化学指纹图谱

化学指纹图谱（共9篇）

化学指纹图谱 篇1

摘要：目的 针对中药三棱高效液相色谱 (HPLC) 图谱中的主要化学成分建立指纹图谱分析方法, 并对指纹图谱中的指纹峰进行指认。方法 利用HPLC方法梯度洗脱。色谱条件为:Agilent Poroshell 120 SB-C18色谱柱 (4.6 mm×100 mm, 2.7μm) , 流速0.6 mL/min, 柱温25℃, 流动相A为乙腈, 流动相B为甲酸水, 流动相A梯度洗脱 (0%～100%乙腈) , 分析时间为60 min。结果 建立了以13个共有峰为特征信息的三棱HPLC指纹图谱;并指认了8个化合物;对21批三棱药材进行相似度评价, 相似度都在0.89以上。结论 三棱中的主要化合物为有机酸和苯丙素类;实验建立的分析方法准确可靠, 重现性好, 可作为三棱质量评价的依据。

关键词：三棱,成分指认,指纹图谱,高效液相色谱法,质量控制

三棱系黑三棱科黑三棱属植物黑三棱 (Sparganium stoloniferum Buch.-Ham.) 的干燥块茎, 冬季至次年春采挖, 洗净, 削去外皮, 晾干, 以块茎人药。此中药味苦、性平, 入肝、脾经。具有破血行气、消积止痛等功能, 是活血化瘀的中药[1]。三棱的化学成分复杂, 目前已分离的化合物种类有挥发油类, 黄酮类, 有机酸类, 苯丙素类和甾体类[2,3,4,5]。现代药理研究表明, 三棱具有抗血小板聚集和抗血栓作用, 同时还具有抗炎镇痛、抗肿瘤, 保肝等药理活性[6,7,8]。三棱在民间主治气血凝滞、经闭、产后淤血腹痛、饮食积滞、跌打损伤等病症[9,10,11]。然而, 其化学成分和临床应用之间的关系仍未阐明。本研究首次建立了三棱的HPLC指纹图谱, 并对其主要成分进行了指认, 为谱效关系探索和药材科学质量控制提供了依据。

1 仪器与材料

Agilent 1100高效液相色谱仪;色谱柱:Agilent Poroshell 120SB-C18色谱柱 (4.6 mm×100 mm, 2.7μm) (安捷伦科技) ;中药图谱相似度软件由国家药典委员会推荐版本。三棱对照品购自上海华谊生物, 乙腈为进口色谱纯;其余试剂均为分析纯;水为Millipore超纯水。

对羟基苯甲酸, 香草酸, 1-O-阿魏酸-3-对香豆酸甘油酯和香兰素由本实验室分离纯化得到, 原儿茶酸, 咖啡酸和对香豆酸购自上海华谊生物, 纯度>98%。三棱二苯乙炔亦由本实验室分离获得, 但由于结构的特殊性导致不稳定, 纯度约为80%, 杂质主要为小极性物质。从全国各地药店及药材市场先后收集20批三棱药材, 均由上海中医药大学崔亚君教授鉴定, 对照药材购自中国药品生物制品检定所, 见表1。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱为Agilent Poroshell 120 SB-C18柱 (4.6 mm×100mm, 2.7μm) , 在线过滤器为Agilent Poroshell 120 SB-C18 (4.6μm×0.2μm) , 流动相A-乙腈, B-0.1%甲酸;二元梯度洗脱:0~13 min, 10%~17%A;13~22 min, 17%~33%A;22~33 min, 33%A;32~34 min, 33%~35%A;34~45 min, 35%A;45~60 min, 35%~100%A;体积流量:0.6 mL/min;柱温:25℃;进样量:10μL;检测波长:300 nm。

2.2 对照品溶液的制备

精密称取对羟基苯甲酸, 原儿茶酸, 香兰素, 咖啡酸和对香豆酸适量, 配制成0.02 mg/mL的溶液;精密称取香草酸, 三棱二苯乙炔和1-O-阿魏酸-3-对香豆酸甘油酯适量, 配制成0.01 mg/mL的溶液, 作为对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备

三棱药材粉碎后过80目筛, 精密称取药材粉末2.0 g, 加入50 mL甲醇, 80℃加热回流提取1 h, 药液减压蒸干后定容至5 mL, 经滤膜 (0.22μm) 滤过, 即得。

2.4 方法学考察

2.4.1 精密度试验

同一份供试品溶液按“2.1”项色谱条件连续测定6次, 测得各主要色谱峰的相对保留时间RSD均<0.3%, 相对峰面积RSD均<2.5%, 表明本方法精密度良好。

2.4.2 重现性试验

同一批药材样品6份按“2.3”项方法平行制备, 按“2.1”项色谱条件测定, 测得各主要色谱峰的保留时间RSD均<0.2%, 相对峰面积的RSD均<3.0%, 表明本方法重现性良好。

2.4.3 稳定性试验

取同一份供试品溶液, 置室温条件下, 按“2.1”项色谱条件, 分别于0、2、4、8、11、24 h进行测定, 测得各主要色谱峰的相对保留时间RSD均<3.0%, 相对峰面积的RSD均<1.0%, 表明样品在24 h内稳定。

2.5 指纹图谱的建立及相似度评价

2.5.1 共有峰的标记

对21批三棱进行指纹图谱分析, 以对香豆酸作为参考峰, 以峰的共有率>80%为依据, 标定了13个共有峰, 分别是1号 (9.227 min) 、2号 (10.041 min) 、3号 (11.008 min) 、4号 (13.365 min) 、5号 (14.208 min) 、6号 (14.961 min) 、7号 (20.363 min) 、8号 (24.778 min) 、9号 (29.869 min) 、10号 (30.889 min) 、11号 (31.679 min) 、12号 (40.087 min) 、13号 (41.414 min) 。

2.5.2 化合物的指认

8个标准品的液相色谱图和紫外光谱图如图1所示, 其化学成分如表2所示。图1中化合物1为原儿茶酸, 化合物2为对羟基苯甲酸, 化合物3为香草酸, 化合物4为咖啡酸, 化合物5为香兰素, 化合物6为对香豆酸, 化合物7为1-O-阿魏酸-3-对香豆酸甘油酯, 化合物8为三棱二苯乙炔。

2.5.3 相似度计算

将21批从不同产地收集的三棱药材分别按“2.3”方法制备, 按“2.1”项色谱条件测定并建立指纹图谱。将所得图谱导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”软件分析, 经校正及色谱峰匹配, 得出各样品指纹图谱与对照药材的相似度, 结果见表3。从各批药材的HPLC图谱与相似度系数可以看出, 不同批次三棱药材无显著差异。

2.5.4 聚类分析

经SPSS数据统计软件将21个样品的共有峰数据, 采用组间对比 (between groups linkage) 进行聚类, 用余弦法 (cosine) 计算样品相似度, 聚类结果见图3。从树状聚类图中看到, 21个样品大体上聚为2类, S11, S18, S21为一类, 其余为第二类。S11, S18, S21批次药材的香兰素和三棱二苯乙炔成分含量较高。

2.5.5 样品主成分分析 (PCA)

把21批样品的指纹图谱导入SPSS软件, 进行主成分分析。如图4所示, S11, S18, S21, S20四个产地样品与大部分三棱样品存在差异。

3 讨论

3.1 提取方法的考察

考察了加热回流法, 超声提取法和微波萃取法, 结果发现:超声提取和微波萃取两种方法效果相同, 但均没有加热回流提取法收率高。同时对提取溶剂甲醇、乙醇、石油醚、乙酸乙酯、氯仿、正己烷和水进行了考察, 发现以甲醇为提取溶剂的热回流法收率最高。

3.2 色谱条件的优化

筛选多种流动相体系, 乙腈-水, 乙腈-磷酸水和乙腈-醋酸水, 甲醇-水, 甲醇-磷酸水体系。结果表明, 乙腈-0.1%醋酸水体系分离效果较好。分析时采用梯度洗脱, A相为乙腈, B项为0.1%醋酸水, 经比较洗脱条件, 最后确定梯度程序为:0~13 min, 10%~17%A线性洗脱;13~22 min, 17%~33%A线性洗脱;22~33 min, 保持33%A;32~34 min, 33%~35%A线性洗脱;34~45 min, 保持35%A;45~60 min, 35%~100%A线性洗脱, 每次运行后平衡色谱柱10min。在此条件下, 各个色谱峰分离度较好, 保留时间适中。

本实验对21批三棱药材进行了HPLC指纹图谱构建和解析, 标定了13个共有峰, 计算了药材的相似度, 对这21批药材进行了系统聚类分析和主成分分析, 将药材分成两类。相似度结果显示, 各地药材与对照药材相比无显著差异。但对其进行聚类和主成分分析后发现, 对照药材, 湖南和昆明产地三棱药材中香兰素和三棱二苯乙炔成分含量较高。

化学指纹图谱 篇2

丹参药材的HPLC指纹图谱

建立了丹参药材的高效液相指纹图谱.研究了不同的`预处理方法、流动相组成、最佳检测波长等操作因素对丹参指纹谱图的影响,并对4处不同产地的丹参药材的指纹图谱进行了比较.色谱条件:SinoChrom ODS-BP(250 mm×4.6 mm,5 μm);检测波长为270 nm;流动相为甲醇-0.002 mol/L四丁基溴化铵水溶液(体积比为6:1);流速:1.0 mL/min;柱温为室温.

