磷脂酶C

磷脂酶C（精选7篇）

磷脂酶C 篇1

植物与病原菌互作过程中,众多细胞信号转导途径参与其中,现已明确G蛋白( Guanine nucleotide binding protein,鸟嘌呤核苷酸结合蛋白) 信号途径是真核生物中最保守的信号传导机制之一。磷酸肌醇特异磷脂酶C( PI-PLC) 、腺苷酸环化酶( AC) 、G蛋白信号调控因子( RGS) 作为G #-GTP的效应分子[1,2],将信号进一步向下游传递,从而发挥着重要作用[3]。基于此,学术界关于真菌RGS的研究产生了较多成果[4],而PI-PLC仅在稻瘟菌[5]、玉米大斑病菌[6]、新生隐球菌[7]、黄色粘球菌[8]以及粗糙脉孢菌[9]等病菌中有一定研究。

自20 世纪70 年代以来,由禾谷炭疽菌( Colletotrichum graminicola ( Cesati) Wilson) 引起的玉米炭疽病在美国、印度等国家就非常普遍[10—12],该菌还可以侵染小麦、高粱等禾本科作物引起炭疽病,给各国农业生产造成巨大的经济损失。随着该菌全基因组序列的公布[13],学术界对该菌G蛋白信号调控因子[14]以及MAPK途径的相关因子[15]进行了一些研究,然而,对于该菌中存在的PI-PLC情况尚不清楚。

利用S. cerevisiae S288c中已经报道的PI-PLC氨基酸序列,通过在炭疽菌属蛋白质数据库中进行Blastp比对分析,以及通过关键词搜索,获得与酿酒酵母PI-PLC同源的C. graminicola序列,并通过保守结构域分析、疏水性分析、二级结构预测、信号肽分析以及跨膜区结构分析、亚细胞定位等生物信息学分析,以期明确该菌中所存在的PI-PLC数量、理化性质、结构特征以及定位情况,同时,基于上述发现的PLCS氨基酸序列,在美国国家生物信息中心在线进行同源序列搜索,通过遗传关系分析,以期为进一步开展同属于炭疽菌属但其基因组序列尚未公布的其他炭疽菌的研究提供重要的理论指导。

1 材料与方法

1. 1 材料

根据S. cerevisiae S288c中含有的1 个PI-PLC氨基酸序列,利用炭疽菌属蛋白质数据库在线Blastp比对[16],所有参数均选择默认值,获得C.graminicola中所含有的典型PI-PLC,同时,通过输入“phosphatidylinositol-specific Phospholipase”、“Phospholipase C”、“PLC”关键词,在上述数据库中进行检索PLC; 另外,利用NCBI明确该菌中PI-PLC蛋白质登录号信息( 表1) 。

1. 2 方法

1. 2. 1 保守结构域预测

利用SMART网站[17]在线分析PI-PLC所具有的保守结构域特征。

1. 2. 2 蛋白质疏水性预测

利用Protscale程序[18]对PI-PLC进行疏水性测定。

1. 2. 3 蛋白质转运肽及信号肽预测

对蛋白质转运肽的预测利用Target P 1. 1 Server在线分析实现[19],信号肽的预测则是利用Signal P3. 0 Server[20]在线分析实现。

1. 2. 4 蛋白质二级结构及跨膜区结构预测

对蛋白质二级结构预测采用PHD[21]在线分析实现,利用TMHMM Server v. 2. 0[20]实现PI-PLC的跨膜区结构预测。

1. 2. 5 亚细胞定位分析

利用Prot Comp v9. 0 实现PI-PLC进行亚细胞定位分析[22]。

1. 2. 6 系统进化树构建

在NCBI中,以C. graminicola中所含PI-PLC氨基酸序列为基础,在线进行Blastp同源搜索,获得来自于不同物种的同源蛋白质序列。对所获得的同源序列,利用Clustal X[23]进行多重比对分析,随后利用MEGA 5. 2. 2 软件[24]构建系统进化树: 采用邻近法( neighbor-joining) 构建系统发育树,各分支之间的距离计算采用p-distance模型,系统可信度检测采用自举法( bootstrapping) 重复1 000 次进行。

2 结果与分析

2. 1 禾谷炭疽菌7 个PI-PLC均具有典型的保守结构域

基于酿酒酵母典型PI-PLC氨基酸序列,对禾谷炭疽菌蛋白质数据库进行Blastp比对分析,总共获得5 个同源序列,同时,利用3 个关键词进行搜索,总共获得6 个相关序列( 表1) ,其中,发现一个蛋白序列( GLRG _04012. 1) ,可以通过Phospholipase-C、phosphatidylinositol-specific Phospholipase搜索到,而通过“PLC”却未能搜索到,该蛋白通过Blastp也可以比对到; 而另一个蛋白( GLRG_04421. 1) 序列则仅可以通过“PLC”搜索到,其他2 个关键词却不能搜索到,通过Blastp也未能比对上,有待于进一步进行核实( 表1) ; 随后,对上述获得的序列进行重复去除,获得8 条蛋白序列,再利用SMART在线分析,结果显示,仅有7 条序列具有典型的PLCXc保守域结构,同时,还具有诸如PLCYc、C2 等保守结构域( 图1) 。

对GLRG_04421. 1 进行深入分析,结果显示,该蛋白属于肌醇鞘磷脂磷脂酶C基因家族,并不是G蛋白下游的效应因子,同时,基于SMART分析,该蛋白并不含有磷脂酶所含有的保守PLCXc或者PLCYc结构域,因此将该蛋白进行排除。根据上述分析,共获得7 条蛋白序列,依据其氨基酸大小进行排序,分别将其命名为Cg PLC1、Cg PLC2、Cg PLC3、CgPLC4、Cg PLC5、Cg PLC6、Cg PLC7( 表1) 。

*注:关键词搜索包括了使用“Phosphatidylinositol-specific phospholipase”、“Phospholipase C”、“PLC”。

2. 2 CgPLC1 具有典型的信号肽区域

通过Signal P分析,除Cg PLC1 在N端含有1 个信号肽外,其他PI-PLC均不含有信号肽( 图2) ; 此外,通过TMHMM分析,除Cg PLC1 在N端含有1 个跨膜域结构外,其他PI-PLC均不含有跨膜域结构( 图3) ,鉴于TMHMM未能将信号肽与跨膜结构进行严格区分,因此,Cg PLC1 在N端含有的序列结构是信号肽,而不是由TMHMM、SMART预测的跨膜结构域( 图1) 。

2. 3 禾谷炭疽菌PLC均为亲水性蛋白

通过对7 个PLC进行疏水性分析,结果显示,尽管Cg PLC1 和Cg PLC2 在亲水性最强氨基酸残基上相同,均是E; Cg PLC1、Cg PLC4、Cg PLC6 疏水性最强氨基酸残基上相同,均是L,但是,彼此之间在亲( 疏) 水性最强氨基酸残基及位置方面仍然存在较大的差异( 表2、图4) ,推测在细胞信号转导过程中,诸多磷脂酶C所具有的功能具有一定的差异性。

2. 4 禾谷炭疽菌PLC的二级结构分析

通过对7 个PLC二级结构进行预测分析,结果显示,均含有无规卷曲、#螺旋以及$转角,所占比例不尽相同。具体而言,就所含的无规卷曲比例而言,Cg PLC1 最低,为17% ,Cg PLC7 最高,为44% ,其他PLC所含比例均集中于20% ~ 30% ; 就所含的#螺旋而言,Cg PLC2 最低,为21% ,Cg PLC6 最高,为37% ,其他PLC所含比例则集中于25% ~ 35% 之间; 就$转角而言,Cg PLC3 最低,为13% ,Cg PLC2 最高,为23% ,其他PLC所含比例则集中于10% ~20% 之间( 图5) 。

