指纹图谱技术（共12篇）
指纹图谱技术 篇1
引言
在日常生活中鞋油广泛应用于皮鞋护理,其使用具有较强的个体差异性,不同的人会有使用不同品牌或不同颜色鞋油的习惯,其使用频次也因人而异。
在一些案件中,当嫌疑人穿着用鞋油护理过的皮鞋作案时,鞋子与墙壁、纺织品、地毯等物品会有接触,鞋油很有可能发生转移从而形成相应污痕或瘢渍,因此通过对此类痕迹的检验鉴别,可以为侦查破案提供线索,指明方向,为证实犯罪提供科学的依据。
鞋油有液体鞋油和固体鞋油之分,其主要成分是石蜡、虫蜡、松节油、棕榈油等[1,2,3,4]。
指纹图谱技术是目前较为新颖检测技术,由于不同物质其组成成分不同、组成成分含量有区别,其反映在紫外吸收曲线上的峰高、峰形及相对强度则存在差异,可据此进行物质的定性检验[5,6,7,8,9,10]。
本文利用紫外—可见分光光度仪,对30份鞋油的有机成分进行分析,使用优选出的检测方法,对膏状鞋油样品进行了谱图采集,依据每个样品的紫外光谱图进行指纹图分析,并对该方法的重现性进行了考查,所测样品均得到较好区分。该方法可以为公安实践部门检验鞋油物证提供借鉴。
1 试验条件
样品:常见液体和膏体鞋油样品30份,见表1。
试剂:蒸馏水、甲醇、乙醇、乙腈、丙酮、乙醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、三氯甲烷(均为分析纯)。
仪器及试验条件:TU-1950双光束紫外可见分光光度仪(北京普析),波长范围190～300nm;分辨率0.5nm。
2 试验方法
2.1 膏状鞋油检测方法的选择
2.1.1 提取剂
根据溶解能力选择提取剂,试验发现,除蒸馏水以外,所选溶剂均能溶解鞋油样品,这是由于鞋油多数为油溶性物质,可溶于有机溶剂。根据溶解能力大小,选择乙醇、丙酮、二氯甲烷、三氯甲烷作为提取剂。
将鞋油样品分别配成质量分数为25mg/mL的鞋油/乙醇溶液、鞋油/丙酮溶液、鞋油/二氯甲烷溶液与鞋油/三氯甲烷溶液,并分别以各自的空白溶剂作为参比液进行对照试验,在波长为190～300nm进行光谱扫描,根据谱图质量确定提取剂,见表2。
2.1.2 扫描波长的选择
将鞋油样品配制成质量分数为25mg/mL的鞋油/乙醇溶液,按一定比例稀释后作为待测液,在乙醇溶液为参比条件下,对待测样品进行光谱扫描。以波长为横坐标、吸光度值为纵坐标,绘制紫外吸收光谱图,根据紫外吸收峰分布情况确定扫描波长。
2.1.3 样品浓度的选择
如果使用样品原液直接进样测试,紫外吸收响应值过高,易超出仪器量程,因此需要确定合适的样品稀释浓度,将5#鞋油样品配制成质量分数为25mg/mL的鞋油/乙醇溶液,再使用乙醇分别按照1:2、1:3、1:5、1:10、1:15进行稀释,以乙醇溶液为参比,波长190～300nm下进行光谱扫描,按照吸收峰强度确定样品配制浓度。
2.1.4 样品载体物的选择
选择14#样品“意尔康”牌黑色膏状鞋油,分别等量涂抹于洁净无纺布与载玻片上,待挥干后用乙醇溶解,于相同试验条件采集扫描光谱。
2.2 特异性检验
将23#鞋油溶液,按照1:2、1:3、1:5、1:6、1:7、1:9、1:10的比例进行稀释,按照上述试验条件扫描光谱,检验稀释浓度对紫外谱图特异性的影响。
2.3 重现性检验
选择2#、19#鞋油样品,稀释1:5后,重复测定3次谱图,观察谱图重复性。
3 试验结果分析与讨论
3.1 试验条件的确定
3.1.1 提取剂
由表2可知,使用乙醇作为鞋油样品的提取剂,溶解效果较好,且乙醇在190～300nm范围内无干扰,所以本试验采用乙醇做提取剂。
3.1.2 样品浓度
根据朗伯—比尔定律,物质吸光度与物质的浓度在一定范围内成正比,当溶液过浓时(物质浓度超过0.01mol/L),吸光粒子由于间距减小,摩尔吸光系数将发生变化,导致吸收曲线线形改变[11]。
将5#样品使用乙醇溶液按照1:2、1:3、1:5、1:10、1:15稀释,进行紫外曲线扫描,结果如图1所示。
由图1可知,当样品浓度过高(稀释比1:2)时,紫外曲线相应值过高,出现吸光度大幅度跃升,曲线峰形出现改变,样品在稀释比1:15时,吸收曲线虽然有完整峰形,但响应值过低,峰形不能完整反映鞋油样品所含信息。
当稀释比在1:5时,紫外吸收曲线响应值适中,并且峰形完整,因此样品稀释比例最终确定为1:5,即按照上述试验条件,取30份鞋油样品,分别配制为25mg/mL鞋油/乙醇溶液,按照1:5稀释后扫描光谱,重复3次,绘制鞋油吸收谱图。
3.1.3 扫描波长的选择
经过试验发现,鞋油样品的紫外吸收峰均集中在190～250nm之间,为鞋油中杂原子不饱和基团C=O和=N的不饱和n→π紫外吸收峰,因此将扫描波长定为190～400nm。
3.2 鞋油样品紫外光谱指纹特异性分析
3.2.1 数据处理
紫外吸收光谱曲线相似度:
式中:n—数据点个数;h1j,h2j—第1,第2条曲线中第j个点的吸光度值。
以相似度s=0.90为临界值,当s>0.90时,认为2条曲线为相同鞋油紫外扫描曲线;当s<0.90时,认为2条曲线为不同鞋油紫外扫描曲线。所得数据使用Excel软件进行处理。
3.2.2 鞋油样品特异性分析
1#～15#鞋油样品紫外吸收曲线如图2所示,16#～30#鞋油样品紫外吸收曲线如图3所示,1#～30#样品紫外吸收曲线相似度对比如表3所示。
由图2、图3、表3可知,30份鞋油样品的紫外吸收曲线均能表现出足够的特异性,鞋油的紫外吸收曲线特异性来源有两个,第一为样品中紫外吸收活性物质的含量,第二为样品紫外吸收活性物质的组成,其中后者是造成鞋油紫外曲线特异性的主要原因。
从表3可看出,s>0.9为相同成分,差异较小,s<0.9则认为成分不同,差异显著。
在3 0份样品的两两比较结果中,大部分的样品可以得到较好的区分,区分率为96.8%。其中即使是相同品牌不同批次的鞋油,相互之间相似度也有差异,如“奇伟”牌新旧两款鞋油的紫外吸收曲线相似度为0.39,说明两款产品在生产配方上有一定的差异,导致曲线变化。使用紫外分光光度检验鞋油样品,具有较好的区分度。
3.2.3 鞋油样品紫外光谱特征
通过分析鞋油样品紫外谱图,发现具有共同特征:在200nm存在一个较强吸收峰,这是由于多元醇和酚产生缔合现象,-OH基的n→π紫外吸收峰发生红移作用,由原来的190nm向200nm移动。
部分鞋油样品的紫外谱图,在225nm,出现一个中等强度的吸收峰。
由此可以推测出鞋油中有N或S等杂原子未成对电子跃迁吸收。根据鞋油样品的紫外吸收峰在225nm附近有无吸收峰,可以将30个样品分为两大类,第Ⅰ类为225nm附近有吸收峰,该类鞋油样品共有6个品牌8个样品;第Ⅱ类为225nm附近没有吸收峰,该类鞋油样品共有15个品牌22个样品。见图4、图5。
3.2.4 相同样品、不同浓度的检验
选择“万金”黑色膏状鞋油(23#)样品,配制25mg/mL鞋油乙醇溶液,分别按照溶液比乙醇1:2、1:3、1:5、1:6、1:7、1:9、1:10进行稀释,其紫外线图谱及相似度对比如图6、表4所示。
从图6、表4可以看出,稀释比在1:10～1:3之间,紫外吸收曲线峰形基本不发生变化,相似度均在0.99～0.98之间。
说明在该浓度范围内同一样品的紫外吸收曲线线形保持稳定,样品中各组分在同比例增加或减少的情况下不会形成差异。
但当稀释比小于1:2时,峰形发生较大变化,说明浓度过大时,样品中对紫外线吸收响应较大的物质会产生较强的掩蔽效应,造成曲线变形。
3.2.5 相同样品、相同浓度、不同载体的检验
实际办案条件中,采集到的鞋油检材均为不新鲜的、转移型的鞋油痕迹,为模拟现场情况,选择“意尔康”黑色膏状鞋油(14#)样品,配制成25mg/mL的鞋油/乙醇溶液后,再用乙醇稀释1:5,均匀涂抹于洁净玻璃板与洁净白色无纺布上,干燥后使用乙醇浸泡溶解,采集光谱,见图7。
由图7可知,从不同的载体上采集到样品的吸收曲线峰形基本不发生变化,曲线之间的相似度均在0.98以上,仅仅在吸收强度上略有变化(1:5稀释溶液最高,玻璃载体其次,无纺布载体最低)。
这主要是因为转移到载体上的鞋油成分不能全部回收,造成浓度降低的缘故。因此,使用紫外指纹图谱技术检验鞋油,载体的不同不会引起相同样品的误判。
3.2.6 重现性试验
在相同的试验条件下,对“庄臣”黑色膏状样品(2#)和“红鸟”黑色膏状鞋油样品(19#)进行重复试验表明,该方法的重现性良好,4次试验中相对峰高比值的变异系数均<0.1%。
4 结论
利用紫外光谱可以对不同品牌、同一品牌不同批次的鞋油样品进行鉴别,该方法操作简便快速,结果准确可靠,重现性高,可以在实际办案中对现场中提取到的膏状鞋油物证进行检验。
关键词：鞋油,紫外光谱,比较研究,法庭科学
参考文献
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指纹图谱技术 篇2
一、中药生物指纹图谱简介
中药生物指纹图谱（biological fingerprint of TCM）是利用基因组学和蛋白组学技术研究药材基因型特征和中药作用于特定生物细胞后引起基因和蛋白的表达的变化规律和作用机制，从分子水平上揭示中药、中药与生物的细胞作用后的基因与蛋白的表达特征，研究解决化学成分和药理作用、药效活性的相关性，是中药指纹图谱研究的一个重要方面和最高级阶段。主要包括中药基因组学指纹图谱、中药蛋白组学指纹图谱 和中药材 DNA 指纹图谱[1]。
目前，由于宏观上中药作用靶点和作用机制的多样性及对基因作用的多样性，中药基因组学指纹图谱和蛋白质组学指纹图谱可反映中药制剂作用于某特定细胞或动物后所引起的基因或蛋白的特定构象的复杂变化情况。这两种指纹图谱可称为生物活性指纹图谱。这种指纹图谱不但包含了化学信息，也体现了和此相关的药效、临床疗效等生物医药信息，通过比较不同蛋白质、基因指纹图谱体现的不同药效结果，就可确定何种物质基础(化学成分群)是该中药制剂的最佳方式，而且为解决中药研究中缺乏标准品的难题提供了一条可行之路[1]。目前，中药基因组学和蛋白质组学有关指纹图谱的研究工作正在开展。中药蛋白质组学及基因组学指纹图谱可从分子水平上丰富整个中药指纹图谱研究体系。无论是中成药二次开发，还是中药新药研究，都有一个关键问题需要解决--逐步在分子水平上研究解决化学成分(物质基础)和药理作用、药效活性的相关性。而其中，通过蛋白质组学的研究得到的蛋白质组学指纹图谱又具有很高的说服力。