作 者：阎正 阎海荣 赵坤娇 马春艳 YAN Zheng YAN Hai-rong ZHAO Kun-jiao MA Chun-yan  作者单位：河北大学化学,与环境科学学院,河北,保定,071002 刊 名：河北大学学报（自然科学版）  ISTIC PKU英文刊名：JOURNAL OF HEBEI UNIVERSITY(NATURAL SCIENCE EDITION) 年，卷(期)： 28(1) 分类号：O657.7 关键词：丹参药材   HPLC   指纹图谱  

化学指纹图谱 篇3

中药指纹图谱技术是一种表征中药所含成分与其质量关系的有效手段, 但目前采用相似度评价, 不能对所含成分进行立体多维的整体分析, 而化学模式识别能实现中药多维信息的综合分析, 已广泛应用于中药材及中成药的研究[7,8,9,10,11]。因此, 本实验以清开灵软/硬胶囊为研究对象, 对比两者指标性成分含量, 进一步采用HPLC-DAD建立清开灵软硬胶囊指纹图谱, 再结合模式识别方法对清开灵软/硬胶囊化学成分进行整体性分析, 为进一步谱效关系、体内吸收、代谢等深入研究奠定基础, 也为不同剂型比较研究提供一种新手段。

1 仪器与试药

日本岛津高效液相色谱仪 ( LC-20AD泵, SIL-20A自动进样器, SPD-M20A检测器) ;KQ5200DA型数控超声波清洗器 ( 昆山市超声仪器有限公司) , 分析天平 ( 赛多利斯仪器系统有限公司) ; G20 型医用离心机 ( 北京白洋医疗机械有限公司) 。

黄芩苷对照品 ( 中国食品药品检定研究院, 批号: 110715-201318) ; 栀子苷对照品 ( 中国食品药品检定研究院, 批号: 110749-201115) ; 绿原酸对照品 ( 中国食品药品检定研究院, 批号: 110753-201314) ;胆酸对照品 ( 中国食品药品检定研究院, 批号:100078-201415) ; 猪去氧胆酸对照品 ( 中国食品药品检定研究院, 批号: 100087-201411 ) ; 甲醇、乙腈 ( Fisher公司, 色谱纯) ; 磷酸 ( TED公司, 色谱纯) ;哇哈哈纯净水 ( 杭州娃哈哈集团有限公司) ; 清开灵软胶囊 ( 神威药业集团有限公司, 批号: 14072411, 15052042, 15051641, 15051941, 15051841, 15051942, 15052041, 15052241, 15051741, 15052111, 15052141, 每粒0. 4 g, 含黄芩苷20 mg) , 清开灵硬胶囊 ( 广州白云山明兴制药有限公司, 批号: 141208, 140607, 548902, 549009, 141001, 140711, 141041, 549010, 141143, 150142, 140512, 每粒0. 25 g, 含黄芩苷10 mg) 。

2 实验方法与结果

2. 1 胆酸、猪去氧胆酸、绿原酸、栀子苷、黄芩苷5种指标性成分含量测定

线性关系考察、精密度、稳定性、重复性及加样回收率均参照2015 版《中华人民共和国药典》四部 ( 药品质量标准分析方法验证指导原则9101) , 结果均符合要求。样品含量测定结果表明胆酸、栀子苷、黄芩苷含量均在药典含量限定范围内。按临床口服剂量 ( 软胶囊口服1 粒/次, 硬胶囊口服2 粒/次) 计算结果表明软/硬胶囊中绿原酸和栀子苷含量差异较大, 胆酸、猪去氧胆酸和黄芩苷含量差异较小。

2. 2 清开灵软/ 硬胶囊指纹图谱研究

2. 2. 1 色谱条件Phenomenex Luna RP C18色谱柱 ( 250 mm × 4. 6 mm, 5 μm) ; 流动相 ( A) 0. 4% 磷酸的水溶液- ( B) 甲醇-乙腈 ( 体积比为4 ∶ 1) , 梯度洗脱; 流速1. 0 m L /min; 柱温: 30℃ ; 进样量为5 μL; 检测波长254 nm。梯度洗脱程序: 0 ~ 15 分钟, 5% ~ 30% B; 15 ~ 22 分钟, 30% ~ 35% B;22 ~ 40 分钟, 35 % ~ 40 % B; 40 ~ 43 分钟, 40% B;43 ~ 55 分钟, 40% ~ 81% B; 55 ~ 60 分钟, 81% ~ 90%B; 60 ~ 65 分钟90% B。

2. 2. 2溶液的配制软胶囊供试品的制备: 取1. 2 g硅藻土置于蒸发皿中, 精密称定, 再取软胶囊内容物0. 4 g, 精密称定于上述蒸发皿中, 研匀后, 将其全部转入锥形瓶中, 精密加入70% 甲醇25 m L, 密塞, 称定重量, 超声70 分钟 ( 功率200 W, 频率40 KHz) , 再称定重量, 用70% 甲醇补足减失的重量, 摇匀, 吸取5 m L以10000 rpm离心10 分钟, 上清液经0. 45 μm微孔滤膜过滤, 取续滤液, 即得。

硬胶囊供试品的制备: 取清开灵硬胶囊内容物0. 5 g, 精密称定, 将其全部转入锥形瓶中, 精密加入70% 甲醇25 m L, 密塞, 称定重量, 超声70 分钟 ( 功率200 W, 频率40 KHz) , 再称定重量, 用70% 甲醇补足减失的重量, 摇匀, 吸取5 m L以10000 rpm离心10 分钟, 上清液经0. 45 μm微孔滤膜过滤, 取续滤液, 即得。

黄芩苷对照品溶液的配制: 称量黄芩苷对照品适量, 加70% 甲醇超声溶解, 配制成含黄芩苷100 μg / m L的对照品溶液。

2. 2. 3 指纹图谱分析方法及数据处理方法中药色谱指纹图谱相似度评价系统 ( 2004A版) 进行指纹图谱分析。多元数据分析和建模均由SIMCA-P11. 5 软件及SPSS 16. 0 来完成。

2. 2. 4 清开灵软/ 硬胶囊指纹图谱方法学考察精密度、稳定性、重复性考察均参照《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求 ( 暂行) 》, 以黄芩苷色谱峰作为参照峰, 统计各共有峰的相对保留时间和相对保留面积, 计算RSD值, 共有峰相对保留时间及相对保留面积的RSD值均小于3% , 符合指纹图谱研究技术的要求。

2. 2. 5 样品测定取11 批清开灵软胶囊, 11 批清开灵硬胶囊, 分别按2. 2. 2 项下对应的方法制备各供试液并按2. 2. 1 项下色谱条件进样检测, 并用中药指纹图谱相似度计算软件进行分析, 考虑到黄芩苷峰面积过大, 会影响相似度计算的准确性, 因此在相似度计算时将其剔除。结果标示出了清开灵软胶囊21 个共有峰 ( 如图1) , 共有峰面积所占总面积比例为87. 18% 。标示出了清开灵硬胶囊16 个共有峰 ( 如图2) , 共有峰面积所占总面积比例为84. 40% 。所得11 批次清开灵软胶囊的相似度为0. 994、0. 993、0. 995、0. 992、0. 92、0. 998、0. 992、0. 994、0. 989、0. 992、0. 976; 11 批硬胶囊相似度结果为0. 992、0. 973、0. 995、0. 944、0. 989、0. 977、0. 981、0. 946、0. 994、0. 975、0. 991。说明清开灵软硬胶囊各自批次之间具有高度相似性, 同时由软/硬胶囊的HPLC对比色谱图可直观得到, 两者之间化学成分种类及峰面积大小均有一定差异 ( 如图3, 箭头标出) , 为了更加形象和确切地说明清开灵软/硬胶囊的成分差异, 拟采用模式识别技术对其进行整体性分析, 判别两者之间的差异。

