酶活性的研究性学习

酶活性的研究性学习（精选8篇）

酶活性的研究性学习 篇1

专业英语作业学号：1110516045姓名：肖卓丽

点突变研究酶活性的文章阅读有感

羧肽酶A的Try248曾被认为是酶催化活性的提供质子的位点。在此之前，科学家已经研究过嗜热菌蛋白酶酸碱催化的反应机制。

这篇文章利用酪氨酸和苯丙氨酸只有一个酚羟基的差异，利用点突变的方式，改变羧肽酶248位的氨基酸。

对其cDNA进行诱变使得TAT→TTT，从而氨基酸的密码子发生变化，在翻译过程中Try248→Phe248。

实验又将野生型和突变型cDNA转到带有α-因子的酵母载体中，进行蛋白质的表达。

在1986年的时候，点突变技术刚刚形成不久，对于点突变研究酶活性也是一个刚刚开始的技术方式。本文在NATURE上发表时，正是对酶的性质研究的一个新方向的开始。

点突变后，单个氨基酸的改变如何影响酶活性的，或者单个氨基酸如何在酶催化反应的作用，本研究的作者通过四个方面的实验，不同方向上佐证羧肽酶A的248位酪氨酸并不是酸碱催化位点而是一个酶的催化结合位点。

-5第一个实验为：测量野生型和突变型的CPA对四种不同底物酶催化的Kcat、Km、10Kcat/Km

得到的结果为突变的酶影响了反应的亲和力。

第二个实验为：利用抑制剂PCI对野生型和突变型酶分解肽类底物的Ki值。

得到的结果说明抑制剂结合了酶的结合位点，同时野生型和突变型的酶活性都收到了相同的影响。这个结果反映了，Try248只是酶催化反应的结合位点。

第三个实验为：X-衍射实验，说明了248位酪氨酸在酶催化反应中没有像酸碱催化一样提供质子，而是这个位点提供了底物与催化剂结合的结合位点。

第四个实验为：TNM的硝化实验。TNM硝化了野生型的248位酪氨酸。使得其提供氢键的位点发生了变化，所以相对于突变型，其酶活性变化较大。这个实验再次验证了248位酪氨酸为酶和底物的结合位点，而不是催化位点。

通过这篇文章的阅读，在生物的蛋白质酶活性的研究中，需要从多个方向多个角度和层次去分析来验证酶活性改变的原因。通过点突变的方式与野生型的酶进行对比。这个方式开创了新的酶功能方面的研究方法。但是我认为研究的还有可以增加的地方。单一的氨基酸也许会改变酶的位点的结合。如果酶有多个结合位点，那实验是否可以通过酶的多个位点突变进行叠加其突变影响的效果研究位点之间的相互作用和酶催化作用时氨基酸的作用。

酶活性的研究性学习 篇2

土壤酶是土壤新陈代谢的重要因素[1],土壤中所进行的生物和化学过程在酶的催化下才能完成。土壤污染条件下酶活性变化很大,土壤酶活性的改变将影响土壤养分的释放,从而影响作物的生长,所以土壤酶活性常作为土壤质量演变的生物活性指标。近年来,随着农药对土壤污染的日益严重,越来越多的研究者将土壤酶作为指示剂,检测农药对土壤环境的影响,并根据土壤酶活性的变化来判断污染物对土壤的毒害程度,这也是从土壤生物化学角度探索环境保护的一个新内容。

1 土壤酶活性的影响因素

1.1 土壤微生物

早在20世纪60年代就有人研究酶活性与土壤微生物活性之间的相互关系,如Lenhard发现微生物活性与土壤脱氢酶活性密切相关[2]。郭继勋证实了脲酶、磷酸酶和纤维素酶的活性与微生物量有较密切的关系,3种酶的活性随着生物量的增强而不断增强,二者变化基本同步[3]。Naseby通过向根际接种遗传改性微生物, 发现遗传改性微生物生成的酶, 对土壤的碳、磷转化具有重要作用[4]。沈宏等发现玉米生长的中、前期, 土壤微生物中碳、氮与土壤过氧化氢、蔗糖酶、脲酶、蛋白酶活性及速效养分的相关性均达到显著或极显著水平[5]。

1.2 土壤理化性质

土壤水分、空气、温度与机械组成,一方面与微生物的活性和类型有显著的相关性,另一方面也会直接影响土壤酶活性的存在状态与强弱。一般来说,土壤湿度大,土壤酶活性高;但土壤过湿可能会造成土壤缺氧,从而影响微生物的生长[1]。温度直接影响释放酶类的微生物种群及数量,冯贵颖研究发现[6],在20~60℃时,各土壤粘粒的脲酶吸附量随温度升高而降低。土壤中二氧化碳、氧气含量与土壤微生物的活性相关,因此对土壤酶活性有直接影响。土壤的机械组成及结构状况也能影响土壤酶活性[7]。同一类土壤的黏质土壤比轻质土壤具有较高酶活性,其原因是酶主要分布在腐殖质含量较高和微生物数量较多的细小颗粒中。因此,向矿质土中加入黏质土,能较大地增强蛋白酶、脲酶和蔗糖酶的活性。

土壤化学性质可从多方面影响土壤酶活性。首先,能在很大程度上直接影响酶的主要生成者—微生物;其次,土壤中的某些化学物质可通过激活或抑制作用来调节胞外酶的功能。另外,土壤一系列化学性质,如土壤pH值、交换性阳离子的组成与比例、盐基饱和度、腐殖质的特性以及有机—矿物质复合体的组成等,在很大程度上决定酶在土壤中的固定情况。土壤pH值越低(低于蛋白酶的等电点),粘粒吸附的酶越多。土壤有机质与土壤酶之间存在显著正相关。土壤有机物质可吸附土壤中的酶, 如脲酶、二酚氧化酶、蛋白酶及水解酶等, 这些物质都曾以“酶—腐殖物质复合物”的形式从土壤中被提取出来。

