环化学院硕士培养方案

环化学院硕士培养方案（共5篇）

环化学院硕士培养方案 篇1

环化学院演讲比赛策划书

一，活动背景；

我们青年人，好像早晨八九点钟的太阳朝气蓬勃，这世界归根结底是我们的。我们即将走到历史的聚光的灯下，去承担自己的历史责任，履行自己的社会义务，去 创造 一个属于我们，奉献给世界的辉煌。新时期的我们大多成长在相对舒适的环境中，丰厚的物质条件除了 给我们安逸与健康，也使我们的 意志变的脆弱，责任感变的淡薄，使命感变的模糊。作为当代大学生的我们要 积极勇敢的面对 这 一切，去承担起自己的责任，履行好 自己义务。今年党的 十八大召开在即，让我们用自己的坚定信念与崇高理想去感召它，让我们以自己切身行动去迎接它。

二，活动目的；

让同学们在这个活动中通过合作探讨的方式激发自己的思维，使同学们对未来的自我在 社会中有个较好的定位，进一步明确自己目标，坚定自己的信念。以便以后的我们在学习中更有方向性，更好的规范自我，激励自我。在合作探讨中增强相互学习的意识和自我推荐的能力。通过演讲增强同学们表现能力和自信心。

三，活动名称；

《让我承担起历史的责任，履行好自己的社会义务》，写作、答辩赛。

四，活动时间；

五，活动地点；

六，活动开展；

1，宣传：过张贴海报和班委传达的方式宣传活动情况；

2，实施：（1）选出评委，评委是党总支成员，最终答辩时尽量请几名老师；

（2）首先同学们自愿组队，2-~3人为一组，针对“大学生如何承担起自己的历史责任，履行好自己的社会义务”这个话题，结合切身实际完成一份书面论述材料，要求2千字以上。

（3）由考核小组对各小组材料进行审评，根据内容是否全面深刻贴切实际选出优秀作品八份。

（4）胜出的八个小组参加答辩赛。答辩形式：小组选出代表（人数不限）进行自由论述十分钟，然后进行评委提问五分钟，最后由评委打分。最终根据分数高低评出一、二、三等奖。3，活动获奖情况进行公示。

七，活动预算

本次活动的主要花费为答辩赛场布置，评委的水及各种宣传材料。

八，活动负责部门

环化院党总支宣传部

九，活动参与者

全体环化学子

十，注意事项，（1）加大宣传力度，调动同学们的积极性。

（2）本活动需要组织人员较多，要加大与其他部门的合作。

（3）为公平起见，尽量避开评委对本班同学评分。

环化学院硕士培养方案 篇2

随着专业学位研究生规模扩大,学科融合趋势增强,以及跨学科、开放性、培养主体多元性等特点,专业学位研究生培养培养诸多问题日渐凸显[1]。生师比过高、学位论文选题多样化与导师专长不一致等矛盾越发突出,传统的单一校内导师制已成为制约专业学位研究生培养质量的主要瓶颈[2]。国家示范性软件学院工程硕士培养面临多方挑战,多学科融合的导师组培养模式由此应运而生,通过初步探索实践取得了较为满意的效果。然而,任何事物都有两面性,如何兴利除弊、切实发挥导师组优势,非常值得我们深入思考。

1 传统工程硕士培养模式面临挑战

北京工业大学软件学院(以下简称学院),为全国首批35所国家示范性软件学院之一,建院10年来一直非常重视研究生培养质量。近年来,随着研究生教育深入,我们越发认识到传统单一校内导师制已无法满足工程硕士研究生培养要求,正面临多方挑战。

1.1 来自导师方面的挑战

根据国家要求,国家示范性软件学院的教师(导师)的配备应按1:1:1比例分配,即校内导师应包含院内专职、院外高校兼职以及校外企事业单位兼职三部分,且所占比例相当。

兼职导师部分。占导师总人数的2/3,具有专业基础扎实、实践经验丰富等诸多优势。然而,这些导师只能在完成其本职工作的基础上,利用业余时间指导学生的实践及论文。而且,兼职校内导师对学校(院)的教学管理、培养要求等不能及时全面掌握或领会不足,很容易滋生诸多指导过程中的问题。

专职导师部分。受高校对教师的考核指标等影响,院内专职导师的精力一般集中在教学、科研、行政,以及对工学博士、工学硕士甚至本科生的指导。对于工程硕士研究生,不在校、基础弱、选题各异等诸多不利指导的因素使其难以针对每个学生开展个性化指导。而且,部分院内专职导师因侧重于学术研究,从事应用开发的实践经验不足,学生被“学术化”现象明显。[3]

