磁性脂质体

磁性脂质体（精选7篇）

磁性脂质体 篇1

摘要：目的 制备将药物治疗与热疗相结合的靶向抗癌药物新剂型—洛莫司汀磁性脂质体。方法 用改良化学沉淀法制备Fe3O4纳米磁性粒子, 运用透射电镜和PE热分析系统进行表征, 在高频交变磁场下进行体外加热试验。采用反相蒸发超声法加高速搅拌制备洛莫司汀磁性脂质体, 用透射电镜、图像分析系统和能谱仪对其进行表征, HPLC法检验脂质体中洛莫司汀的包封率。结果 Fe3O4纳米磁性粒子近似球形, 粒径10~50 nm。居里温度在120℃140℃之间, 其磁流体在高频交变磁场下可升温至40℃46℃并保持恒定。以此磁性材料为载体制成的洛莫司汀磁性脂质体的平均粒径为176.6 nm, 其中含有Fe3O4成份, 药物包封率达到71.96%。结论Fe3O4纳米粒子是制备医用磁性脂质体的良好载体, 采用反相蒸发超声法加高速搅拌可制备纳米级Fe3O4磁性脂质体。

关键词：磁性纳米粒,磁性脂质体,Fe3O4,洛莫司汀

脂质体作为纳米药物载体满足了治疗上的许多要求, 药物由脂质体携带后, 能改变其体内的药动学行为, 降低毒副作用和提高疗效。但因稳定性不够, 产品包封率较低和靶向性分布欠佳等不足, 应用程度受到限制。近年来虽然发展了脂质体、微球毫微粒等靶向给药系统, 但是这些微粒载体只能发挥被动靶向的作用, 常常被网状内皮系统的巨噬细胞吞噬。而作为具有磁定位功能的靶向给药系统, 磁性纳米脂质体在外加交变磁场的作用下有良好的载药靶向能力[1,2]及特有的局部热疗作用[3], 从而显示出良好的应用前景。磁性靶向给药系统是将药物和适当的磁性材料及必要辅料配制而成, 在足够的体外磁场引导下, 随血流运行, 选择性地到达并定位于肿瘤靶区。药物以受控的方式从载体中释放, 然后在肿瘤组织的细胞或亚细胞水平上发挥药效作用, 故对正常组织无太大影响[4]。

洛莫司汀系亚硝脲类药物, 属细胞周期非特异性药物, 具有抗瘤谱较广、口服吸收迅速、脂溶性大并且易通过血脑屏障等特点, 抗癌作用持久。但是它有骨髓抑制等不良反应, 并有累计毒性[5]。将其制成纳米磁性脂质体, 可供注射, 减轻不良反应, 并具有主动靶向的抗癌作用。

本实验首先用盐酸和PEG制备Fe3O4纳米磁性粒子[6], 实验证明其在外加磁场的作用下具有控温、恒温的特点后, 采用反相蒸发超声法研制了洛莫司汀磁性脂质体, 并对其表征进行分析。

1 材料和方法

1.1 材料

四水氯化亚铁 (上海久亿化学试剂有限公司) ;六水三氯化铁;卵磷脂 (中国医药集团上海化学试剂公司) ;胆固醇 (北京奥星生物技术责任有限公司) ;维生素E (美国Sigma公司) 。H-600透射电子显微镜 (日本) ;JEM-2010高分辨透射电镜 (日本) ;能谱仪 (美国) ;旋转蒸发器 (河南巩义英裕予华仪器厂) ;超声波清洗器 (上海超声波仪器厂) ;SP.04C高频感应加热器 (深圳双平高频加热器厂) 。

1.2 方法

1.2.1 Fe3O4纳米磁性粒子的制备

Fe Cl4·H2O和Fe Cl3·6H2O按1∶1.5的摩尔比例加入去离子水制成总浓度为0.60 mol的溶液, 搅拌过滤, 在50℃, 剧烈搅拌下逐滴加入1 mo L的Na OH溶液直到p H11。溶液中随即形成黑色粒子。在80℃下继续搅拌熟化30 min, 沉淀用永磁铁分离纯化, 水洗5次, 除去钠离子等, 直到p H为7。然后同时加入适量盐酸和PEG2000, 在50℃下剧烈搅拌1 h, 静置24 h, 弃去沉淀, 混悬液在15 000 r/min下离心15 min, 倾去上清液, 重复离心3次, 加双蒸水重悬浮, 超声, 用0.2μm的过滤头过滤, 然后真空干燥, 即得磁性纳米粒。此磁性纳米粒加双蒸水即可得稳定的磁流体。整个过程中不需要使用氮气。

1.3 Fe3O4纳米磁性粒子的表征

1.3.1 形态观察

透射电镜观察其形貌及粒径。

1.3.2 居里温度 (curie temperature.Tc) 测定

采用Perkin.Elmer 7系列热分析系统进行Tc测定。其原理是在某特定磁场中磁性材料温度达到Tc时, 材料完全失重。故当磁性材料完全失重时的温度就是其Tc。

1.3.3 磁流体的体外升温及恒温试验

将Fe3O4磁性纳米粒子用生理盐水配制成1, 5, 10, 15, 20 g/L的磁流体后置于直径25 mm的玻璃管中, 分别置于高频磁感应加热器线圈上 (输出电流为300 A) 进行加热实验, 每隔10 min测温1次, 共60 min。将磁性纳米粒配成15 g/L的磁流体, 固定输出电流为300A, 进行加热试验。纳米粒子配置成l5 g/L的磁流体, 改变磁感应加热器的输出电流为200 A, 250 A, 300A, 350 A, 进行加热试验。