2. 5 禾谷炭疽菌PLC的转运肽及亚细胞定位分析

通过对PLC进行转运肽分析,结果显示,除CgPLC1 明确定位于分泌途径、Cg PLC2 定位于线粒体外,对其他PLC定位在任何位置( 表3) 。为了更好地明确PLC的亚细胞定位,利用Prot Comp进行分析,结果显示,Cg PLC1 定位于高尔基体、Cg PLC5、6定位于细胞核中,而其他PLC定位于细胞质中( 表4) 。上述定位预测结果说明,禾谷炭疽菌中不同的PLC发挥着不同的功能,其定位情况也不尽相同。

注: 1 ~ 5,数值越大可靠性越差。1 表示其概率为大于0. 8,2 表示其概率在0. 6 ~ 0. 8; 3 表示其概率在0. 4 ~ 0. 6; 4 表示其概率在0. 2 ~0. 4; 5 表示其概率为小于0. 2。

2. 6 禾谷炭疽菌PI-PLC遗传关系分析

通过在NCBI中对PI-PLC进行Blastp比对,获得与禾谷炭疽菌PI-PLC同源序列,对这些序列进行遗传关系分析,结果显示,就物种之间关系而言,该菌中的PI-PLC与希金斯炭疽菌( Colletotrichum higginsianum、Colletotrichum fioriniae) 亲缘关系较近; 就该菌中的PI-PLC之间的关系而言,7 个PI-PLC可以大致聚为3 大类,具体而言,Cg PLC7、Cg PLC4 关系较近,为一类; Cg PLC3、Cg PLC6 与Cg PLC5 关系较近,为一类; Cg PLC1、Cg PLC2 亲缘关系较近,为一类。

3 结论与讨论

随着禾谷炭疽菌全基因组序列的释放,学术界对其致病因子开展了较为深入的研究,一些涉及G蛋白信号转导途径上的重要效应分子得到进一步明确[14]。然而,对于该菌PI-PLC的研究尚未见报道,本研究基于前人研究成果,利用Blastp比对及关键词搜索等方法对炭疽菌属蛋白数据库进行分析,明确该菌中存在7 个典型的PI-PLC,同时,利用生物信息学分析软件对上述蛋白序列进行保守结构域、疏水性、亚细胞定位以及二级结构等分析,初步明确上述蛋白具有典型的PLCXc、PLCYc、C2 等保守域结构域、均为亲水性蛋白等特点。尽管如此,禾谷炭疽菌中7 个PI-PLC彼此之间在亚细胞定位、信号肽、二级结构组成方面上存在一定差异,推测上述蛋白在不同位置发挥不同作用,同时,对上述PI-PLC与其他物种进行遗传关系分析,明确禾谷炭疽菌与C. higginsianum、C. fioriniae亲缘关系较近,这为进一步深入研究其他炭疽菌属真菌PI-PLC打下坚实的理论基础。

摘要：磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C(PI-PLC)作为植物病原菌G蛋白信号转导过程中的重要调节因子,在对植物侵染、定殖、扩展等致病过程中发挥着重要作用。禾谷炭疽菌侵染玉米、小麦等农作物引起炭疽病,给各国农业生产造成了巨大经济损失。基于酿酒酵母典型PI-PLC序列,利用Blastp以及关键词对禾谷炭疽菌蛋白质数据库进行比对、搜索,以及通过SMART保守结构域分析,明确该菌存在7个典型的PI-PLC;同时,通过对上述氨基酸序列进行细胞信号肽、跨膜结构域以及二级结构等生物信息学分析,明确上述PI-PLC在蛋白质二级结构组成、信号肽等方面均具有一定差异,除Cg PLC1具有信号肽外,其他均不含有;7个PI-PLC中4个定位在细胞质中,其他则定位在细胞核、高尔基体上。此外,通过对禾谷炭疽菌中的7个PI-PLC与其他物种中的30个同源序列进行遗传关系比较分析,发现禾谷炭疽菌中的PI-PLC与C.higginsianum、C.fioriniae等炭疽菌属中的病菌具有较高的同源序列,较近的亲缘关系。该研究为深入开展禾谷炭疽菌PI-PLC定位、功能研究打下坚实的理论基础,同时,也为进一步开展其他炭疽菌的研究提供重要的理论指导。

关键词：禾谷炭疽菌,磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C,信号肽,二级结构,炭疽菌属

磷脂酶C 篇2

毛油中的胶溶性物质主要为磷脂类物质, 酶法脱胶的原理就是利用磷脂酶对非水化磷脂进行酶解, 使水化磷脂酶解成不同的脂肪和不同的磷脂[5]。根据研究, 目前有4种磷脂酶 (phospholipase) 可以酶解磷脂酸 (甘油磷脂) , 它们分别为磷脂酶A1 (PL A1) , 磷脂酶A2 (PL A2) 、早期称为PLB是一种溶血性毒素, 磷脂酶C (phospholipase C, 简称PLC, 下同) 和磷脂酶D (PLD) [6]。它们对磷脂酸的酶解作用如图1所示。

由图1可知:PLC是一种水解甘油磷脂C3位点甘油磷酸脂键的脂类水解酶, 水解卵磷酯为二甘油脂和胆碱磷酸酯[7], 它最早是在产气荚膜梭菌α中发现的。目前在微生物及动植物的组织和细胞中均发现了磷脂酶C。本文对蜡样芽孢杆菌深圳株754-1 (Bacillus cereus ShenZhen Strain.754-1) [8]发酵产生磷脂酶C进行了脱胶研究, 旨在为后续磷脂酶C用于植物油脱胶提供试验参数[9]。

R1、R2代表脂肪酸:前者多为饱和脂肪酸, 后者多为不饱和脂肪酸

1 试验材料与方法

1.1 原料与试剂

由本试验室提供的蜡样芽孢杆菌深圳株754-1 (Bacillus cereus ShenZhen Strain.754-1) ;原菜籽油 (初始含磷量189mg/kg) , 随县天星粮油有限公司提供;培养基和发酵培养基;无菌水、生理盐水和鸡蛋清等。所用其他试剂均为市售分析纯, p-nitrophenylphorylchoine, NPPC为美国sigma公司提供。

1.2 主要仪器

SPX-150C恒温恒湿箱、SW-CJ-1F单人双面净化工作台、HYQ-150S全温摇床、LDZX-75KB立式蒸汽灭菌器、XSP-BM-2CA生物显微镜、TDL-5A台式低速离心机、DF-1型数显集热式磁力搅拌器、AUY120型电子天平、GZX-9070 MBE数显鼓风干燥箱和分光光度仪。