1.3 植物

植物根分泌物形成的根际微生态环境是植物与土壤直接进行物质交换最活跃的场所,不仅对微生物有重要的影响,同样对土壤酶也有极大的影响,能够导致酶数量和种类的改变。大多数根际土壤酶活性比非根际强,这种效应称为酶的根际效应,可用根际土壤酶活性与非根际土壤酶活性之比(R/S)来表示。研究表明[8],根际土壤比非根际土壤更能增加磷酸酶、核酸酶、转化酶、脲酶、过氧化氢酶、芳基硫酸酯酶和蛋白酶的活性。

1.4 人为因素

1.4.1 耕作方式

耕作会引起土壤成分的内在变化,使土壤有机物质在微生物和酶推动下发生一系列转化[9]。采用不同种类犁具,耕作效果不同,引起酶活性的变化也会有差异;合理轮作能够促进土壤生物化学过程,增强土壤酶活性;污水灌溉及排水也会引起土壤酶活性的变化。

1.4.2 重金属

重金属随工业废弃物及肥料和农药的施用进入土壤,由于其难降解、移动性差,常对土壤生态系统造成不可恢复的破坏。研究表明[10],镉对转化酶和碱性磷酸酶产生抑制作用并且随浓度增高而加强;镉、锌、铅共存时对脲酶活性产生协同抑制效应,对过氧化氢酶却产生拮抗作用和屏蔽作用。

1.4.3 肥料

肥料对土壤酶的影响分为直接和间接两种。其中,直接影响是肥料中的化学物质直接对酶产生作用;间接影响是肥料通过促进微生物的合成作用来影响土壤酶的活性。无机肥料可为植物提供养料,植物庞大的活根系分泌释放许多酶类;有机肥料不仅提供营养物质,还能改善土壤的理化性质,提高土壤保水、保肥能力和缓冲性能[11]。

1.4.4 农药

农药进入土壤后,相当一部分以农药本身或分解产物的形式残留在土壤中,影响土壤生态环境及土壤酶活性。在农业实践中,农药对土壤酶活性的影响,可以是直接抑制或激活土壤酶活性,也可通过改变植物根系功能以及土壤生物的组成来影响土壤酶的含量与活性。因此,土壤酶可作为检测农药对土壤环境条件影响的指示剂。

2 农药对土壤酶活性的影响

目前,国内外关于农药对土壤酶活性影响的报道很多[12,13],研究的土壤酶包括:蔗糖酶、脲酶、过氧化氢酶、脱氢酶、磷酸酶等。本文以蔗糖酶、脲酶和过氧化氢酶为例,介绍当前的研究进展。

2.1 农药对土壤蔗糖酶活性的影响

蔗糖酶又叫转化酶或β-呋喃果糖苷酶,是表征土壤生物活性的一种重要水解酶。蔗糖分子被蔗糖酶催化水解后,生成葡萄糖和果糖,是植物和微生物的营养源。一般情况下,土壤的肥力越高,蔗糖酶活性越强。因此,蔗糖酶不仅能够表征土壤生物学活性强度,也可作为评价土壤熟化程度和土壤肥力水平的重要指标。

Ginarfeda研究了4种农药(阿特拉津、西维因、草甘麟、百草枯)对蔗糖酶催化行为的影响。结果发现:草甘磷和百草枯能增加高岭石土壤中蔗糖酶的活性,而西维因会使某些土壤蔗糖酶活性降低[14]。

闫颖研究了5种农药对土壤蔗糖酶活性的影响[15]。结果表明:百菌清、百菌清—多菌灵混剂、氯氰菊酯可明显抑制土壤蔗糖酶活性;多菌灵、吡虫啉低浓度时激活而高浓度时抑制蔗糖酶活性;百菌清和多菌灵联合使用,可明显增加农药的毒性,在实验浓度(0.1~50mg/g)范围内, 对大棚土壤蔗糖酶的抑制率达到80%~90%。

周世萍发现[16]:施入土壤中的毒死蜱农药对土壤蔗糖酶活性具有抑制作用,抑制程度的大小随外界环境的变化而变化,与土壤有机质含量、作用时间及酸度条件有关。有机质含量越高,抑制作用越显著;酸性条件下抑制较碱性条件强。

和文祥等通过模拟方法,研究了呋喃丹与土壤中蔗糖酶的关系及其影响因素[17]。结果表明: 土壤蔗糖酶活性在0.3%呋喃丹浓度范围内被激活,部分样品的蔗糖酶活性与呋喃丹浓度呈显著或极显著正相关,说明蔗糖酶活性可在一定程度上表征土壤受呋喃丹污染的程度。

2.2 农药对土壤脲酶活性的影响

脲酶广泛存在于土壤中,是研究的比较深入的一种水解酶,能反映土壤有机氮的转化情况。脲酶酶促尿素水解生成氨、二氧化碳和水。氨是植物氮素营养源之一,因此控制土壤脲酶活性,对提高尿素氮肥利用率、防止硝酸盐和亚硝酸盐的大量积累等具有重要意义。