2. 3 色谱峰的峰匹配及数据转化

通过中药色谱指纹图谱相似度评价系统, 将10个较大峰进行保留时间对比, 把清开灵软/硬胶囊各11 批的图谱进行峰匹配, 数据导出后经原始数据、离差标准化及Z-score标准化三种方式处理, 导入到SIMCA-P 11. 5 软件中, 比较所建模型的各相关参数, 结果见表1。由表1 可得, 数据经Z-score标准化处理后, 在PCA模型及PLS模型中各相关参数最优, 因此在接下来建模中对数据进行Z-score标准化预处理。

2. 4基于PCA模型对清开灵软/ 硬胶囊进行整体性评价

通过将数据导入SIMCA-P中, 得3 个主成分模型, 模型的R2X = 0. 712, Q2= 0. 452, 说明模型的解释能力较高, 符合实验要求。分别绘制出PCA得分图 ( 见图4) 、PCA得分与载荷汇总图 ( 见图5) 。

由得分图 ( 图4) 结果可知, 软硬胶囊11 批次各自聚集在一起, 说明各自批次间具有高度相似性, 与指纹图谱相似性计算结果一致, 而两剂型组分别分布在得分图左右象限各两边, 说明两组之间存在明显差异, 硬胶囊中第四个样品超出95% 置信区间, 但对比其色谱图发现差异不大, 因此将其保留, 这也说明硬胶囊与软胶囊相比, 其离散程度更大, 提示硬胶囊的生产工艺可能不如软胶囊稳定。由得分与载荷汇总图 ( 图5) 可知, 总变量的整体分布趋势大致集中在左右象限对应的软硬胶囊样本各两边, 有少数分布在原点附近, 根据PCA相似相近的原理, 变量距离哪个样本近表明其在相应的样本中含量越高, 距离越远表明其含量越低或不存在于该样本中, 而两剂型组间变量分布各自集中在左右象限两端且相互距离较远, 说明软/硬胶囊两种制剂的化学成分在种类或含量上存在较大差异, 这种差异有可能由不同的生产工艺及原料来源不同导致。绿原酸 ( 峰号59) 、栀子苷 ( 峰号66) 和黄芩苷 ( 峰号82) 在22 个样本中的分布比例图 ( 图6) 显示绿原酸与栀子苷在软硬胶囊中含量差异较大 ( 为一折线) , 黄芩苷含量差异较小 ( 为一直线) , 这与HPLC含量测定结果相一致 ( 由于黄芩苷含量较绿原酸、栀子苷含量高很多倍, 因此将绿原酸、栀子苷分布比例图放大) 。

2. 5 清开灵软/ 硬胶囊组间差异化学成分的筛选

为考察引起两种制剂间差异的化学成分具体有哪些, 进行PLS建模分析。通过将数据导入SIMCA-P中, 得2 个主成分, 模型的R2X为0. 626, R2Y为0. 998, Q2为0. 992, 能够解释62. 6% 的X变量, 解释99. 8% 的Y变量, 交叉有效性为99. 2% , 解释指标及预测指标均较高, 模型拟合较好。分别绘制出预测值与观测值拟合曲线图 ( 图7) 、得分与汇总图 ( 图8) 、各化合物系数图 ( 图9) 、和各化合物VIP值图 ( 图10) 。

由图7 可见PLS模型的预测值与观测值基本一致, R2= 0. 9976, RMSEE = 0. 0527, 模型较好, 能够很好地通过模型预测Y。

由图8 可见, 与PCA模型类似, 软硬胶囊两组分布在得分与载荷图左右象限, 说明两剂型具有明显差异。由图9 可得, 59 个峰对应的化学成分浓度在软胶囊中高, 40 个峰对应的化学成分浓度在硬胶囊中高。其中除峰号82、41、56、18、39、63、84、43、15、54、36、2、92、30、31、86、37、20、73、28、76、79、42、24、69、87、32、12、46、27 共30 个峰没有较大差异 ( 如图9 灰色部分) 外, 其余峰对应的化学成分均存在较大差异。由图10 可得, 共53 个峰 ( 图10 中标绿部分) VIP值均大于1, 说明这53 个峰对应的化学成分对软硬胶囊两组间差异贡献较大。通过将第一主成分loading值、系数分布及VIP值 ( 阈值> 1) 相关参数总值| r| 对比, 再结合色谱峰比对及T检验 ( 阈值P < 0. 05) , 结果见表2, 由表可得, 共16 个峰的总值|r|均大于1, 色谱峰对比得到其保留时间及峰响应强度, t检验P值均小于0. 0001, 说明组间存在显著差异, 因此最终确定峰号17、19、40、48、59、60、66、70、75、77、78、81、83、90、94、97 共16 个峰对应的化学成分是引起组间差异的主要化学成分, 即为潜在标志物, 其中59、66 号峰鉴定为绿原酸及栀子苷。

3 讨论

本实验采用HPLC-DAD法建立清开灵软/硬胶囊指纹图谱并同时测定绿原酸、栀子苷、黄芩苷三种成分, 在192 nm下同时测定胆酸和猪去氧胆酸2 个有效成分, 相比较通用的单个成分测定及胆酸成分的HPLC-ELSD测定, 方法简便、准确、可靠, 可以实现5种成分的快速定量分析, 多成分定量结合指纹图谱可为清开灵软/硬胶囊的质量评价提供实验数据基础。

由清开灵软/硬胶囊指纹图谱相似度计算结果可得出清开灵软/硬胶囊各自批次之间没有较大差异性, 而PCA及PLS分析得出清开灵软硬胶囊两种剂型存在明显差异, 说明两者之间差异主要不是来自于批次本身, 而是由于不同厂家原料来源及生产工艺不同所导致。硬胶囊与软胶囊相比, 其离散程度更大, 由于在硬胶囊的生产工艺中, 缺少醇沉的纯化工艺, 由此造成的批间差异要大于软胶囊, 也提示硬胶囊的生产工艺不如软胶囊稳定。5 个指标性成分的含量测定结果表明两者之间的化学成分含量有一定的差异, 其中通过PCA模型对绿原酸、栀子苷、黄芩苷三种指标性成分对应的色谱峰提取分析, 所得结果与指标性成分含量测定结果一致, 2 种方法得到相互印证, 也从侧面反映出所建模型的可行性。最后通过进一步归纳, 分析得出59 个化学成分浓度在软胶囊中高, 40 个化学成分浓度在硬胶囊中高, 得到对两者差异性贡献度最大的16 个成分 ( 其中两个成分鉴定为绿原酸和栀子苷) , 即为潜在的标志物, 说明两者化学成分差异较大。

化学指纹图谱 篇4

利用随机多态扩增DNA(RAPD)分子标记对53个墨西哥落羽杉无性系的研究表明:31个随机引物共扩增出了241条谱带,其中118条谱带在无性系间呈现多态性,多态位点占48.96%;用POPGENE软件对无性系进行遗传分析,得出无性系间的`遗传距离为0.271～0.537,说明无性系间的遗传差异相对较大.通过聚类分析将53个优良无性系分为两大类,同时利用RAPD分子标记构建了53个无性系的指纹图谱,可对墨西哥落羽杉优良无性系进行区分和鉴定.