1.2 来自工程硕士自身的挑战

相对于工学硕士而言,绝大多数工程硕士为在职学习,具有离校时间长、家庭负担重、学习时间紧、工作压力大、专业基础差、不进实验室等特点。普遍存在与导师见面少、交流不足或沟通不畅等问题,为校内导师指导工作平添层层障碍。

1.3 学位论文选题多样化引发的挑战

国家对于工程硕士研究生学位论文选题要求明确,应源于生产实际或具有明确的工程背景,其研究成果要有实际应用价值。因此,学生论文选题通常由其所在单位或岗位确定,与校内导师关系甚微。然而,导师一般只在一两个专业方向上具有较深的造诣。面对专业背景各异、选题多样的工程硕士,在知识高度分化融合、更新迅速的软件工程领域,导师指导工作仅限于宏观层面的现象并不罕见。由此,学生论文选题的多样化与导师个人知识专门化就成为矛盾的诱因,直接影响师生关系、制约学生培养质量,学生的创新能力培养更是无从谈起。

1.4 新兴专业引发的挑战

软件工程下设的专业方向多是学科间交叉、融合的产物。例如,我院目前开设的数字体育、数字艺术、技术转移等。按常理,各专业方向导师应该是该方向的专家。比如,数字体育方向的导师,不仅是软件工程领域方面的专家,还具有体育领域方面从事训练与科学研究的能力。然而,现实中却鲜有这样的复合型人才。而且,这样的专业方向必定会集聚不同学科、不同领域、不同专业的导师。如何使导师间更好合作,优势互补,培养出满足要求、思维活跃、勇于创新的研究生,需要我们更新观念,切合实际采取有效措施。

1.5 导师指导均衡引发的挑战

在目前招生规模不断扩大的压力下,为控制合理的生师比,多数院校对导师的遴选不得不放宽条件,致使目前导师队伍水平参差不齐,导师指导流于形式的现象并不罕见。而且,导师对学生严格要求的程度差别越大,越易使学生感觉不平衡、滋生不满情绪。为此,在加强导师素质与能力的同时,应辅以有效的管理手段才能逐渐避免。

1.6 青年教师发展及作用发挥引发的挑战

软件学院专职教师中青年教师比例较大,基本上都具有博士学位,有些还有海外学习工作经历。然而,在被聘为研究生导师之前,因不能直接指导研究生而直接影响其融入学院的速度,更不利于其科研等任务的完成。而在获得研究生指导资格之后,又需要较长时间的学习和磨合,客观上直接影响到研究生的培养质量。因此,仅靠青年教师个人独立成长有较大弊端,迫切需要学院采取某种机制,由经验丰富、认真负责的教师或专家进行传、帮、带、导。

2 工程硕士导师组培养模式实践

自2010年10月,针对上述诸多挑战,为进一步改进专业学位研究生培养质量,北京工业大学软件学院果断进行导师组培养模式的探索与实践。率先在数字体育班、烟草系统行业班试行导师组培养模式后,陆续在本部导师间、数字艺术、技术转移、电子政务以及同方等行业班试行。相继完成调研报告、问卷统计分析报告、可行性分析报告以及导师组培养模式管理办法等文件。目前,《北京工业大学软件学院工程硕士导师组培养模式实施办法》正在紧张制定中,将于近期在全院正式推行工程硕士导师组培养模式改革。

与其他高校导师组模式不同[4,5,6],我们提出的导师组培养模式是从国家示范性软件学院实际出发,针对工程硕士研究生学位论文阶段,采用责任导师与导师组相结合、一主多辅、分工合作,多学科融合的动态导师组培养模式。主要具有如下特征:

1)与国家示范性软件学院师生多元性、学科新兴化等相适应。

2)重点指导工程硕士培养的关键环节——学位论文撰写。

3)导师组成员由学院专职导师、来自兄弟院校及企事业单位的兼职校内导师组成,各展所长、优势互补,实现导师组价值最大化。

4)配置导师组秘书负责师生沟通与事务性管理。不但能合理分担指导教师的事务性工作,还能有效提高自身在教学科研方面的素质与能力,为其日后指导学生奠定良好基础。

5)导师组工作主要以工程硕士学位论文选题、开题、中期检查等关键节点的报告会形式为主,辅以必要的沙龙、研讨等活动形式,平时借助邮件“一件多发”(即学生发邮件给自己校内导师的同时抄送组内其他导师。任何导师的意见反馈该生的同时抄送导师组内所有成员)进行沟通。