和文祥研究了2,4-D对土壤酶的影响[18]:2,4-D对土壤脲酶的影响存在一个浓度迟缓期,随后表现出较强的抑制作用,作用机理为完全抑制。

徐珍的研究表明[19]:氟铃脲对土壤脲酶活性的影响较为复杂。高浓度10.08mg/kg处理的土壤脲酶活性在培养期间一直处于被抑制状态。较低浓度 5.040 mg/kg处理的土壤脲酶活性在培养初期被抑制,而后被激活,低浓度0.504 mg/kg处理的土壤脲酶活性则表现为在培养初期被激活,而后逐渐恢复到与对照相一致。原因可能是高浓度的氟铃脲,超出了土壤脲酶的耐受闽值,致使土壤脲酶的活性被抑制;少量氟铃脲的加入,为土壤微生物提供了碳源,从而激活了土壤脲酶的活性。随着时间的推移,氟铃脲逐渐被降解,因此对土壤脲酶活性激活的影响也就越来越小,慢慢恢复到对照。

杨玲比较了9种农药(功夫、敌杀死、氧乐果、久效磷、蚜虱净、好年冬、敌稗和尼索朗)对土壤脲酶活性的影响[20],发现土壤中的农药对土壤脲酶活性具有一定的影响作用,影响程度的大小随农药的种类及外界环境的变化而变化。当底物浓度(尿素)相同时, 拟除虫菊酯类农药(功夫、敌杀死)在试验用量范围内, 对脲酶活性的抑制作用呈递减趋势。有机磷类农药(氧乐果, 久效磷, 蚜虱净)、氨基甲酸酯类农药(好年冬)、酰胺类农药(敌稗, 尼索朗)在试验用量范围内的趋势是:随农药用量增加,对脲酶活性的抑制率增加;而有机氯类农药(三氯杀螨醇)在试验用量范围内, 对脲酶活性基本无抑制作用。

农药对脲酶活性作用还因土壤理化性质的不同而有所差异。樊宏娜研究发现[21],五氯硝基苯对不同土壤脲酶活性的影响规律不同,粘粒含量高的土壤脲酶活性值也高,土壤脲酶受到粘粒的保护,使五氯硝基苯对其影响不显著,即使产生激活作用也能较快的恢复。

2.3 农药对土壤过氧化氢酶活性的影响

过氧化氢酶属氧化还原酶类,广泛存在于土壤中和微生物体内,酶促过氧化氢分解,可以有效防止土壤及生物体在新陈代谢过程中产生的过氧化氢对生物体的毒害。

鲁赫鸣发现:大棚土壤中施用多菌灵与氯氰菊酯后, 低浓度时对过氧化氢酶活性影响不显著, 高浓度(150μg/g)时表现出强烈的抑制影响。农田土壤中施用多菌灵与氯氰菊酯后, 低浓度时对过氧化氢酶有一定的激活作用, 高浓度(150μg/g)时过氧化氢酶表现为抑制—激活—恢复的变化趋势。高浓度处理对大棚土壤的抑制作用明显高于农田土壤[22]。

徐珍研究发现[23],唑螨酯对土壤中过氧化氢酶的活性有一定影响但不显著。氟铃脲对土壤过氧化氢酶的影响大体表现为抑制—激活—抑制—恢复。其中,高浓度处理对土壤过氧化氢酶活性的影响非常大,表现为抑制-激活-抑制。另外,大棚土壤和农田土壤施用多菌灵与氯氰菊酯后,过氧化氢酶在低浓度农药作用下,表现为先激活再恢复,在高浓度(150μg/g)处理时,表现出强烈的抑制影响。两种农药的抑制影响趋势基本相同,但对大棚土壤的抑制作用明显高于对农田土壤的抑制作用。

杨敏发现[24],不同浓度的草甘膦对大棚土壤和农田土壤过氧化氢酶活性的影响是比较复杂的。在一定范围内,先呈现轻微的激活,再激发,然后恢复到与对照基本一致。草甘瞵对两种土壤过氧化氢酶活性激活的影响趋势基本相同,低浓度激活,高浓度抑制。高浓度的草甘膦对大棚土壤过氧化氢酶的抑制作用高于对农田土壤的抑制作用。

3 研究展望

目前,有关农药对土壤酶活性的研究很多,也取得了一些成就,但大多集中在不同种类农药对不同土壤酶的影响,而对于作用机理的研究不够深入。农药对土壤酶活性的影响可通过多种途径实现:一是农药作用于土壤微生物,影响微生物的新陈代谢,改变微生物向土壤分泌酶的种类及数量;二是农药使附在有机粘粒上的酶发生解吸,改变土壤游离状态的酶的种类及数量;三是农药直接作用于土壤酶,通过改变其分子结构来影响土壤酶的活性;四是农药参与酶促反应,通过改变反应速率来影响土壤酶的活性。由此可知,农药对土壤酶活性影响的机理是非常复杂的,需要多学科知识体系相互渗透,这也是今后需要进一步努力的方向。

另外,由于大部分试验属室内模拟试验,与田间实际环境差别很大,实验室内得出的结论未必能很好地代表实际情况,今后也应加强这方面的研究,以期为土壤农药污染的进一步修复和治理提供可靠数据。

摘要：随着农药对土壤污染的日益严重,越来越多的研究者将土壤酶作为指示剂,检测农药对土壤环境条件的影响,并根据土壤酶活性的变化来判断污染物对土壤的毒害程度,这也是从土壤生物化学角度探索环境保护的一个新内容。为此,介绍了影响土壤酶活性的环境因素,综述了农药对土壤酶活性影响的研究进展,并对今后的研究方向进行了展望,以期为土壤农药污染的进一步治理和修复提供科学依据。