中药材 DNA指纹图谱多运用聚合酶链反应(PCR)从不同生物样品中人工合成 DNA 片段, 这种 DNA片段的大小、数目因不同生物而异, 因而称之为 DNA 指纹图谱。由于 DNA分子标记技术直接分析的是生物遗传因子而非表现型, 所以结果可不受环境因素、样品状态和材料来源等外界条件的影响, 因此为中药品种鉴别中极为可靠的手段。随着分子生物学技术的发展, 已有文献报道用 DNA指纹图谱作为药材的鉴定方法.李晓波[2]等人的研究预示 DNA 指纹技术正在逐渐成为中药鉴定的一种新方法。DNA 指纹图谱由于其特点，无法客观反映药用植物因外部环境影响基因表达造成的药效成分含量的差异，只能用于药材种质资源的考察。对于 DNA 指纹技术在中药材鉴定方面的推广和普及的关健是
降低检测成本和简化操作过程。目前，应用于中药质量研究的 DNA分析技术主要有分子杂交和 PCR 两方面。前者有以低拷贝序列基因为对象的RFLP(限制性内切酶片段长度多态性),以中度重复序列为对象的卫星 DNA 指纹图，后者有 RAPD(随机扩增 多态性DNA)，AFLP(扩增片断长度多态性)和 DNA 测序等。
二、中药生物指纹图谱应用
不同产地人参指纹图谱研究对比 篇3
目前中药指纹图谱中应用最多的方法是高效液相色谱法，因为其对样品挥发度和热稳定性限制小，兼具高柱效、高选择性、灵敏度高的优点，比较适合中药材复杂体系的分析。所以，在参考前人的研究基础上，利用高效液相色谱法对人参药材进行多维谱图条件研究，寻找不同产地人参之间的识别因子以及通过人参药材与制剂指纹图谱的相关性分析，能科学评价及有效控制人参质量。
仪器与试剂
仪器。美国Agilent 1200 高效液相色谱仪；德国sartorius CP224S电子分析天平；天津奥特赛恩斯AS20600BDT超声波清洗仪；上海菲恰尔TDL-5A离心机。
试剂。乙腈（色谱纯，美国TEDIA公司）；磷酸（优级纯，国药集团化学试剂有限公司）；甲醇（分析纯，广州化学试剂厂）；乙醇（分析纯，广州化学试剂厂）；人参皂苷Rb1、Rb2、Rb3、Re、Rf、Rg1（中国药品生物制品检定所）；Rc、Rd、Rh1（北京恒元启天化工技术研究院）
样品。本实验共收集人参药材26批，其中吉林12批，辽宁10批，北京、山东、加拿大、东北各1批。药用部位均为人参主根。
实验方法
色谱条件。色谱柱：phenomenex Kinetex C18 100?（100×4.6mm，2.6μm）；检测波长：203nm；柱温：25℃；流速：1.0mL/min；流动相：以乙腈为流动相A，0.1%磷酸溶液为流动相B，洗脱程序：0～17.5min，乙腈
19%，17.5～22.5min，乙腈变化到29%，22.5～35min，乙腈保持在29%，35～50min，乙腈变化至40%；分析时间：50min；进样量：5μL。
对照品溶液的制备。精确称取人参皂苷Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd、Re、Rh1、Rf、Rg1对照品适量，加甲醇溶解分别制成0.2mg/mL的对照品溶液。
供试品溶液的制备。取粉末（过四号筛）2g，精密称定，置具塞离心管中，加入70%甲醇20mL，超声提取（功率500W，频率40kHz）60分钟，3000转离心10分钟，上清液转移至50mL量瓶中，滤渣再加入70%甲醇20mL，再超声提取60分钟，离心，上清液转移至50mL量瓶中，用70%甲醇分次洗涤离心管，合并滤液，定容至刻度。经0.45μ m微孔滤膜滤过，取续滤液备用。
方法学考察
指纹图谱分析与建立。精密吸取对照品溶液和吉林供试品溶液各5μL，注入液相色谱仪，记录60分钟的色谱图。根据多批样品的指纹图谱给出的相关参数，所有组分在60分钟全部出峰。选取分离度以及峰形均较好的5～60分钟比较供试品谱图，其中19个峰为共有峰。根据保留时间确定5号峰为人参皂苷Re，是人参的指标成分之一，将其作为内参比峰。
精密度试验。精密称取吉林人参药材，按方法操作，制备供试品溶液。在色谱条件下，连续进样5次，记录指纹图谱。计算各共有峰相对于内参比峰的相对保留时间和相对峰面积比值。试验数据见表1。结果表明，各色谱峰的相对保留时间和其相对峰面积比值的RSD均小于3.0%，表明方法精密度良好，符合指纹图谱技术要求。
稳定性试验。精密称取吉林人参药材，按方法操作，制备供试品溶液。在色谱条件下，分别在0、2、4、8、16小时进行分析，记录色谱图。计算各共有峰相对于内参比峰的相对保留时间和相对峰面积比值。试验数据见表2。结果表明，各色谱峰的相对保留时间和其相对峰面积比值的RSD均小于5.0%，符合指纹图谱技术要求。
结果
辽宁人参药材HPLC指纹图谱中共有指纹峰的标定与技术参数的设定。将10批产自辽宁的人参指纹图谱中各共有色谱峰的相对保留时间、相对峰面积，及其指纹图谱输入国家药典委员会指定的中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004A）中，进行图形匹配及其数据匹配后，建立了供试品指纹图谱的共有模式，当中含有共有峰22个。取下对照品溶液，在色谱条件下，分别注入液相色谱仪，根据保留时间确定以上各种人参皂苷在谱图中的位置，可确定22个共有峰中，5、6、9、12、13、14、16、17、20号峰分别为人参皂苷Rg1、Re、Rf、Rh、Rb1、Rc、Rb2、Rb3、Rd。
讨论
提取方法的选择。根据人参药材的主要成分特性，结合文献资料，实验对索氏除杂后超声提取、加热回流提取法、超声振荡法、加热回流后液液萃取、超声提取后液液萃取等多种方法进行了考察。结果显示，超声振荡法操作简便易行，便对这种方法作进一步优化。采用70%甲醇和70%乙醇为提取溶剂，不同提取时间进行对比，结果表明，70%甲醇的样品峰面积较70%乙醇的样品峰面积大，并且随着提取时间增加，峰面积也随之增加。浸泡过夜后超声与直接超声处理相比较，浸泡过夜稍好，但差异并不明显。因此，本文采用70%甲醇直接超声提取2次，每次60分钟作为人参药材提取方法。
流动相的选择。实验对乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸溶液、乙腈-0.5%磷酸溶液3种溶剂系统进行梯度洗脱，以乙腈-0.1%磷酸溶液系统所得图谱的峰形较好、分离度大。所以选用乙腈-0.1%磷酸溶液流动相系统为本实验的流动相系统。
色谱柱的选择。分别采用phenomenex Kinetex C18 100A（100×4.6mm，2.6μm）、phenomenex Luna 5μ C18（2） 100A（150×4.6mm，5μm）、phenomenex Synergi 4μ Hydro-RP 80 A（250×4.6mm，4μm）、Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18（150×4.6mm 5μm）、Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18（150×4.6mm 5μm）进行洗脱。结果表明：phenomenex Kinetex C18 100A柱洗脱出的色谱峰基本平稳，峰数多且分离度好，所以选用phenomenex Kinetex C18 100A柱作为本实验的色谱柱。
柱温的选择。分别选用25℃、30℃、35℃、40℃等4种柱温进行试验。结果表明：25℃时分离效果最好，所以选用25℃作为本实验的柱温。
不同产地人参指纹图谱的比较。各产地的人参药材的HPLC指纹图谱存在较大差异，北京、山东、加拿大均不含有人参皂苷Rf，但此3个产地的人参皂苷Rb1、Re、Rc的含量则比东北、吉林、辽宁的高。这说明以上 6个产地的人参药材由于生长的地理环境、纬度和气候的不同而导致主要化学成分含量差别很大。
指纹图谱相似度。本实验建立的指纹图谱分析方法预处理简单，色谱条件优越，出峰数量多且大多数组分达到了基线分离，指纹图谱相似度均在0.90～1.00之间，在分析未知样品时，凡未知样品与标准样本间的相似度达到以上标准，其他项目均符合质量标准时，均可作为合格药材入药。
指纹图谱HPLC条件：色谱柱：phenomenex Kinetex C18 100A（100×4.6mm，2.6μm）；流动相：乙腈-0.1%磷酸溶液（梯度洗脱）；检测波长：203nm；柱温：25℃；流速：1.0ml/min；分析时间：50min。
结论
产地为吉林的人参指纹图谱共标示出19个共有峰；产地为辽宁的人参指纹图谱共标示出22个共有峰。利用中药色谱指纹图谱相似度评价系统，测得12批吉林的人参指纹图谱相似度结果均在0.90～1.00之间；10批辽宁的人参指纹图谱相似度结果均在0.90～1.00之间。
该人参指纹图谱分析方法预处理简单，色谱条件优越，出峰数量多且大多数组分达到了基线分离，可为有效控制人参药材的质量提供可靠的依据。
（作者单位：无限极（中国）有限公司）
中药指纹图谱技术的研究进展 篇4
1 指纹图谱技术的形成及发展