1.4 洛莫司汀磁性脂质体的制备

将配方量洛莫司汀、卵磷脂、胆固醇和维生素E置于圆底烧瓶中, 加入适量无水乙醚充分溶解。旋转蒸发器减压蒸发至瓶壁内形成薄膜, 适量乙醚溶解薄膜, 将纳米磁性粒子加入PBS液中, 与上液混合, 超声, 将此液放入圆底烧瓶, 高速搅拌抽真空, 加入甘油后, 反复超声、冻融。2 500 r/min离心5 min, 弃上清及瓶底未包封的磁性材料, 取中层褐色水性悬浊液, -70℃条件下保存。

l.5洛莫司汀磁性脂质体的表征

1.5.1 形态观察

用透射电镜观察其形貌及大小, 扫描电镜下观察其立体构型。

1.5.2 平面参数统计学分析

采用透射电镜 (TEM) 拍摄后, 任选600个脂质体, 把底片用扫描仪扫描后用CMIAS 98A图像分析系统进行平面参数统汁学分析。

1.6 药物包封率测定

取未离心的脂质体1.0 m L (含洛莫司汀5.0 mg) 置于eppendorf管中。12 000 r/min离心5 min, 收取离心液0.8 m L, 再用等量PBS缓冲液冼涤上述离心管, 12 000 r/min离心4 min, 重复5次, 分别收取离心冼涤液。用HPLC测定离心液及洗涤液中洛莫司汀的含量, 此为脂质体混悬液中游离洛莫司汀的量 (Cf) 。洛莫司汀的投药量为脂质体混悬液中洛莫司汀的总量 (Co) 。脂质体的包封率= (1-Cf/Co) ×l00%。

1.7 脂质体中洛莫司汀的含量测定

精密吸取洛莫司汀磁性脂质体0.5 m L (相当于洛莫司汀0.5 mg) , 置于25 m L棕色容量瓶中, 曲拉通破乳, 加入流动相稀释对刻度, 摇匀, 作为供试液;准确配制浓度为20.0μg/m L的洛莫司汀对照品溶液。取上述溶液各20μL进行分析, 记录色谱图。按外标法计算出供试品中洛莫司汀的含量。

1.8 洛莫司汀磁性脂质体的体外释放

采用透析袋研究洛莫司汀磁性脂质体的体外释放。取5 m L新制备的脂质体混悬液于透析袋中, 悬吊于溶出仪搅拌桨中, 置于盛有三蒸水溶出杯中, 37℃, 50 r/min搅拌, 于设定的时间点从透析液中取样1 m L过滤, 取续滤液20μL注放到液相色谱仪中, 测定洛莫司汀含量, 同时在溶出杯中补充等量溶出介质。

2 结果

2.1 Fe3O4纳米磁性粒子的形态

制备的Fe3O4纳米磁性粒子为黑色粉末, 用透射电镜观察, 近似球形粒子, 大小一致, 粒径10~50nm, 并可以因磁性粒子间的相互吸引而成串珠状或分枝状排列, 如图1所示。

2.2 Fe3O4纳米磁性粒子的Tc及磁流体体外加热实验

热失重法所测Fe3O4纳米磁性粒子的Tc为120℃~140℃, 其相应磁流体置于高频交变磁场下, 温度便易于控制在40℃~46℃恒温。体外加热试验证明, 最初10 min温度上升快, 20 min后基本达到一个稳定温度。固定输出电流值时, 随着磁流体浓度的增高升温增快, 最终温度增高 (见图2) ;在磁流体浓度相同时, 高频感应加热器的输出电流越高, 升温越快, 最终温度越高 (见图3) 。

2.3 纳米Fe3O4磁性脂质体的形态及粒径

在电镜下发现.纳米Fe3O4磁性脂质体多数为单室脂质体, 近似球形, 单室脂质体粒径较小, 约100~200 nm。磁性脂质体外同有单层脂质薄膜, 中央有一个或多个电子密度高的磁性纳米粒子核心。洛莫司汀在双分子膜层中间, 膜与致密核心之间的透明区为水溶液 (图4) 。空白脂质体为单室脂质体, 直径约50~80 nm。磁性脂质体粒径及粒径分布采用纳米粒径仪测量, 在水溶液中平均粒径为176.6 nm, 多极分散指数为0.350, 见图5。

2.4 磁性脂质体的磁性

图6给出了室温下PEG包覆Fe3O4磁流体的磁滞回线。该磁滞曲线显示出超顺磁性以及极强的磁性。如图7所示, 这种超顺磁性同时也能在分散于水中的磁性脂质体溶液中观察到。在实验中, 磁性脂质体确实能分散在水中而不会自我团聚。

2.5 洛莫司汀磁性脂质体的药物包封率

离心液及洗涤液中的洛莫司汀总量为1.402mg, 1.0 m L洛莫司汀磁性脂质体所含洛莫司汀的总量为5.0 mg, 即洛莫司汀磁性脂质体的药物包封率为71.96%。

2.6 脂质体中洛莫司汀的含量及体外药物释放

按外标法计算出供试品中洛莫司汀的含量为97.10%。采用透析袋研究洛莫司汀磁性脂质体的体外释放, 结果见图8。从图中可以看出, 洛莫司汀磁性脂质体外释放较慢, 8 h内药物释放不超过20%, 随后达到平衡, 显示了洛莫司汀磁性脂质体具有一定的缓释性, 在溶出介质中具有一定的稳定性。

3 讨论

由于磁流体广泛应用于工业至医药学, 它的研究引起了广泛的兴趣。然而, 仍然需要对制备满意、方便、稳定的磁流体的技术进行进一步的研究。磁流体是一种稳定的胶体系统, 由磁性纳米粒分散在适当的液体载体中。现今通常使用的这种磁流体由在60年代就被合成[7]。磁流体由铁磁性或亚铁磁性材料的纳米粒分散和稳定在一种液体载体中通过一些适当的有机表面活性剂的胶体分散系统组成。包裹的表面活性剂在粒子间形成一个包裹排斥力, 所以热运动单独就足以保持稳定地分散在它们中间[8]。由于磁流体的特殊属性, 它们广泛应用于密封、轴承、碾磨、扬声器、阻尼器等等[9,10,11,12,13,14]。它们的属性如磁性、热传递和光学性质已经有较透彻的研究[15,16,17,18,19,20]。一般说来, 磁流体的饱和磁化强度高, 在操作温度稳定性好。其中磁性纳米粒的制备是最重要的[21]。为了在生物医学的应用, 纳米粒子的粒径、粒径分布、形态和表面状况是关键因素。目前, 许多方法已经发明用于制备磁性四氧化三铁纳米粒子如多元醇法[22]、微乳法[23], 激光热解法[24]、声化学合成法[25]和化学共沉淀法[26]等。这些已经报道的方法中, 化学共沉淀法可能是最有前景的一个, 因为它简单、方便而且产量大[27]。然而, 这种方法难以控制粒子的粒径和粒径分布, 从而不利于在生物医学的进一步应用。而且磁性纳米粒难于分散在水溶液中。因此, 在一些研究中, 它需要大量的分散剂。而本研究中, 作者改良了共沉淀法:采用氢氧化钠代替氨水以减少刺激性, 盐酸和PEG 2000用于控制粒子的平均粒径和粒径分布。由于它们的非毒性、高度水化性和粒径可控性, 选择盐酸和PEG 2000来制备水基磁流体。在实验中, 作者也研究了盐酸和PEG 2000在磁流体中的作用。