新一代脱墨酶生物活性的研究 篇3

关键词：脱墨酶；脱墨剂；生物活性

中图分类号：TS745 文献标识码：A 文章编号：1009-2374（2013）29-0013-03

1 概述

随着社会经济的发展，纸张的使用量迅速上升，与此同时，废纸也因此大量的产生，中国作为世界第二大纸张消费国，2003年纸张的消费量为4806万吨，废纸的回收量保守估计为1400万吨。由于利用原木造浆造纸消耗大量的木材、破坏生态环境，同时还造成了严重的环境污染，因此，废纸的循环利用已经成为现代造纸业的一大发展趋势。但是，由于近年来造纸和印刷技术的改进，加大了印刷效果，使得印刷后的纸面与油墨牢固结合，造成了脱墨的难度大大增加。传统的脱墨方法采用的是表面活性剂脱墨，但是存在很多弊端，例如脱墨后的成浆细小纤维颗粒含量高、滤水性能差、纤维的结合力很低，使得纸物理强度等主要指标下降。利用脱墨酶法进行脱墨已经成为国内外废纸回收利用的研究重点。

目前发现能用于脱墨的生物酶主要有纤维素酶、木聚糖酶、脂肪酶、果胶酶、淀粉酶、木质素降解酶等。其中脱墨效果好的主要是纤维素酶和木聚糖酶，它们都是以改变油墨粒子附近的纤维表面或连接价键释放油墨粒子的方式脱墨，纤维素酶的脱墨效果比木聚糖酶好，但是对纤维的损伤程度更大。本研究采用的新一代脱墨酶是已经由纤维素酶和木聚糖酶1∶1复配而成的复合酶，该酶充分利用两者的互补作用和协同效应对废纸进行脱墨从而获得最佳的脱墨效果。研究主要探索了脱墨酶在不同温度、pH、碎浆时间下的脱墨效果；在适宜条件下，利用脱墨酶脱墨和化学脱墨法脱墨的性能比较。

2 材料与方法

2.1 实验材料

废纸选用8#新闻纸，原浆白度43.5%，残留油墨量为48.3%；脱墨酶由济南诺能生物工程有限公司提供，化学脱墨剂采用***公司的国产脱墨剂（1#）和进口脱墨剂（2#）。

2.2 实验方法

2.2.1 备料：废纸撕碎后浸泡，疏解至纤维基本解离，挤干、分散后装入塑料袋中备用。

2.2.2 脱墨酶在不同温度、pH、碎浆时间下的脱墨

实验。

（1）脱墨酶不同温度下的脱墨实验。称取一定量的废纸浆疏解后与酶液、缓冲溶液在聚乙烯塑料袋中充分混匀后置于35℃、45℃、55℃、65℃、75℃、85℃恒温水浴中加热，每10min揉搓一次，使浆料与酶液混合均匀，一定时间后进行浮选，测定其白度。

（2）脱墨酶在不同pH下的脱墨实验。称取一定量的废纸浆疏解后与酶液、缓冲溶液在聚乙烯塑料袋中充分混匀后，调节pH于4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，置于恒温水浴中加热，每10min揉搓一次，使浆料与酶液混合均匀，一定时间后进行浮选，测定其白度。

（3）脱墨酶在不同碎浆时间下的脱墨实验。选取碎浆时间为20min、25min、30min、35min、40min的碎浆液疏解后与酶液、缓冲溶液在聚乙烯塑料袋中充分混匀后置于恒温水浴中加热，每10min揉搓一次，使浆料与酶液混合均匀，一定时间后进行浮选，测定其白度。

2.2.3 脱墨酶脱墨与化学脱墨法性能比较实验：

酶法脱墨：称取一定量的废纸浆，疏解后与酶液、缓冲溶液在聚乙烯塑料袋中充分混匀后置于恒温水浴中加热，每10min揉搓一次，使浆料与酶液混合均匀，一定时间后进行浮选。

化学脱墨：称取一定量的废纸浆，疏解后与脱墨剂、缓冲液在聚乙烯塑料袋中充分混匀后置于恒温水浴中加热，每10min揉搓一次，使浆料与酶液混合均匀，一定时间后进行浮选。

漂白：称取一定量的脱墨浆料，疏解后与H2O2、Na2SiO3、NaOH、螯合剂EDTA在聚乙烯塑料袋中充分混匀后置于70℃的恒温水浴中，每10min揉搓一次，一定时间后取出洗涤。

浮选：将脱墨浆料倒入浮选器中，调节浆浓至1%加入0.2%CaCl2和0.1%浮选剂进行浮选，一定时间后倒入滤袋挤干、分散，用于抄片。

白度、返黄值、物理强度等按标准方法测定；油墨量使用Autospec计算机软件测定。

3 结果与讨论

3.1 脱墨酶在不同温度、pH、碎浆时间下的脱墨结果

3.1.1 脱墨酶不同温度下的脱墨实验。实验进行了不同温度下的脱墨实验，实验结果如图1：

由图1可知，脱墨酶在55℃～70℃下白度较高，因而脱墨效果更好，随着温度的升高，酶的活性也随之降低，因而在75℃后，白度逐渐降低，脱墨效果因此减弱，因此该种脱墨酶在55℃～70℃条件下的脱墨效果更好。

3.1.2 脱墨酶在不同pH下的脱墨实验。实验进行了不同pH条件下的脱墨实验，实验结果如下图2。由图2可知，脱墨酶在pH6.0～pH10.0下白度值相差不大，因而脱墨效果差别不大，因此脱墨酶在此pH范围内的脱墨效果比较好，耐受pH范围广。

3.1.3 脱墨酶在不同碎浆时间下的脱墨实验。实验进行了不同碎浆时间下的脱墨实验，实验结果如下图3。

由图3可知，随着碎浆时间的增加，脱墨浆的白度值也在逐渐增加，但是碎浆时间达到30min后，碎浆经脱墨后的白度值变化不大，脱墨效果也相近，因此在实验过程中，会选取30min作为最佳碎浆时间。