3 工程硕士导师组培养模式实施效果

针对工程硕士专业学位研究生进行导师组培养模式的初步实践,给我们带来重要启发。从目前看,软件学科的跨学科融合趋势增强,如何面向实践,将不同专业背景的工程硕士研究生培养成从事软件工程领域的优秀人才,是一项迫切的任务。导师组培养模式为开展这方面工作迈出颇有成效的一步。两年多的针对工程硕士专业学位研究生进行的导师组培养模式探索与实践结果表明,收效明显。

3.1 师生受益

采用导师组培养模式,即便于学生博采众家之长,导师亦可各展所能,及时发现学生论文工作的亮点与不足,有效提升培养效果。仅以数字体育班为例,该班学生于09年9月入学,共有41名,均为体育教师,部分是运动员出身,培养难度可想而知。首次论文开题仅有3人通过。学院当即决定试行导师组模式,将来自学院和国家体育总局的共12位导师分成两个导师组,并设有导师组秘书。通过组织多次研讨、沙龙等活动,学院导师、体育总局专家通力合作,至2011年3月,学生的开题通过率显著提升,而且论文选题紧密切合实际,具有很强的实用价值,如《武力使用模拟训练系统的设计与实现》等。在我院严格的论文质量关把控下,目前该班仅5人因个人原因尚未开题,12名学生已顺利获得学位。

3.2 学院受益

采用导师组培养模式,不仅能充分发挥专、兼职导师作用,实现学院师资价值最大化,而且对新兴专业拓展、学科建设、团队意识等方面都有意想不到的促进。单从管理角度看,之前仅学位论文开题等各环节的报告会安排,为保证每位拟参加学生的导师都到会,需根据几十位相关导师的申请,按专业方向等为导师们分组、逐一与每位导师沟通确认报告会时间等一系列工作。现在则只需根据导师组组长申请落实报告会地点即可。直接避免因分组等引发的矛盾以及报告会时间确认方面带来的烦扰,而且学生对各环节审核意见不一甚至相左、以及对导师不及时反馈意见等方面的投诉也几乎杜绝。

3.3 社会受益

通过搭建导师组平台,交流中师生间、导师间以及学生间思维的碰撞,不仅有利于师生创新能力培养,而且有助于企业实际问题的解决,切实推进产学研一体化建设。比如,在学院体育班师生间的交流研讨中,就曾促成导师组成员与学生间深化合作的雏形。

4 实施导师组培养模式应注意的问题

两年多的探索与实践结果表明,对专业学位研究生采用导师组培养模式,其积极效果毋庸置疑。然而,任何事物都有双面性,导师组培养模式亦不例外。如何使导师组培养模式兴利除弊,切实保证其作用发挥,需要特别关注如下问题。

4.1 导师层面

采用导师组培养,并不表示学生的培养工作就交由整个导师组来负责。即具体到某个学生的培养,既定校内导师是依然指导该生的第一责任人,对研究生培养起主要指导作用,其余组内导师则主要起辅助培养作用。导师组作用真正发挥的关键在于导师组成员能及时有效吸收导师组集体的智慧来培养自己所指导的学生。

4.2 学生层面

导师组模式的采用,为学生搭建了宽厚的知识平台。但是,要注意学生在研究方向上的迷失。学生不能只顾博采众长,要学会综合导师组成员的意见,结合自己课题(项目)实际情况,及时与自己的校内导师沟通,明确改进方向,准确定位不迷惘。

4.3 学院层面

首先,导师组的建立要切合本单位实际。比如在国家示范性软件学院设立导师组,因学科交融趋势增强、学生的选题多样化特征明显,所建立导师组就应该动态而不是静态的,而且是多学科融合的,允许个别导师跨导师组。成员组成方面,也应有一定的要求。如在成员数量方面,人员方面注意老中青、院内外、专兼职搭配等,以保证成员间优势互补、导师组作用切实发挥。

其次,要注意充分发挥导师组组长作用。导师组组长在导师组相关工作的组织、内部矛盾协调、成员考核等方面将发挥关键作用,其工作好坏直接关乎整个导师组的实施效果。应采取一定的激励措施,如在津贴奖励、工作量核算以及职称评聘等方面,以充分调动导师组组长的积极性。