作 者：周玉珍 李火根 张燕梅 滕士元 黄敏仁 ZHOU Yu-zhen LI Huo-gen ZHANG Yan-mei TENG Shi-yuan HUANG Min-ren  作者单位：周玉珍,ZHOU Yu-zhen(北京林业大学园林学院,北京,100083;吴江苗圃有限公司,江苏,苏州,215222)

李火根,张燕梅,黄敏仁,LI Huo-gen,ZHANG Yan-mei,HUANG Min-ren(南京林业大学森林资源与环境学院,江苏,南京,210037)

松子仁的红外指纹图谱鉴别 篇5

1 仪器与试剂

1.1 仪器

傅里叶变换红外光谱仪 (Thermo Scientific Nicolet is5) , 扫描范围4000~400 cm-1;HY-12型红外压片机 (天津天光光学仪器有限公司) 。

1.2 药品与试剂 溴化钾, 光谱纯 (天津市津科精细化工研究所) ;红松种仁、华山松种仁、马尾松种仁均购自广州南北行中药行饮片有限公司, 批号分别为C20140810、L20140909、S20140623。

2 试验方法

2.1 试样制作

分别取药材低温粉碎成200目, 准确称量药材细粉按1:100比例加入溴化钾, 在红外光灯下研磨至均匀, 取适量放入红外压片机模具内, 在压力10 MPa条件下作用25 s, 制成均匀透明样品片。取纯溴化钾按同上方法压片作为空白片。

2.2 光谱扫描

以空白片为背景进行扫描, 设定扫描次数为10次, 分辨率4 cm-1, 取上述药材压制成的溴化钾片在4000~400 cm-1下进行测定:每个样品片变换5次扫描位置, 获得5个光谱图, 取平均值作为单个样品的光谱图, 所有光谱图都扣除空白背景光谱。原始光谱数据首先进行多点基线校正, 除去基线影响后将预处理后的光谱数据用软件进行标准归一化, 以消除不同样本的差异化影响, 最后用Thermo Scientific OMNIC处理软件绘制药材粉末的特征红外光谱, 在4000~400 cm-1区域进行详细分析, 见图1~4。

3 结果

3.1 红松、华山松、马尾松种仁的药材粉末红外光谱分析

在3385 cm-1附近有一个极强且宽的吸收峰, 其为水分子吸收峰;2830 cm-1是甲基和亚甲基伸缩振动区;1750~1500 cm-1是酰胺和羰基振动区;1500~1100 cm-1为蛋白质、脂肪酸混合振动吸收区;1200~500 cm-1主要是多糖吸收区[5]。通过红外光谱可以看出松子仁主要含有蛋白质、脂肪酸、脂类化合物、多糖等。

3.2 红松、华山松、马尾松种仁的药材粉末红外光谱比较

3种药材粉末的红外光谱图基本相似, 均有9个基本一致的共有吸收峰: (764.1±5.0) cm-1、 (861.1±5.0) cm-1、 (1023.7±5.0) cm-1、 (1156.8±5.0) cm-1、 (1448.4±5.0) cm-1、 (1517.3±5.0) cm-1、 (1627.9±5.0) cm-1、 (2930.1±5.0) cm-1、 (3365.1±5.0) cm-1。但华山松种仁在420 cm-1处峰形明显, 在500~600 cm-1处峰较尖锐, 1000~1500 cm-1吸收较弱;红山松种仁与马尾松种仁均在817.9 cm-1附近吸收峰明显增强, 但红山松500~1000 cm-1吸收较强, 与其他两者多出875.6 cm-1及701.5 cm-1吸收峰, 马尾松在1355.3 cm-1附近裂开3个吸收峰, 见图1~3。

3.3 3种药材粉末2阶导数红外光谱比较 华山松种仁在501.5 cm-1处有一尖锐峰, 600.9 cm-1处峰强度与698.3 cm-1强度相当;红松种仁在521.1 cm-1峰略弱于550.2 cm-1, 789.3 cm-1处峰平宽但吸收较强, 在895.4 cm-1与973.6 cm-1处的峰强度弱于789.3 cm-1峰;马尾松500~1000 cm-1吸收强度略弱于华山松与红松种仁, 但峰形数多于其他, 特别是600~800 cm-1处, 较其他两者多出656.9 cm-1、699.9 cm-1、783.1 cm-13个非常明显的尖锐峰, 且764.8 cm-1处峰可观察到开裂现象。

4 讨论

华山松、红松、马尾松种仁皆为卵形, 外形较相似, 但尺寸略有区别:华山松种仁长1.0~1.5 cm, 直径0.6~1.0 cm;红松种仁长1.2~1.8 cm, 直径0.9~1.6 cm;马尾松种仁长0.4~1.0 cm, 直径0.3~0.6 cm。由于种仁大小受采收季节、产地来源等影响, 在无对比参照情况下, 仅凭经验、尺寸大小较难区别, 且不科学。所以有必要寻找一种可靠的化学鉴别手段。

传统中药化学鉴别方法主要是利用各种专业分析检测仪器, 采用高效液相色谱法、薄层色谱法、气相色谱法、质谱分析法等方法获得中药指纹图谱或检测单一成分含量, 在检测前需经过提取分离等复杂手段。在中药研究领域, 红外光谱技术是一种分析物质结构和含量的工具, 可直接用于中药材的分析, 且具有快速、无损、灵敏等特点, 是常用的物质定性鉴别方法之一, 图谱表观为药材中各种成分单体中的分子结构对红外光吸收的叠加结果, 是特征性所有成分的整体效应, 对待测物的整体鉴别具有重要意义。

产生红外吸收的基团是C-O、C-N、C-F、C-P、C-S、P-O、Si-O等和C=S、S=O、P=O等, 华山松、红松及马尾松种仁中成分基本相同, 所以红外光谱整体相似。但物种不同, 其基团含量会不同, 从而导致峰位和峰强度的变化, 而红外光谱能较好、快速、无损伤地鉴别药材。本研究对华山松、红松及马尾松种仁的粉末经溴化钾压片后进行红外光谱扫描, 发现3者的红外光谱虽然相似性较高, 尤其是红松与马尾松具有高度相似性, 推测其主要有效化学成分基本相同。虽然3者红外光谱相似, 但依据彼此之间的细小差异, 特别是二阶导数红外光谱具有明显差别, 可为松子仁种属来源的鉴别提供参考。

综上所述, 红外光谱法能快速、方便地用于华山松、红松、马尾松种仁的鉴别。但本研究有效数据量偏小, 在后续试验研究中应大量采集不同地区、时节的华山松、红松、马尾松种仁, 建立更加完整的红外光谱指纹图库, 为快速鉴别松子仁来源提供理论依据。

参考文献

[1]李哲敏.松子仁的营养保健功能[J].家牧产品开发, 2001 (7) :23-24.

[2]王明清.松子油开发利用[J].粮食与油脂, 2002 (10) :35-36.

[3]中华人民共和国国家中医药管理局《中华本草》编委会.中华本草[M].上海:上海科学技术出版社, 1999:59-60.

[4]刘小丽.红外光谱在药物分析中的应用研究[D].陕西:西北大学, 2013.

川牛膝的HPLC指纹图谱研究 篇6

目前国内对川牛膝的研究主要集中在其化学成分及药理研究方面, 缺乏综合评价药材品质的方法和标准, 且川牛膝在长期的应用和栽培的过程中, 种内产生很大的变异, 出现伦理较多的类型, 同时由于加工、储存等方法的不同, 药材质量存在较大的差异, 造成目前药材质量不稳定和市场药材质量无法评价的局面。本研究通过采用HPLC法建立川牛膝药材指纹图谱, 为控制川牛膝药材的综合质量提供参考依据。

1 试验材料、试药、试剂与仪器

1.1 试验材料、试药、试剂

川牛膝药材:经成都中医药大学峨眉学院王书林教授鉴定为苋科植物川牛膝 (Cyathula officinalis Kuan.) 的干燥根, 符合2005年版《中国药典》规定, 见表1。

对照品:杯苋甾酮 (cyasterone) 由四川省中医药研究所提供。试剂:甲醇 (色谱纯) , 水为重蒸水, 其它试剂均为分析纯。

1.2 仪器

Waters2996-2695型高效液相色谱仪;Waters Empower化学工作站;KQ3200型超声波清洗器 (40KHZ, 120W) , 昆山市超声仪器公司;BP-211D型电子分析天平 (Max:210g, d=0.1mg) , 北京赛多利仪器系统有限公司) 。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱:Symmetry® C18 (5μm, 4.6×250mm, Waters公司) ;流动相:甲醇-水二元梯度洗脱, 如表2;流速:0.9ml/min;柱温:35℃;检测波长:266nm;进样量:20μl;运行时间:35min。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备

取杯苋甾酮对照品适量, 精密称定, 加甲醇制成每1ml含60μg溶液, 即得。

2.2.2 样品溶液的制备

取川牛膝药材细粉 (批号7#) 5g (过四号筛) , 精密称定, 置于100ml锥形瓶中, 精密量取甲醇50ml, 振摇, 回流提取1h, 放冷, 加甲醇补足损失的重量, 摇匀, 水浴挥干, 残渣加甲醇使溶解, 定容至10ml, 0.45μm微孔滤膜滤过, 取续滤液, 即得[3,4,5,6]。

2.3 方法学考察

2.3.1 精密度试验

精密吸取对照品溶液20μl, 重复进样5次, ≥5%总峰面积的各共有峰相对峰面积的RSD在1.3263%～2.1634%之间, 表明精密度良好。

2.3.2 重复性试验

取同一批次的川牛膝药材6份, 按上述样品测定方法分别测定, ≥5%总峰面积的各共有峰相对峰面积的RSD在2.3013%～2.8706%之间, 表明方法重现性良好。