作者探讨了通过采用改良化学共沉淀技术 (使用盐酸和PEG) 制备的磁流体的一些特性, 研究了它们在磁流体中的作用。根据改良共沉淀技术, 在共沉淀法制备四氧化三铁后, 加入盐酸和PEG与磁性粒子在一定温度反应从而产生预期的磁性纳米粒。反应过程在空气条件下操作不需要氮气。与传统技术相比, 这种方法制备的磁性纳米粒粒径更小, 分散性和稳定性更好, 平均水化粒径可以在10~50 nm之间调节。本研究显示磁性纳米粒粒径减少主要由于加热后盐酸与四氧化三铁粒子反应, 而不是主要因为氯离子包裹磁性纳米粒。同时, PEG作为一种分散剂和稳定剂能够稳定或者包裹四氧化三铁纳米粒。

磁性脂质体纳米粒通常由铁磁性物质、抗癌药物及脂质体组成。载体材料应具备下列条件: (1) 所含磁性物质的粒径范围应在10~20 nm之间, 最大不超过100 nm, 因磁性脂质体粒径范围在1~3μm时才能保持一定斥力, 不聚集、不堵塞毛细血管; (2) 应有较高的磁导率和磁感应强度; (3) 应有最强的生物相容性; (4) 无毒, 并能在一定时间内排出体外; (5) 应具有足够的载药能力、一定的机械强度和期望的释药速度。本实验方法制备的洛莫司汀磁性脂质体粒径在180 nm左右, 磁响应性好, 载药率较高。且此磁性脂质体注入体内毒性较小, 生物利用度高, 生物相容性好, 不引起免疫反应, 且保护所载药物, 防止体液对药物的稀释及被体内物质破坏。

本研究采用改良化学沉淀法制备Fe3O4纳米磁性粒子, 再用反相蒸发超声法加高速搅拌制备洛莫司汀磁性脂质体, 所制备的脂质体粒径均匀, 分布范围窄, 药物含量稳定, 包封率为71.96%。目前磁靶向治疗肿瘤, 国内外均处于起步阶段, 而纳米Fe3O4磁性脂质体作为一种新型抗肿瘤药物载体显示了良好的应用前景。

脂质体应用的研究进展 篇2

1 脂质体的特点

脂质体具有的独特分子结构和理化性质使其具有如下特点[1]:①靶向性。脂质体能选择性地分布于人体内某些组织和器官, 俗称药物导弹。②缓释性。药物被包在脂质体内, 在组织和血液中的扩散速率降低, 药物作用的时间延长。③长效性。在脂质体双分子层的保护下, 药物可避免氧化、降解和破坏, 药物的疗效延长。④无毒性。脂质体膜与哺乳动物的细胞相似, 对机体无免疫原性, 不会引起局部组织损伤、不诱发过敏反应。⑤与细胞有亲和性。可增加药物通过细胞膜的能力, 起到增强疗效的作用。⑥给药途径多样性。脂质体不仅可静脉给药, 也可通过皮肤、皮下、肌肉、黏膜给药, 还可以将脂质体制成涂擦剂、膏剂、口服液等。⑦可控性。在制备的过程中, 通过改变其表面的性质如颗粒大小、表面电荷等改变脂质体药物的靶向性, 从而控制药物在体内的分布。

2 脂质体的制备方法及分类

脂质体制备方法的研究已有20多年的历史, 形成了很多方法。例如, 薄膜法、逆相蒸发法、复乳法、离心法、钙融合法、注入法、超临界流体技术、pH梯度法等。对前体脂质体制备的方法还有喷雾干燥法、冷冻干燥法、真空干燥法、薄膜沉淀法等。脂质体的分类方法很多, 但没有一种分类方法能包含所有类型的脂质体。如按其性能可分为:①普通脂质体。指一般脂质组成的脂质体。②变形脂质体。指在普通磷脂双分子层中加入某些表面活性剂, 使其具有充分的柔性和变形性, 能大量透过皮肤角质层的脂质体。③长循环脂质体。在普通脂质体表面修饰了聚乙二醇, 使其在血液里的保留时间延长。④智能脂质体。利用机体内外特殊的理化性质而构建的脂质体。例如, 各类敏感脂质体、多糖包覆脂质体、磁性脂质体和免疫脂质体等。智能脂质体目前还处于实验室研究阶段。

3 脂质体的应用

3.1 作为药物载体

现有的药物载体有高分子聚合物载体和脂质载体两类。脂质载体是属于第4阶段的药物制剂。20世纪60年代末, Rahman Y E等人研究发现脂质体可作为生物降解性和生物相容性药物载体。1988年, 第一个脂质体包裹的药物在美国进行临床实验。目前, 我国也有多个以脂质体作载体的新药进入了临床验证阶段, 如阿霉素脂质体和替米考星脂质体等。