3.2 脱墨酶脱墨与化学脱墨法性能的比较

3.2.1 化学脱墨浆与脱墨酶脱墨浆的脱墨性能

比较。实验将化学脱墨浆与脱墨酶脱墨浆进行了脱墨性能的对比，脱墨酶脱墨采用最佳工艺条件进行实验；化学脱墨法采用国产脱墨剂和进口脱墨剂，实验结果如表1。

由表1可知，使用脱墨酶进行脱墨后的脱墨浆的白度要高于化学脱墨浆，酶脱墨浆的白度要比国产脱墨剂高出2.4个百分点，比进口脱墨剂高出0.9个百分点。进口化学脱墨浆的油墨脱除率最高，但是因碱会产生碱性发黑现象，因而浆料的白度低于酶脱墨浆。

使用脱墨酶脱墨的脱墨浆的得率要高于化学脱墨浆。酶脱墨浆的得率分别比国产和进口化学脱墨浆提高了3.0和6.3个百分点，使用脱墨酶进行脱墨可以降低纸浆纤维的降解程度，从而提高得率。

3.2.2 化学脱墨浆与脱墨酶脱墨浆的漂白性能

比较。研究以H2O2作为漂白剂，对唾沫所得废纸浆进行漂白，实验结果如下表2：

由表2可知，经漂白后，酶脱墨浆的白度高于化学脱墨浆，因为脱墨酶对浆料中的纤维有更强的剥离作用，促使漂白剂深入渗透到纤维中，因而漂白效果更好。

通过比较可知，经脱墨酶脱墨后返黄值较低，脱墨剂返黄值较高，这主要是因为化学脱墨剂中含有碱性物质，所以返黄程度较大。脱墨酶在剥离纤维后，有利于浆中部分木质素和木聚糖等的溶出，因而浆料不容易发生返黄。

4 结语

脱墨酶在不同温度、pH、碎浆时间下的脱墨实验研究中，碎浆时间为30min时，脱墨酶在55℃～70℃条件下的脱墨效果更好，有较广的温度耐受范围，因而适用于工业化大规模的生产；同时该脱墨酶还具有良好的耐碱性，pH的耐受范围为6.0～10.0，在此范围内脱墨效果最佳。

通过实验研究可知，脱墨酶法脱墨与传统的化学脱墨法相比具有明显的技术优势：

（1）消除油墨的障碍，提高了脱墨浆的产品质量，使用脱墨酶脱墨，提高了废纸的脱墨效率，所得脱墨浆白度高，残留的油墨少，滤水的性能好，经脱墨酶脱墨后的纤维暴露出更多的表面，增强了纤维的柔软度，从而有利于纤维间的结合，增加纸的强度。

（2）降低了生产成本。使用脱墨酶进行脱墨，减少了表面活性剂、消泡剂、杀菌剂以及废水处理絮凝剂等化学用品的用量。使用脱墨酶脱墨的成浆具有良好的可漂性，在相同的白度下，脱墨酶脱墨法的双氧水用量明显比化学法用量少。同时由于脱墨酶脱墨改善了纸浆的强度和游离度，因此大大减少了助留助滤剂、增强剂的用量。

（3）有利于环境的保护。脱墨酶法脱墨减少了化学用品的用量，使废水中的BOD和COD含量大大降低，从而减轻了对环境的污染。

参考文献

[1] EOM T J， OW S K. Enzymat ic deinking met hod of

old newspaper[J]. Japan Tappi， 1991， 45（12）：

81.

[2] ZEYER C， HEITAMANN J A， JOYCE T W， et al.

Factors influencing enzyme deinking of recycled fiber

[J]. Tappi J， 1994， 77（10）： 169.

[3] BAJPAI P， BAJPAI P K. Deinking with enzymes：

a review [J]. Tappi J， 1998， 81（12）： 111.

[4] PUTZ H J， et al. 1994 Tappi Pulping Conference

[C].San Diego：1994. Nov.6-10，Boo k 2：887.

[5] 陈佩蓉，屈维均，何福望.制浆造纸实验[M].北

酶活性的研究性学习 篇4

珙桐与光叶珙桐过氧化氢酶活性及酶谱研究

采用铁氢化钾染色法对珙桐和光叶珙桐进行CAT酶谱分析;用碘量法进行CAT酶活性的研究.研究结果表明:珙桐有酶带两条,Rf值分别为0.74和0.90,CAT酶活性为0.40824mg・(g・min)-1;光叶珙桐也有两条酶带,Rf值分别为0.76和0.93,CAT酶活性为1.3608mg・(g・min)-1;表明珙桐和光叶珙桐在遗传特性、生物进化等方面存在差异性;光叶珙桐代谢比珙桐旺盛,先叶珙桐是珙桐的变种,抗逆性更强,为珙桐种质生化分析、植物学分类及品种选育奠定了理论基础.

作 者： 作者单位： 刊 名：湖北民族学院学报（自然科学版） 英文刊名：JOURNAL OF HUBEI UNIVERSITY FOR NATIONALITIES(NATURAL SCIENCE EDITION) 年，卷(期)：2009 27(3) 分类号：Q945.32 关键词：珙桐   光叶珙桐   过氧化氢酶活性   酶谱  

酶活性的研究性学习 篇5

测定了人工湿地基质微生物和酶活性,结果表明,人工湿地基质好氧微生物数量下行池大于上行池;基质上层好氧微生物数量显著大于中下层基质;人工湿地基质中酶活性下行池大于上行池;基质上层磷酸酶、脲酶和蛋白酶的活性显著大于中下层基质;不同时间的基质酶活性不同.基质上层区域是人工湿地污水处理系统最有效的`净化空间.由于人工湿地下行池基质中好氧微生物数量和酶活性大于上行池,在人工湿地净化污水的过程中,下行池的作用占主导地位.