2.3.3 稳定性试验

取同一供试品溶液, 分别在0, 2, 4, 8, 12, 24h分别进样20μl, ≥5%总峰面积的各共有峰相对峰面积的RSD在2.1181%～2.5066%之间, 表明样品在24h内稳定。

2.4 指纹图谱相似度分析

2.4.1 共有峰的标定

根据18批次供试品测定结果所给出的峰数, 对峰值和峰位等相关参数进行分析、比较, 川牛膝药材高效液相色谱可分离出20多个色谱峰, 经与杯苋甾酮对照品对照, 并比较所有记录的色谱图, 选取11个共有峰作为指纹图谱的特征峰, 其中9号峰为杯苋甾酮。

2.4.2 共有图谱模式的建立

根据《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求 (暂行) 》, 以参照物峰 (S) 的相对保留时间和相对峰面积为1, 计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。杯苋甾酮为川牛膝药材中的主要有效成分, 且其峰面积在图谱中相对较大, 保留时间适中, 故选择杯苋甾酮为参考峰 (S) , 以其保留时间和峰面积为1, 计算各样品共有峰的相对保留时间和相对峰面积。

2.4.3 图谱相似度分析

根据18批样品的相对保留时间及指纹图谱的整体谱峰特点对峰进行匹配, 以相对方面积的平均值建立共有模式, 见图2, 以相关系数法对样品的相似度进行评价, 各样品相似度结果见表3, 结果表明, 大多数样品之间相似度良好, 都达到0.90以上, 平均相似度为0.906。

3 讨论

本课题首次将HPLC法运用到川牛膝药材的鉴定与质量评价中, 能更加有效地解决药材化学成分的多样性与复杂性的质量评价技术难题。本实验采用二极管阵列检测器对指纹图谱的检测进行了选择, 结果表明在检测波长266nm处, 色谱图所包含的信息量更大。从相似度分析结果来看, 18批川牛膝药材相似度均在0.9以上, 表现出良好的相似性。在川牛膝药材指纹图谱的共有特征峰中, 整体分离度较好, 能充分反映出川牛膝药材醇溶性物质的化学成分特征, 可用于川牛膝药材鉴定及内在质量评价。在本实验建立的川牛膝药材指纹图谱分析方法中, 杯苋甾酮的保留时间适中, 与相邻色谱峰达基线分离, 分离度良好。

本实验所建立的方法, 精密度、稳定性和重复性均符合指纹图谱研究的技术要求, 为进一步制订川牛膝质量评价标准提供了科学依据。

摘要：目的:采用HPLC法构建川牛膝药材的化学指纹图谱。方法:采用Waters2695高效液相色谱仪, 色谱柱为Symmetry (C18 (5μm, 4.6×250mm, Waters公司) ;流动相为甲醇-水二元梯度洗脱;流速为0.9ml/min;柱温为35℃;检测波长为266nm。结果:测定基地产及市场上流通的样品共18批次, 标示了11个共有峰, 其指纹图谱相似度均在0.9以上, 指纹图谱整体面貌基本一致。结论:该方法简便、快速、准确、重现性好, 为川牛膝药材的定性鉴别和药材内在质量评价提供了依据。

关键词：川牛膝,指纹图谱,HPLC

参考文献

[1]中华人民共和国卫生部药典委员会.中华人民共和国药典 (一部) [S].北京:人民卫生出版社, 2005:26.

[2]《全国中草药汇编》编写组.全国中草药汇编 (上册) [M].北京:人民卫生出版社, 1996:217～229.

[3]陈幸, 黎万寿, 朱久武.等.RP-HPLC法测定川牛膝中杯苋甾酮的含量[J].重庆中草药研究, 1999, (40) :69～71.

[4]马英, 毕开顺, 王玺等.HPLC法测定川牛膝中杯苋甾酮的含量[J].中草药, 2000, 31 (6) :427～428.

[5]黎万寿, 陈幸, 李彬.等.正交法优选酒炙川牛膝最佳炮制工艺[J].现代中药研究与实践, 2005, 19 (4) :54～56.

不同产地灯盏花成分指纹图谱研究 篇7

关键词：灯盏花,灯盏乙素,高效液相色谱,指纹图谱

中药材来源于自然界, 同一味药由于生长、采收季节、加工方法和贮存条件不同, 其所含化学成分、质量及至临床疗效也有很大差异。灯盏花是菊科植物短葶飞蓬Erigeron breviscapus (Vant.) Hand-Mazz.的干燥全草, 又名灯盏细辛、东菊, 主要分布于我国西南地区, 海拔1 200～3 500m的高山开阔山坡、草地、林缘, 其中98%左右分布于云南, 四川、贵州等省也有少量种植。灯盏花首载于《滇南本草》, 现收载于《中国药典》2010年版一部。从灯盏花中提取的黄酮类活性成分, 统称为灯盏花素, 其活血化瘀的主要有效成分为灯盏乙素 (Scutellarin) , 含量达95%以上, 另含有少量的灯盏甲素[1]。本品具有扩张血管, 改善脑血液循环, 增强脑血流, 降低血管阻力和抗血小板凝聚作用[2]。目前以灯盏花药材开发的制剂有“灯盏细辛注射液”、“灯盏花素注射液”、“灯盏花素滴丸”、“灯盏花素片”、“灯盏生脉胶囊”等多种剂型, 临床主要用于治疗脑血栓形成、脑梗死、冠心病和心绞痛等心脑血管疾病, 应用广泛[3,4]。

药材的质量是保证中成药质量稳定的根本。近年来, 由于以灯盏花素提取物为原料的制剂快速发展以及相关制剂在临床上的广泛应用, 西南各省尤其是云南各县市兴起了灯盏花种植的热潮, 种植面积不断扩大。但长期以来, 由于对灯盏花药材的质量缺乏系统性研究, 云南的灯盏花种植带有一定的盲目性, 不同产地、不同季节采收的灯盏花药材之间会存在一定的差异, 因此有必要建立一种有效、可靠的控制灯盏花质量的分析方法作为灯盏花药材质量控制标准。中药指纹图谱是一种全面、定量反映中药所包含化学信息的分析方法, 建立在中药成分系统研究的基础之上, 为药材真伪判断和质量鉴定提供重要依据, 是综合的鉴别手段, 可以反映不同产地、不同采收期和不同工艺的“特性”[5]。

为比较不同产地的灯盏花药材主成分, 控制药材质量, 本研究建立了以灯盏乙素为有效成分的高效液相色谱指纹图谱分析方法, 确定控制灯盏花药材质量的指纹峰, 利用色谱指纹图谱相似度计算软件, 进行相似度计算, 为快速简便地鉴定不同来源的灯盏花药材质量提供了参考标准。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent高效液相色谱仪 (包括G1313A自动进样器, G1314A紫外检测器, Agilent1100色谱工作站) , SK250LH型超声波清洗器 (上海科导超声食品有限公司) , 电子天平 (Sartorius AG) ;中药色谱指纹图谱相似度评价系统 (国家药典委员会2004A版) 。

1.2 试剂

超纯水, 色谱级甲醇, 其它试剂均为分析纯。灯盏乙素对照品购自中国药品生物制品检定所 (842-200102, 纯度为98.0%) 。

1.3 药材

分别采集云南大理、个旧等地不同年份的灯盏花药材, 并经冯云曾高工鉴定为灯盏花, 见表1。阴凉通风处保存, 粉碎, 过20目筛, 备用。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

检测波长335nm (灯盏乙素在此波长下有最大吸收峰) , 色谱柱采用Hanbon C18 (5μm, 250mm×4.6mm) , 柱温:25℃, 流速1mL/min, 流动相:甲醇 (A) -0.4%磷酸缓冲液 (B) 梯度洗脱, 见表2。

2.2 溶液制备

对照品溶液:精密称取灯盏乙素对照品5.02mg, 置25mL容量瓶中, 加甲醇溶解并稀释到刻度, 摇匀, 即得。

供试品溶液[6,7]:准确称取灯盏花药材粗粉约1g, 精密加入50%乙醇50mL, 称重, 浸泡1h后加热并保持微沸回流提取60min, 放冷, 补足重量, 滤过。精密吸取1mL溶液至50mL容量瓶中, 用0.4%磷酸缓冲液-甲醇 (50∶50) 稀释25倍后, 用0.45μm微孔滤膜过滤, 取续虑液20μL进行HPLC测试。

