3 讨论
长非编码RNAs (Long non-coding RNAs, lnc RNAs) 是一种长度大于200 bp且缺乏蛋白编码能力的RNA, 在调节肿瘤抑制途径和原癌基因在肿瘤的发生、发展以及转移中发挥十分重要的作用[6]。根据文献报道, HIF1A-AS1在多种肾脏肿瘤中表达, 表明其参与肿瘤的发生[7]。此外, HIF1A-AS1在腹主动脉瘤中表达上调, 其HIF1A-AS1与细胞凋亡蛋白之间的相互作用在VSMCs细胞体外增殖和凋亡中发挥重要作用[8]。而HIF1A-AS1在NSCLC中的研究报道较少。
X染色体失活特异转录因子lnc RNA (X-inactive specific transcript, XIST) 是XIST基因编码产物, 主要调节哺乳细胞X染色体失活, 其XIST基因仅由失活的X染色体编码[9]。研究证实XIST在某些肿瘤中高表达, 例如胶质母细胞瘤[10]、乳腺癌[11]和子宫癌[12], 表明XIST可以作为生物标志物用于肿瘤性疾病的诊断[13]。XIST基因敲除后能够通过抑制细胞增殖、迁移和侵入进而抑制肿瘤生长。体内研究也证实, 敲除XIST基因可以抑制肿瘤生长进而提高裸鼠的生存率[10]。上述研究结果提示XIST在恶性肿瘤的发生和发展中发挥重要作用, 然而关于其在NSCLC中的研究鲜见报道。
研究证实, 在肿瘤患者的血清和血浆中可以检测到胞外核苷酸, 例如DNA和mirco-RNA, 因此长非编码RNAs可以作为肿瘤的诊断的工具[14,15]。本研究检测了NSCLC患者组织和血清中XIST和HIF1A-AS1表达水平, 结果表明与对照组相比, XIST和HIF1A-AS1在肿瘤组织或血清中表达均显著上调。本研究进一步采用ROC曲线分析血清XIST和HIF1A-AS1检测用于NSCLC临床诊断的价值, 结果证实XIST和HIF1A-AS1用于NSCLC诊断的AUC分别为0.834和0.876。另外, 联合检查两种标志物能显著提高NSCLC疾病筛查的效率, 其AUC高达0.931, 显著高于单独检测XIST或HIF1A-AS1。
长链非编码RNA 篇5
1 Inc RNAs作用机制
在很多生物学过程中, lnc RNAs都发挥着极其重要的作用, 其作用机制主要和调控基因表达水平相关, 目前通过分析研究lnc RNAs功能, 可以把其作用机制分为转录后调控以及转录调控两种类型, 具体的作用机制如下。
1.1染色质结构改变
lnc RNAs是人类基因组转录的一种重要调控因子, 经过直接调节转录因子活性, 转变染色质结构参与到调控基因转录中, 然而两者并没有非常明显的界限。Inc RNAs最突出的一种功能是参与到表现调控中, 可以和染色质修饰复合物等表观调控因子相互作用, 而且将其引导到某个特定染色质区域中, 然后经过乙酰化、组蛋白甲基化或者DNA甲基化等修饰使染色质状态发生改变, 进而对转录因子以及RNA聚合酶II等和DNA接近能力造成影响, 这样容易使靶基因转录沉默或者活化。有的lnc RNAs可以广泛募集蛋白复合物恢复到最开始的生成位置, 这样有利于调控其基因转录, 这种作用机制也被称作顺式作用。有的lnc RNAs可以把复合物转移到基因组的其他位置来调控基因转录过程, 这种作用机制也被称作反式作用。目前最早被发现并研究的一个lnc RNAs是lnc RNA HOTAIR, 其转录主要来自HOXC位点, 主要是通过和LSD1、PRC2复合物相互作用, 并且将复合物引导到HOXC以及其他的基因组位点, 并且分别介导组蛋白H3K4脱甲基化以及组蛋白H3K27三甲基化, 两者可以对沉默基因进行共同作用[2]。其次, linc RNA-p21也可以利用反式作用对基因转录进行调控, P53被DNA损伤后对于linc RNA-p21表达具有诱导作用, 而且可以和hn RNP-K复合物发生相互作用, 将复合物引导到靶基因中进而调节100多个基因表达, 这样会加快凋亡速度。
1.2直接调节转录因子活性