最后,要明确导师组成员权责。避免职责不清,造成无谓的消耗。对导师组成员参加导师组活动次数、质量等均要有要求,有效的机制可切实保证导师作用的发挥。

5 结论

对工程硕士专业学位研究生采用导师组培养模式,不仅适应国家示范性软件学院实际,还能有效解决目前工程硕士专业学位研究生培养中存在的诸多问题,对改进专业学位研究生培养质量、增进师生创新能力、实现学院师资价值最大化等方面都起到有效的推动作用,很值得各专业学位研究生培养单位尤其是国家示范性软件学院推行。

参考文献

[1]张海英,韩晓燕等.关于我国工程硕士培养现状的调查报告[J].高等工程教育研究,2006(3):15-19

[2]孙阳春,王富荣,李瑨孺.应用型研究生教育对导师制度的挑战与对策[J].黑龙江教育(高教研究与评估),2010(12):9-10

[3]陈立章,刘光连,宋招权.工程硕士师资队伍现状分析及建设探讨[J].学位与研究生教育,2011(9):51-54

[4]王世杰,郑鹏,王洁.以规范的导师组架构提高研究生培养质量[J].沈阳工业大学学报(社会科学版),2009(10):373-376

[5]靳遵龙,陈晓堂.本科生导师组制教学改革初探[J].中国电力教育,2010(13)39-40

环化学院硕士培养方案 篇3

关键词： 跨学院；联合培养；油气储运；硕士研究生

1 引言

研究生教育是我国教育结构中最高层次的教育，肩负着为国家现代化建设培养高质量创造性人才的重任。联合培养是近年来国家教育部大力倡导的研究生培养模式，虽然培养方案和管理体制尚有待改革，合作机制仍需完善，但培养模式能够在很大程度上加强各培养单位之间的交流，充分利用优质教学、实验资源，有效提高培养质量、降低培养成本，因此，已逐渐被广大高校和科研单位所认可。

2 跨学院联合培养油气储运硕士研究生的主要研究内容

为了加强东北石油大学油气储运硕士研究生综合素质和实践能力、创新能力的培养，全面提高培养质量，东北石油大学石油工程学院、土木建筑工程学院、机械科学与工程学院三个学院开展了跨学院联合培养油气储运硕士研究生培养模式的改革与实践。跨学院联合培养在多个不同学科背景下，可以达到多学科交叉渗透、协同攻关，有利于拓宽研究生的知识面，培养研究生的创新能力和综合型的思维能力，丰富研究生的科研选题，具有独特的培养优势。跨学院联合培养油气储运硕士研究生的主要研究内容包括：

（1）确定研究方向，突显培养特色

以把握油气储运学科内涵为核心，寻找与工程热物理、机械工程学科的知识交叉点和问题突破口，凝炼突出学科特色、体现学科水平，提出跨院联合培养研究方向。同时，遵循学科发展规律，建立联系的枢纽，体现学科专业的内在属性，优化学科结构，贯彻培养方针，明确培养目标，坚持培养理念，突显联合培养的特色。

（2）整合培养资源，实现优势互补

不同学院之间容易沟通协调和接洽、资源容易整合和共享，包括教学资源、导师资源、科学研究实验资源、图书资源。围绕培养目标，积极鼓励研究生学习各学院的优质课程、精品课程，通过取长补短、相互促进，使课程设置逐渐向前沿化、多元化的方向发展，最终实现优质教学资源的共享；建立导师组制度，充分发挥各学科带头人优势，联合培养研究生的各院之间通过导师之间的相互交流，组成导师组指导研究生；开放重点实验室，既可有效利用各院校现有重点实验室资源，提供良好实验条件，减少仪器设备闲置，又可以加强实验技术交流，充分发挥重点实验室在研究生培养过程中的重要作用；充分利用各院馆藏书量，避免重复购置资料造成无谓的浪费，可以跨院查阅文献，真正实现图书资源共享。

（3）配套管理措施，保证培养质量

加强过程管理， 在学位课程学习阶段，主要提高基本理论学习和基本技能训练两个方面。使研究生掌握各学科基本理论，了解最新研究成果，巩固知识，开阔视野， 采用灵活多样的考核办法，为今后课题研究奠定基础；课题研究阶段，着重针对提升选题、开题、中期考核、课题研究过程、论文质量、论文評议、论文答辩等研究生培养过程制定相应的质量标准和评价办法，进行严格考核，从环节上保证了培养质量。