在上述色谱条件下, 对照品和供试品溶液的色谱图分别见图1、图2, 各峰的分离度较好。

2.3 方法学研究

为考察分析方法的可行性, 以样品编号1云南大理的灯盏花提取液作为供试品溶液, 对仪器精密度、方法重现性和稳定性作了相应考察。

2.3.1 精密度试验

取一新制备供试品溶液, 按上述色谱条件连续进样6次, 每次20μL, 以灯盏乙素为对照, 分别考察各共有峰的保留时间及峰面积, 结果共有峰的峰面积RSD在0.24%～1.23%, 保留时间RSD在0.07%～1.09%, 说明仪器精密度良好。

2.3.2 稳定性试验

取同一供试品溶液, 分别在0、3、6、9、12、24h按上述色谱条件分别进样, 每次20μL, 以灯盏乙素为对照, 分别考察各共有峰的保留时间及峰面积, 结果共有峰的峰面积RSD在0.18%～1.85%, 保留时间RSD在0.17%～1.71%, 说明该方法在常温下24h内稳定性良好。2.3.3重复性试验取同一批灯盏花药材, 照“2.2”项下方法制备提取液6份, 按上述色谱条件分别进样, 每次20μL, 以灯盏乙素为对照, 分别考察各共有峰的保留时间及峰面积, 结果共有峰的峰面积RSD在0.24%～1.98%, 保留时间RSD在0.12%～1.74%, 说明重现性好。

2.4 指纹图谱及技术参数

(1) 指纹图谱建立及共有峰的标定及相对保留时间的计算。共有峰标定:将10批灯盏花药材, 照“2.2”项下方法制备提取液10份, 分别精密吸取供试品溶液20μL进样, 记录60min的色谱图, 得到10批灯盏花药材的HPLC-UV指纹图谱。在各色谱峰中选取峰面积较大的6号峰, 经对照品对照确定其为灯盏乙素, 作为对照峰。

将10批样品的数据采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004版》进行评价, 确定22个共有峰, 见图2。其中, 第1、3、5、6、9、11、16、22共8个峰出峰较为稳定、峰面积较大。其中, 在8个峰中以6号峰出峰最为稳定, 峰面积最大。因此, 以6号峰灯盏乙素为对照, 计算10批药材8个各共有峰的相对保留时间及其标准偏差, 结果RSD值, 见表3。

(2) 相似度评价结果。相似度是国家药典委员会确定中药指纹图谱标准中的一项重要评价指标。本研究应用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004版》对10批次不同产地灯盏花的色谱图进行相似度评价, 选用的基本参数为8个共有峰, 相似度评价结果见表4。云南不同地区灯盏花中主要成分相似度均在0.85以上, 说明云南地区不同产地灯盏花药材的化学组成较一致。

3 讨论

(1) 灯盏花提取工艺的选择。本研究考察了灯盏花药材的提取溶剂和提取方法。经过多次试验, 结果表明, 与超声法相比, 采用50%乙醇回流提取的灯盏花提取液HPLC指纹图谱中峰数最多, 同一个峰的峰面积也较大, 但耗时较长。

(2) 检测波长的选择。通过对灯盏花主要活性成分灯盏乙素的UV扫描, 存在两个吸收带, 即335nm处的B环吸收带和280nm的A环吸收带。实验中比较了335nm和280nm检测波长下的色谱图, 结果表明, 335nm检测条件下基线较平稳, 检测到的峰较多, 峰面积适中, 分离度好, 最终确定检测波长为335nm。

(3) 流动相的选择。实验中比较了乙腈-水、乙腈-不同浓度的磷酸水体系、甲醇-水、甲醇-不同浓度的磷酸水体系, 实验结果表明甲醇-0.4%磷酸系统较好, 基线漂移小, 出峰数目多, 峰分离情况也比较理想。在此基础上, 调整了甲醇与0.4%磷酸梯度洗脱的比例关系, 最终确定了色谱洗脱条件。

(4) 相似度结果分析。本实验采用HPLC法, 以含量最高的主要活性成分灯盏乙素作对照, 建立灯盏花药材的HPLC指纹图谱, 结果显示:其共有色谱峰数目一致, 反映所含化学成分的相似性。但由于药材受产地或者采收年份的影响, 各色谱峰的相对峰面积差异有统计学意义, 反映为化学成分的相对含量不同。从相似度分析结果来看, 10批灯盏花药材的相似度>0.85, 说明各产地灯盏花药材质量有较好的相似性。该方法稳定可靠, 提供的信息较多, 可为灯盏花药材进行综合评价, 为其鉴定及质量控制提供科学依据, 并为灯盏花素药材道地产地的确定提供参考。

参考文献

[1]陈一截, 王胜涛, 曾文珊, 等.灯盏花素对大鼠主动脉肌环的松驰作用[J].中药新药与临床药理, 1994, 5 (2) :15-19.

[2]陈书芳, 张英娜, 张晓平, 等.灯盏花临床应用近况[J].时珍国医国药, 2000, 11 (2) :177.

[3]巢艳红, 徐希明, 余江南.灯盏花素新剂型及其质量控制的研究进展[J].中国药事, 2010, 24 (7) :711-714.

[4]丁润芳, 李正翔.灯盏花素制剂的临床应用[J].天津药学, 2009, 21 (2) :60-63.

[5]谢培山.中药制剂色谱指纹图谱 (图像) 鉴别[J].中成药, 2000, 22 (6) :391-395.

[6]张旭, 耿伯显, 陈玲玲.灯盏花HPLC指纹图谱的研究[J].中国医药工业杂志, 2003, 34 (6) :23-31.

紫外指纹图谱技术检验鞋油的研究 篇8

在日常生活中鞋油广泛应用于皮鞋护理,其使用具有较强的个体差异性,不同的人会有使用不同品牌或不同颜色鞋油的习惯,其使用频次也因人而异。

在一些案件中,当嫌疑人穿着用鞋油护理过的皮鞋作案时,鞋子与墙壁、纺织品、地毯等物品会有接触,鞋油很有可能发生转移从而形成相应污痕或瘢渍,因此通过对此类痕迹的检验鉴别,可以为侦查破案提供线索,指明方向,为证实犯罪提供科学的依据。

鞋油有液体鞋油和固体鞋油之分,其主要成分是石蜡、虫蜡、松节油、棕榈油等[1,2,3,4]。

指纹图谱技术是目前较为新颖检测技术,由于不同物质其组成成分不同、组成成分含量有区别,其反映在紫外吸收曲线上的峰高、峰形及相对强度则存在差异,可据此进行物质的定性检验[5,6,7,8,9,10]。

本文利用紫外—可见分光光度仪,对30份鞋油的有机成分进行分析,使用优选出的检测方法,对膏状鞋油样品进行了谱图采集,依据每个样品的紫外光谱图进行指纹图分析,并对该方法的重现性进行了考查,所测样品均得到较好区分。该方法可以为公安实践部门检验鞋油物证提供借鉴。

1 试验条件

样品:常见液体和膏体鞋油样品30份,见表1。

试剂:蒸馏水、甲醇、乙醇、乙腈、丙酮、乙醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、三氯甲烷(均为分析纯)。

仪器及试验条件:TU-1950双光束紫外可见分光光度仪(北京普析),波长范围190～300nm;分辨率0.5nm。

2 试验方法

2.1 膏状鞋油检测方法的选择

2.1.1 提取剂

根据溶解能力选择提取剂,试验发现,除蒸馏水以外,所选溶剂均能溶解鞋油样品,这是由于鞋油多数为油溶性物质,可溶于有机溶剂。根据溶解能力大小,选择乙醇、丙酮、二氯甲烷、三氯甲烷作为提取剂。

将鞋油样品分别配成质量分数为25mg/mL的鞋油/乙醇溶液、鞋油/丙酮溶液、鞋油/二氯甲烷溶液与鞋油/三氯甲烷溶液,并分别以各自的空白溶剂作为参比液进行对照试验,在波长为190～300nm进行光谱扫描,根据谱图质量确定提取剂,见表2。

2.1.2 扫描波长的选择

将鞋油样品配制成质量分数为25mg/mL的鞋油/乙醇溶液,按一定比例稀释后作为待测液,在乙醇溶液为参比条件下,对待测样品进行光谱扫描。以波长为横坐标、吸光度值为纵坐标,绘制紫外吸收光谱图,根据紫外吸收峰分布情况确定扫描波长。

2.1.3 样品浓度的选择

如果使用样品原液直接进样测试,紫外吸收响应值过高,易超出仪器量程,因此需要确定合适的样品稀释浓度,将5#鞋油样品配制成质量分数为25mg/mL的鞋油/乙醇溶液,再使用乙醇分别按照1:2、1:3、1:5、1:10、1:15进行稀释,以乙醇溶液为参比,波长190～300nm下进行光谱扫描,按照吸收峰强度确定样品配制浓度。