在19世纪末20世纪初,出现了“指纹”鉴定这个概念,最初指纹鉴定运用于法医和犯罪领域里,是根据每个人的手纹的结构有着绝对唯一的差别,来区分个体身份的。也因此“指纹”技术也成了当时一个标志性的词汇。后来随着仪器和分子生物学的快速发展,在生命科学的研究领域里也开始使用指纹分析技术来进行研究,之后发展了蛋白组学指纹分析技术,即利用种群和种群间的共性以及种群内部个体间的差异,来进行物种的鉴定的。随着技术的迅速发展,中药指纹图谱技术也应运而生。早在上个世纪70年代,就开始有学者用薄层色谱法指纹图谱技术对中药的定性鉴定分析进行了研究。发展到上世纪90年代的时候,《中华人民共和国药典》中很多中药品种都已经收录了用薄层色谱指纹图谱的方法用于其品种的鉴定,特别是薄层扫描仪、成像系统、自动点样器和数据处理系统的出现和发展更使得TLC指纹图谱的运用不在是幻想。到了21世纪,指纹图谱可以运用在生物、食品、环境、石油、化学等很多领域的研究中,特别是在中药和食品质量的控制方面,有时还结合一定的分子生物学的知识。有学者通过吸收面积和体积排阻色谱(高效液相色谱法)分离蛋白质组分面积的百分比值显示与品质性状显著相关性,说明质量特性与蛋白质的分子量分布的关联[2]。伴随着更多更新的仪器的出现和发展,中药指纹图谱技术开始向纵向快速发展,技术种类越来越多,应用范围越来越广。日趋完善的中药指纹图谱技术包括:TLC法指纹图谱技术、GC法指纹图谱技术、HPLC法指纹图谱技术、NMR法指纹图谱技术、XRD法指纹图谱技术、IR法指纹图谱技术、HSCCC法指纹图谱技术、HPCE法指纹图谱技术等。其中色谱法比较流行,而色谱法中的HPLC法应用最为广泛。
2 中药指纹图谱的国内外研究进展
2.1 国内研究进展
中药是多组分的复杂体系,化学成分种类丰富,同时又会受到中药品种,产地,运输,加工等诸多方面的影响,所以对中药及其制剂的质量控制的研究一直是中药及其制剂现代化和走向国际的瓶颈,一直是中药及其制剂研究的一个重中之重,同时也是一个难点。而中药指纹图谱技术现在是国际社会公认的用来鉴别中药品种和质量控制的最有效,最准确,最直接的方法手段。近年来,国内外医药相关领域为了解决中药的质量评价方面的问题,对中药指纹图谱技术进行了大量深入的研究,也取得了很多值得祝贺的成绩。杜程芳和屠鹏飞[3]以不同产地的白鲜皮药材为材料,运用反相高效液色谱梯度洗脱法建立了白鲜皮药材的HPLC指纹图谱,结果该指纹图谱可以用来评价白鲜皮药材的质量;王斌等人利用在SGE 30QC3石英毛细管柱优化色谱条件和分离测定条件的基础上建立了鱼腥草和金银花包括这两种中药的下游制剂鱼金注射剂的的挥发性成分GC指纹图谱,同时对其图谱的各共有峰进行了相似性评价,并对其中出现的问题进行了讨论[4]。石荣等以已经建立的大豆异黄酮HPLC指纹图谱的方法为研究方法,选择5个极性各异的代表样品,在不同的仪器上进行测定,研究了大豆异黄酮指纹图谱中保留时间飘移及其校正的工作[5]。魏刚研究利用气相色谱和质谱联用技术对石菖蒲的挥发油成分进行了指纹图谱的研究,得到了具有详细数据信号的特征性指纹图谱,并将其用到石菖蒲制剂的质量判断方面,同时还建立了广藿香挥发油的气相色谱与质谱联用的特征性指纹图谱[6]。杨东风等2007年建立了商洛GAP基地丹参水溶性和脂溶性成分的高效液相色谱指纹图谱,并对不同产地,西藏产丹参的指纹图谱进行了研究和比较,他所建立的丹参指纹图谱专属性强,能准确的反映丹参的真实质量,为GAP基地的建设和丹参的质量控制提供了参考[7]。梁倩发表的文献报道称已经用气相色谱建立了金银花的挥发油成分的指纹图谱,所建立的指纹图谱专属性和稳定性都较强,同时比较了不同产地的金银花指纹图谱的差异,为金银花的质量控制提供一些依据[8]。经过长期的研究发展,中药指纹图谱技术在中药质量评价方面的作用和地位得到了业界广泛的共识,是否能将指纹图谱技术用在中药的质量标准方面成为衡量一个企业是否有好的技术水平和好的管理水平的重要标志之一。
近年来,随着中药现代化和国际化的要求,国内对中药进行指纹图谱技术的研究范围越加广泛,越加深入成熟。截止目前已经建立了丹参、黄芪、天麻、三七等多种中药及其制剂的指纹图谱,尤其是建立了丹参的多元指纹图谱,更标志了中药质量控制的可控性已经达到中药现代化和国际化的要求,已经具有国际先进水平。
2.2 国外研究进展
目前,国外对植物药指纹图谱研究的成果较丰富,德国和法国最先将指纹图谱技术用到银杏叶标准制剂EGB761的质量标准里,该标准对总黄酮、总内酯、槲皮素以及异鼠李素以及它们之间的比例等内容都做出了明确规定,这让植物药在欧美的地位大幅度提高[9]。紧接着美国和加拿大的人参制剂也引入指纹图谱的方法对其原料药和标准提取物进行分析比较,从原料开始控制,以此来保证生产出来的人参制剂的品质,确保药品的稳定性,安全性和有效性。美国民间组织制定的美国草药药典(AHP)对已经流向市场的热点中药和植物药均进行了调查研究,制定了比较全面的,有较强参考价值的质量标准[10]。美国的FDA在植物药制品指导原则中也允许申报者可以提交产品的相关色谱指纹图谱的资料。英国草药典、欧共体草药质量指南和印度草药典都将指纹图谱用来鉴别草药的种类的真实和质量控制的一致。德国著名的生药学家Wagner教授已经建立了人参、黄芪等常用的不同产地的指纹图谱,为其质量控制提供科学的依据。Areias F M 2001年对葡萄牙北部产的薄荷叶中的酚类物质进行了研究,建立了其酚类物质的指纹图谱,结果说明薄荷叶的酚类物质的指纹图谱可以用来鉴别薄荷的不同种,同时可以真实的反应出薄荷的质量。Gulnur Toker 2001年通过对从葡萄籽中提取出的黄酮物质的指纹图谱的建立,说明黄酮指纹图谱可以用来控制葡萄籽提取物的质量[10]。随着技术的不断革新,中药指纹图谱技术的研究无论是国内还是国外,无论是在技术上还是在应用领域里都会有更好的发展,在将来也会有更多的技术手段被应用到中药指纹图谱的技术当中。S
参考文献
[1]王永刚,吴忠,魏凤环,方铁铮.中药指纹图谱研究的现状与未来[J].中药材,2003,26(11):820-825.
[2]Ohm J B,.Ross A S,Peterson C J,Morris C F.Relationships of Quality Characteristics with Size-Exclusion HPLC Chromatogram of Protein Extract in Soft White Winter Wheats[J].Cereal chemistry,2009,86(2):197-203.
[3]杜程芳,屠鹏飞.白鲜皮药材的指纹图谱研究[J].中国天然药物,2003,1(2):94.
[4]王斌,王燕,徐丹,梁振辉,孙文基.鱼金注射剂指纹GC图谱的研究[J].中成药,2004,25(4):365.
[5]石荣,王少云,侯准,桑立红.大豆异黄酮指纹图谱中保留时间漂流的校正研究[J].色谱,2006,24(1):65.
[6]魏刚.广藿香GC-MS特征指纹图谱’数字化”在药材鉴定中的应用模式研究[J].中成药,2007,29(3):322.
[7]杨东风.丹参药材HPLC指纹图谱及其质量评价的研究[D].西北农林科技大学,2007:14-50.
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[9]戴玉梅.中药指纹图谱技术发展概况[J].江西医药,2007,42(6):574-575.
指纹图谱技术 篇5
采用高效液相色谱(HPLC)法测定了12个菊花样品中绿原酸、黄芩苷、槲皮素、木犀草素和柯因五种活性成分的含量.色谱柱为Nov-pak C18,以0.1%磷酸-甲醇为流动相,流速0.6 mL/min,梯度洗脱,检测波长为254 nm.该方法在10-3～10-5g/mL范围内线性关系良好,保留时间和峰面积相对标准偏差(RSD)分别在0.20%～0.96%、0.23%～0.77%之间,回收率在96.5%～104.0%之间.同时建立了菊花样品的指纹图谱,采用夹角余弦和相关系数法计算了12个菊花样品的`相似度,并且运用MATLAB程序对相关系数法计算值进行聚类分析,结果与实际样品种属区分一致,为菊花的质量控制和种属的区分提供依据.
作 者：程宏英 冯启余 曹玉华 龚立冬 侯建霞 汪云 作者单位：程宏英(江南大学化学与材料工程学院,江苏无锡 214122;苏州科技学院,江苏苏州 215009)
冯启余,曹玉华,龚立冬,侯建霞,汪云(江南大学化学与材料工程学院,江苏无锡 214122)
指纹图谱技术 篇6
【关键词】金乌骨通胶囊；高效液相色谱；指纹图谱
【中图分类号】R284.1【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517（2014）22-0008-03
3讨论
3.1提取溶剂的选择比较不同浓度甲醇溶液（20、40、50、60、80、100%）共6种提取溶剂对样品的提取效率，结果显示，甲醇浓度较低时，脂溶性成份提取不佳，反之则水溶性成份提取不佳，且甲醇浓度较高时，色谱峰溶剂效应明显，流出时间较短的色谱峰前伸严重，对分离度影响较大，经比较，确定提取溶剂为50%甲醇，此条件下，色谱峰丰富，峰形及分离效果良好。
3.2流动相的选择比较了乙腈-水、乙腈-醋酸溶液、乙腈-磷酸溶液等多种不同组成、不同梯度溶剂系统。结果显示，按1.4项下洗脱溶剂系统实验得到的图谱峰形及分离度较好，故确定此梯度系统为流动相系统。
3.3检测波长的选择使用DAD检测器全波长扫描功能，在210～600nm波长范围内进行扫描，得到全光谱色谱图。根据3D谱图，确定检测波长为：0～60min，254nm；60～85min，380nm；85～125min，254nm。在此条件下，兼顾各峰强度，谱峰最为丰富。
3.4实验注意事项流出时间在75min附近的姜黄素类化合物具光敏性[3]，实验中发现其相对峰面积比值随时间呈缓慢下降趋势，因此实验过程应避光操作以控制其降解速率，获得可靠数据。
3.5实验结果连续4年共29批样品的指纹图谱相似度较高，稳定性、精密度和重现性好，指纹图谱具有一定特征性，可为金乌骨通胶囊的内在质量提供可靠的参考依据。
参考文献
[1]WS-10140（ZD-0140）-2002.国家药品标准（试行）颁布件[S].
[2]何佳，李懿，韦建荣.宫血宁胶囊HPLC指纹图谱研究[J].中成药，2011，33（7）：1098-1101.
[3]王雪梅，陈利华，施文婷.姜黄素类化合物的光稳定性研究[J].安徽大学学报（自然科学版），2012，36（3）：73-78.