1.3 试验方法

1.3.1 菌种的保藏

蜡样芽孢杆菌深圳株754-1的斜面保藏, 如图2所示。

1.3.2 菌种的富集培养

将保藏的菌接种于固体培养基, 于32℃恒温培养箱中静止培养3d。2d后, 平板照片如图3所示。

1.3.3 种子及发酵培养

1.3.3. 1 种子培养

在平板培养基上挑取一环, 接种于一级种子培养基, 置于控温摇床上, 32℃、180r/min培养10~12h。

1.3.3. 2 发酵培养

将种子液按10%的接种量接种到发酵培养液中32℃、180r/min条件下震荡培养20h。

1.3.4 离心分离

将发酵液收集, 然后进行离心分离10min, 转速为4 800r/min, 上层清液为发酵液, 含有所需的磷脂酶C, 底物为菌泥。

1.3.5 硫酸铵沉淀

收集上清液, 加入40%上清液的硫酸铵, 充分溶解混合, 此时可见上清液浑浊, 静置, 待上清液澄清后, 收集底部沉淀, 即是有PLC活性的部分[8]。

1.3.6 离心收集磷脂酶C

收集得到的沉淀含有大量的水分, 需要进一步离心, 于高速离心机上以11 000r/min条件下离心10min, 收集沉淀, 即为粗制磷脂酶C。

1.4 卵黄平板初步测磷脂酶C的酶活

1.4.1 原理

利用磷脂酶C可水解卵黄中的卵磷脂从而在含有卵黄的琼脂平板上产生乳白色晕圈的特点。根据酶样品在卵黄培养平板上所产生的乳白色晕圈的大小来判断酶活的高低。该法并不能直接检测出酶活力的实际酶活单位数, 故只能用于菌种产磷脂酶C酶活高低及酶样品磷脂酶C活力高低的定性检测。由于操作方便, 原料丰富, 在早期磷脂酶C菌种的筛选及磷脂酶C的纯化制备中得到广泛的应用。缺点是反应时间过长。此外, 乳白色晕圈的大小受卵黄平板的厚度、琼脂的含量、反应温度及时间的影响, 必须确保这些条件的一致, 测定结果才具有良好的可比性[10]。

1.4.2 材料

基础培养基、鸡蛋黄和生理盐水。

1.4.3 平板制备

点燃酒精灯, 镊子用酒精棉球擦拭然后灼烧灭菌。酒精棉球擦拭鸡蛋平滑处, 用灭过菌的镊子打破蛋壳, 放出鸡蛋清, 收集蛋黄, 然后加入等量的无菌生理盐水。然后倒入事先灭过菌的液体培养基中充分混合, 摇匀倒平板。

1.4.4 方法

称取磷脂酶C 0.5g, 定容至4mL, 充分混匀, 然后分别用移液枪吸取1 000μL至3个灭过菌的试管中, 分别编号为1、2和3, 然后分别向1中加入1 000μL无菌水, 2中加入2 000μL无菌水, 3中加入3 000μL无菌水, 摇匀。分别取1、2和3中溶液200μL, 定容至4mL, 平板测酶活。步骤:分别吸取1、2和3中溶液200μL至事先在平板中放入的无菌小钢圈中, 每2个小钢圈一种浓度, 做上标记, 中间的小钢圈注入200μL的经高速离心后的上清液。注意注入后, 不要立即挪动平板, 否则液体可能自底部流出, 待静置一段时间后, 然后放入32℃的恒温箱中。第2天观察结果, 结果如图4所示。磷脂酶C的活性还是很大的, 晕圈的大小反应酶活的大小。随着浓度越来越高, 晕圈也越来越大。直径越大, 表明酶活也越高。

1.5 NPPC法测定磷脂酶C的酶活

1.5.1 原理

NPPC法是采用磷脂酸胆碱的结构类似物一对硝基苯磷酸胆碱 (p-nitrophenylphorylchoine, NPPC) , 作为磷脂酶C反应的底物, 利用磷脂酶C水解NPPC产生对硝基苯酚, 对硝基苯酚是一种黄色物质, 在410nm处有最大吸收。利用分光光度计测定反应前后吸光度的变化, 可测定出酶反应所产生的对硝基苯酚的量, 故能用于对磷脂酶C样品酶活力高低的定量检测。

1.5.2 方法

按照陈涛[8]等人的方法对制备的PLC制剂用酶法检测其活性。

酶反应体系:0.25mol/L Tris-HCl (pH值7.2) , 0.001mol/L ZnCl2, 60%山梨醇 (w/v) , 10nmol/L NPPC。

取2mL酶反应体系溶液, 向其中添加100μL磷脂酶C样品, 37℃保温反应30min。利用分光光度法测定酶反应液在410nm处的吸光度A, 得到PLC酶解NPPC产生对硝基苯酚的量, 从而定量PLC的酶活大小。

酶活计算公式:

酶活力 (U/mL) =1.3636×103×A/t

式中:A为吸光度;t为反应时间。

酶活单位定义:在pH值7.2, 温度为37℃的条件下, 每分钟水解NPPC产生1nmol对硝基苯酚所需的酶量为1个酶活单位 (U) 。

通过NPPC法测定的由蜡样芽孢杆菌深圳株754-1制备的PLC的酶活为82 215U;比酶活为337U/mg。

1.6 磷脂酶C用于菜籽油脱胶

1.6.1 磷含量的测定

磷含量的测定采用GB 5537-2008[11]。

1.6.2 磷脂酶C脱胶试验方法[12]

称取200g菜籽油 (含磷量189mg/kg) , 预热到75℃, 加入50%的柠檬酸0.25mL, 180r/min搅拌40min, 冷却到酶解适合温度, 用5%的NaOH溶液调节pH值, 再加入1mL去离子水和稀释的磷脂酶C, 180r/min搅拌反应一定时间, 80℃水浴灭酶10min, 趁热3 500r/min离心20min, 根据GB 5537-2008测定上清液磷含量。

1.6.3 磷脂酶C脱胶正交试验设计

磷脂酶C脱胶正交试验设计因素水平见表1。

2 结果与讨论

2.1 磷标准曲线绘制

准称0.4387g磷酸二氢钾, 定容至1 000mL, 含磷0.1mg/mL。稀释至0.1mg/mL作为标准工作液, 依次在6个试管中配制成含磷0.01、0.02、0.04、0.06和0.08mg的溶液, 分别再加入0.015%硫酸联氨溶液8mL和2.5%钼酸钠溶液, 沸水浴10min, 取出稀释至刻度, 在650nm处, 测定吸光度。标准曲线如图5所示。

通过比色法绘制磷标准曲线, 横坐标为磷含量, 纵坐标为吸光度值。标准曲线方程为y=5.3347x-0.0014, R2=0.9994, 线性关系良好。

2.2 加酶量对磷残留量的影响

称取200g油样, 经预热后, 用柠檬酸和NaOH将pH值调节至4, 加入1mL去离子水, 分别添加占样品用量0.01%、0.02%、0.03%、0.04%和0.05%的磷脂酶C, 40℃不断搅拌 (180r/min) 酶解6h, 灭酶离心, 取上清液测定含磷量, 结果如图6所示。

由图6可知:随着加酶量的增加, 精制油中的磷脂含量降低明显, 加酶量在0.01%~0.03%, 磷含量急剧下降, 在0.04%以后, 脱胶效果没有特别大的改善, 综合考虑到酶的成本和脱胶效果, 选定0.04%为脱胶加酶量, 残留磷含量为10.3mg/kg。

2.3 酶解温度对磷残留量的影响

称取200g油样, 经预热后, 用柠檬酸和NaOH将pH值调节至4, 加入1mL去离子水, 添加0.04%的磷脂酶C, 在50、55、60、65和70℃条件下不断搅拌 (180r/min) 酶解200min, 灭酶离心, 取上清液测定含磷量, 结果如图7所示。

由图7可知:在低于60℃时, 随着温度的增加, 脱胶效果越来越好, 在60℃时, 酶解200min, 磷残留量为4.6mg/kg;但随着温度继续升高, 酶活力急剧下降, 这是因为在温度过高时, 磷脂酶C发生不可逆变性, 而导致失活, 与高林[10]提出的纯化的磷脂酶C分子量为75 100Da, 对热敏感一致。因此选定60℃为酶解最适温度。