作 者：李智 杨在娟 岳春雷 LI Zhi YANG Zai-juan YUE Chun-lei  作者单位：李智,LI Zhi(浙江省森林资源保护管理总站,浙江,杭州,310020)

杨在娟,岳春雷,YANG Zai-juan,YUE Chun-lei(浙江省林业科学研究院,浙江,杭州,310023)

刊 名：浙江林业科技  ISTIC PKU英文刊名：JOURNAL OF ZHEJIANG FORESTRY SCIENCE AND TECHNOLOGY 年，卷(期)： 25(3) 分类号：X703 关键词：人工湿地   微生物   酶活性  

酶活性的研究性学习 篇6

镉胁迫对水稻颖果充实和淀粉合成关键酶活性的影响

盆栽试验研究了Cd胁迫对水稻(扬稻6号和粳稻941)颖果充实过程中颖果鲜千重、可溶性糖和淀粉含量以及淀粉合成关键酶活性的影响,结果显示Cd胁迫:(1)降低了颖果淀粉合成关键酶的活性,缩短了颖果维持上述酶活性的天数;(2)降低了颖果可溶性糖的含量;(3)颖果灌浆减慢,鲜重、干重增加速率减缓,灌浆的.天数变短,最终成熟颖果干重降低.说明,淀粉合成关键酶活性下降和维持活性的时间缩短使淀粉等贮藏物质的合成和积累降低是Cd胁迫降低颖果粒重的原因之一.

作 者：陈娟 孙鉴坤 方元平CHEN Juan SUN Jian-kun FANG Yuan-ping  作者单位：黄冈师范学院生命科学与工程学院,湖北黄冈,438000 刊 名：生态科学 英文刊名：ECOLOGICAL SCIENCE 年，卷(期)： 28(3) 分类号：Q511 Q945 关键词：水稻   镉胁迫   淀粉   淀粉合成关键酶  

酶活性的研究性学习 篇7

1 材料与方法

1.1 试验地概况

试验在大连市甘井子区辛寨子街道的西沟苗木试验中心进行,当地属具有海洋性特点的大陆性季风气候,年均温、年均降雨量、年均相对湿度分别为10.5℃、655.7 mm、70%,降雨多集中在6—8月。

1.2 试验材料

试验材料为7个欧美杨一年生扦插苗(种条由中国林业科学研究院提供),分别为N177、青13、03-04-111、03-04-141、03-04-97、03-04-170、I108。据潘姝慧等[9]调查表明,7个品种中,N177对锈病免疫,03-04-111、03-04-97和I108为抗病,03-04-141、03-04-170为感病,青13为乡土对照品种。

在落叶松-杨栅锈菌浸染发病中期,每个无性系随机取5株,分别采取感病和健康叶片。在树冠中上部,按东、南、西、北4个方向选择枝条,每个枝条上选择第5~7片叶。采后立即放入装有冰块的保温箱中储藏,带回实验室后立即放入超低温冰箱中冷冻储存备用。

1.3 不同杨树品种5种酶活性测定

1.3.1 苯丙氨酸解氨酶(PAL)的提取和活性测定。

取叶片样品1.0 g,加4倍重量预冷的0.2 mol硼酸缓冲液(pH值8.8,含8 mmol巯基乙醇)冰浴研磨匀浆,4℃下10000 r/min离心20 min,上清液用于酶活性检测。检测反应液组成:硼酸缓冲液3.0 mL+80 mmol/L L-苯丙氨酸1.0 mL+酶液1.0 mL,35℃水浴反应60 min,紫外分光光度计测OD 290,以每克鲜组织每分钟OD 290变化0.01为1个PAL酶活性单位(U)。

1.3.2 多酚氧化酶(PPO)的提取和活性测定。

取叶片样品1.0 g,加适量磷酸缓冲液(0.2 mol,pH值5.9,内含0.006 mo半胱氨酸),研磨匀浆,定容20 mL,4 000 r/min离心15 min,上清液为待测酶液。反应液组成:磷酸缓冲液2.5 mL+酶液1.0 mL+80 mmol/L邻苯二酚1.0 mL,30℃水浴反应15 min,加入20%三氯乙酸2 m L终止反应。525 nm处测定OD值,以每克鲜组织每分钟产生使OD 525值变化0.10为1个酶活性单位(U)。

1.3.3 过氧化物酶(POD)的提取和活性测定。

取叶片样品1.0 g,加入预冷的0.1 mol/L磷酸缓冲液(pH值6.5)10 mL,冰浴研磨匀浆,4℃下冷提30 min,3 000 r/min离心10 min,取上清液为待测酶液。POD活性测定反应液组成:pH值6.5的磷酸缓冲液2 mL,0.1%愈创木酚1 mL,酶液(适当稀释)0.25 mL,混匀后在35℃水浴上保温熟化5 mim,加0.08%H2O20.25 m L,立即在470 nm处读取0~3 min OD值(光程1cm),以每克鲜叶使OD 470变化0.10为1个酶活性单位(U)。

1.3.4 几丁质酶的提取和活性的测定。

取叶片样品1.0 g,加5 mL预冷的0.1 mol/L醋酸缓冲液(pH值5.0)冰浴研磨匀浆,10 000 r/min离心10 min(4℃),上清液在10 000 r/min下再离心10 min(4℃),上清液即为酶粗提液。取0.4 mL酶液,加1%蜗牛酶0.04 m L,37℃水浴反应30 min后,加入0.2 mL饱和硼砂,放入沸水浴中7 min,冷却后加入冰醋酸2 mL和1%对二甲氨基苯甲酸(DMAB)1 mL,37℃保温15 min,585 nm下测定其光密度。根据N—乙酰氨基葡萄(NAG)糖标准曲线得到对应产生还原残基的NAG的量,以1 g产生0.1 mg NAG为1个酶活单位(U)。