（收稿日期：2014.09.16）
【摘要】目的：建立金乌骨通胶囊的高效液相色谱指纹图谱分析方法，为金乌骨通胶囊药品质量评价积累数据。方法：采用反相高效液相色谱方法，以安捷伦Eclipse plus C18色谱柱（4.6mm×250mm，5μm）；流动相为乙腈（A）-1%冰醋酸水溶液（B），梯度洗脱程序为：0～15min，9～10%A，流速1.0ml/min；15～65min，10～40%A，流速1.0ml/min；65～115min，40～70%A，流速1.5ml/min；115～125min，70%A，流速1.5ml/min；检测波长为0～60min为254nm，60～85min为380nm，85～125min为254nm；洗脱总时间为125min；柱温30℃；进样量20μl，进行指纹图谱研究。结果：建立金乌骨通胶囊高效液相指纹图谱，以淫羊藿苷色谱峰为参照峰，确定13个共有峰，共测定29批样品，样品指纹图谱的相似度均大于0.985。结论：本方法分离效果好，精密度、稳定性、重现性等指标均良好，可用于金乌骨通胶囊的产品质量控制及市场真伪品鉴别。
【关键词】金乌骨通胶囊；高效液相色谱；指纹图谱
【中图分类号】R284.1【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517（2014）22-0008-03
3讨论
3.1提取溶剂的选择比较不同浓度甲醇溶液（20、40、50、60、80、100%）共6种提取溶剂对样品的提取效率，结果显示，甲醇浓度较低时，脂溶性成份提取不佳，反之则水溶性成份提取不佳，且甲醇浓度较高时，色谱峰溶剂效应明显，流出时间较短的色谱峰前伸严重，对分离度影响较大，经比较，确定提取溶剂为50%甲醇，此条件下，色谱峰丰富，峰形及分离效果良好。
3.2流动相的选择比较了乙腈-水、乙腈-醋酸溶液、乙腈-磷酸溶液等多种不同组成、不同梯度溶剂系统。结果显示，按1.4项下洗脱溶剂系统实验得到的图谱峰形及分离度较好，故确定此梯度系统为流动相系统。
3.3检测波长的选择使用DAD检测器全波长扫描功能，在210～600nm波长范围内进行扫描，得到全光谱色谱图。根据3D谱图，确定检测波长为：0～60min，254nm；60～85min，380nm；85～125min，254nm。在此条件下，兼顾各峰强度，谱峰最为丰富。
3.4实验注意事项流出时间在75min附近的姜黄素类化合物具光敏性[3]，实验中发现其相对峰面积比值随时间呈缓慢下降趋势，因此实验过程应避光操作以控制其降解速率，获得可靠数据。
3.5实验结果连续4年共29批样品的指纹图谱相似度较高，稳定性、精密度和重现性好，指纹图谱具有一定特征性，可为金乌骨通胶囊的内在质量提供可靠的参考依据。
参考文献
[1]WS-10140（ZD-0140）-2002.国家药品标准（试行）颁布件[S].
[2]何佳，李懿，韦建荣.宫血宁胶囊HPLC指纹图谱研究[J].中成药，2011，33（7）：1098-1101.
[3]王雪梅，陈利华，施文婷.姜黄素类化合物的光稳定性研究[J].安徽大学学报（自然科学版），2012，36（3）：73-78.
（收稿日期：2014.09.16）
【摘要】目的：建立金乌骨通胶囊的高效液相色谱指纹图谱分析方法，为金乌骨通胶囊药品质量评价积累数据。方法：采用反相高效液相色谱方法，以安捷伦Eclipse plus C18色谱柱（4.6mm×250mm，5μm）；流动相为乙腈（A）-1%冰醋酸水溶液（B），梯度洗脱程序为：0～15min，9～10%A，流速1.0ml/min；15～65min，10～40%A，流速1.0ml/min；65～115min，40～70%A，流速1.5ml/min；115～125min，70%A，流速1.5ml/min；检测波长为0～60min为254nm，60～85min为380nm，85～125min为254nm；洗脱总时间为125min；柱温30℃；进样量20μl，进行指纹图谱研究。结果：建立金乌骨通胶囊高效液相指纹图谱，以淫羊藿苷色谱峰为参照峰，确定13个共有峰，共测定29批样品，样品指纹图谱的相似度均大于0.985。结论：本方法分离效果好，精密度、稳定性、重现性等指标均良好，可用于金乌骨通胶囊的产品质量控制及市场真伪品鉴别。
【关键词】金乌骨通胶囊；高效液相色谱；指纹图谱
【中图分类号】R284.1【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517（2014）22-0008-03
3讨论
3.1提取溶剂的选择比较不同浓度甲醇溶液（20、40、50、60、80、100%）共6种提取溶剂对样品的提取效率，结果显示，甲醇浓度较低时，脂溶性成份提取不佳，反之则水溶性成份提取不佳，且甲醇浓度较高时，色谱峰溶剂效应明显，流出时间较短的色谱峰前伸严重，对分离度影响较大，经比较，确定提取溶剂为50%甲醇，此条件下，色谱峰丰富，峰形及分离效果良好。
3.2流动相的选择比较了乙腈-水、乙腈-醋酸溶液、乙腈-磷酸溶液等多种不同组成、不同梯度溶剂系统。结果显示，按1.4项下洗脱溶剂系统实验得到的图谱峰形及分离度较好，故确定此梯度系统为流动相系统。
3.3检测波长的选择使用DAD检测器全波长扫描功能，在210～600nm波长范围内进行扫描，得到全光谱色谱图。根据3D谱图，确定检测波长为：0～60min，254nm；60～85min，380nm；85～125min，254nm。在此条件下，兼顾各峰强度，谱峰最为丰富。
3.4实验注意事项流出时间在75min附近的姜黄素类化合物具光敏性[3]，实验中发现其相对峰面积比值随时间呈缓慢下降趋势，因此实验过程应避光操作以控制其降解速率，获得可靠数据。
3.5实验结果连续4年共29批样品的指纹图谱相似度较高，稳定性、精密度和重现性好，指纹图谱具有一定特征性，可为金乌骨通胶囊的内在质量提供可靠的参考依据。
参考文献
[1]WS-10140（ZD-0140）-2002.国家药品标准（试行）颁布件[S].
[2]何佳，李懿，韦建荣.宫血宁胶囊HPLC指纹图谱研究[J].中成药，2011，33（7）：1098-1101.
[3]王雪梅，陈利华，施文婷.姜黄素类化合物的光稳定性研究[J].安徽大学学报（自然科学版），2012，36（3）：73-78.
指纹图谱技术 篇7
目前, 在品种鉴定中应用较多的指纹图谱主要有两种:一类是较早开始研究的生化指纹图谱, 包括同工酶电泳指纹图谱和蛋白电泳指纹图谱。另一类是20世纪90年代之后发展起来的DNA指纹图谱, 目前用于作物品种鉴定的主要有四种:RFLP、RAPD、SSR、AFLP。本文就两种生化指纹图谱技术的研究和应用进行综述, 以期为农业生产服务。
1 同工酶电泳指纹图谱
同工酶差异主要是由决定酶蛋白本身的等位基因和非等位基因的差异造成的。同工酶谱是基因表达后分子水平的表型, 通过对其谱带的分析能快速简便地识别出编码这些谱带的基因位点和等位基因。由于几乎25%的基因位点具有多态性, 一般不同同工酶酶谱的差异表现为同一基因位点上的等位基因的差异, 在分离群体中能区分所有可能的基因型, 因而可用作指纹图谱。
从1959年Market和Moller首次提出同工酶的概念以来, 同工酶研究得到了迅猛发展。70年代初期, 同工酶电泳技术就已应用于种子纯度鉴定。1973年, Singh利用酯酶同工酶、亮氨酸氨肽酶及磷酸酶同工酶的淀粉凝胶电泳对10个燕麦品种进行鉴定, 结果表明, 每个品种都具有其特有的酶带, 证明了利用同工酶电泳鉴定种子纯度的可靠性。1976年, Woods对抱球甘蓝进行了同工酶的淀粉凝胶电泳鉴定。
80年代以后, 电泳方法不断改进, 分析技术越来越精确, 逐渐采用聚丙烯酰胺凝胶电泳。Nielsen (1986) 综合分析了1979-1986年间不同同工酶和不同电泳方法在大麦品种纯度上的鉴定后, 认为聚丙烯酰胺凝胶电泳法是最具有潜力的品种纯度鉴定方法。利用这一技术, Freeman (1991) 对早熟禾种子纯度进行了鉴定, 并制作了一系列早熟禾品种的酯酶同工酶酶谱, 以便于对照比较。在国内, 最早将这项技术应用于种子纯度鉴定的陆士伟[1]利用酯酶同工酶聚丙烯酰胺凝胶电泳测定了杂交水稻种子的纯度, 颜启传[2]利用这一技术检测了杂交水稻及其三系种子的真实性和品种纯度, 证明此方法具有灵敏度高、准确、经济、易于操作等优点。张春庆[3]利用过氧化物同工酶电泳鉴定了玉米自交系及其杂交种的纯度, 取得较好的效果。郭虎[12]通过对马铃薯30个品种的过氧化物同工酶电泳分析, 认为马铃薯叶片的过氧化物同工酶丰富而稳定, 品种间差异显著, 可用于品种真实性和纯度鉴定。
90年代以后, 同工酶电泳技术广泛应用于作物品种纯度鉴定上, 许多工作者在水稻[4~6]、玉米[7]、油菜[8]、大白菜[9]等作物品种纯度鉴定方面做了大量的工作, 取得了良好的经济效益。
同工酶电泳酶带的显现灵敏, 较易获得成功, 一次可进行多种酶的分析, 从而大大提高了种子纯度检测的功效, 具有速度快、费用低、准确度高等优点[10], 因此一度应用于作物纯度检测。然而, 同工酶的表达在时间和空间上的特异性又影响着同工酶在不同组织或器官中的分布与活性。酶的提取和电泳技术的实验条件要求严格, 可利用的同工酶非常有限, 并有酶谱不纯的现象, 因而在生产实践中未能得到推广应用。
2 蛋白电泳指纹图谱
蛋白质作为基因的直接稳定产物, 能反映生物DNA组成上的差异, 但适合鉴定品种的基因产物必须在品种间存在较高的多态性, 且易于检测出来。植物胚乳 (种子) 贮藏蛋白就是符合要求的一类基因产物, 这些蛋白的组成由遗传决定, 不受环境影响, 其组分上的差异可反映出基因型的不同, 因而可作为品种的“生化指纹”。