3.1.1 作为抗肿瘤药物的载体

抗肿瘤药物一般是细胞毒性化合物, 对肿瘤细胞缺乏特异性, 在杀伤肿瘤细胞的同时也杀伤正常细胞。脂质体抗肿瘤药物的临床应用, 既增加了疗效又降低了药物的不良反应。1974年, Gregoriadis G等首次提出脂质体可作为药物载体用于肿瘤的治疗。1995年, 获得美国食品和药物管理局 (FDA) 批准的阿霉素脂质体, 成为世界上第一个临床应用的抗肿瘤药物脂质体, 也是目前研究较深入的脂质体制剂[2]。由美国Regulon公司开发的顺铂脂质体 (Lipoplatin) 的粒径小于130 nm, 可延长药物在机体内的作用时间, 并对肿瘤组织具有靶向性, 药物浓度是正常组织的2～50倍。临床前的研究表明, 顺铂脂质体在小鼠经腹腔给药过程中, 对肾的毒性明显小于顺铂[3]。英国Skyepharma制药公司将阿糖胞苷利用其脂质体技术平台 (Depofoam) 制成阿糖胞苷脂质体注射剂 (Depocyt®) , 主要用于淋巴性脑膜炎的治疗。目前, 爱尔兰Elan公司研制出了阿霉素柠檬酸盐脂质体注射液 (Myocet®) , 主要用于治疗乳腺癌。我国抗癌药物脂质体的研究始于20世纪80年代。林巧平等对注射用多西他赛脂质体的研究发现, 多西他赛脂质体的平均粒径为 (85.3±4.8) nm, 包封率为 (99.89±0.06) %, 用5%葡萄糖注射液稀释后 8 h内稳定;在1 mol/L水杨酸钠磷酸盐缓冲液中 24 h累积释放约85%, 且对血浆蛋白结合率均高于注射液;多西他赛脂质体对肿瘤细胞的IC50均较注射液低, 对肿瘤细胞的抑制作用强于注射液。2009年, 上海复旦张江生物医药股份有限公司研发的聚乙二醇 (PEG) 化阿霉素脂质体用于临床, 是我国目前首个用于临床的阿霉素脂质体。其采用隐性脂质体技术, 对肿瘤组织具有较精确的靶向性, 不良反应较常规化疗药物小。

3.1.2 作为抗寄生虫、抗菌和抗病毒药物的载体

由于脂质体具有靶向性, 静脉注射后可迅速被网状内皮细胞所摄食, 利用这一特点可以用含药物脂质体治疗内皮系统疾病, 如利什曼病、血吸虫病等。山羊静注吡喹酮脂质体3 mg/kg的药代动力学研究表明, 吡喹酮脂质体在山羊体内的半衰期t1/2β为 (10.00±0.59) h, 比家兔单剂量静注吡喹酮的半衰期延长5倍。家兔单剂量静注吡喹酮脂质体的药动学试验研究表明, 其半衰期t1/2β为 (12.42±0.36) h, 比游离吡喹酮延长5倍[4]。刘伟等[5]用伊维菌素脂质体对猪疥螨病的治疗效果表明, 高、低剂量的伊维菌素脂质体对猪疥螨病的治愈率明显高于伊维菌素, 且用药剂量小、药效时间长和药物残留低。穿心莲内酯在临床上主要用于治疗上呼吸道炎症和细菌类痢疾。于波涛等[6]制备的穿心莲内酯脂质体的体积平均粒径为6.7 μm, 包封率为92.7%, 载药量为9.3%。由美国Aradigm公司开发的吸入性环丙沙星脂质体可减少患者痰中绿脓杆菌的数量。患者在使用穿心莲内酯治疗14 d后, 其痰中绿脓杆菌减少, 治疗结束后1周, 其病菌仍持续减少, 表明脂质体耐受性好, 无严重不良反应[7]。瑞士血清和疫苗研究所研制的脂质体甲肝疫苗含有灭活的甲肝病毒颗粒和流感病毒血凝素, 不仅能诱导甲肝抗原的抗体产生, 而且能在脂质体表面表达流感病毒蛋白。Ahmad N等[8]将鸡蛋卵清蛋白包裹于膜融合脂质体中制备抗感染疫苗并免疫小鼠, 结果表明这种疫苗可以成功诱导细胞毒T淋巴细胞 (CTL) 反应, 杀死被病毒感染的细胞。阿昔洛韦是一种广谱抗病毒药, 但其水溶性很差, 口服吸收少, 生物利用度低, 并容易产生抗药性, 有人将其制成阿昔洛韦脂质体, 包封率达到90%以上。将抗病毒药物制成脂质体可明显提高抗病毒疗效, 降低用量和减少不良反应。

3.2 作为基因转染载体

脂质体用于基因载体始于20世纪70年代末期。通常是将基因包裹在脂质体内并转移至受体细胞以获得表达, 迄今作为转基因载体的脂质体主要是阳离子脂质体。马百超等[9]以阳离子脂质体Lipofectamine 2 000为基因载体, 研究了其对不同细胞的转染效率, 并将其与转染试剂Sofast和DOTAP进行比较, 结果表明随着复合物中转染试剂比例的增加, DNA延滞作用明显增强。当Lipofectamine 2 000与DNA的质量比增至5∶1时, 仅有小部分DNA移出原点。其对SW-480细胞的转染效率明显高于其他3种细胞, 对B16细胞株的转染效果要优于Sofast。脂质体与其他非病毒类基因转运系统一样, 具有制备简便、毒性低、无感染危险等优点。

3.3 用于免疫学检测

脂质体用于免疫学检测主要有荧光抗体脂质体 (FAL) 和脂质体免疫传感器 (LIS) 。荧光抗体脂质体是把荧光性物质、酶活性物质包裹于脂质体中, 再于脂质体上连接特异性抗体, 抗体与抗原的特异性结合会导致脂质体破裂, 释放出荧光素, 然后测定其荧光强度, 即可求出抗原含量。该法可用于定性或定量分析, 操作快速而简便, 现已用于一些病毒和药物的检测。脂质体免疫传感器是把信号物质或生物识别分子连接于脂质体, 再将脂质体与传感器连接, 通过检测脂质体由于结构或性质发生改变而产生的响应信号, 间接测定被检测物质的量。脂质体免疫传感器不仅保持了传统免疫传感器高度的专一性和高效性的优点, 还极大地增强了响应信号。当抗原或抗体与脂质体结合后, 传感器只对抗原与抗体的特异性吸附进行检测, 避免了非特异性吸附的干扰, 从而提高了脂质体传感器的灵敏度。脂质体免疫传感器为临床诊断学、流行病控制、食品安全检测以及环境监测提供了一种新型、快速、高效的分析工具。