（4）制定相应规章制度，构建联合培养机制

针对选择性招收的联合培养研究生，制定学科交叉的联合培养计划，营造有利于联合培养的教学条件和氛围。同时开展学科交叉科研课题的研究，这有利于提高基于学科交叉研究的整体科学能力，加速基于学科交叉创新科研成果的实际应用。构建联合培养研究生的评价体系，建立研究生教育宏观调控机制，有助于管理部门及时发现问题，采取措施，保证和提高研究生培养质量；同时有助于研究生本人发现存在的问题，不断地提高自身的全面素质。以研究生联合培养的全过程为主线，根据教学要求和培养其创新能力的目的，探讨联合培养研究生的评估细则，确定评估项目和具体评估指标及其主要参考依据，逐项评估其在学习各不同阶段的能力，建立一个评价研究生能力的操作平台和便于评估的科学体系，最终达到以评促建，以评促管，评、建、管有机结合的评估体系。

3 跨学院联合培养油气储运硕士研究生需解决的关键问题及对策

（1）资源整合问题

由于各培养单位之间的相互独立，联合培养工作不论是在观念上，还是在操作管理上都还存在着一定的困难，因此，在某种程度上限制了培养单位之间的合作交流。另外，由于受到教学体制和科研环境的影响，学校科研环境还需完善，实验室的硬件设施和软件设施还不健全，没有很好的讨论环境，实验设备、实验仪器及相关的设备服务也需丰富。这就需要各院之间、各导师之间、导师与学生之间及时加强沟通，共同解决面对的问题。

（2）创新性管理模式

跨院联合培养研究生是研究生教育改革和创新的重要尝试，仍处于摸索阶段，还没有一套切实可行的管理工作流程， 在实施过程中给工作的开展带来一系列问题，例如研究生的日常学习生活安排、课题选择、毕业答辩等环节、各院的行政管理、课题的经费筹措、专项资金保障、合作协调、奖励惩罚、学术交流、监督评价、考核、成果归属认定及知识产权保护等机制。必须建立一套切实可行的管理模式， 保障跨院联合培养的顺利推进。

4 结论

通过对石油工程学院、土木工程学院和机械工程学院，以及油气储运工程学科硕士研究生情况调研（包括与学生座谈，相关指导教师研讨等），探索跨院培养硕士研究生的可行性；通过调研与研讨，确定联合培养硕士研究生的选择原则，包括学生的原专业、学生的发展意向、动手能力等，确定联合培养硕士研究生的选择原则；确定联合培养硕士研究生的指导教师队伍；制定联合培养机制与管理机制；构建和谐的工作环境等，从整体上保证了跨学院联合培养油气储运硕士研究生的培养质量。

参考文献

[1] 刘润进，原永兵.学科交叉联合培养研究生的方法与实践[J].高等农业教育，2011，5（5）：68-70.

[2] 陈力.地质工程专业产学研联合培养研究生的机制研究[J].人力资源，2012，（5）：81 -82.

[3] 赵映儿，赵杰煜，叶善文，等.浅析联合培养研究生模式在我院的实践[J]. 科技信息，2007， （21）：51.

环化学院硕士培养方案 篇4

华北煤炭医学院是全国唯一开办卫生事业管理专业 (医事文秘方向) 本科、硕士研究生教育的院校, 具有多年的硕士研究生教育和举办硕士研究生课程研修班的经验。现招收2010年社会医学与卫生事业管理专业 (医事文秘方向) 硕士研究生课程研修班。要求如下: (1) 招收对象及条件:具有大学本科学历及学士学位 (毕业及获得学位两年以上) 从事与医药卫生工作有关的文书、秘书及管理人员等。 (2) 培训时间及地点:学期一年 (2010年6月-2011年6月) , 地点为华北煤炭医学院 (河北唐山) 。 (3) 培训形式及所学课程:学员免试入学, 采用自学与集中授课相结合的培训形式。主要课程有管理学基础、英语、卫生事业管理、秘书专题、公文管理与写作等10余门。 (4) 学员待遇:修完全部课程且成绩合格者发给经河北省学位办备案的《硕士研究生课程研修班结业证书》;符合国务院学位委员会有关规定 (三年内学位英语考试及卫生管理综合考试合格) , 在导师的指导下完成毕业论文后, 可申请办理硕士学位有关事宜。 (5) 报名截止日期2010年5月15日。具体事宜可与华北煤炭医学院医事文秘学科李萍老师联系, 电话:0315-2833941, 13731553626。通讯地址:河北省唐山市建设南路57号。邮编:063000。Email:rubysin@126.com。