自70年代以来, 蛋白质电泳作为鉴定品种的一种方法引起了人们的极大兴趣。Ellis (1977) 利用淀粉凝胶电泳分析了29个英国小麦品种的醇溶蛋白, 除极个别外, 这些品种都能被区分开。他们认为, 每个品种分析50粒种子, 既不需花费很多时间, 又能保证结果统计的准确性。Shewry (1978) 利用SDS-PAGE技术对大麦种子醇溶蛋白进行了分析, 成功地将88个大麦品种分为29个种类, 显示了醇溶蛋白电泳技术在品种鉴定上的巨大价值。Lookhart (1982) 建立了一种标准化的麦醇溶蛋白鉴定技术。1986年, 国际种子检验协会将大麦、小麦品种醇溶蛋白电泳鉴定技术列入国际种子检验规程。Cross对玉米的胚蛋白进行SDS-PAGE电泳分析, 成功区分了自交系和杂交种。Anisimova (1989) 对53个向日葵品种的球蛋白电泳图谱进行比较, 表明球蛋白多态性丰富, 可用于品种、自交系同质性和遗传纯度的鉴定。Varier (1992) 利用球蛋白的SDS-PAGE技术对向日葵的4个杂交种及其亲本自交系进行了研究, 总共检测到了27条带, 除3条共有带外, 其他带的有无可以决定品种间基因型的不同。
此后, 蛋白质电泳鉴定种子纯度技术迅速发展起来, 广泛应用于小麦[13]、玉米[14]、水稻[15]、胡椒[16]、番茄[17]等作物。同时, 电泳技术也日臻完善, 在品种鉴定和纯度分析中主要有以下两种方法, 即根据蛋白质等电点不同来分离的等电聚焦电泳法 (IEF) 和根据蛋白质分子量不同来分离的十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法 (SDS-PAGE) 。此外, 毛细管电泳技术 (CE) 、超薄等电聚焦电泳技术 (UTLIEF) 、酸性聚丙烯酰胺凝胶电泳技术 (Acid-PAGE) 、双向电泳技术 (2-D) 、高效液相色谱技术在蛋白质分离方面也有很多应用, 并显示了强大的优势。
蛋白质电泳技术是目前种子纯度检验中广泛适用的方法。蛋白质提取容易, 无需低温, 需时较短, 成分数量稳定, 具有较高的准确性和广泛的适应性[18]。需要指出的是, 由于基因表达有时会受到器官、发育阶段甚至环境条件的影响, 故进行电泳鉴定时, 除了电泳条件的适当选择外, 试验材料的采集也会直接影响了鉴定的准确性。另外, 对于某些遗传组成非常接近的品种, 如保持系和不育系, 不易找到特异蛋白, 采用蛋白质电泳难以发现特征带。此外, 蛋白质电泳图谱易受种子发育阶段及表达器官的影响, 有时不够稳定, 影响了电泳图谱的分析, 从而影响了鉴定结果的准确性[19]。并且, 随着近几年杂交组合的不断推陈出新, 品种之间的差异甚微, 亲缘关系较近, 鉴定更加困难。
3 结语
玛咖HPLC指纹图谱研究 篇8
目前玛咖种植地广泛, 颜色众多, 市售产品混乱, 真伪产品难以区分, 且研究玛咖时缺乏活性成分对照品。玛咖与其他天然植物一样成分复杂, 中药指纹图谱技术能提供丰富的鉴别信息, 较为全面地反映植物药所含化学成分的种类与数量, 进而对药品质量进行整体描述和评价[4]。金文闻[5]对玛咖的红外指纹图谱、薄层指纹图谱以及气相指纹图谱进行了研究, 指出了其图谱特征。HPLC具有操作简便、图谱稳定性和可靠性高的特点, 采用其对玛咖进行分析目前尚未见报道。本试验以原产地秘鲁玛咖为对照, 研究了秘鲁、丽江、会泽、格萨拉 (四川攀枝花) 四个产地的HPLC图谱, 并与形态和功效与玛咖相似的植物材料 (圆根萝卜和西洋参) 进行对比, 初步建立玛咖的HPLC指纹图谱, 并在此基础上对市售无商标的10批玛咖进行指纹图谱分析。
1 材料与试剂
1.1 仪器
P200-高效液相色谱仪 (大连依利特分析仪器有限公司) ;SHIMADZU-UV-1700型紫外可见分光光度计 (日本岛津) , SY360超声波提取器 (上海宁商超声仪器有限公司) ;Millipore超纯水器 (美国MILIPORE公司) ;ESJ120-4电子天平 (沈阳龙腾电子有限公司) 。
1.2 药品与试剂
秘鲁黄玛咖购自上海中智科技应用发展公司 (秘鲁玛咖进口商) ;丽江黄玛咖购自丽江格林恒信生物科技开发有限公司 (产地丽江) ;会泽黄玛咖购自云南禾农食品开发有限公司 (产地会泽) , 格萨拉黄玛咖购自和润农业开发有限公司 (产地格萨拉) ;西洋参购自一心堂医药公司;圆根萝卜采自盐边县格萨拉乡农田。此外, 从昆明、成都、攀枝花市场上购买不同产地的商品玛咖。
色谱甲醇 (成都科龙化工有限公司) , 实验用水为超纯水, 其余试剂为分析纯 (成都科龙化工有限公司) 。
2 方法
2.1 供试品溶液制备
精密称取秘鲁、丽江、会泽、格萨拉黄玛咖, 西洋参和圆根萝各1g (过60目) , 加入甲醇30mL, 超声提取30min (40Hz, 40℃) , 共提取3次, 过滤, 定容至100mL。
2.2 色谱条件
色谱柱:CS-120-5-C18-AP (5μm, 4.6mm×50mm) ;流动相:甲醇-水 (25∶75) ;流速:0.8mL/min;柱温:25℃;检测波长:210nm;进样量:20μL;时间:30min。
2.3 实验方法建立
2.3.1 检测波长选择
分别以甲醇、95%乙醇、水为溶剂, 按照“2.1”项下提取秘鲁玛咖, 得到的溶液在紫外分光光度计上进行波长扫描, 对190~800nm范围内的色谱图进行分析比较, 结果在210nm波长下峰数最多, 峰型较好, 因此确定检测波长为210nm。
2.3.2 提取溶剂选择
以甲醇、95%乙醇、水为溶剂制备供试品溶液, 以“2.2”项下色谱条件进样测定。结果以乙醇为提取溶剂, 得到的指纹图谱各峰分离度差、基线不平稳。水为提取溶剂的指纹图谱峰数少;以甲醇为提取溶剂得到的峰数多、峰面积大, 各峰分离良好, 因而确定提取溶剂为甲醇。
2.3.3 流动相选择
笔者先以乙腈和水作为流动相, 不论如何调整比例, 均得不到个数较多的色谱图。换为甲醇和水后, 随水的比例增大, 色谱峰变多, 但峰型拖尾, 加入适量磷酸后峰型变好, 最后确定流动相为甲醇-水 (25∶75) , 磷酸调节pH=4.8。
3 方法学考察
3.1 精密度实验
取同一批秘鲁玛咖供试品溶液, 在“2.1”项下色谱条件下连续进样6次, 记录指纹图谱。结果表明各色谱峰相对保留时间RSD<0.2%, 相对峰面积RSD<1.7%, 符合指纹图谱的要求。
3.2 稳定性实验
取同一批秘鲁玛咖供试品溶液, 分别于放置0、2、4、8、12、24h后进样, 记录指纹图谱。结果表明各色谱峰相对保留时间RSD<0.2%, 相对峰面积RSD<3.0%, 表明供试品溶液在24h内稳定。
3.3 重现性实验
取同一批秘鲁玛咖供试品6份, 按照“2.1”项下制备方法, 分别制取供试品溶液, 进样测定指纹图谱。结果表明各色谱峰相对保留时间RSD<0.2%, 相对峰面积RSD<4.0%。
4 结果
4.1 玛咖指纹图谱共有峰、参照峰标定
按照上述优化的条件, 对6个样品提取液进样测定, 得到各自的指纹图谱, 见图1。将6个指纹图谱数据输入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统 (2004A版) 》, 确定玛咖共有峰18个, 其占总峰面积91.43%;4个玛咖样品的指纹图谱及图谱数据显示, 保留时间tR=12.46~12.50min的色谱峰 (标记为S) 为各种玛咖的共有峰, 也是区别于圆根萝卜和西洋参的特征峰;其中S峰面积最大, 与相邻色谱峰分离良好, 可作为玛咖的参照峰;结果还显示4种产地的玛咖指纹图谱相差不大。
4.2 相似度
计算各个样品的相似度, 数据处理采用Waters Pater Sach相似度软件, 计算原理为夹角余弦法[6]。以共有峰的峰面积计算相似度, 其中4个产地的玛咖相似度为95.5%~98.7%, 与西洋参和圆根萝卜的相似度相差很大, 可作为玛咖具有专属性的指纹图谱。
4.3 玛咖指纹条形码建立
由相似度计算结果可知:当以4个产地的玛咖样品共有峰面积均值为对照时, 4个玛咖样品的相似度均大于0.9, 表明整体上相似, 故可以4个样品共有峰为基础采用均值法建立玛咖的对照指纹图谱。绘制对照品指纹图谱时, 以参照峰S为基准, 以各共有峰的相对保留时间为横坐标, 以相应峰号的相对峰面积为纵坐标, 绘制玛咖对照指纹条形码, 见图2。
4.4 适用性考察
采用本试验优化的提取方法和测定条件, 结合建立的玛咖指纹条形码, 对市场上购买的10批产品进行检验, 结果见表1。由表1中可知, 一级和二级商品玛咖块根或切片, 无论是何种产地、何种皮色, 其相似度都在90%以上;四级黄玛咖块根和黄玛咖须根的相似度只有72.1~83.8%;玛咖叶的相似度只有65.3%;市场上的玛咖粉末相似度在80%以下。品质越好的玛咖相似度越高, 品质越差的玛咖和玛咖须根、玛咖叶的相似度越低。建议在质量标准中确定相似度阈值不低于80%为合格产品, 高于90%为优质产品。
5 讨论
有文献[7]报道了玛咖活性成分, 如玛咖酰胺、玛咖烯、生物碱等, 但因含量低, 目前尚缺乏活性成分对照品, 给玛咖质量标准研究带来困难。我国玛咖产业都致力于生产粗加工产品以获取短期利润, 目前市场充斥着大量以玛咖为原料的保健食品, 成分明确、疗效明显的玛咖深加工产品较少[8]。同时, 我国玛咖种植地广泛, 颜色众多, 厂家参差不齐, 市售产品混乱, 质量无法得到保证。因此玛咖质量标准建立尤为重要。
本试验对供试品溶液制备、色谱条件进行优化, 建立玛咖指纹图谱。结果表明, 玛咖指纹图谱中主要峰群整体一致, 与西洋参和圆根萝卜相差很大, 同时标定玛咖特征峰。以共有峰的峰面积计算相似度, 4个产地的玛咖相似度大于0.9, 表明不同产地的玛咖差异不大。本试验还考察了方法的适用性, 对市场上购买的10批产品进行检验, 根据结果建议玛咖等级的制定标准, 相似度>0.90可判定为优质玛咖, 相似度<0.80为不合格产品。
本试验首次建立的商品玛咖HPLC指纹图谱分析方法具有较好的精密度、稳定性和重复性, 符合指纹图谱研究的技术要求。同时标定的玛咖特征峰S附近杂峰少, 峰面积大, 纯度高, 下一阶段实验可进一步分离提取, 有望鉴定其结构, 制备标准品, 为玛咖质量标准建立提供依据。
参考文献
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川牛膝的HPLC指纹图谱研究 篇9
目前国内对川牛膝的研究主要集中在其化学成分及药理研究方面, 缺乏综合评价药材品质的方法和标准, 且川牛膝在长期的应用和栽培的过程中, 种内产生很大的变异, 出现伦理较多的类型, 同时由于加工、储存等方法的不同, 药材质量存在较大的差异, 造成目前药材质量不稳定和市场药材质量无法评价的局面。本研究通过采用HPLC法建立川牛膝药材指纹图谱, 为控制川牛膝药材的综合质量提供参考依据。