2.4 不同pH值对酶解效果的影响

称取200g油样, 经预热后, 用柠檬酸和Na OH将pH值分别调节至6.0、6.5、7.0、7.5和8.0, 加入1mL去离子水, 添加0.04%的磷脂酶C, 在60℃条件下不断搅拌 (180r/min) 酶解6h, 灭酶离心, 取上清液测定含磷量, 结果如图8所示。

由图8可知:pH值过高或过低, 都会影响磷脂酶C的活性, 这可能是因为磷脂酶C在过酸或过碱的条件下, 容易失活导致的。最优pH值为7.0, 在此条件下, 酶解200min, 磷残留量仅有5.3mg/kg。

2.5 不同酶解时间对脱胶效果的影响

称取200g油样, 经预热后, 用柠檬酸和Na OH将pH值分别调节至7, 加入1mL去离子水, 添加0.04%的磷脂酶C, 在60℃条件下不断搅拌 (180r/min) 酶解90min, 120、150、180、210和240min, 灭酶离心, 取上清液测定含磷量, 结果如图9所示。

由图9可知:随着时间的延长, 磷残留量不断降低。酶解240min时, 由原料中磷含量189mg/kg降至6mg/kg, 脱除率达到97.6%, 完全达到油脂质量要求。在酶解到180min以后, 磷残留量变化不是很大, 综合考虑酶解时间越短, 工业生产周期越短, 生产成本越低, 因此确定酶解时间为180~200min。

2.6 正交试验结果与分析

综合考虑各因素对脱胶效果的影响, 对加酶量、温度、pH值和时间4个因素进行正交试验设计, 以磷残留量为考察指标, 选用正交表L9 (34) 进行试验。结果见表2。

由表2可知:在设定的试验条件范围内, 影响磷残留量的因素顺序为:B>C>D>A, 即酶解温度>pH值>酶解时间>加酶量;最佳工艺条件为A3B2C2D3, 即加酶量为0.05%、酶解温度60℃、pH值7和酶解时间220min。在该条件下进行验证试验, 得到脱胶油脂的平均磷残留量为4.3mg/kg。

3 结论

利用蜡样芽孢杆菌深圳株754-1在营养丰富的培养基中生长, 经发酵可以制取高酶活的磷脂酶C制剂。本试验得出当发酵液培养时间为20h左右, 培养温度在32℃, 接种量在10%时, 制取的磷脂酶C的活性较高。在制备磷脂酶C的基础上, 对制得的磷脂酶C进行脱胶试验[12], 进行单因素试验及正交优化试验, 得到最优酶解条件为加酶量0.05%、酶解温度60℃、pH值7和酶解时间220min, 经过磷脂酶C脱胶后的油脂, 含磷量为4.3mg/kg。本文的研究为以后的磷脂酶C用于菜籽油脱胶打下良好的理论基础。

摘要：利用微生物发酵法制备磷脂酶C, 用卵黄琼脂法和NPPC法对PLC的活性进行检测, 测得PLC粗酶酶活为337U/mg。PLC用于菜籽油脱胶的试验, 其结果:加酶量为0.05%、温度60℃、pH值7和时间220min, 脱胶油脂的最低磷残留量为4.3mg/kg。

关键词：磷脂酶C,活性,脱胶

参考文献

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[11]GB/T5537-2008粮油检验磷脂含量的测定[S].

磷脂酶C 篇3

1 材料和方法

1.1 主要试剂

RNA提取试剂盒Trizol、表达载体pc DNA3.1购于美国Invitrogen公司;逆转录酶购于美国Fermentas公司;PCR试剂盒购于北京天根生化科技有限公司;克隆载体p GEM-Teasy购自美国Promega公司;3'-Full RACE Kit、5'-Full RACE Kit购自日本Ta Ka Ra公司;克隆测序、引物均由上海生物工程公司合成;小鼠分泌胰岛素细胞株MIN6由解放军总医院邢军老师馈赠;高糖DMEM、血清购自美国GIBCO公司;质粒提取试剂盒购自德国QIAGEN公司;转染试剂Fu GENE HD Transfection Reagent购于Roche公司;抗体PLA1A购自英国Abcam公司。

1.2 RNA的提取及逆转录

取在液氮中保存的人肾脏组织,研磨后按Trizol操作说明书提取总RNA,DNase 1处理以酶解可能残余的基因组DNA,将获得的总RNA溶于DEPC水中,在1%的琼脂糖凝胶上电泳检测RNA的质量,紫外分光光度仪下测量总RNA含量及纯度。以提取的总RNA 5μg为模板,Oligo(d T)18为引物进行逆转录为c DNA。

1.3 PA-PLA1基因片段扩增

参照文献[2]设计引物,以Oligo(d T)18为引物逆转录的c DNA为模板,扩增部分PA-PLA1基因片段,所用引物序列为P1:GCCTGATGAACGATGGAT GA,P2:TCCAACTCCAATGCAGAATC,扩增长度为770 bp。扩增条件:94℃预变性5 min,94℃变性30s,58℃退火30 s,72℃延伸50 s,循环30次后,72℃保温10 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳,切胶回收纯化。之后将所得PCR片段克隆入p GEM-Teasy载体中,并测序。

1.4 3'-RACE扩增和5'-RACE扩增

根据已知序列设计3'-Rapid Amplification of c DNA Ends(RACE)特异引物OP3:ACGGCTGAAGG AAATAGAAGAAC,IP3:GAAAGCATCATCTATGACA C,以Oligo(d T)18为引物逆转录的c DNA为模板,以OP3为外引物,以IP3为内引物c DNA3'-末端的扩增,操作步骤按试剂盒说明书进行。之后将所得PCR片段克隆入p GEM-Teasy载体中,并测序。根据已知序列设计5'-RACE特异性引物OP5:GACGGCTGA AGGAAATAG,IP5:GAGCTATGAAGAACGACATC,以Oligo(d T)18为引物逆转录的c DNA为模板,以OP5为外引物,以IP5为内引物c DNA5'-末端的扩增,操作步骤按试剂盒说明书进行。之后将所得PCR片段克隆入p GEM-Teasy载体中,并测序。

1.5 序列拼接与分析

采用Vector NTI 8.0拼接序列并进行序列对比,DNASTAR构建系统树,登录NCBI用人类基因组数据库做BLAST分析,用ORF(open reading frame)finder预测PA-PLA1的编码框。

1.6 真核表达载体pc DNA3.1-PA-PLA1的构建及检测

设计引物P3:GGATCCGCCACCATGAACTATC C,P4:GAATTCTCAGAGTGAACCTAGG;扩增小鼠PA-PLA1基因开放阅读框架,酶切后装入pc DNA3.1载体,测序结果提示载体构建正确。以标准方案培养MIN6细胞,在转染前1天严格细胞计数2×105个细胞接种于6孔细胞培养板中,细胞达到60%融合时,以Fu GENE HD试剂按2μg/孔转染,转染36h后,裂解细胞提取总蛋白,Western blotting检测PA-PLA1表达量。

2 结果

2.1 PA-PLA1基因片段、3'-RACE及5'-RACE扩增结果

采用所设计的引物扩增PA-PLA1基因片段,以1%琼脂糖电泳检测结果(见图1A),扩增大小与预期相符,阴性对照无条带。克隆测序后获PA-PLA1基因部分序列。分别进行5'-RACE及3'-RACE反应后,琼脂糖电泳结果见图1B和1C,分别得到1500 bp左右及1 400 bp左右c DNA片段,阴性对照无条带。分别克隆测序后获相应序列。