3.4 作为免疫增效剂

1974年, Allison A C发现脂质体对白喉类毒素具有免疫增效作用, 从而揭开了脂质体作为免疫增效剂的序幕。目前, 已经发现脂质体对一系列物质具有免疫增效作用, 如酶、血清蛋白、合成多肽、类脂、脂多糖、单糖、寡糖等, 并成功地用脂质体增强了许多病原微生物及肿瘤抗原的免疫原性。张静等[10]用脂质体包被的轮状病毒基因疫苗pcDNA1/VP7, 经肌注及鼻黏膜两种途径免疫Balb/c小鼠, 并用酶联免疫吸附法 (ELISA) 对其诱导产生的体液免疫应答进行测定后发现, 脂质体在DNA接种中不仅作为质粒DNA疫苗的载体, 而且起到免疫佐剂的作用。脂质体作为疫苗佐剂虽然能够诱导机体产生良好的免疫应答, 但也有轻微的不良反应。

3.5 在其他领域中的应用

脂质体不仅用于疾病的治疗和诊断, 而且在生物化学、生物物理学、免疫学及免疫诊断等许多领域中得到应用[11]。此外, 脂质体还在食品行业、化妆品行业及血液学等方面得到了应用。

3.5.1 脂质体在食品行业中的应用

脂质体日益成为食品体系的一种常见组分载体, 受到越来越多的关注。脂质体在食品工业中主要用于敏感性营养成分的保护性载体。例如, 维生素、微量元素、酶和免疫蛋白等。有研究表明, 脂质体微胶囊化能有效地在胃蛋白酶环境下保护免疫球蛋 (IgY) 活性。有人将脂质体用于肉嫰化包载菠萝蛋白酶, 改善了在肉制品处理过程中酶的稳定性, 并提高了酶的活性。脂质体还可以作为食品中特殊组分的缓释载体。例如, 风味组分、抗菌组分、防腐组分等。

3.5.2 脂质体在化妆品行业中的应用

化妆品脂质体具有皮肤护理和功能性成分载体的作用, 有着非常重要的实际研究和应用价值, 是目前化妆制剂的研究热点[12]。脂质体在化妆品中不仅可作为添加剂, 发挥其独特的作用, 而且还可用作功能性成分的载体, 提高功能性成分的皮肤美容效果。1986年, 迪奥 (Dior) 为法国Lancome公司开发了世界上第一个叫做“capture”的脂质体化妆品, 随后在各国家逐渐推广。目前, 含各种脂质体的化妆品已得到广泛应用。

3.5.3 制作血液替代品

脂质体包封的血红蛋白 (LEH) 是一种血液替代品, 也是第3代人工血红蛋白制品。血红蛋白可有效扩充血容量, 并向组织供氧, 能长期冻干保存, 并能有效地复苏致死性出血性休克的动物, 具有比单纯的血容量扩充剂更好的复苏特性。脂质体包裹血红蛋白不仅可用于常规输血、特殊血液病传播的区域和地震、战争等灾难的救护中, 且在损伤、器官灌注骨髓细胞造血、外科手术、抗休克等方面具有良好的应用前景[13]。

4 脂质体应用研究中存在的问题

胰岛素脂质体制剂研究概况 篇3

脂质体是一种类似生物膜结构的双分子层微小囊泡, 具有生物膜特性和药物传输能力, 胰岛素以脂质体包裹方式给药有利于提高生物利用度和患者用药依从性, 脂质体的内水相能保护胰岛素的结构和构象, 而外部亲脂层有助于改善跨生物膜屏障吸收性能。在胰岛素脂质体中, 胰岛素被包裹在脂质体内部, 可抵抗蛋白酶的降解[4], 脂质体的磷脂双分子层还可以控制胰岛素的释放, 达到比较平稳的降低血糖。笔者对胰岛素脂质体制剂近年来的研究进展进行综述。

1 鼻腔给药胰岛素脂质体

鼻腔黏膜中动、静脉和毛细淋巴管分布十分丰富, 鼻腔呼吸区细胞表面具有大量微小绒毛, 药物对鼻腔黏膜的穿透性较高, 鼻腔内酶相对较少, 对药物的分解作用比胃肠道低, 从而有利于药物的吸收并直接进入体内血液循环, 避免肝脏首过作用。因此, 鼻腔给药是多肽及蛋白质类药物非注射给药途径中最有发展前途的途径。Muramausu等[5]以豆固醇葡糖苷 (SG) 为促进剂, 将胰岛素包封于具有高流动性的二棕榈酰磷酯酰胆碱 (DPPC) /SG (7/4摩尔比) 脂质体中鼻腔给药, 观察到持续8小时高效的降糖作用。吴正红等采用Caco-2细胞模型法和离体肠黏膜法研究了用壳聚糖及其衍生物包覆的脂质体对胰岛素经细胞旁路转运的影响, 结果脂质体可促进胰岛素的跨膜转运, 脂质体用壳聚糖及其衍生物包覆后还可通过打开上皮细胞的紧密连接, 从而进一步的增强胰岛素通过细胞旁路的转运能力[6]。为增加脂质体给药系统在黏膜的吸附性, 增强吸收, Jain等[7]制备表面包有壳聚糖的多室脂质体 (MVL) , 粒径是26～34μm, 胰岛素载药量为58%～62%, 体外释放可维持7～9d, 而一般脂质体只能维持24h, 通过糖尿病大鼠鼻腔给药实验, 黏附性MVL的降血糖效应可维持72h, 维持时间比未包有壳聚糖的MVL和一般的脂质体明显延长。

2 口服给药胰岛素脂质体

口服给药是最方便、最受患者欢迎的给药方式。多肽、蛋白质类药物口服给药面临的主要问题是:胃酸对药物的降解;酶对药物的降解;药物对胃肠道黏膜的穿透性差;肝脏对药物的首过作用。为解决这些问题医药学家做了大量的研究。脂质体能保护胰岛素活性, 增加胰岛素的吸收, 研究口服给药的胰岛素脂质体制剂是比较重要的研究方向。为了提高胰岛素的生物利用度, 近年来, 研究者们在改变脂质体的表面性质和组成成分方面做了许多研究。