1 试验材料、试药、试剂与仪器
1.1 试验材料、试药、试剂
川牛膝药材:经成都中医药大学峨眉学院王书林教授鉴定为苋科植物川牛膝 (Cyathula officinalis Kuan.) 的干燥根, 符合2005年版《中国药典》规定, 见表1。
对照品:杯苋甾酮 (cyasterone) 由四川省中医药研究所提供。试剂:甲醇 (色谱纯) , 水为重蒸水, 其它试剂均为分析纯。
1.2 仪器
Waters2996-2695型高效液相色谱仪;Waters Empower化学工作站;KQ3200型超声波清洗器 (40KHZ, 120W) , 昆山市超声仪器公司;BP-211D型电子分析天平 (Max:210g, d=0.1mg) , 北京赛多利仪器系统有限公司) 。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱:Symmetry® C18 (5μm, 4.6×250mm, Waters公司) ;流动相:甲醇-水二元梯度洗脱, 如表2;流速:0.9ml/min;柱温:35℃;检测波长:266nm;进样量:20μl;运行时间:35min。
2.2 溶液的制备
2.2.1 对照品溶液的制备
取杯苋甾酮对照品适量, 精密称定, 加甲醇制成每1ml含60μg溶液, 即得。
2.2.2 样品溶液的制备
取川牛膝药材细粉 (批号7#) 5g (过四号筛) , 精密称定, 置于100ml锥形瓶中, 精密量取甲醇50ml, 振摇, 回流提取1h, 放冷, 加甲醇补足损失的重量, 摇匀, 水浴挥干, 残渣加甲醇使溶解, 定容至10ml, 0.45μm微孔滤膜滤过, 取续滤液, 即得[3,4,5,6]。
2.3 方法学考察
2.3.1 精密度试验
精密吸取对照品溶液20μl, 重复进样5次, ≥5%总峰面积的各共有峰相对峰面积的RSD在1.3263%～2.1634%之间, 表明精密度良好。
2.3.2 重复性试验
取同一批次的川牛膝药材6份, 按上述样品测定方法分别测定, ≥5%总峰面积的各共有峰相对峰面积的RSD在2.3013%～2.8706%之间, 表明方法重现性良好。
2.3.3 稳定性试验
取同一供试品溶液, 分别在0, 2, 4, 8, 12, 24h分别进样20μl, ≥5%总峰面积的各共有峰相对峰面积的RSD在2.1181%～2.5066%之间, 表明样品在24h内稳定。
2.4 指纹图谱相似度分析
2.4.1 共有峰的标定
根据18批次供试品测定结果所给出的峰数, 对峰值和峰位等相关参数进行分析、比较, 川牛膝药材高效液相色谱可分离出20多个色谱峰, 经与杯苋甾酮对照品对照, 并比较所有记录的色谱图, 选取11个共有峰作为指纹图谱的特征峰, 其中9号峰为杯苋甾酮。
2.4.2 共有图谱模式的建立
根据《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求 (暂行) 》, 以参照物峰 (S) 的相对保留时间和相对峰面积为1, 计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。杯苋甾酮为川牛膝药材中的主要有效成分, 且其峰面积在图谱中相对较大, 保留时间适中, 故选择杯苋甾酮为参考峰 (S) , 以其保留时间和峰面积为1, 计算各样品共有峰的相对保留时间和相对峰面积。
2.4.3 图谱相似度分析
根据18批样品的相对保留时间及指纹图谱的整体谱峰特点对峰进行匹配, 以相对方面积的平均值建立共有模式, 见图2, 以相关系数法对样品的相似度进行评价, 各样品相似度结果见表3, 结果表明, 大多数样品之间相似度良好, 都达到0.90以上, 平均相似度为0.906。
3 讨论
本课题首次将HPLC法运用到川牛膝药材的鉴定与质量评价中, 能更加有效地解决药材化学成分的多样性与复杂性的质量评价技术难题。本实验采用二极管阵列检测器对指纹图谱的检测进行了选择, 结果表明在检测波长266nm处, 色谱图所包含的信息量更大。从相似度分析结果来看, 18批川牛膝药材相似度均在0.9以上, 表现出良好的相似性。在川牛膝药材指纹图谱的共有特征峰中, 整体分离度较好, 能充分反映出川牛膝药材醇溶性物质的化学成分特征, 可用于川牛膝药材鉴定及内在质量评价。在本实验建立的川牛膝药材指纹图谱分析方法中, 杯苋甾酮的保留时间适中, 与相邻色谱峰达基线分离, 分离度良好。
本实验所建立的方法, 精密度、稳定性和重复性均符合指纹图谱研究的技术要求, 为进一步制订川牛膝质量评价标准提供了科学依据。
摘要：目的:采用HPLC法构建川牛膝药材的化学指纹图谱。方法:采用Waters2695高效液相色谱仪, 色谱柱为Symmetry (C18 (5μm, 4.6×250mm, Waters公司) ;流动相为甲醇-水二元梯度洗脱;流速为0.9ml/min;柱温为35℃;检测波长为266nm。结果:测定基地产及市场上流通的样品共18批次, 标示了11个共有峰, 其指纹图谱相似度均在0.9以上, 指纹图谱整体面貌基本一致。结论:该方法简便、快速、准确、重现性好, 为川牛膝药材的定性鉴别和药材内在质量评价提供了依据。
关键词：川牛膝,指纹图谱,HPLC
参考文献
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中药材指纹图谱的研究概况 篇10
关键词：中药材,指纹图谱,研究进展
中药指纹图谱已作为一种重要的中草药质量控制技术,它是指通过对中药材、中药材提取物或中药制剂等采用一定的处理方法和分析手段,得到的能够标示其化学特征的色谱图或光谱图。中药指纹图谱的研究已经从测定方法、构建模式等等多方面进行了较深入的研究,在建立中药化学成分系统研究模式、评价中药材、中药材中间品以及中药制剂质量的真实性、安全性、优良性和稳定性等方面表现出很好的作用,逐步成为一种药材或成药新的质量控制的手段和方法。目前,对中药材指纹图谱的研究较多,本文就中药材指纹图谱的建立方法等进行了较全面的综述。
1 DNA指纹技术在中药材鉴别中的应用
随着DNA鉴别技术如DNA指纹技术、PCR指纹分析法等的发展和应用,指纹图谱技术也逐步发展起来,中药材中均含有蛋白质、核酸等生命物质,因而DNA指纹技术成为中药材的鉴定有效手段之一。马小军等[1]采用扩增酶切片段多态性(AFLP)方法研究5种农家类型,结果5种人参农家类型多态位点仅46%,说明各农家类型之间的遗传差异性很小,但长脖的AFLP有相对较高的多态性,说明长脖类型内部有更多的杂合态个体,更接近野生人参;同时,他们[2]分析山参遗传多样性及其遗传特性,采用随机扩增多态DNA(RAPD)标记方法对7个来源地不同的山参和1个园参样品进行遗传多样性检测和遗传分析,结果用14个10mer寡聚核苷酸引物共检测111个位点,其中多态位点76个,占67.6%,远大于园参内的遗传变异,因此山参在人参育种上有很大利用价值。聚类分析表明,山参之间及其与园参之间的遗传变异,没有超出与近缘种西洋参之间的遗传差异;遗传因素在人参形态变异上的作用小于环境因素,这一结果为“山参”的培育提供了理论依据。王培训等[3]采用随机扩增引物DNA(RAPD)法,筛选适于鉴别南、北五味子的随机引物,结果总共筛选了80条随机引物,得到一条引物S429能准确区分南、北五味子,并且其重复性非常高,可利用随机引物S429通过RAPD准确区分南、北五味子。
2 高效液相色谱法(HPLC法)构建中药材指纹图谱的应用
高效液相色谱法法因其分离效能高、速度快等特点已成为指纹图谱应用最多的分析方法,同样也广泛应用于中药材指纹图谱的建立。张聪等[4]对同一组中国红参和高丽红参进行指纹谱(HPLC FPS)比较研究。刘丽娟等[5]研究了不同来源的刺五加药材,采用HPLC指纹图谱分析法,建立3个刺五加药材样品的指纹图谱。陈蕴等[6]采用HPLC法分析检测8个蝎毒样品,结果获得了蝎毒的指纹图谱。周晓英等[7]用高效液相色谱法建立红花的指纹图谱分析方法。潘馨等[8]应用RP-HPLC(DAD)对三七药材进行指纹图谱研究,该方法简便,重现性好,对三七的质量控制有很好的实际应用价值。
3 气相色谱法(GC法)构建中药材指纹图谱的应用
GC法也同样因为具有分离效能高、速度快等特点,尤其适用于含有挥发性成分中药材的分析。近来的研究中,GC法常与MS法联用用于中药和中药材的指纹图谱构建。高广慧等[9]建立了羌活挥发油指纹图谱测定方法,为含羌活中药制剂制定指纹图谱奠定基础,采用水蒸气蒸馏法提取不同产地羌活的挥发油,用毛细管气相色谱技术测定指纹图谱(GC FPS),选用聚类法分析比较,结果该方法灵敏度高,稳定性、重现性的RSD<3%,该气相色谱指纹图谱分析法与聚类分析可作为羌活药材的质量控制方法。魏刚等[10]采用GC-MS法对不同采集期石牌藿香,以及同基地栽培的高要、湛江藿香挥发油进行主成分比较分析,结果以11个主要共有峰为评价指标,GC-MS色谱条件的精密度、稳定性、重现性良好,固定产地的石牌藿香稳定性好,不同采收期主成分基本相同,其中广藿香酮的含量随种植时间的延长而明显增高,与同地栽培的高要、湛江藿香相比,广藿香酮、广藿香醇等含氧组分以及不含氧的倍半萜烯类主成分的相对含量均有明显差异,从而建立了石牌广藿香挥发油GC-MS分析色谱条件,初步拟定了石牌藿香挥发油特征指纹图谱指标成分群,阐明石牌藿香的道地特性。叶崇义等[11]采用程序升温毛细管气相色谱法,分析挥发油成分,建立了术类药材气相色谱保留指数(GC-RI)指纹谱,并根据色谱峰的重叠率和含量特征图分析对比,以此对术类药用植物种缘关系进行探讨,试图为生药品种鉴定、内在质量评价及药用植物分类学研究开辟一条新途径。
4 核磁共振法(NMR法)构建中药材指纹图谱的应用