2.1.4 样品载体物的选择

选择14#样品“意尔康”牌黑色膏状鞋油,分别等量涂抹于洁净无纺布与载玻片上,待挥干后用乙醇溶解,于相同试验条件采集扫描光谱。

2.2 特异性检验

将23#鞋油溶液,按照1:2、1:3、1:5、1:6、1:7、1:9、1:10的比例进行稀释,按照上述试验条件扫描光谱,检验稀释浓度对紫外谱图特异性的影响。

2.3 重现性检验

选择2#、19#鞋油样品,稀释1:5后,重复测定3次谱图,观察谱图重复性。

3 试验结果分析与讨论

3.1 试验条件的确定

3.1.1 提取剂

由表2可知,使用乙醇作为鞋油样品的提取剂,溶解效果较好,且乙醇在190～300nm范围内无干扰,所以本试验采用乙醇做提取剂。

3.1.2 样品浓度

根据朗伯—比尔定律,物质吸光度与物质的浓度在一定范围内成正比,当溶液过浓时(物质浓度超过0.01mol/L),吸光粒子由于间距减小,摩尔吸光系数将发生变化,导致吸收曲线线形改变[11]。

将5#样品使用乙醇溶液按照1:2、1:3、1:5、1:10、1:15稀释,进行紫外曲线扫描,结果如图1所示。

由图1可知,当样品浓度过高(稀释比1:2)时,紫外曲线相应值过高,出现吸光度大幅度跃升,曲线峰形出现改变,样品在稀释比1:15时,吸收曲线虽然有完整峰形,但响应值过低,峰形不能完整反映鞋油样品所含信息。

当稀释比在1:5时,紫外吸收曲线响应值适中,并且峰形完整,因此样品稀释比例最终确定为1:5,即按照上述试验条件,取30份鞋油样品,分别配制为25mg/mL鞋油/乙醇溶液,按照1:5稀释后扫描光谱,重复3次,绘制鞋油吸收谱图。

3.1.3 扫描波长的选择

经过试验发现,鞋油样品的紫外吸收峰均集中在190～250nm之间,为鞋油中杂原子不饱和基团C=O和=N的不饱和n→π紫外吸收峰,因此将扫描波长定为190～400nm。

3.2 鞋油样品紫外光谱指纹特异性分析

3.2.1 数据处理

紫外吸收光谱曲线相似度:

式中:n—数据点个数;h1j,h2j—第1,第2条曲线中第j个点的吸光度值。

以相似度s=0.90为临界值,当s>0.90时,认为2条曲线为相同鞋油紫外扫描曲线;当s<0.90时,认为2条曲线为不同鞋油紫外扫描曲线。所得数据使用Excel软件进行处理。

3.2.2 鞋油样品特异性分析

1#～15#鞋油样品紫外吸收曲线如图2所示,16#～30#鞋油样品紫外吸收曲线如图3所示,1#～30#样品紫外吸收曲线相似度对比如表3所示。

由图2、图3、表3可知,30份鞋油样品的紫外吸收曲线均能表现出足够的特异性,鞋油的紫外吸收曲线特异性来源有两个,第一为样品中紫外吸收活性物质的含量,第二为样品紫外吸收活性物质的组成,其中后者是造成鞋油紫外曲线特异性的主要原因。

从表3可看出,s>0.9为相同成分,差异较小,s<0.9则认为成分不同,差异显著。

在3 0份样品的两两比较结果中,大部分的样品可以得到较好的区分,区分率为96.8%。其中即使是相同品牌不同批次的鞋油,相互之间相似度也有差异,如“奇伟”牌新旧两款鞋油的紫外吸收曲线相似度为0.39,说明两款产品在生产配方上有一定的差异,导致曲线变化。使用紫外分光光度检验鞋油样品,具有较好的区分度。

3.2.3 鞋油样品紫外光谱特征

通过分析鞋油样品紫外谱图,发现具有共同特征:在200nm存在一个较强吸收峰,这是由于多元醇和酚产生缔合现象,-OH基的n→π紫外吸收峰发生红移作用,由原来的190nm向200nm移动。

部分鞋油样品的紫外谱图,在225nm,出现一个中等强度的吸收峰。

由此可以推测出鞋油中有N或S等杂原子未成对电子跃迁吸收。根据鞋油样品的紫外吸收峰在225nm附近有无吸收峰,可以将30个样品分为两大类,第Ⅰ类为225nm附近有吸收峰,该类鞋油样品共有6个品牌8个样品;第Ⅱ类为225nm附近没有吸收峰,该类鞋油样品共有15个品牌22个样品。见图4、图5。

3.2.4 相同样品、不同浓度的检验

选择“万金”黑色膏状鞋油(23#)样品,配制25mg/mL鞋油乙醇溶液,分别按照溶液比乙醇1:2、1:3、1:5、1:6、1:7、1:9、1:10进行稀释,其紫外线图谱及相似度对比如图6、表4所示。

从图6、表4可以看出,稀释比在1:10～1:3之间,紫外吸收曲线峰形基本不发生变化,相似度均在0.99～0.98之间。

说明在该浓度范围内同一样品的紫外吸收曲线线形保持稳定,样品中各组分在同比例增加或减少的情况下不会形成差异。

但当稀释比小于1:2时,峰形发生较大变化,说明浓度过大时,样品中对紫外线吸收响应较大的物质会产生较强的掩蔽效应,造成曲线变形。

3.2.5 相同样品、相同浓度、不同载体的检验

实际办案条件中,采集到的鞋油检材均为不新鲜的、转移型的鞋油痕迹,为模拟现场情况,选择“意尔康”黑色膏状鞋油(14#)样品,配制成25mg/mL的鞋油/乙醇溶液后,再用乙醇稀释1:5,均匀涂抹于洁净玻璃板与洁净白色无纺布上,干燥后使用乙醇浸泡溶解,采集光谱,见图7。

由图7可知,从不同的载体上采集到样品的吸收曲线峰形基本不发生变化,曲线之间的相似度均在0.98以上,仅仅在吸收强度上略有变化(1:5稀释溶液最高,玻璃载体其次,无纺布载体最低)。

这主要是因为转移到载体上的鞋油成分不能全部回收,造成浓度降低的缘故。因此,使用紫外指纹图谱技术检验鞋油,载体的不同不会引起相同样品的误判。

3.2.6 重现性试验

在相同的试验条件下,对“庄臣”黑色膏状样品(2#)和“红鸟”黑色膏状鞋油样品(19#)进行重复试验表明,该方法的重现性良好,4次试验中相对峰高比值的变异系数均<0.1%。

4 结论

利用紫外光谱可以对不同品牌、同一品牌不同批次的鞋油样品进行鉴别,该方法操作简便快速,结果准确可靠,重现性高,可以在实际办案中对现场中提取到的膏状鞋油物证进行检验。

关键词：鞋油,紫外光谱,比较研究,法庭科学

参考文献

[1]谢增瑞,杜建平,马俊福.皮鞋油的紫外光谱法检验[C].第三届微量物证检验学术交流会论文汇编.北京:中国人民公安大学出版社,1993:138-140

[2]孙宝国.日用化工辞典[M].北京:化学工业出版社,2002:719-720

[3]盛旋,胡艳云,张蕾,等.正相液相色谱-蒸发光散射测定食品中的石蜡[R].分析化学研究报告,2009(12):1765-1770

[4]徐徐,王琳琳,陈小鹏,等.折光率法快速测定松节油主要成分的含量[J].化学世界,2008,49(11):660-661

[5]解东华,布丽君.基于紫外指纹图谱技术的食醋品种检测方法[J].农业机械学报,2009,40(4):135-138

[6]李倩倩,吴丽君,刘伟,等.基于紫外光谱结合偏最小二乘法测定手性药物对映体的组成[J].光谱学与光谱分析,2012,32(2):500-504

[7]姜红,雷昭明,阎子龙,等.傅立叶变换红外光谱法检验膏状鞋油的研究[J].中国皮革,2014(12):102-105

[8]Simal G J,Sarria V M,Rijk R,et al.Determination of paraffins in food simulants and packaging materials by liquid chromatography with evaporative mass detection and identification of paraffin type by liquid chromatography/gas chromatography and Fourier transform infrared spectroscopy[J].Journal of AOAC International,2000(2):83-85