Iwanaga等[8]将胰岛素脂质体表面包裹PEG2000, 显著延长了脂质体在大鼠小肠内停留的时间, 使胰岛素与胃肠道黏膜接触的时间和机会明显增多, 促进胰岛素的吸收, 研究者认为大鼠胃肠道黏膜上的Payer's组织与胰岛素吸收的增多有关, 含胰岛素的脂质体粒子从Payer's组织吸收进入血液循环后, 胰岛素从脂质体中缓慢释放, 有一定的缓释作用。

吴正红等[9]考察了分子量、季铵化程度及浓度不同的N-三甲基壳聚糖盐酸盐 (TMC) 对胰岛素脂质体的影响, 胰岛素脂质体用TMC包覆后, 其粒径和ζ电位, 随着TMC季铵化程度的增加而降低, 随TMC浓度增大而增大;TMC的分子量对粒径和ζ电位的影响不明显, TMC的分子量、浓度和季铵化程度对胰岛素包封率影响不大。TMC对胃蛋白酶和胰蛋白酶的抑制作用, 随着TMC的分子量、浓度和季铵化程度的增大而增强, TMC可增强胰岛素口服后的吸收。吴正红等[10]还研究了壳聚糖和壳聚糖-EDTA接合物 (CEC) 双层包覆胰岛素脂质体的性质和降血糖作用, 结果表明在胃蛋白酶、胰蛋白酶和胃肠道内容物中, 壳聚糖-CEC双层包覆胰岛素脂质体对胰岛素有较好的保护作用, 在大鼠降血糖试验中, 血糖在1h降至最初血糖值的45.98%, 作用时间延长, 以皮下注射胰岛素为对照, 其相对生物利用度为17.02%。吴正红等[11]用不同分子质量的聚维酮 (PVP) 制备PVP-胰岛素脂质体, 考察PVP对胰岛素的保护作用, 结果含PVP-K17、PVP-K30和PVP-K90三种分子量的PVP-胰岛素脂质体包封率分别为64.4%、62.8%和57.5%, 对胃蛋白酶都有一定抑制作用, 且随分子量增加有所增强, 但对胰蛋白酶未见有抑制作用, 小鼠口服降血糖试验显示, 含PVP-K30的PVP-胰岛素脂质体有较好降血糖作用, 最大降血糖值达40.4%, 维持25.8%以上降血糖作用可达6h。

张娜等[12]考察了用荆豆凝集素修饰后的胰岛素脂质体对小鼠胰岛素口服吸收的影响。给予糖尿病模型小鼠和正常的小鼠分别灌胃350U/kg的经修饰后的胰岛素脂质体溶液, 并与相同剂量的普通胰岛素脂质体进行比较。对正常的小鼠, 经荆豆凝集素修饰的胰岛素脂质体在4h使血糖降至最初血糖值的 (84±15) %, 8h降至 (78±11) %, 12h为 (90±12) %。而含胰岛素的普通脂质体基本无降血糖作用。对于糖尿病模型小鼠, 经荆豆凝集素修饰的胰岛素脂质体在4h使血糖值降为最初血糖值的 (73±7) %, 8h为 (74±9) %, 12h为 (86±9) %。张娜等[13]采用相同的实验方法考察了经西红柿凝集素修饰的胰岛素脂质体在小鼠肠道中的吸收。对正常的小鼠, 经西红柿凝集素修饰后的胰岛素脂质体组血糖有下降, 而普通的胰岛素脂质体组基本无血糖下降。对于糖尿病模型小鼠, 经西红柿凝集素修饰的胰岛素脂质体在4h血糖值降为最初血糖值的 (38±13) %, 8h为 (50±15) %, 12h降至 (50±16) %。张娜等[14]还研究了麦胚凝集素修饰的胰岛素脂质体对小鼠口服吸收的促进作用。结果表明修饰脂质体显著促进胰岛素的胃肠吸收。

3 肺部给药胰岛素脂质体

肺泡具有表面积大、透过性高和较大循环灌注的特点, 可使药物迅速吸收, 进入血液循环[15]。避免了大分子药物在肠道被消化酶分解及肝脏的首过效应。许多因素会影响肺深部的药物沉积, 包括微粒大小, 微粒速度和空气动力学参数等, 其中微粒大小的控制是影响肺部吸入的主要因素。通常认为, 微粒直径>5μm在到达肺泡前可能沉积在口咽部和上呼吸道, 吞咽比吸入的更多, 若直径<1μm, 则不能达到肺脏深部而随呼气排出, 已建立药物传递至肺泡的最佳空气动力学直径为1～3μm[16,17]。因此, 肺部给药脂质体的粒径要适宜。McGurk等[18]试用磷脂乙醇液或磷脂-氯氟碳混合液放置于加压容器里直接喷雾制备成脂质体气雾剂, 所制得的脂质体粒径比较大, 无法进入到呼吸道内部。目前, 脂质体肺部给药研究最多的是胰岛素脂质体混悬液 (INS-LIP-SP) 经喷雾器雾化以后经肺部给药。通过选用不同的喷雾器, 或改变脂质体的组成及混悬液的黏度, 在一定的温度和雾化气流压力下可制备粒径适宜的脂质体, 适用从肺部给药[19]。江志强等[20]研究发现, 制备的INS-LIP-SP即使不加入渗透促进剂, 给正常Wistar鼠气管滴注后, 其相对生物利用度仍然可达37%, 高于普通INS溶液。这是因为磷脂类物质是一种表面活性剂, 能降低表面张力, 使得液滴迅速在肺泡的表面铺展, 脂质体解体, 有利于药物在肺泡表面的吸收而产生作用。胰岛素脂质体肺部给药有相当广阔的前景。

4 口腔黏膜给药胰岛素脂质体

口腔黏膜较鼻黏膜厚, 但表层不象皮肤那样角质化, 由于面颊部血管丰富, 药物吸收后可经颈静脉、上腔静脉直接进入全身循环, 可避免胃肠道消化液的影响及肝的首过作用。通过改进药物的膜穿透性, 胰岛素也可以经口腔黏膜给药。杨天智等[21]用反相蒸发法制备胰岛素柔性纳米脂质体, 以家免为动物模型, 口腔给药后, 进行体内降血糖试验。结果给药1h血糖降至 (42±23) %, 给药10h血糖仍未完全回到初值, 说明胰岛素柔性纳米脂质体具有持久的降血糖作用。