环化学院硕士培养方案 篇5

腺苷酸环化酶 (adenylyl cyclase, AC) 作为第二信使c AMP (3'-5'-cyclic adenosine monophosphate) 信号通路的重要组分, 催化ATP生成c AMP并释放出焦磷酸, 参与多种细胞生物活动, 在细胞增殖、分化以及发育过程中发挥重要作用[1]。现已发现10种不同AC亚型, 即AC1-AC10, 其中AC1-AC9为膜结合蛋白, AC10为胞内可溶性蛋白[2]。

骨髓间充质干细胞 (bone marrow stromal cells, BMSCs) , 也称骨髓基质来源干细胞, 是存在于骨髓中除造血干细胞以外另一类具有多向分化潜能的干细胞, 参与骨造血微环境构成[3]。在一定诱导条件下, 这类细胞可定向分化为多种造血以外的组织, 特别是中胚层和神经外胚层来源的组织细胞, 例如成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞、腱细胞、肌肉细胞 (例, 心肌细胞[4,5]、骨骼肌细胞[6]) 、神经细胞[7,8]等, 进而参与骨量调节[9]等机体的生长与损伤的修复过程。由于BMSCs具有贴壁生长的特性, 易在体外分离和增殖, 并易于外源基因的转入和表达, 因此, 被认为是一种理想的细胞治疗工具和基因治疗的靶细胞, 在理论和应用上具有重要意义[10]。

c AMP信号通路在哺乳动物BMSCs的成骨/成脂细胞分化过程中具有重要作用。在不同物种之间, 特别是人类间充质干细胞 (human marrow stromal cells, h MSCs) 与啮齿类动物BMSCs之间, c AMP信号通路在向成骨细胞/脂肪细胞分化过程中的调控作用相似[11—15]。被AC激活剂毛喉素 (forskolin) 处理的小鼠BMSCs, c AMP表达上调, 成骨分化增强[11,13]。研究表明, 毛喉素处理的人类MSCs可加强体内的成骨分化。虽然c AMP信号通路在哺乳动物BMSCs分化过程中具有重要调节作用, 特别是对分化方向决定 (mesenchymal cell fate decision) 具有重要作用[12,14,15], 但具体哪些AC亚型通过c AMP信号通路参与BMSCs分化过程的调节并不明确。

尽管大鼠肺外周动脉平滑肌细胞 (PASMCs) [16]、神经元细胞系 (CAD) [17]、血管平滑肌细胞 (VSMC) [18]、大鼠主动脉平滑肌细胞 (RASMC) [19]等细胞中AC家族成员表达已经确定, 但小鼠BMSCs中AC家族成员表达情况, 尚待确定。

通过优化BMSCs原代培养条件, 对纯化培养的BMSCs进行纯度初步检测后, 提取其总RNA反转录。通过反转录PCR和测序比对, 初步确定有6种AC亚型表达于小鼠BMSCs, 分别为AC2、AC3、AC4、AC6、AC7和AC9。

2 材料与方法

2.1 试剂、材料

所用试剂和抗体为:FITC标记的抗鼠单克隆抗体CD45 (BD Pharmingen公司) ;FITC标记的抗鼠单克隆抗体Sca-1 (BD Pharmingen公司) ;DAPI (ROCHE 236276) ;青/链霉素 (上海杰美基因医药科技有限公司) ;胎牛血清 (FBS, 上海生工有限公司) ;EDTA和胰酶 (上海生工公司) ;DMEM培养基 (高糖) (GIBCO公司产品) ;Trizol (Invitrogen) ;氯仿 (北京化标源科技有限公司) ;异丙醇 (北京化标源科技有限公司) ;95%乙醇 (北京化标源科技有限公司) ;RNA反转录试剂盒 (宝生物工程 (大连) 有限公司) ;以及Fluorgel With Tris Buffer (Electron Microscopy Sciences) 。

2.2 动物

研究所用3月龄雄性C57/BL6小鼠最初引进自美国华盛顿大学 (西雅图分校) Daniel.R.Storm实验室, 饲养并繁殖于河北大学标准动物房。实验动物的所有处理方法和操作程序均符合中华人民共和国科学技术部《关于善待实验动物的指导性意见》, 并得到河北大学动物伦理及关爱委员会的批准。