[9]姜红,冯计民,勇巾凡,等.红外光谱法检验热敏纸的研究[J].中华纸业,2013,34(2):12-15

[10]张敏,王岩,王景翰,等.圆珠笔油墨中染料成分的紫外光谱分析[C].第五届全国微量物证检验学术交流会论文汇编.群众出版衬,2003:18-21

中药指纹图谱技术的研究进展 篇9

1 指纹图谱技术的形成及发展

在19世纪末20世纪初,出现了“指纹”鉴定这个概念,最初指纹鉴定运用于法医和犯罪领域里,是根据每个人的手纹的结构有着绝对唯一的差别,来区分个体身份的。也因此“指纹”技术也成了当时一个标志性的词汇。后来随着仪器和分子生物学的快速发展,在生命科学的研究领域里也开始使用指纹分析技术来进行研究,之后发展了蛋白组学指纹分析技术,即利用种群和种群间的共性以及种群内部个体间的差异,来进行物种的鉴定的。随着技术的迅速发展,中药指纹图谱技术也应运而生。早在上个世纪70年代,就开始有学者用薄层色谱法指纹图谱技术对中药的定性鉴定分析进行了研究。发展到上世纪90年代的时候,《中华人民共和国药典》中很多中药品种都已经收录了用薄层色谱指纹图谱的方法用于其品种的鉴定,特别是薄层扫描仪、成像系统、自动点样器和数据处理系统的出现和发展更使得TLC指纹图谱的运用不在是幻想。到了21世纪,指纹图谱可以运用在生物、食品、环境、石油、化学等很多领域的研究中,特别是在中药和食品质量的控制方面,有时还结合一定的分子生物学的知识。有学者通过吸收面积和体积排阻色谱(高效液相色谱法)分离蛋白质组分面积的百分比值显示与品质性状显著相关性,说明质量特性与蛋白质的分子量分布的关联[2]。伴随着更多更新的仪器的出现和发展,中药指纹图谱技术开始向纵向快速发展,技术种类越来越多,应用范围越来越广。日趋完善的中药指纹图谱技术包括:TLC法指纹图谱技术、GC法指纹图谱技术、HPLC法指纹图谱技术、NMR法指纹图谱技术、XRD法指纹图谱技术、IR法指纹图谱技术、HSCCC法指纹图谱技术、HPCE法指纹图谱技术等。其中色谱法比较流行,而色谱法中的HPLC法应用最为广泛。

2 中药指纹图谱的国内外研究进展

2.1 国内研究进展

中药是多组分的复杂体系,化学成分种类丰富,同时又会受到中药品种,产地,运输,加工等诸多方面的影响,所以对中药及其制剂的质量控制的研究一直是中药及其制剂现代化和走向国际的瓶颈,一直是中药及其制剂研究的一个重中之重,同时也是一个难点。而中药指纹图谱技术现在是国际社会公认的用来鉴别中药品种和质量控制的最有效,最准确,最直接的方法手段。近年来,国内外医药相关领域为了解决中药的质量评价方面的问题,对中药指纹图谱技术进行了大量深入的研究,也取得了很多值得祝贺的成绩。杜程芳和屠鹏飞[3]以不同产地的白鲜皮药材为材料,运用反相高效液色谱梯度洗脱法建立了白鲜皮药材的HPLC指纹图谱,结果该指纹图谱可以用来评价白鲜皮药材的质量;王斌等人利用在SGE 30QC3石英毛细管柱优化色谱条件和分离测定条件的基础上建立了鱼腥草和金银花包括这两种中药的下游制剂鱼金注射剂的的挥发性成分GC指纹图谱,同时对其图谱的各共有峰进行了相似性评价,并对其中出现的问题进行了讨论[4]。石荣等以已经建立的大豆异黄酮HPLC指纹图谱的方法为研究方法,选择5个极性各异的代表样品,在不同的仪器上进行测定,研究了大豆异黄酮指纹图谱中保留时间飘移及其校正的工作[5]。魏刚研究利用气相色谱和质谱联用技术对石菖蒲的挥发油成分进行了指纹图谱的研究,得到了具有详细数据信号的特征性指纹图谱,并将其用到石菖蒲制剂的质量判断方面,同时还建立了广藿香挥发油的气相色谱与质谱联用的特征性指纹图谱[6]。杨东风等2007年建立了商洛GAP基地丹参水溶性和脂溶性成分的高效液相色谱指纹图谱,并对不同产地,西藏产丹参的指纹图谱进行了研究和比较,他所建立的丹参指纹图谱专属性强,能准确的反映丹参的真实质量,为GAP基地的建设和丹参的质量控制提供了参考[7]。梁倩发表的文献报道称已经用气相色谱建立了金银花的挥发油成分的指纹图谱,所建立的指纹图谱专属性和稳定性都较强,同时比较了不同产地的金银花指纹图谱的差异,为金银花的质量控制提供一些依据[8]。经过长期的研究发展,中药指纹图谱技术在中药质量评价方面的作用和地位得到了业界广泛的共识,是否能将指纹图谱技术用在中药的质量标准方面成为衡量一个企业是否有好的技术水平和好的管理水平的重要标志之一。

近年来,随着中药现代化和国际化的要求,国内对中药进行指纹图谱技术的研究范围越加广泛,越加深入成熟。截止目前已经建立了丹参、黄芪、天麻、三七等多种中药及其制剂的指纹图谱,尤其是建立了丹参的多元指纹图谱,更标志了中药质量控制的可控性已经达到中药现代化和国际化的要求,已经具有国际先进水平。

2.2 国外研究进展

目前,国外对植物药指纹图谱研究的成果较丰富,德国和法国最先将指纹图谱技术用到银杏叶标准制剂EGB761的质量标准里,该标准对总黄酮、总内酯、槲皮素以及异鼠李素以及它们之间的比例等内容都做出了明确规定,这让植物药在欧美的地位大幅度提高[9]。紧接着美国和加拿大的人参制剂也引入指纹图谱的方法对其原料药和标准提取物进行分析比较,从原料开始控制,以此来保证生产出来的人参制剂的品质,确保药品的稳定性,安全性和有效性。美国民间组织制定的美国草药药典(AHP)对已经流向市场的热点中药和植物药均进行了调查研究,制定了比较全面的,有较强参考价值的质量标准[10]。美国的FDA在植物药制品指导原则中也允许申报者可以提交产品的相关色谱指纹图谱的资料。英国草药典、欧共体草药质量指南和印度草药典都将指纹图谱用来鉴别草药的种类的真实和质量控制的一致。德国著名的生药学家Wagner教授已经建立了人参、黄芪等常用的不同产地的指纹图谱,为其质量控制提供科学的依据。Areias F M 2001年对葡萄牙北部产的薄荷叶中的酚类物质进行了研究,建立了其酚类物质的指纹图谱,结果说明薄荷叶的酚类物质的指纹图谱可以用来鉴别薄荷的不同种,同时可以真实的反应出薄荷的质量。Gulnur Toker 2001年通过对从葡萄籽中提取出的黄酮物质的指纹图谱的建立,说明黄酮指纹图谱可以用来控制葡萄籽提取物的质量[10]。随着技术的不断革新,中药指纹图谱技术的研究无论是国内还是国外,无论是在技术上还是在应用领域里都会有更好的发展,在将来也会有更多的技术手段被应用到中药指纹图谱的技术当中。S

参考文献

[1]王永刚,吴忠,魏凤环,方铁铮.中药指纹图谱研究的现状与未来[J].中药材,2003,26(11):820-825.

[2]Ohm J B,.Ross A S,Peterson C J,Morris C F.Relationships of Quality Characteristics with Size-Exclusion HPLC Chromatogram of Protein Extract in Soft White Winter Wheats[J].Cereal chemistry,2009,86(2):197-203.

[3]杜程芳,屠鹏飞.白鲜皮药材的指纹图谱研究[J].中国天然药物,2003,1(2):94.

[4]王斌,王燕,徐丹,梁振辉,孙文基.鱼金注射剂指纹GC图谱的研究[J].中成药,2004,25(4):365.

[5]石荣,王少云,侯准,桑立红.大豆异黄酮指纹图谱中保留时间漂流的校正研究[J].色谱,2006,24(1):65.

[6]魏刚.广藿香GC-MS特征指纹图谱’数字化”在药材鉴定中的应用模式研究[J].中成药,2007,29(3):322.

[7]杨东风.丹参药材HPLC指纹图谱及其质量评价的研究[D].西北农林科技大学,2007:14-50.

[8]Liang qian,Liang zong suo.Essential oil composition of salvia miltiorrhiza flower[J].Foal chemistry2009,113,592-594.

[9]戴玉梅.中药指纹图谱技术发展概况[J].江西医药,2007,42(6):574-575.