5 经皮给药胰岛素脂质体

皮肤的水解酶活性相当小, 有利于多肽及蛋白质类药物保持稳定, 经皮给药可维持恒定的血药浓度, 可自主给药, 安全方便, 还可避免肝脏首过作用和胃肠道的降解。但面临的最大问题是药物对皮肤的穿透性太弱。郭建新等[22]制备含有胆酸钠的脂溶性环多肽-环孢素柔性脂质体, 这种脂质体可促进胰岛素的经皮吸收, 给小鼠皮肤用药后, 降血糖作用相当明显和持久, 与普通的胰岛素脂质体比较有显著差异 (P<0.05) , 其促进渗透的机制可能为, 胆酸钠可插入磷脂双分子层中, 使磷脂分子之间的距离增大, 磷脂酰基链的顺序被扰乱, 使其流动性增强。此柔性脂质体皮肤穿透作用比较强, 可能会成为大分子药物经皮吸收的有效载体。

6 结语

中药脂质体制备的研究进展 篇4

关键词：中药脂质体制备,临床应用,生命科学

脂质体进入人体内部之后会作为一个“入侵者”而启动人体的免疫机制, 被网状内皮系统吞噬, 从而在肝、脾、肺和骨髓等组织中靶向性地富集。这就是脂质体的被动靶向性。通过在脂质体膜中掺入一些靶向物质, 可以使脂质体在生物或者物理因素的引导下向特定部位靶向集中, 这就是主动靶向脂质体, 目前已经出现的脂质体主动靶向机制有:热敏脂质体、磁导向脂质体和抗体导向脂质体等[1,2,3]。

1 中药脂质体的制备方法

1.1 注入法:主要用于制备单室脂质体, 少数为多室脂质体, 其粒径绝大多数在2m以下。

1.2 薄膜分散法:主要用于制备多室或大单室脂质体, 超声后以单室脂质体为主。

1.3 超声波分散法:主要用于制备以单室为主单室脂质体。

1.4 逆相蒸发法:

将磷脂溶于有机溶剂, 加入含药物的缓冲液, 超声使成稳定w/o乳剂, 减压除去有机溶剂在旋转器壁上形成薄膜, 加入缓冲液使凝胶脱落, 制得水性混悬液, 通过凝胶色谱法或超速离心法, 除去未包入的药物, 即得大单室脂质体。

1.5 冷冻干燥法:适合于热敏感的药物。

1.6 重建脂质体:

单室或多室型。是目前国外应用最为广泛的制备方法之一。其具有工艺稳定、适合于工业化生产、质量易于控制、产品稳定性好等特点。

2 影响脂质体产品稳定性的因素

脂质体做成注射剂有几个问题, 一是如果减小粒径达到注射剂的要求, 二是如何保证脂质体的稳定性, 脂质体放时间长了都会融合, 粒径变大, 所以上市产品都将其做成冻干制剂, 但冻干剂再水化又会遇到粒径变大的问题, 若是水溶性药物, 包封率还会下降, 大凡科研单位都在用旋转蒸发仪制备脂质体, 通过超声减小粒径, 研发阶段确实比较方便实用。但这种方法可能很难上大生产。一下分析脂质体不稳定的因素。

2.1 生物体液

全血、血浆和血清影响脂质体的稳定性, 高密度脂蛋白 (HDL) 使脂质体不稳定, 可能通过从脂质双层组分子层中去除磷脂。富含胆固醇的脂质体对抗 (HDL) 的作用。脂质体在全血中比在血清中稳定, 这可能是由于HDL与红细胞相互作用先于HDL与脂质体相互作用, 也可能是胆固醇从红细胞转移到了脂质体。

2.2 光和金属污染

重金属和光催化不饱和磷脂发生氧化。可以通过加入金属鳌合剂EDTA, 在无氧环境下低温避光存储并加人生育酚抑制氧化作用等方法清除其氧化作用。

2.3 蛋白质的作用

蛋白质与脂质体表面结合严重影响脂质体的稳定性。脂质体膜对包封葡萄糖通透性的增加与蛋白质结合成直线关系, 脂质表面结合蛋白质的脂质体在磷脂相变温度的区域通透性比正常区域更高。这提示当磷脂的胶相和液晶相共存时通透性最高, 脂质双层错位是通透性增加的机制。脂质体内部包裹蛋自质也对脂质体稳定性起重要作用, 蛋白质可以与脂质双层内侧和外侧相互作用或跨过脂质双层。

2.4 多聚磷脂的作用

在多聚磷脂的脂肪酰基中含有能聚合的基团, 磷脂制备的多聚脂质体对超声、去污剂、有机溶剂、血浆蛋白的作用非常稳定。冰冻干燥不改变多聚脂质体结构或大小分布。多聚脂质体用于缓慢释放内容物, 然而, 日前对这种脂质体的毒性和生物降解了解较少。

2.5 非离子表面活性剂

在脂质双层掺入非离子表面活性剂如聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯 (吐温80) 制备立体化学性稳定脂质体, 这种脂质体无毒, 比传统的胆固醇稳定脂质体或多聚脂质体更稳定, 其理论是当两个体稳定的脂质体接近时, 由于存在水溶性链, 脂质体间的化学能降低, 因此, 由于渗透作用, 脂质体之间进入大量的水而分离。

2.6 醇类的作用

当乙醇浓度增加时, 漏出率增加。乙烯二醇和甘油对漏出率无影响。

3 脂质体的前沿研究

目前, 有许多公司正在开发阳离子脂质体、高相转移脂质体、聚乙二醇聚合物包裹脂质体等避免免疫应答的修饰性脂质体研究, 用于转基因治疗中DNA的导入。Sequus Pharmaceuticals公司的第一个改进的脂质体产品Doxic已在美国和欧洲上市, 用于治疗卡波济肉瘤。其中, 由于新系统安全性和靶向性显著提高, 阳离子脂质体转移系统的研究正掀起一股新热潮, 而多价表面修饰的阳离子脂质体也被业界认为, 可能将成为保证脂质体包埋复合物在血清中稳定的极有潜力的技术。

开发疗效高、生物利用度高、毒副作用低、患者顺应性高的新型给药系统是各大医药公司竞争的一大热点。脂质体包埋已经成为新的靶向性给药系统, 并已被业界广为接受。然而, 由于投入风险大、工业化存在困难等原因, 至今国内上市的品种仍然较少。

参考文献

[1]姜华, 高原, 杨景明.中药脂质体的研究进展[J].当代医学, 2009, 15 (28) :12-13.