2.2 PA-PLA1基因编码序列克隆

PA-PLA1基因m RNA全长为2 923 bp,ORF finder预测该基因含有一完整阅读框,起始密码子ATG位于第125~127 bp,终止密码子TGA位于第2 360~2 362 bp,编码区长2 238 bp,编码1个由745个氨基酸残基组成的蛋白多肽,分子量为83141 Da,等电点为5.64。本研究克隆的全长序列上传Gen Bank后,登录号为DQ315474。

2.3 人PA-PLA1 m RNA及氨基酸序列分析

利用NIT8.0比对人与牛的PA-PLA1 m RNA序列,其中m RNA序列全长一致性为49%,开放阅读框架一致性为77.7%。对比Gen Bank上牛、人和小鼠PA-PLA1氨基酸序列,同源性达73.2%,三者均具有DDHD结构区域,且DDHD结构域具有高度的一致性达90.3%。以Mge Align分析本克隆的氨基酸序列(DQ315474)与人脂蛋白脂肪酶、胰脂肪酶、肝脂肪酶、内皮脂肪酶、亲磷脂酰丝氨酸磷脂酶、KI AA0725p及p125蛋白的系统发生关系,结果见图2。PA-PLA1与KIAA0725p及p125蛋白具有更高的相似性。脂肪酶家族酶活性中心中具有GXSXG保守序列。对比人PA-PLA1(DQ315474)、牛PA-PLA1、KIAA0725p及p125蛋白发现,DQ315474与牛PA-PLA1相似,其活性中心保守序列为Ser408-His-Ser410-Leu-Gly412(SX-S-XG),而KIAA0725p及p125蛋白与脂肪酶家族的大多数成员一致,为GX-S-XG(见图3)。以NCOILS version 1.0,选择非加权的MTIDK矩阵分析牛PA-PLA1、本研究中的人PA-PLA1氨基酸序列、KIAA0725p及p125蛋白时发现,除KIAA0725p蛋白外,牛PA-PLA1、人PA-PLA1及p125蛋白均具卷曲螺旋区域,人PA-PLA1氨基酸序列中Glu448-Ala475区可形成卷曲螺旋区域,其28-residue window显示score为0.749。牛PA-PLA1的Glu578-Ala605区形成卷曲螺旋区域,p125蛋白的Gln883-Glu925区形成卷曲螺旋区域,三者卷曲螺旋区域氨基酸对比,显示人与牛的卷曲螺旋区域氨基酸高度相似,而与p125蛋白有较大差异。

1:空白对照;2~3:pc DNA3.1-PA-PLA1载体

2.4 转染pc DNA3.1-PA-PLA1后细胞内PA-PLA1表达的Western blotting检测结果

Western blotting检测结果见图4,转染pc DNA3.1-PA-PLA1载体细胞中PA-PLA1蛋白表达水平明显增高,检测灰度值并经内参较正后相比较,两个转染载体的细胞中PA-PLA1表达的水平分别是空白对照的3.69倍和3.04倍。

3 讨论

PA-PLA1最先由华盛顿大学GLOMSET的实验室从牛的睾丸组织中分离、纯化与克隆[2,3,4]。该酶在细胞内水解PA的sn-1脂酰基生成sn-2-溶血磷脂(sn-2-LPA),生理条件下对PA具有高度的亲和性。虽然PA-PLA1的酶学功能已较为清楚,但其生理功能仍不明确。

本研究参照GLOMSET等人报道的方法,从人肾组织中克隆了一种人的PA-PLA1(Gen Bank Accession No:DQ315474)。序列分析表明,本研究所克隆的人PA-PLA1是牛PA-PLA1的同源基因,两者开放阅读框架相似度达77.7%。系统发生关系分析显示,PA-PLA1在脂肪酶家族中,与KIAA0725p蛋白和p125蛋白有较高的同源性,三者在脂肪酶家族组成亚家族(subfamily),均为细胞内的磷脂酶(intracellular phospholipase)[6]。但PA-PLA1具有独特的活性中心保守序列SX-S-XG,而KIAA0725p蛋白和p125蛋白活性中心保守序列与其他脂肪酶家族成员,包括细胞外的磷脂酶(extracellular phospholipase)[7]相同,为GX-S-XG。

研究表明,PA-PLA1、KIAA0725p蛋白和p125蛋白3种细胞内的磷脂酶在细胞内定位及生理功能均有差别[6]。KIAA0725p蛋白位于高尔基体内并促进高尔基体分泌小泡的形成[8]。p125蛋白与外被蛋白Ⅱ(coat proteinⅡ,COPⅡ)包被成分Sec23P相互作用,参与将蛋白质从内质网运输到高尔基体[9]。牛PA-PLA1被报道与生物膜相互作用并对膜上的PA有高度的催化活性,进而影响磷脂酶D或甘油激酶介导的PA信号传导通路[10]。最近有报道[11]指出,PA-PLA1在大脑细胞内生成一种新的大麻受体——G蛋白偶联受体55(G protein-coupled receptor 55,GPR55)的激动剂2-花生酰-溶血磷脂酰肌醇(2-arachidonoyl-2-arachidonoyl-lysophosphatidylinositol),并可能通过PA-PLA1-溶血磷脂酰肌醇-GPR55轴参与大脑功能的发挥。笔者的研究[5]显示,小鼠分泌胰岛素细胞株MIN6中PA-PLA1基因表达与胰岛素分泌有关。不论是不同浓度葡萄糖的葡萄糖刺激胰岛素分泌(Glucose-stimulated in sulin secretion,GSIS)实验,还是不同时间葡萄糖GSIS实验,MIN6细胞的PA-PLA1基因表达均与细胞的胰岛素分泌呈显著的正相关,提示PA-PLA1对MIN6细胞的胰岛素分泌可能具有促进作用。为进一步研究PA-PLA1功能,笔者构建了小鼠PA-PLA1真核表达载体pc DNA3.1-PA-PLA1,测序结果证实该载体构建正确。Western blotting检测显示,pc D-NA3.1-PA-PLA1转染的MIN6细胞过表达PA-PLA1蛋白。

综上所述,本研究首次报道了人PA-PLA1基因的克隆,分析了PA-PLA1酶基因及其蛋白质的序列特征,序列分析显示所克隆的人PA-PLA1是牛PA-PLA1的同源基因,与KIAA0725p蛋白和p125蛋白组成脂肪酶亚家族,同为细胞内磷脂酶。本研究还构建小鼠PA-PLA1基因真核表达载体,该载体在MIN6细胞中能过表达PA-PLA1蛋白。本研究结果为进一步研究PA-PLA1的生理功能提供了实验依据。