1.3.5 β-N-乙氨基酰葡萄糖苷酶活性的测定。

取叶片样品1 g,加0.2 mol/L醋酸缓冲液(pH值5.0)研磨匀浆,10 000r/min离心15 min(4℃),上清液即为待测酶液。以对硝基酚-β-N-乙酰氨基葡萄糖苷(pNP-β-D-GlcNAc)为底物,反应液包括2 mmol/L底物250μL,醋酸缓冲液(pH值5.0)200μL。40℃预热10 min后加入酶液50μL,40℃保温15min,加入0.2 mol/L Na2CO32 mL显色,测定OD 400,以每分钟每克鲜组织从底物中释放1μmol/L对硝基酚为1个酶活力单位(U),对硝基酚的摩尔吸收系数为1.74×104mol/cm。

2 结果与分析

2.1 不同杨树品种染病与健康叶片苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性

由图1可知,染病叶片的PAL活性均高于比未染病叶片,其中N177提高了2.3%,03-04-97提高33.5%,03-04-170提高38.9%,03-04-141为2.5%,03-04-111为2.8%,青13提高20.2%,I108提高107.0%。7个杨树品种中,与未染病叶片相比,N177的PAL酶活性增量最小,I108的PAL活性变化最大。

2.2 不同抗病性杨树多酚氧化酶(PPO)活性的研究

由图2可知,染病叶片的PPO活性均高于比未染病叶片,其中N177提高了5.1%,03-04-97提高了75.0%,03-04-170提高了65.1%,0304-141提高了53.3%,03-04-111为1.7%,青13提高了18.5%,I108提高了234.4%。7个杨树品种中,与未染病叶片相比,03-04-111的PPO活性增量最小,I108的变化最大。

2.3 不同抗病性杨树过氧化物酶(POD)活性的变化

由图3可知,染病叶片的POD活性均高于未染病叶片,其中N177提高了25.0%,03-04-97提高了19.6%,03-04-170提高了11.6%,03-04-141提高了9.3%,03-04-111提高了24.3%,青13提高了104.1%,I108提高了29.6%。7个杨树品种中,与未染病叶片相比,03-04-141的变化最小,青13的POD活性增量最大。

2.4 不同抗病性杨树几丁质酶活性的变化

由图4可知,染病叶片的几丁质酶活性均高于比未染病叶片,其中N177提高70.0%,03-04-97提高17.0%,03-04-170提高37.0%,03-04-141提高27.2%,03-04-111提高10.1%,青13提高42.5%和I108提高41.5%。7个杨树品种中,与未染病叶片相比,N177的几丁质酶活性增量最大,03-04-111的变化最小。

2.5 β-N-乙氨基酰葡萄糖苷酶活性的比较

由图5可知,染病叶片的β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶活性均高于比未染病叶片,其中N177提高13.7%,03-04-97提高23.5%,03-04-170提高35.5%,03-04-141提高12.2%,03-04-111提高32.8%,青13提高66.2%,I108提高2.3%。7个杨树品种中,与未染病叶片相比,青13的β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶活性增量最大,I108的变化最小。

3 结论与讨论

3.1 结论

杨树受到落叶松-杨栅锈菌浸染后的酶活性均比未染病的酶活性要高,其中PAL的活性提高了2.3%~107.0%,PPO活性提高了1.7%~234.4%,POD活性提高了9.3%~104.1%,几丁质酶活性提高了10.1%~70.0%,β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶活性活性提高了2.3%~66.2%。

不同品种感染落叶松—杨栅锈病后,每个品种的防御系统中酶活性变化差异较大。其中,N177是落叶松-杨栅锈菌的免疫品种,该品种染病后,PAL、PPO和β-N-乙氨基酰葡萄糖苷酶3种酶活性变小幅度较小,POD和几丁质酶活性提高幅度最大;03-04-111、03-04-97、I108为抗病品种,其中I108的PAL、PPO酶活性增加幅度最高;03-04-141和03-04-170为感病品种,这2个品种PPO和几丁质酶活性明显提高,其他酶活性变化幅度较小;乡土品种青13的POD酶活性β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶提高幅度最大。

综上所述,感染锈病后,抗锈病杨树品种的PPO、PAL酶活性变化最明显,免疫杨树品种的几丁质酶活性增量最大,乡土品种青13的POD酶活性、β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶活性增量最大,感病品种的酶活性变化幅度均处在较低的水平。

3.2 讨论

参与植物抗病性反应的酶中,几丁质酶和β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶等酶具有直接破坏或者攻击病原菌的作用。几丁质酶能抑制真菌孢子的萌发和菌丝体生长[10,11,12],在抵御病原真菌侵染的保卫反应中起重要作用;β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶协同几丁质酶分解几丁质,并与细胞壁木质素的沉积以增强细胞壁的强度有关。该研究中,免疫和乡土杨树品种的几丁质酶、β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶活性较强,验证了这2种酶在病菌感染后的保卫反应中具有重要的作用。

PAL被认为是植物抗病性的重要生理指标[8,13],由该酶控制的苯丙烷代谢途径能合成包括多种酚类物质、类黄酮类植保素、木质素等抗菌物质;PPO能将多酚氧化成醌类物质(具有要化学抗菌性),能抑制病原发育所需的转氨酶、磷酸化酶等,同时对病原菌侵染起重要作用的果胶酶、纤维素酶等有明显的抑制作用。该研究中,染病后,抗性杨树品种的PAL、PPO活性明显提高。因此,在进一步的杨树抗锈病研究中,可选择PAL、PPO酶活性作为指示杨树抗叶锈病的生理指标。