秦海林等[12]对苦皮藤的1HNMR指纹图进行解析,采用硅胶柱色谱法分离苦皮藤根皮CGEA的化学成分,鉴定单体化合物的结构并对其进行1HNMR研究,结果不同来源的苦皮藤样品,其1HNMR指纹图有很好的重现性和高度的特征性,说明苦皮藤根皮的1HNMR指纹图可用于其基源鉴定,并主要显示了以上3个化合物的特征共振信号。王思宏等[13]研究长白山地区野生和栽培高山红景天核磁共振特征图谱,采用赵天增总提取物通用方法,用液-质联机作比较,同时以长白红景天作对比,结果采用赵天增总提取物通用方法,薄层层析后都可以得到有效成分红景天苷特征明显的核磁共振特征图谱,长白红景天有效成分红景天苷特征不明显的核磁共振特征图谱,根据野生和栽培高山红景天核磁共振特征图谱,可以成为高山红景天真伪鉴别的依据。
5 红外光谱法(IR法)构建中药材指纹图谱的应用
倪力军等[14]提出简便易行的对指纹图谱间相似程度进行量化评价的方法并开发用户友好的应用软件,对9个丹参提取物的红外图谱的相似度分析结果与实际情况分析其红外指纹图谱。结果红外图谱之间有很好的相似程度。周红涛等[15]首次运用傅里叶变换红外光谱技术对不同产地芍药根部的混合化学体系进行了全组分快速分析,对所获得的指纹图谱进行特征峰指认和对比分析,结果赤芍野生品与栽培品的红外吸收频率、吸收峰的相对强度都存在比较大的差异,多伦赤芍(道地药材)的红外吸收峰形状也有一定的特异性。
6 其他方法构建中药材指纹图谱的应用
目前,其他一些方法如薄层扫描法(TLCS)、高效毛细管电泳法(HPCE)等也应用到中药材的指纹图谱的研究中,还有一些是多种方法的综合应用。
王东等[16]为鉴别生熟地黄及考察熟地黄饮片质量的稳定性和一致性,建立了薄层色谱指纹图谱,采用乙酸乙酯∶丙酮∶甲酸∶水(3∶5∶1∶1)为展开剂,苯胺-二苯胺-磷酸溶液为显色剂,85℃加热至斑点显色清晰,色谱图谱及全通道扫描结果显示10批清蒸和10批酒炖样品间的相似程度较高,饮片质量比较均一、稳定,薄层色谱方法操作简单,图谱特征明显,可比性强,是一种可以快速鉴别药材真伪及考察药材质量是否稳定、一致的有效手段。
林文津等[17]建立了中药枇杷叶的高效毛细管电泳(HPCE)指纹图谱,采用正丁醇超声提取法制备品种、批次不同的枇杷叶供试液,以熊果酸对照品为内参考物,运用高效毛细管区带电泳法测定指纹图谱,并用相似度评价软件分析其相似度,结果所测定的13个品种枇杷叶样品,其指纹图谱相似度0.9以上有11个,0.9~0.8之间1个,0.8~0.7之间1个,指纹图谱整体面貌基本一致的,所建立的枇杷叶高效毛细管电泳指纹图谱稳定、可靠,可作为枇杷叶的特征指纹图谱。
苏娴等[18]建立了黄芪的RRLC/UV-MS指纹图谱分析方法,采用Agilent Zorbax Extend C18色谱柱(2.1 mm×100mm,1.8μm),以乙腈-0.1%甲酸为流动相进行梯度洗脱,流速0.3 m L.min-1,进样量0.5μL,柱温30℃,检测波长254 nm,结果建立了黄芪药材RRLC UV-MS指纹图谱分析方法,对11批样品进行了分析,其相似度均达到0.92以上。
7 构建中药材指纹图谱模式的研究
指纹图谱标准模式构建方面,有根据不同的方法构建指纹图谱的识别模式,都具有一定的可行性和科学性,而这些标准模式的建立正催化规范的、广泛适用的标准指纹图谱模式的出现。
尚刚伟等[19]提出中药“指纹-药剂学”方法论,意在为中药现代化提供一种具科学性、先进性、可行性及实用性的方法,在中药的研究过程中,采用现代科学方法和分离分析手段,在药物(复方、单方)、有效成分群和有效成分三个层次上进行研究工作,密切结合药效学研究与临床。
余杰等[20]提出研究中药材质量分析与评价的新方法,运用科学计算可视化原理,建立了仪器分析数据可视化技术,通过主成分分析和空间投影变换方法对药材的红外光谱分析数据进行预处理,实现特征提取和高维数据空间的降维,进而采用二维灰度图对变换后的数据进行可视化处理,获取中药材质量的特征指纹图谱,对野生、栽培桑白皮及其伪品共42个样品进行了测定,结果表明样品鉴别的准确率达到90.5%,从而说明该方法是一种具有重要发展意义的中药材质量鉴定新技术。
安金兵等[21]针对中药色谱指纹图谱中色谱峰面积值存在较大变异性的问题,从拟分布函数的角度介绍了一种新的分析方法,采用秩变换将色谱峰面积值转化为相对秩次,然后通过一系列变换将原数据转换成拟分布函数的形式,再利用柯尔莫哥洛夫检验实现不同类别样品的色谱指纹图谱之间的相似性分析,通过对北马兜铃和南马兜铃样品的比较,说明了该方法有较好的灵敏度和稳健性。
指纹图谱技术 篇11
关键词：气相色谱-质谱 指纹图谱 白酒 鉴别
中图分类号：TS261.7；O657.7+1文献标识码：A 文章编号：1672-5336（2014）10-0015-02
目前，随着生活质量的提高，人们对品牌酒及年份酒的需求量逐渐增加，从而也激发了一些不法分子利用这一强大的需求而从中作假，对标签的胡乱贴制、对白酒的随意勾兑、或者低档酒灌充高档酒，这些行为大大损害了消费者的利益，这样也使得如何区分和鉴别真假名优白酒受到广泛的重视。目前，我国鉴定白酒品质及种类主要还是依靠人的感官——品尝酒的口感和查看酒的色泽来进行断定，但是该方法需要專业的人员，且受感官等主观因素影响，难以保证准确性和稳定性。因此找到一种方便快捷而科学有效的方法迫在眉睫。
本研究利用GC-MS获得数十种不同品牌不同年份白酒的指纹图谱，然后建立模型，并采用相似度的计算方法对不同样品进行分类，考察这种方法在鉴别不同类型白酒中的应用价值。
1 实验部分
1.1 仪器及样品
气相色谱质谱联用仪（Agilent），带有自动进样器；毛细管色谱柱（DB-WAX 60m×0.25mm ID，0.25μm film）水为符合GB/T 6682规定的一级水。
样品：白云边5种年份酒，泸州老窖二曲酒，乐香醇，北京二锅头，红星二锅头（8年），郎酒，稻花香，泸州老酒坊（42%），枝江，关公坊，小迎驾，黄鹤楼8年，黄鹤楼10年，黄鹤楼12年，老郎酒，嘉宾郎酒，茅台液，泸州老酒坊（52%），枝江王，三星枝江，迎驾珍品酒坊，白云边陈年浓香酒，五粮醇，稻花香三麦酒。
1.2 试验方法
1.2.1 样品前处理方法
待测样品应保证包装完好，取样前应将酒样摇匀。在进样瓶（1.5mL）中加入酒样1ml，2%乙酸正戊酯溶液10μl，密封后充分混匀，待气相色谱-质谱分析。
1.2.2 实验参考条件
色谱柱：DB-WAX；载气为高纯度He；线速度：1cm/s；分流比：30：1；进样量：1μL；进样口温度：250℃；升温程序：初始温度35℃，保持 5min，10℃/min升温至220℃，保持1min，15℃/min升温至240℃，保持5min。
MS条件：电子轰击离子源（EI）；电子能量：70eV；离子源温度：230℃；四级杆温度：150℃；传输线温度：250℃；检测模式：选择离子扫描模式（SIM）。各化合物根据其特征离子的保留时间及峰面积进行定性、定量分析。
按照上面的方法对酒样处理后，用气相色谱-质谱仪器进行分析，选取相对比较明显的峰作为试验样品酒的特征峰，建立试验样品白酒的模板指纹图谱。
2 结果与讨论
2.1 酒样指纹图谱的建立
白云边12年样本色谱图如图1所示。
通过化学工作站检索彼岸准质谱库以及文献比确定了十几种特征峰，如表1所示。
2.2 方法的精密度
通过同一酒样连续分析数次，各项指标均在标准范围内。对同一酒样制备的6份样品分别进样分析，考察相对峰面积的RSD，结果均小于5%，说明分析方法的重现性良好。
2.3 指纹图谱模型的建立与依靠相似度进行分类
通过GC-MS采集到的指纹图谱，进行建模，然后从每瓶酒所测得的6个色谱图中随机选取2个作为测试样本，依靠相似度来进行分类，结果如图2。
图2中空心圆圈为测试样本的理论分类区域，红色*为测试样本通过分类程序，实际得到的结果。从图中我们可以看出，28瓶酒，56个测试样本，错分样本只有1个，正确率达到98.21%，模型识别结果良好。
2.4 建立鉴别真假白酒体系
通过对以上模拟样品的研究，建立的指纹模型比较成功的对不同类型白酒进行了分类。通过该指纹图谱模型可以判别部分含量较高的重要微量成分的比例关系的特点，同时结合感官品评，可以有一个相对科学公正的鉴定结果。
3 结语
本文建立了采用气质联用色谱分析相的方式区分不同种类白酒的方法及流程，以28瓶各不相同的白酒为基础，以其他国际标准为参考，建立了气相色谱指纹模型，应用这个模型成功识别了不同类型的白酒样品，效果良好。
这一想法对白酒鉴别真假的方式进行了一定的研究，但还应该丰富指纹模型库中样品的数量，以便用来增强所建立的模型的代表性，然后结合人为感官品尝进行综合判断。所建方法为白酒的真伪鉴定提供了技术储备。
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丹参药材指纹图谱建立方法研究 篇12
丹参, 为唇形科植物丹参Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根及根茎。秋季9—10月份采挖, 除去泥沙, 干燥。
丹参药材中有效成分主要分为两类:一类为水溶性的酚酸类成分 (丹参素、原儿茶醛和丹酚酸A、B、C等) , 另一类为脂溶性的二萜类成分 (丹参酮I、丹参酮II和隐丹参酮等) 。定性鉴别上述两类成分或定量测定其某种或多种有效成分含量, 已成为评价丹参及其制剂质量的重要方法[1]。据统计, 丹参制剂达100多种, 而丹参制剂中主要有效成分为水溶性的酚酸类成分, 考虑到原药材的质量控制与制剂质量之间的相关性, 我们主要对丹参药材水溶性酚酸类成分进行了指纹图谱的研究, 该类成分对紫外线具有较强的吸收值, 可采用HPLC-UV法建立制剂指纹图谱。
1 丹参指纹图谱研究情况
1.1 脂溶性成分的指纹图谱
丹参脂溶性成分的指纹图谱, 一般将药材经处理提取后, 以甲醇-水溶剂系统进行梯度洗脱。由于丹参药材、对照品以及使用仪器等条件的不同, 洗脱系统存在差异。徐德然[2]等以丹参酮ⅡA、隐丹参酮为对照进行指纹图谱研究。
目前获取指纹图谱的主要方法有色谱法、光谱法、X射线衍射法和分子生物技术等。其中, 色谱技术是近年来分析化学领域中发展快、应用广的方法之一。常用的色谱技术包括薄层色谱、液相色谱、气相色谱和毛细管电泳等[3]。其中, 高效液相色谱是液相品, 5%甲醇与0.1%乙酸-甲醇梯度洗脱, 在254 nm波长处检测, 用于不同产地丹参脂溶性成分指纹图谱的比较研究。
1.2 水溶性成分的指纹图谱