摘要：目的 克隆人亲磷脂酸磷脂酶A1(PA-PLA1)基因,分析该酶基因及其蛋白质的序列特征并构建PA-PLA1基因真核表达载体,为该酶生理功能的研究提供实验依据。方法 从人的肾脏组织中提取总RNA,逆转录制备cDNA。扩增人PA-PLA1基因并克隆测序。以Vector NTI 8.0、DNASTAR、ORF finder分析所克隆的人PA-PLA1基因及其蛋白质序列。构建真核表达载体pcDNA3.1-PA-PLA1,测序证实后转染小鼠分泌胰岛素细胞株MIN6,以Western blotting检测PA-PLA1蛋白的表达水平。结果 人PA-PLA1基因mRNA全长为2 923 bp,编码区长2 238 bp,编码1个由745个氨基酸残基组成的蛋白多肽。序列比对表明所克隆的人PA-PLA1基因与牛PA-PLA1基因同源,并与KIAA0725p和p125基因高度相似,三者在脂肪酶家族中形成亚家族,但KIAA0725p蛋白和p125蛋白具有常见的脂肪酶活性中心保守序列GX-S-XG,而PA-PLA1的该序列为SX-S-XG。真核表达载体pcDNA3.1-PA-PLA1构建正确并在所转染的MIN6细胞中过表达PA-PLA1蛋白。结论 PA-PLA1、KIAA0725p蛋白和p125蛋白在脂肪酶家族中形成亚家族,但PA-PLA1具有独特的脂肪酶活性中心保守序列SX-S-XG。所构建的PA-PLA1基因真核表达载体能在MIN6细胞中过表达小鼠PA-PLA1蛋白。该研究结果将为PA-PLA1生理功能的研究提供实验依据。

关键词：亲磷脂酸磷脂酶A1,克隆,序列分析,真核表达载体

参考文献

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磷脂酶C 篇4

由中国老年学学会心脑血管病专业委员会和中国医师协会检验医师分会心脑血管病专家委员会主导制定的据了解, 《脂蛋白相关的磷脂酶A2临床应用中国专家建议》 (《建议》) 于2015年10月30日在北京正式发布, 是我国首个预测冠心病及缺血性脑卒中的生物标志物脂蛋白磷脂酶A2 (Lp-PLA2) 的临床应用专家建议。Lp-PLA2是具有血管特异性的炎症标志物, 为冠心病和缺血性卒中的独立危险因素, 美国FDA批准其用于预测冠心病和缺血性卒中风险。一项研究提示随Lp-PLA2水平升高, 冠心病和卒中风险增加, 尤其是老年人和无症状的动脉粥样硬化疾病人群。32项前瞻性研究包括79036患者的荟萃分析纳入了无血管性疾病、稳定性血管疾病和急性血管疾病30天的患者, 结果Lp-PLA2水平均与冠心病和血管性死亡呈线性对数相关。《建议》推出的意义, 是我国首次综合多学科经验, 系统总结脂蛋白相关的磷脂酶A2的临床价值, 指导该指标在动脉粥样硬化性心血管疾病中的全程管理。

磷脂酶C 篇5

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2009年10月～2010年3月笔者所在医院2型糖尿病患者108例,符合WHO(1999年)的DM诊断标准[1]。其中男49例,女59例,年龄60～81岁,平均(66.81±4.59)岁,病程(8.60±5.01)年。根据有无DM并发症分为三组:2型糖尿病组29例,DM并心脑病变组37例,DM并肾脏病变组42例。心脑血管病变确定依据为有下列情况之一者:曾有心绞痛或心肌梗死病史或经心电图、超声心动图、Holter证实为冠心病者;有脑血管意外病史,颅脑CT或MRI扫描有缺血性或出血性病灶。糖尿病肾病的确诊依据Mogensen等[2]的诊断标准。

健康对照组为体检健康的老年人50例,其中男22例,女28例,年龄60～79岁,平均(66.02±4.37)岁。符合1995年中华医学会老年医学学会推荐的健康老年人标准[3]。健康对照组与DM各组在性别、年龄等方面具有可比性。

1.2 研究方法

各组患者测身高、体重,计算体重指数(BMI)=体重(kg)/身高2(m2)。甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白(HDL-C)用酶法测定,低密度脂蛋白(LDL-C)按Friedewald公式计算。空腹血糖(FBG)用葡萄糖氧化酶法测定。

PON 1活性测定[4],空腹取血,离心分离血清,-20 ℃保存,以对氧磷为底物(paraoxonase),3周内同批测定。用血清10 μl、对氧磷应用液0.4 ml、甘氨酸缓冲液1.2 ml、0.1 MEDTA在25 ℃分别配制对照管和PON 1活性管。准备完毕后置于5 ml比色杯中,412 μm波长处,以水为参比,读取吸光度A值。由光密度换算为活性单位。PON 1活性管A1与对照管A0差值查标准曲线得血清PON 1活性单位。酶活性在0～1600单位内与吸光度值呈线性。以每分钟每升血清水解生成对硝基酚1 μmol为1个国际单位(IU/L)。

1.3 统计学处理

采用SPSS 10.0统计软件包进行多样本两两比较q检验、单因素方差分析,以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组一般情况及FBG、血脂测定结果

DM各组患者与健康对照组FBG均值间差异有统计学意义(P<0.01);DM各组与健康对照组及DM各组间TC均值间差异均有统计学意义(P<0.01);DM并心脑病变组、DM并肾脏病变组与健康对照组TG、TC、LDL、HDL的均值间差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。见表1、2。

2.2 PON1活性、PON1/HDL-C活性

健康对照组与DM各组患者PON1活性及PON1/HDL-C间差异均有统计学意义(P<0.01)。见表3、4。

3 讨论

PON1是一类钙离子依赖的与高密度脂蛋白相关性芳香酯酶,PON1与高密度脂蛋白(HDL)紧密结合,通过水解脂质过氧化物,保护HDL与LDL免受氧化修饰[5]。90年代初发现,动脉粥样硬化、高脂血症和2型糖尿病患者PON1活性显著下降[6]。本研究显示,2型糖尿病患者PON1活性显著下降,且合并心脑血管病变、肾脏病变者其PON1活性更低。为避免HDL浓度影响,采用PON1/HDL-C比值来标化,该值也显著下降,提示PON1活性的减低参与了2型糖尿病心脑血管病变、肾脏病变的发生。

2型糖尿病患者长期处于高血糖状态,血中糖基化水平较高,PON1与HDL结合部位被不断糖基化修饰,必然影响该位点的构型,进而降低PON1活性。同时体内LDL被糖基化,使2型糖尿病患者体内ox-LDL明显增多[7]。不断增加的高浓度ox-LDL可以灭活部分PON1活性[8]。

尽管在糖尿病状态下多种机制使血管损伤,导致并加速动脉粥样硬化的发生、发展,引起心、脑、肾血管并发症,但其中更为重要的危险因素无疑是糖尿病时存在的血脂异常。糖尿病时血脂异常的特点常见为血中TG升高、LDL升高、HDL降低。而PON1活性降低正是涉及上述3个环节中的2个环节,即PON1活性降低使过氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)增加,使HDL减少。因此,PON1活性减低是2型糖尿病血管并发症的危险因素之一。能否通过提高PON1活性来改善脂代谢异常、动脉粥样硬化有待今后进一步研究。

摘要：目的 探讨血清对氧磷脂酶1活性与2型糖尿病血管并发症的关系。方法 以对氧磷为底物测定2型糖尿病各组患者及健康老年人血清对氧磷脂酶1活性。结果 2型糖尿病组与健康对照组血清对氧磷脂酶1活性差异有统计学意义(P<0.01);2型糖尿病合并血管病变组与2型糖尿病组血清对氧磷脂酶1活性差异有统计学意义(P<0.01)。结论 对氧磷脂酶1活性在2型糖尿病及并发血管病变患者中均显著降低,提示对氧磷脂酶1活性的降低参与了糖尿病血管并发症的发生。

关键词：对氧磷脂酶1,糖尿病,2型糖尿病,糖尿病血管病变

参考文献

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[2]Mogensen CE.Manangement of early nephropaphy in diabetic pa-tients[J].Annu Rev Med,1995,7(2):46-79.