2.3 小鼠BMSCs原代培养

采用全贴壁法培养小鼠BMSCs。颈椎脱臼法处死雄性C57BL/6小鼠, 在医用酒精中浸泡5 min。收集小鼠四肢的股骨和胫骨, 在预冷PBS中除净股骨和胫骨上附着的软组织, 剪除骨两端骨骺, 暴露骨髓腔。用1 m L注射器吸取DMEM培养液 (高糖) 冲洗骨髓腔。收集骨髓并用1 m L注射器分散, 筛网过滤除去块状肌肉组织和骨渣, 得到单细胞悬液。用自动细胞计数器 (美国Invitrogen公司) 计数有核细胞总数。调整悬液中骨髓单核细胞浓度为2.0×106~4.0×106cell/m L, 在37℃、5%CO2条件下静置培养3~5 d。换液以去除漂浮细胞碎片和血细胞等杂质, 并保持骨髓间充质细胞贴壁。所用高糖DMEM培养液含10%FBS、100 U/m L青霉素、100 U/m L链霉素。每2 d更换细胞培养液1次, 8~10 d细胞生长至覆盖度达到70%~90%后传代培养。

2.4 细胞免疫荧光染色

将原代细胞于5%CO2、37℃细胞培养箱培养, 待细胞覆盖度达到90%~100%, 用PBS洗3次, 加入4%PFA固定细胞30 min, 吸出后再用PBS清洗3次, 每次15 min。用0.2%Triton X-100通透10min, PBS清洗3次。封闭液 (5%BSA+0.05mol/L Glycine) 37℃封闭1 h。加入FITC标记的抗鼠单克隆抗体 (1∶1 000) , 4℃孵育过夜 (湿盒中) 。用DA-PI进行细胞核复染色, Fluorgel With Tris Buffer封片。荧光显微镜 (Olympus BX53, JPN) 下观察, O-lympus Fluoview1000采集照片。

2.5 细胞总RNA提取及RT-PCR

培养细胞至覆盖度>90%, Trizol法提取细胞总RNA, Nano Drop 2000 (Thermo) 检测且琼脂糖凝胶电泳验证合格后, 用Prime ScriptTMRT reagent Kit with g DNA Eraser (Takara) 除去基因组DNA, 并将RNA反转录成c DNA。PCR反应条件及各AC亚型基因正、反向引物序列 (南京金斯瑞生物科技有限公司合成) 见表1。

2.6 不同AC亚型序列比对

将不同AC亚型的RT-PCR产物委托 (北京) 华大基因测序, 所得序列分别与Gene Bank中鼠的各AC亚型序列进行比对分析。

注:不同AC亚型PCR反应中变性温度和时间均采用94℃30 s, 延伸温度和时间均采用72℃40 s。

3 结果

3.1 小鼠BMSCs原代培养条件

与人和大鼠的BMSCs形态不同, 小鼠BMSCs体形小, 最初几代形态多样[20]。原代培养在接种72 h后可见贴壁细胞, 形态为小圆形、多角形、梭形和扁平形。通过调节单细胞悬液中骨髓单核细胞浓度以及贴壁时间, 使用含10%FBS的高糖DMEM培养基 (100 U/m L青霉素、100 U/m L链霉素) 对细胞进行传代。发现当单细胞悬液中骨髓单核细胞浓度为4.0×106cell/m L, 贴壁时间为4 d时, 传代2次, 细胞生长状态较好 (图1) 。

(BMSCs) 生长状态。调整单细胞悬液中骨髓单核细胞浓度为4.0×106cell/m L, 细胞完全静置贴壁时间分别为3 d (图A、图B) 、4 d (图C、图D) 和5 d (图E、图F) , 首次换液时细胞生长状态如图A (3 d) 、图C (4 d) 和图E (5 d) 。传代培养后, 贴壁4 d的细胞 (图D) 生长速度较快, 且生长状态较均一。标尺长度:20μm adherented for different time.Through regulateing the concentration of nucleated cells to 4×106, the cells are incubated for 3 days (fig.A, B) , 4 days (fig.C, D) and 5 days (fig.E, F) differently.The growth states of the cells replaced with fresh medium are shown in fig.A (3 d) , fig.C (4 d) and fig.E (5 d) , respectively.After subculturing, the cells adherented for 4 days (fig.D) grow faster than the cells adherented for 3 days (fig.B) and are more uniform than the cells adherented for 5 days (fig.F) .Scale bar, 20μm

小鼠BMSCs特异性高表达干细胞抗原Sca-1和特异性低表达造血系抗原CD45[10]。使用小鼠BM-SCs表面特异性表达抗体Sca-1和CD45, 所培养BMSCs细胞能够高表达Sca-1 (图2A) , 特异性低表达CD45 (图2B) 。对特异性高表达抗原Sca-1和特异性低表达造血系抗原CD45的细胞数进行统计分析表明, 特异性表达抗原Sca-1的细胞占所统计细胞总数的100% (总细胞数n=1 656) , 特异性表达抗原CD45细胞占所统计细胞总数的4.31% (总细胞数n=1 687, 特异性表达抗原CD45细胞数n=73) 。统计数据表明所培养的细胞纯度达到90%以上, 符合实验要求。