近10年来, 采用HPLC法分析技术对水溶性酚酸类化合物进行指纹图谱研究有显著的优势。研究中一般采用C18柱, 甲醇或乙腈同时加入酸抑制剂进行线性梯度洗脱, 分离效果较佳。周欣[4]等以丹参素钠、原儿茶醛为对照品, 乙腈-0.4%冰醋酸水溶液进行梯度洗脱, 检测波长254 nm, 建立了贵州铜仁地区丹参药材的HPLC水溶性共有指纹图谱;宋敏[5]采用甲醇-1.0%冰醋酸溶液梯度程序洗脱, 以丹参对照药材制备指纹对照品进行了色谱系统适用性试验, 并考察了梯度洗脱程序、流动相酸度以及色谱柱填充剂对指纹图谱重现性的影响。
1.3 有效成分的指纹图谱研究
随着丹参指纹图谱研究的深入, 丹参有效成分 (脂溶性和水溶性) 指纹图谱的研究也日益成熟。鉴于药材的有效成分理化性质差异较大, 实际操作中, 多采用水提、不同浓度甲醇提取等方法, 以含酸抑制剂的乙腈或甲醇为流动相, 建立丹参有效部位指纹图谱定性研究的分析方法。
刘艳华[6]等采用水提法, 以原儿茶醛为外标, 1%冰醋酸和1%冰醋酸甲醇溶液梯度洗脱, 检测波长270 nm, 建立了河南灵宝地区丹参药材的指纹图谱;郑晓珂[7]等以甲醇-0.5%冰醋酸梯度洗脱, 流速0.8 m L/min, 检测波长281 nm, 柱温35℃, 建立了丹参药材的指纹图谱;黎琼红[8]等采用甲醇为溶剂进行索提后, 以丹参酮ⅡA、原儿茶醛、丹参素钠为对照品, 0.02%磷酸乙腈-0.02%磷酸梯度洗脱, 40℃柱温, 检测波长280 nm, 建立了丹参药材的高效液相指纹图谱;刘洋[9]等采用水回流提取后甲醇超声的方法, 以丹参素、原儿茶醛、丹酚酸B、隐丹参酮、丹参酮I、丹参酮ⅡA为对照品, 用0.1%三氟乙酸水溶液-乙腈为流动相梯度洗脱, 检测波长270 nm, 柱温30℃, 在同一图谱中同时建立起水溶性成分和脂溶性成分的指纹图谱。
1.4 其他方法
近些年来, 随着毛细管电泳 (HPCE) 、高速逆流色谱 (HSCCC) 及HPLC-MS联用技术的发展, 这些技术已经被用于丹参指纹图谱的研究。
季一兵[10]等用毛细管电泳技术, 采用50μm×50 cm未涂渍毛细管柱, 20 mmol/L硼砂溶液作缓冲液, 运行电压为15 k V, 检测波长210 nm, 建立了丹参中药材的HPCE指纹图谱;顾铭[11]等采用HSCCC法, 以正己烷-乙醇-水体系采用分步洗脱, 建立了丹参药材中脂溶性成分的HSCCC指纹图谱;陈勇[12]等应用电喷雾-质谱 (ESI-MS) 技术研究了原儿茶醛和丹参素的ESI-MS规律, 并对丹参药材中已知的18种水溶性成分中的5种进行了质谱检测和电喷雾行为探讨, 初步制定了丹参药材的水溶性成分的特征图谱。此外, 汪红[13]等以丹酚酸B为指标, 以0.5%甲酸-乙腈为流动相, 检测波长287 nm, 得到其LC-MS (n) 特征图谱, 同时对图谱中7种主要化合物进行了精确归属, 初步探讨丹酚酸成分的ESI-MS (n) 规律。
徐曼[14]等还应用对照品对照和高效液相色谱-质谱联用技术对丹参注射液中的主要成分进行了定性分析, 测定了18个不同厂家生产的丹参注射液的HPLC-UV指纹图谱以及代表性厂家注射液的HPLC-DAD-MS图谱, 指认了其中的15个酚酸类成分, 研究结果显示, 18个不同厂家生产的丹参注射液在所含化学成分的数目和含量上差异显著。该方法可用于测定不同来源的丹参注射液的色谱指纹图谱, 并为丹参注射液的全面质量评价和生产工艺监控提供了可行的方法。
2 丹参水溶性成分指纹图谱建立方法试验
2.1 供试品溶液的制备
原药材质量标准研究主要是为了更好地控制制剂的质量, 因而在药材指纹图谱的研究中, 应充分考虑药材指纹图谱控制与制剂质量之间的相关性, 故在供试品溶液的制备时, 我们参考了制剂的制备工艺, 即以一定浓度的碱水进行提取。
2.1.1 丹参药材的粉碎
丹参药材需粉碎成细粉后进行提取, 粉碎前如药材含水量较高, 则应将药材低温干燥, 根据《中国药典》2010版丹参含量测定项下规定, 药材粉碎成过三号筛的药材细粉即可, 但我们在粉碎时发现有少量药材纤维难以粉碎过三号筛, 该部分应尽量粉碎后加入药材细粉混匀, 再称取样品, 以保证取样的均匀。
2.1.2 提取方式及溶剂的选择
考虑到丹参注射剂制剂的制备工艺采用水提醇沉和碱水解的工艺, 本药材提取方法拟采用碱水提取。首先对提取方式及提取溶剂进行了优选:称取药材粉末1.0 g, 共6份, 按表1进行提取, 提取时间为1 h, 各提取液滤过, 取续滤液5 m L, 加入等体积甲醇, 摇匀, 滤过, 取续滤液, HPLC分析。
结果显示, 以0.1%Na2CO3水溶液回流提取, 效果较好, 与中间体及制剂的色谱图相对吻合, 提示该提取溶剂较为适合。
为了更进一步地优选适宜的提取溶剂, 以0.1%Na2CO3为参考, 考察了多个不同浓度的Na2CO3水溶液:称取药材粉末1.0 g, 共8份, 按表2进行回流提取, 提取时间为1 h, 各提取液滤过, 取续滤液5 m L, 加入等体积甲醇, 摇匀, 滤过, 取续滤液, HPLC分析。
结果显示, 以0.08%Na2CO3水溶液回流提取, 样品色谱峰与半成品及制剂的指纹图谱吻合度相对较好, 因此, 最终选择提取方式为0.08%Na2CO3水溶液回流提取。
2.1.3 提取时间的选择
考察了不同的提取时间对图谱的影响:称取药材粉末1.0 g, 共3份, 精密加入25 m L 0.08%Na2CO3溶液回流提取, 提取时间按表3进行, 提取结束, 取续滤液5 m L, 加甲醇5 m L, 混匀, 滤过, 取续滤液, HPLC分析。
药材回流提取1 h及2 h, 色谱峰差异较小, 指纹图谱的吻合度较好, 考虑到节约时间, 选择提取回流时间为1 h。
药材供试品溶液的制备确定为:称取丹参药材粉末 (过三号筛) 1.0 g, 置具塞圆底烧瓶中, 加0.08%Na2CO325 m L, 称定重量, 加热回流1 h, 放冷, 加0.08%Na2CO3补足失重, 滤过, 精密量取续滤液5 m L置10 m L量瓶中, 甲醇定容, 摇匀, 滤过, 取续滤液, 即得。
2.2 检测方法选择
考虑到药材提取液中主要含水溶性的酚酸类成分, 并参考了丹参注射剂等制剂有效成分的检测条件, 选用HPLC-UV法进行分析, 具体的测试条件、方法考察如下:
2.2.1 仪器和试剂
HPLC仪器:Agilent 1100 G1311A Quart Pump, VWD紫外-可见检测器, 全自动进样器, Agilent LC色谱工作站。
溶剂:甲醇为色谱纯 (汉邦科技有限公司) , 乙腈为色谱纯 (Tedia company) , 三氟乙酸、冰醋酸均为色谱纯, 水为亚沸蒸馏水, 其余试剂均为分析纯。
2.2.2 流动相选择
(1) 甲醇:酸水系统; (2) 乙腈:酸水溶液系统。
试验优选了两种系统的流动相条件 (甲醇为流动相A, 乙腈为流动相B, 酸水溶液为流动相C) , 试验结果如表4~表8所示。
试验结果表明, 在乙腈-酸水溶液系统下该制剂中整体色谱峰能呈现良好的分离, 0.1%三氟乙酸水与0.5%冰醋酸水效果相当, 考虑到大部分丹参制剂含量测定中使用的酸水为0.5%冰醋酸水, 因此指纹图谱流动相条件最终确定为梯度 (5) 的方法。
2.2.3 测定波长选择
对丹参样品进行了全波长 (190~400 nm) HPLC测试, 结果显示, 在281 nm测定波长下整体色谱峰较好, 有效成分能够充分体现, 因此选择测定波长为281 nm。
2.3 色谱柱选择
(1) C18柱:Hedera C18 (250 mm×4.6 mm, 5μm) , 江苏汉邦科技有限公司; (2) C18柱:Kromasil C18 (250 mm×4.6 mm, 5μm) , 大连依利特公司; (3) C18柱:Phenomenex C18 (250 mm×4.6 mm, 5μm) , 菲罗门公司。
在上述条件下, 3支以上规格C18色谱柱样品的HPLC色谱图均能达到分离要求, 考虑简便、经济的因素, 我们选择江苏汉邦科技公司的Hedera C18色谱柱。
2.4 延时测试
丹参药材供试液指纹图谱延时测试, 延长测试时间1倍至2 h, 药材色谱图中未见明显的成分滞后峰, 如图1所示。
2.5 精密度试验
同一批丹参药材供试液, 连续进样6次进行精密度测定, 测定结果如表9、表10所示。结果表明, 供试液中各共有峰的相对保留时间及主要峰的峰面积比值基本一致 (RSD%≤5%) , 符合指纹图谱的技术要求。
2.6 稳定性试验
同一批丹参药材同法制备供试液6份, 依法测定, 结果分别如表11、表12所示。结果表明, 供试液中各共有峰的相对保留时间及主要峰的峰面积比值基本一致 (RSD%≤5%) , 符合指纹图谱的技术要求。
注:表中S为参照峰、t R为保留时间、ts为参照峰保留时间、A为峰面积、As为参照峰峰面积。
2.7 重复性试验
同一批丹参药材同法制备供试品液6份, 依法测定, 结果分别如表13、表14所示。结果表明, 供试品液中各共有峰的相对保留时间及主要峰的峰面积比值基本一致 (RSD%≤5%) , 符合指纹图谱的技术要求。
2.8 丹参药材指纹图谱测定
2.8.1 标准指纹图谱制备
取19批丹参药材, 依法制备, 分别精密吸取供试品溶液各10μL, 注入液相色谱仪, 测定19批丹参药材60 min指纹图谱, 发现石家沟的丹参药材图谱有较大差异, 所以将其舍去, 考察剩余18批丹参药材的相似度。
图谱采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版》软件对多批制剂指纹图谱进行处理:从中选择1张图谱为对照图谱, 对色谱峰进行自动匹配后生成“对照图谱”, 将该图谱作为本丹参药材的标准指纹图谱, 如图2所示。
2.8.2丹参药材指纹图谱测定
对以上各批丹参药材以标准指纹图谱为对照进行相似度评价, 采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004B版》软件进行处理:以标准指纹图谱为对照图谱, 自动匹配后, 进行相似度评价, 结果如表15所示。
结果显示, 以标准指纹图谱为对照, 18批药材与之相似度均大于0.960, 符合指纹图谱要求。
3 结语