酶活性的研究性学习 篇8

关键词：瘦柄红石蕊；Biruloquinone；BACE抑制活性

中图分类号：R96 文献标识码： A 文章编号： 1674-0432（2014）-06-28-1

瘦柄红石蕊（Cladonia macilenta Hoffm.）是地衣门（Lichenes）、子囊衣纲（Ascolichens）、石蕊科（Cladoniaceae）、石蕊属（Cladonia）的一种朽木生地衣。据报道，罗姮[1]等首次从C. Macilenta中分离出一种自然界罕见的菲醌化合物biruloquinone。该类化合物已被发现具有多种重要的活性，如丙肝肝炎病毒（HCV）蛋白酶抑制剂活性、CD45抑制剂活性等[2]，但对其BACE抑制剂活性研究未见报道。在阿尔茨海默病（AD）的发病机制中，β分泌酶（BACE1）是产生淀粉样β蛋白（Aβ）的关键分子[3]，BACE1抑制剂的研发在AD治疗方面已成为社会及医药工业界关注的热点之一[4]。

1 材料与方法

1.1 实验材料

供试菌株：瘦柄红石蕊采集于云南省，地衣标本存放于昆明植物研究所标本馆（CH050136），地衣体经内生真菌分离得到的紫色C.macilenta LFF保存于韩国地衣资源银行（KOLABIC），国立顺天大学。

试剂药品：β-分泌酶（BACE）抑制剂筛选分析试剂盒（欣博盛生物科技有限公司），其余化学试剂均为国产分析纯。

主要仪器：旋转蒸发器RE-52AA（上海亚荣生化仪器厂），Synergy HT多功能微孔板酶标检测仪（美国Bio Tek公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 Biruloquinone的提取和分离 将地衣型真菌瘦柄红石蕊的菌丝体接种于PDB培养基中（5瓶×300毫升/1000毫升三角瓶），15℃、150转/分避光培养30天（发酵液呈深紫色），将全部1.5L发酵液，用乙酸乙酯等体积萃取24小时。将有机层通过Whatman No.1定性滤纸除去菌丝体。重复两次该过程，并将提取液合并，40℃真空浓缩至500毫升。将浓缩的提取物过硅胶柱（230～400目，3.5×80厘米）纯化，用甲苯-乙酸乙酯-甲酸（90∶20∶2，v/v，4升）洗脱，得到暗紫色组分（980毫升），将该组分集中在真空30℃浓缩，获得110mg biruloquinone固体粗提物。然后将粗提物用氯仿-甲醇重结晶法纯化（1：1，v/v），得到35mg暗紫色的biruloquinone晶体。

1.2.2 Biruloquinone的体外BACE抑制实验 样品准备：将biruloquinone配成6.25，12.5，25，50，75，100微克/毫升的质量浓度。BACE酶抑制率的测定：（1）向背景值检测孔加95微升检测缓冲液和2.5微升 80%乙醇溶液；（2）向空白对照孔加92.5微升检测缓冲液，2.5微升 80%乙醇和2.5微升 BACE；（3）向样品检测孔分别加95微升检测缓冲液，2.5微升不同浓度的biruloquinone和2.5微升 BACE；（4）向所有检测孔加2.5微升酶作用底物（10微米），轻轻震荡混匀，室温孵育40 分；（5）使用酶标仪以激发光（excitation，ex）340nm-发射光（emission，em）500nm检测荧光强度；（6）每个检测孔3个重复，根据以下公式计算平均抑制率：

抑制率I（%）=[（A2-A3）/A3-A1]×100%

其中：A1为缓冲液背景值；A2为抑制前酶活性；A3为抑制后剩余酶活性。

2 结果与讨论

Biruloquinone体外BACE抑制活性：本实验采用重组人BACE-1，荧光底物含有一个强荧光7-甲氧基香豆素基团，BACE能切割荧光基团和猝灭基团之间的肽酶活性，使荧光增强。因此可以根据荧光的变化值来判断样品对BACE的抑制活性。从图1可知，biruloquinone对BACE的抑制与浓度正相关，抑制率随浓度增加而迅速提高，对酶活抑制50%的浓度（IC50）为62.3微克/毫升（191微米）。在最大浓度为100微克/毫升时，抑制率达68.36%，由此可知，biruloquinone具有较强的BACE抑制活性。

图1 Biruloquinone对BACE抑制作用曲线

3 结语

Biruloquinone具有较强的BACE抑制剂活性，在最大浓度为100微克/毫升时，清除率可达68.36%（IC50=62.3微克/毫升）。由此可见，biruloquinone具有一定的治疗AD的能力，这种特性为将瘦柄红石蕊的次生代谢产物biruloquinone开发成为多靶点的抗AD的天然药物提供科学依据。

参考文献

[1] Biruloquinone ， an Acetylcholinesterase Inhibitor Produced by Lichen-Forming Fungus Cladonia macilenta[J].Microbiol. Biotechnol，2013， 23（2）：161-166.

[2] 魏其艳，罗应冈，张国林.菲醌的生物活性[J].天然产物研究与开发，2005，17（5）：665-668.

[3] Cai H， Wang Y， McCarthy D， et al. BACE1 is the major β-secretase for generation of Aβ peptides by neurons[J]. Nat Neurosci， 2001， 4（3）： 233-234.

[4] 周金武，程肖蕊，程军平，等.BACE1抑制剂分子水平高通量筛选体系的建立[J].国际药学研究杂志，2010，37（4）：302-309.