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磷脂酶C 篇6

1 材料

1.1 菌株与质粒

大肠杆菌TOP10、BL21和DH5α感受态细胞、载体p EGFP-N1和p ET30a、分枝杆菌DNA基因组, 由宁夏临床病原微生物重点实验室保存;RAW264.7细胞, 购自中国科学院上海细胞库。

1.2 主要试剂

限制性内切酶SacⅠ、KpnⅠ、Ex Taq DNA聚合酶、DNA Marker、琼脂糖、SYBR GreenⅠ和RNAiso Reagent, 均购自Ta KaRa公司;卡那霉素, 购自Sigma公司;DNA片段回收试剂盒、质粒提取试剂盒、除内毒素质粒大量提取试剂盒, 均购自天根生化科技 (北京) 有限公司;胰化蛋白胨、酵母提取物, OXOID公司产品;琼脂粉、Na Cl、Ca Cl2等化学试剂, 均购自北京化学试剂公司;胎牛血清, 购自杭州四季青生物工程材料有限公司;高糖DMEM, 购自美国Gibco公司;Lipofectamine 2000, 购自Invitrogen公司。

2 方法

2.1 结核分枝杆菌溶血磷脂酶真核表达载体的构建与制备

根据Gen Bank中H37Rv分枝杆菌的溶血磷脂酶基因序列, 利用Primer 5.0软件设计1对引物, 上游引物Lip-S 5'-AATTTGGACGAGCTCATGACTAC-CACCCGGACTGAACGG-3' (下画线部分为SacⅠ酶切位点) ;Lip-AS 5'-AACCTTGGCTGGTACCGT-CAACCGCTCGGTGAGCCAGG-3' (下画线部分为KpnⅠ酶切位点) , 引物由北京三博远志生物工程公司合成。PCR反应条件:94℃1 min;64℃1 min, 72℃1 min, 共32个循环;最后72℃延伸10 min;4℃保存, 备用。分别用SacⅠ和KpnⅠ限制性内切酶双酶切扩增片段和载体, 利用DNA T4连接酶于4℃过夜连接酶切片段和载体, 连接产物转化至大肠杆菌TOP10感受态细胞中, 利用双酶切方法鉴定连接产物并测序。

2.2 RAW264.7细胞的培养与p EGFP-质粒的转染

转染前将每孔细胞调整到1×104~1×105个, 置37℃、5%CO2培养箱中培养24 h。当细胞密度达到95%时进行转染。根据DNA与Lipofectamine2000最佳转染比例, 将利用除内毒素质粒大量提取试剂盒提取的p EGFP和Lip-p EGFP质粒分别转染到RAW264.7细胞中, 用荧光显微镜检测绿色荧光蛋白 (GFP) 在细胞中的表达情况。

2.3 RAW264.7细胞总RNA的提取与IL-6、NF-κB、β-actin、Toll-Like Receptor 2和Toll-Like Receptor 6表达的检测

弃掉分别转染24, 48, 72 h的p EGFP组和Lipp EGFP组的RAW264.7细胞上清液, 参照RNAiso Reagent试剂盒说明书提取RAW264.7细胞的总RNA, 并进行c DNA合成。IL-6、NF-κB、β-actin、TLR-2和TLR-6的引物设计参照Gen Bank上已公开发表的mRNA序列, 引物序列、各基因登录号、扩增片段长度及PCR条件见表1。设计引物时跨外显子的接头区, 避免基因组DNA的污染。参照SYBR GreenⅠPCR试剂盒进行Real-time PCR, PCR反应条件见表1, 反应结束后计算机自动绘制出标准曲线;同时, 以不同处理RAW264.7细胞c DNA作模板, 用荧光定量PCR技术检测各细胞因子的表达情况, 通过标准曲线计算出各细胞因子的表达水平。计算公式:细胞因子相对表达量=同模板细胞因子的拷贝数/同模板β-actin的拷贝数。

2.4 Lip-p EGFP稳定细胞株的建立与细胞凋亡的检测

转染前将每孔细胞调整到1×104~1×105个, 置37℃、5%CO2培养箱中培养24 h。当细胞密度达到95%时进行转染。弃掉分别转染48, 72 h和稳定转染7 d的p EGFP组、Lip-p EGFP组和RAW264.7正常细胞组的RAW264.7细胞上清液, 用PBS清洗3次;加入含EDTA的0.5%胰酶, 消化制备细胞悬液, 细胞数量不小于1×106个;用1 m L冰冷的PBS重悬, 以1 500 r/min离心5 min;用200μL冰冷的PBS重悬, 以加样器混匀后缓慢加入含4m L冰冷的70%乙醇的10 m L离心管中, 边加边摇匀, -20℃过夜;次日1 500 r/min离心10 min;小心弃掉上清液, 用1 m L冰冷的PBS重悬;用400目的细胞筛过滤, 加入100μL的PI (propidium iodide) 及100μg/m L的RNase避光染色1 h, 采用流式细胞术进行检测。

2.5 统计学分析

每个样品重复3次, 由美国Bio-rad i Q5实时PCR检测系统荧光分析软件自动进行定量。用SPSS13.0分析软件对不同处理巨噬细胞的细胞因子表达水平进行t检验, P<0.05为差异显著。

3 结果与分析

3.1 结核分枝杆菌溶血磷脂酶真核表达载体的构建、RAW264.7细胞的转染结果

将Lip基因PCR扩增、回收后插到p EGFP载体中, 经SacⅠ、KpnⅠ双酶切和测序鉴定后, 成功构建了Rv0183-p EGFP重组载体;利用Lipofectamine2000将其转染到RAW264.7细胞中, 结果含有p EG-FP和Rv0183-p EGFP载体的RAW264.7细胞在转染24 h后, 即可检测到表达绿色荧光蛋白的细胞;转染48~72 h后, 阳性细胞数量明显增多, 多呈明亮的绿色荧光。由此证明, 结核分枝杆菌溶血磷脂酶在RAW264.7细胞中成功表达。

3.2 结核分枝杆菌溶血磷脂酶对RAW264.7细胞IL-6、NF-κB、β-actin、Toll-Like Receptor 2和Toll-Like Receptor 6 mRNA表达影响的结果

将重组质粒Lip-p EGFP和p EGFP分别转染到小鼠RAW264.7细胞中, 结果显示:24 h后转染Lip-p EGFP质粒的RAW264.7细胞的IL-6、NF-κB、TLR2和TLR6的mRNA表达水平分别上升了1.99, 3.15, 2.66, 1.71倍;48 h后分别上升了3.68, 7.95, 2.81, 3.35倍;72 h后分别上升了9.12, 11.08, 13.32, 6.50倍, 并且随着转染时间的增加表达量也升高。Lip-p EGFP和p EGFP刺激RAW264.7细胞后对IL-6、NF-κB、Toll-Like Receptor 2和TollLike Receptor 6mRNA表达的影响见表2。