3.2 小鼠BMSCs中AC表达种类

收集3月龄雄性小鼠BMSCs细胞并提取总RNA, RNA进行反转录后, 用表1中的引物和反转录PCR条件, 分析各AC亚型基因的表达。结果发现, 小鼠骨髓间充质干细胞中共有6种AC亚型表达, 分别是AC2, AC3, AC4, AC6, AC7和AC9 (图3) 。对PCR产物进行测序, AC2, AC3, AC4, AC6, AC7和AC9的RT-PCR产物长度分别为311 bp, 526bp, 387 bp, 494 bp, 355 bp和423 bp, 序列比对结果与目的基因一致。

小鼠BMSCs细胞特异性高表达干细胞Sca-1 (图A) 和特异性低表达造血系抗原CD45 (图B) 。标尺长度:10μmThe results show that the measured cells express stem cell antigen Sca-1 highly (fig.A) and specific hematopoietic antigen CD45 lowly (fig.B) .Scale bar:10μm

4 讨论

骨髓细胞中含有造血和骨髓间充质两种干细胞。目前用于分离BMSCs的方法主要有全骨髓贴壁法、密度梯度离心法、流式分选法、免疫磁珠分离法[20]以及骨片培养法[10,21]。相对骨髓中其他种类细胞, 骨髓间充质干细胞的数量极少, 约每10万个有核细胞中才含有一个BMSCs[20]。相对于密度梯度离心法、流式分选法和免疫磁珠分离法, 全骨髓贴壁法可以通过换液及传代, 去除造血系细胞, 从而得到符合纯度要求的足量原代细胞[20,22]。

首次换液时间及原代贴壁培养细胞浓度对骨髓间充质干细胞的生长影响很大。从细胞生长情况和纯度综合考虑, 单细胞悬液中骨髓单核细胞浓度为4.0×106cell/m L, 贴壁时间为4 d时, 传代2次, 获得的细胞生长状态较好。

BMSCs主要通过对Cbfa1/Runx2的调节[24]分化为成骨细胞, 而该调节又受第二信使c AMP信号通路调控[12, 24—26]。有文献报道, AC基因家族的AC2和AC5基因在细胞的生长、增殖过程中有重要的调节作用[16]。当AC5基因敲除后, 骨量上调[27], 推断AC5可能参与骨量调节。但在本研究结果中却未能检测到AC5的表达。而抑制人类h MSCs成骨分化的AC8[28]在研究中亦未发现表达。作为感知胞外机械信号和化学信号刺激与嗅觉信号成分的AC3[29]、在小鼠肾上腺皮质细胞中表达并受特异性蛋白-1 (specificity protein-1, SP1) 和类固醇生成因子-1 (steroidogenic factor 1, SF-1) 调节的AC4[30]、主要在大鼠肾上腺皮质表达且在受到维持肾上腺正常形态和功能的重要激素促肾上腺皮质激素 (ACTH) 刺激后表达增加的AC9[31]在BMSCs中均有一定的表达。可能物种不同, 或者AC亚型表达具有组织特异性, 致使不同实验结果有所差异。

总之, 本研究发现, 体外培养的小鼠原代骨髓间充质干细胞中通过c AMP信号通路参与调控BMSCs分化的AC亚型有6种, 分别是AC2, AC3, AC4, AC6, AC7和AC9。但这6种AC亚型参与调节BM-SCs分化的具体分子机制有待深入研究。

摘要：骨髓间充质干细胞 (bone marrow stromal cells, BMSCs) 是骨髓中具有多向分化潜能的干细胞, 腺苷酸环化酶 (adenylyl cyclase, AC) 作为第二信使c AMP信号通路的重要组分, 在BMSCs的成骨/成脂分化中具有重要作用, 但BMSCs中AC亚型表达种类, 尚待明了。通过对小鼠BMSCs原代培养条件优化, 获得最适培养条件下生长良好的细胞, 提取其总RNA并反转录;采用RT-PCR和序列比对分析, 鉴定了小鼠BMSCs中AC亚型的表达种类。研究发现:1小鼠BMSCs原代培养:以4.0×106cell/m L的骨髓单核细胞浓度培养, 并于4 d首次换液, 增殖速度快, 可以达到后续实验要求;2原代小鼠BMSCs中AC亚型表达种类分别为AC2、AC3、AC4、AC6、AC7和AC9。