很多lnc RNAs可以通过对转录因子复合物聚集以及活性进行调节来参加转录后调控过程, 糖皮质激素可以和其GR受体结合, 也可以激活GR受体, 进而使活化GR可以成为一种转录因子对GREs元件 (处于靶基因启动子区) 进行作用, 而lnc RNA Gas5也可以借助特定序列直接结合活化GR的DNA结合区域, 抑制活化GR对GREs发生作用, 进而对靶基因转录过程造成影响[3]。PANDA对于DNA损伤具有较高的敏感度, P53在DNA损伤后会诱导PANDA表达, 直接结合转录因子NF-YA, 抑制其对靶基因FAS基因的作用, 进而对凋亡基因表达起到很好的抑制作用。
1.3调节m RNA形成
核旁斑是一种独立的核糖核蛋白小体, 主要存在于细胞核中, 目前相关学者并没有完全阐释其功能, 但是目前已经证实这种结构在m RNA剪切、储留以及加工中都具有极其重要的作用。lnc RNA MALAT-1可以和SR核磷蛋白家族发生相互作用, 同时也可以调节其磷酸化状态以及浓度, 其中SR家族对于多种m RNA前体选择性剪切模式都有很大影响, 因此, 在剪切调控过程中, MALAT1具有极其重要的作用。在核旁斑形成以及维护核旁斑结构完整性等过程中, lnc RNAs也发挥着极其重要的功能。因此, lnc RNAs可以参与到剪切、加工以及运输m RNA等过程中进行转录后调控。
2 lnc RNAs在肿瘤中的重要作用
2.1和癌变有关
目前临床上首次发现Inc RNA和肿瘤相关的因子是lnc RNAAHOTAIR, 其对于肿瘤发生、发展、转移以及预后等各方面都具有极其重要的作用, 其表达水平也可以当作预测癌细胞转移以及死亡的重要指标。有学者对乳腺癌患者进行调查分析, 发现患者体内HOTAIR表达较高, 而且肿瘤转移以及患者预后较差也和相关被容具有密切相关。同时, 黑色素瘤中的BRAF癌基因突变的话, 会产生活跃突变体蛋白产生。这种蛋白会对很多未知lnc RNAs表达、已经lnc RNAs以及蛋白编码转录本等进行调节, 一旦机体内BRAF (V600E) 内表达升高, 敲碎BANCR后会大大降低黑色素瘤细胞转移能力。其次, PCAT-1、VNRIL、nc RAN、MALAT—I等对于细胞凋亡也具有追击。
2.2对癌变的抑制作用
Inc RNA PTCSC3在甲状腺组织中有特异表达, 但是乳头状甲状腺癌患者机体内表达较少。通过对乳头状甲状腺癌进行全基因研究分析表明, rs944289以及rs965513两个相互独立的单核苷酸多态性 (SNPs) , 两者突变后会导致C/EBPα、C/EBPβ无法结合、活化PTCSC3表达, 进而降低PTCSC3表达水平。同时PTCSC3也会对DNA复制、DNA修复、DNA重组、细胞运动等基因表达会造成很大影响, 如果恢复PTCSC3表达会对于乳头状甲状腺细胞癌细胞生长造成显著抑制作用, 进而抑制肿瘤发展。
3结语
临床相关学者发现Lnc RNAs后, 导致基因表达调控及其作用机制日益复杂, 很多学者研究出肿瘤发病和Lnc RNAs异常表达相关。当前lnc RNAs主要利用其和染色质重塑蛋白之间的相互作用来调控其基因表达, 染色质重塑蛋白在恶性肿瘤发生以及发展过程中也具有极其重要的作用。未来如果想要更好的防治新恶性肿瘤的发生, 进一步研究新的基因表达调控模式以及内容, 一定要对lnc RNAs和染色质重塑蛋白之间的相互作用进行进一步深入研究。
摘要：长链非编码RNAs (lncRNAs) 是一种转录产物, 其碱基长度超过200nt, 其可直接调节转录因子活性或者转变染色质结构参与到转录调控中, 也可以通过对mRNA形成过程及其翻译进行调节参与到转录后调控中。根据大多数学者研究表明, 肿瘤发生以及发展和lncRNAs表达水平异常紧密相关, 有的可能对于癌变的发展会有促进作用, 肿瘤患者体内表达较高;有的会对癌变具有抑制作用, 肿瘤患者体内表达相对较低。该文主要介绍了IncRNAs作用机制, 同时分析了其在肿瘤中的作用。
关键词：长链非编码RNAs,作用机制,肿瘤,作用分析
参考文献
[1]张争, 郝瀚, 张崔建, 等.新基因UCA1用于膀胱癌诊断的临床应用价值[J].中华医学杂志, 2012, 92 (6) :384-387.
[2]潘延凤, 冯磊, 魏凌雁.长链非编码RNA在肝癌中表达谱的变化[J].中华实验外科学杂志, 2011, 28 (3) :406-407.