注:同一时间同行数据进行比较, *表示差异显著 (P<0.05) 。

3.3 结核分枝杆菌溶血磷脂酶对RAW264.7细胞凋亡影响

结果显示:转染72 h后Lip-p EGFP组细胞开始发生凋亡, 转染7 d后凋亡明显, 可观察到大量凋亡小体, 见图1。

4 讨论与结论

A.正常RAW264.7细胞;B.转染72 h p EGFP组的RAW264.7细胞;C.转染72 h Lip-p EGFP组的RAW264.7细胞。

目前, 磷脂代谢在结核分枝杆菌的各种代谢途径中占有非常重要的比重。许多脂类都被发现与结核分枝杆菌的致病性和病原性相关。肺泡巨噬细胞通过吞噬作用杀灭和清除病原体及异物, 并介导炎性反应, 而结核分枝杆菌主要侵害宿主的肺泡巨噬细胞。IL-6是一种炎性细胞因子, 主要与机体的炎性反应有关[5]。在结核病免疫应答过程中, NF-κB信号通路具有极为重要作用, 肺泡巨噬细胞的NF-κB激活可导致细胞因子和促炎介质持续升高表达, 如肿瘤坏死因子-α (TNF-α) 和巨噬细胞促炎蛋白-2 (MIP-2) , 炎性介质表达的升高, 将会加重肺脏损伤[6], 导致病情加重。Toll样受体的主要功能是介导结核分枝杆菌进入肺泡巨噬细胞中, 与肺泡巨噬细胞一起参加抗原递呈, 炎症调控和细胞凋亡有关。由于结核分枝杆菌表面存在不同的病原相关分子模式, 因此可供不同的模式识别受体识别。TLR-2可广泛识别多种病原相关分子模式, 包括革兰阳性菌的肽聚糖和磷壁酸、细菌脂蛋白、分枝杆菌细胞壁组分、钩端螺旋体的LPS、酵母菌细胞壁等[7]。研究发现, TLR-2可以与结核分枝杆菌表面19 ku脂蛋白相互作用, 使巨噬细胞TNF-α和i NOS合酶的表达水平升高, 分泌γ-IFN和NO, 发挥杀菌作用[8]。

本试验结果表明, 结核分枝杆菌溶血磷脂酶可引起RAW264.7细胞炎性细胞因子表达上调 (P<0.05) , 说明其能够引起宿主细胞发生炎性反应, 保护机体在病理过程中免受微生物的损伤;结核分枝杆菌溶血磷脂酶能够促使RAW264.7细胞NF-κB表达上调, 说明其在结核分枝杆菌的致病机理中具有重要作用。

参考文献

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磷脂酶C 篇7

1 资料与方法

1.1 临床资料

2010年5月至2013年5月行冠状动脉造影检查的140例患者, 其中92例男性患者, 48例女性患者, 患者年龄为34~79岁, 其年龄中位数为60.2岁。所有患者均签署知情同意书, 均自愿参加本组研究, 且均除外血液病、急慢性感染性疾病、心肌病、明显脑血管病变、结缔组织病、瓣膜性心脏病、严重肝肾功能不全、恶性肿瘤等。将140例患者中右冠状动脉、左前降支、左回旋支及冠状动脉左主干中至少1支血管狭窄程度在50%以上的94例患者分为治疗组, 而其余的46例冠状动脉未见狭窄患者分为对照组, 且两组患者一般资料没有明显的差异, 不具有统计学意义 (P>0.05) , 具有可比性。

1.2 方法

所有患者在入院时即对其舒张压、收缩压、体质量、身高等进行测量, 同时询问患者的糖尿病史、高血压史及吸烟史, 计算其体质量指数 (BMI) 。在对患者进行冠状动脉造影术检查之间, 测定其Lp-PLA2水平, 以及测定血糖 (Glu) 、白细胞 (WBC) 、LDL-C、HDL-C、总胆固醇 (TC) 、三酰甘油 (TG) 等。入院之后, 所有患者均给予12h禁食, 然后于次日清晨采集3m L空腹肘静脉血, 肝素抗凝, 进行10min离心, 3000r/min, 然后分取血清, 并将其置于-80°C冰箱保存待测。按照同一批次的原则完成所有样品检测, 血清Lp-PLA2水平的检测采用ELISA方法完成, 严格按照操作规范要求进行操作。按照心绞痛情况, 将治疗组患者分为心肌梗死组、不稳定型心绞痛组和稳定型心绞痛组;按照RCA、LCX、LAD中1支狭窄程度在50%及其以上者分为单支、双支、三支病变组;按照Gensini积分方法及相关积分分段评价标准[2], 狭窄直径在25%以下计1分, 狭窄直径在25%~49%计2分, 狭窄直径在50%~74%计4分, 狭窄直径在75%~89%计8分, 狭窄直径在90%~98%计16分, 狭窄直径在99%及其以上计32分。

1.3 统计学方法

数据采用SPSS13.0统计学软件处理, 组间数据采用t检验, 计数资料采用χ2检验, 以P<0.05为具有统计学意义。

2 结果

治疗组患者血糖值、高血压患者数、糖尿病患者数、性别构成比、吸烟患者数等比对照组高 (P<0.05) , HDL-C明显低于对照组 (P<0.01) , Lp-PLA2、LDL-C明显高于对照组 (P<0.01) 。两组患者Lp-PLA2水平相比较, 治疗组中各组患者均明显高于对照组 (P<0.01) ;AMI组Lp-PLA2水平明显高于UAP组和SAP组 (P<0.01) ;UAP组和SAP组Lp-PLA2水平差异不明显, 不具有统计学意义 (P>0.05) 。冠状动脉单支、双支及三支病变组Lp-PLA2水平均比对照组高 (P<0.01) , 且Lp-PLA2水平随着病变支数的增加而升高, Lp-PLA2水平在三组间差异明显, 具有统计学意义 (P<0.01) 。LpPLA2水平在不同Gensini积分亚组中均明显高于对照组 (P<0.01) , 且其水平随着积分的增加而升高, Lp-PLA2水平在不同Gensini积分亚组间差异明显, 具有统计学意义 (P<0.01) 。详细情况见表1。

3 讨论

磷酸酯酶A2超家族中, Lp-PLA2是其中的一员, 其相对分子量是45.4k Da, 含有氨基酸441个, 具有水解血小板活化因子的活性[3]。人血清Lp-PLA2的合成和分泌主要由成熟的淋巴细胞、巨噬细胞完成, 同时还会受到炎性介质的调节。通过本组研究表明, Lp-PLA2密切联系着促进动脉粥样硬化, 它对斑块的不稳定性可进行反映, 可作为急性期非特异性炎性标志物, 使得冠脉事件风险增加[4]。Lp-PLA2水平是独立的冠心病危险因素, 对预测冠心病发展、风险及预后均具有十分重要的意义, 研制其抑制剂或降低其水平可能为治疗心血管病提供一个新靶点。

摘要：目的 探讨血清脂蛋白相关磷脂酶A2 (Lp-PLA2) 水平与冠心病的关系。方法 我院自2010年5月至2013年5月行冠状动脉造影检查患者140例, 其中检查结果为冠状动脉粥样硬化性心脏病患者94例做为治疗组, 另外46例冠状动脉未见狭窄患者作为对照组。采用ELISA方法对患者的Lp-PLA2水平进行检测, 同时进行对比统计分析。结果 患者血清Lp-PLA2水平相比较, 治疗组明显高于对照组 (P<0.01) ;急性心肌梗死与稳定型心绞痛Lp-PLA2水平差异明显, 与不稳定型心绞痛差异也十分明显 (P<0.01) 。结论 Lp-PLA2是一个独立的冠心病危险因素, 其水平能够对冠状动脉病变的严重程度及冠状动脉粥样斑块的稳定性进行反映。

关键词：血清脂蛋白,磷脂酶A2,冠心病

参考文献

[1]胡威威, 李海涛.血清脂蛋白相关磷脂酶A2水平与冠心病关系[J].中国循证心血管医学杂志, 2010, 2 (1) :21-24.

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