[2]李晓君.中药脂质体靶向给药的研究进展[J].辽宁医学院学报, 2009, 30 (1) :78-81.

紫杉醇脂质体自动化生产探索 篇5

恶性肿瘤是世界公认的对人类健康危害最严重的疾病之一, 随着人类生存环境和生活习性的改变, 在不良外部环境和一些不利因素的作用下, 肿瘤病人呈总体增长趋势, 且肿瘤发病者呈年轻化趋势, 使得市场对肿瘤药的需求急剧上升。然而, 传统的紫杉醇脂质体生产工艺中的薄膜分散过程, 成膜水化一直是脂质体工业化的瓶颈所在, 原方法使用人工操作, 把药剂装填到旋转蒸发瓶中, 通过水浴减压蒸干除去有机溶剂, 然后加入洗膜液, 得到多室脂质体 (MLV) 。在此过程中, 需使用大量人工操作, 不仅产量受限, 而且药液与外界接触增多, 药品的质量不稳定, 也不满足新版GMP的要求。基于原有方法的不足, 使用全自动控制药液的生产来进行中试放大, 不仅可以减少人工干预, 增加药品稳定性, 满足GMP要求, 而且能大幅增加产量。

1 问题分析

本文根据某公司提供的紫杉醇脂质体薄膜分散工艺进行自控设计。整个系统包含:1个300 L的制膜液配制罐, 在此罐中进行紫杉醇脂质体的配制;1个300 L的洗膜液配制罐, 在此罐中进行紫杉醇脂质体洗膜液的配制, 因配制过程中会接触乙醇, 所以整套设备安置在防爆间中。随后, 在制模间中有1个200 L的制膜液分配储罐, 1个200 L的洗膜液分配储罐, 还有30台旋转蒸发仪及配套的抽真空设备, 生产出来的脂质体通过真空输送到均质间。均质间有两个150 L的均质罐, 并有20台均质机对储罐内的脂质体进行均质操作, 均质完的药液输送到暂存间。暂存间有1个200 L的不锈钢储罐, 随后通过灌装机和冻干机把脂质体灌装冻干。

此项工程的难点在制膜间, 制膜间整体设备包含1个制膜液储罐、1个洗膜液储罐、两个定容蠕动泵、30个旋转蒸发仪和30个水浴锅。MLV的生产过程为分配药液至30个旋转蒸发瓶, 然后下降到水浴锅中加热, 对旋转蒸发仪进行抽真空, 通过蒸发瓶旋转均匀加热将膜液蒸干成膜, 然后注入洗膜液进行脱膜制成MLV。在整个过程中, 影响整体药品质量的关键点在于制膜液分配到各个蒸发瓶的平均度, 只有每个瓶子一样的药液才能保证30个旋转蒸发瓶旋转蒸发时间一致和可控。同样, 洗膜液的平均分配也直接影响薄膜洗脱时间的一致性和可控性, 只有在每个旋转瓶中重量精确一致, 才能有效保证药品生产的标准化和质量稳定性。

2 方案整体设计

自动控制方案使用S7-300控制器, 用于工艺过程控制, 通过15寸平板电脑完成对该区域现场设备的操作和数据记录, I/O模块完成对现场信号的数据采集和工艺上的控制要求, 控制器通过以太网完成向HMI (操作屏) 的数据交换, 利用HMI的组态软件完成数据的显示、趋势、记录和报警等一系列功能。整个硬件及操作系统完全符合国际工业标准, 具有开放性强、实时性高、数据吞吐量大、运行安全稳定、操作方便等特点。系统具有良好的可扩充性, 更易于升级换代。制膜间内包含两个储罐、两个蠕动泵、30个旋转蒸发仪以及配套管道阀门, 阀门选用气动隔膜阀, 电气柜内使用先导阀对阀门进行开关控制。

制膜罐内药液重量大概150 kg, 前期设计30个旋转蒸发仪根据药液重量平均分配, 制模液输送药液管道长度大概在50 m。为达到自控分配的目标, 整个分配系统分为以下3个部分。

2.1分配前准备

分配前, 首先要静置整个储罐, 称量出储罐内药液净重量, 选择可以正常使用的旋转蒸发仪, 因整个系统在某几个设备出现故障时仍然可以正常使用, 所以要剔除有故障的设备, 统计能正常使用的旋转蒸发仪的数量, 用整个储罐内药液的重量除以能正常使用的旋转蒸发瓶的数量, 计算出每个旋转蒸发仪应加入的药液量, 接着确认蠕动泵的输送频率, 确定蠕动泵每分钟输送的药液量, 根据之前算出的重量计算出每个旋转蒸发瓶的输送时间。

2.2填充输送管道

要保证填充管道, 是为了在打开旋转蒸发瓶时保证输送的药液都送到了蒸发瓶内, 而不是输送到空的管道中。打开罐底阀门和最后1个蒸发瓶进料阀门, 然后启动蠕动泵把药液填充到管道中。当最后一个瓶口有稳定的药液流出时, 则可以保证输送管道内已完全填满。然后进入下一步。

2.3药液平均分配

需对30个旋转蒸发瓶平均分配药液, 该系统为整个配制系统中最重要的子系统, 药液分配的平均度关系到整个产品的质量, 要求每个蒸发瓶分配5 L, 每个瓶内药液的误差在0.5%以内, 即在25 m L以内。

2.3.1 方案一

要依靠现场设备做好初步计划, 使用定容量蠕动泵进行药液分配, 以控制蠕动速度和蠕动时间, 进而控制每个瓶的分配量。然后, 打开第一个开始填充蒸发瓶并计时, 当计时达到时则关闭此蒸发瓶阀门, 此后再打开后一个, 以此类推, 直到倒数第二个瓶内药液灌装完成。最后, 把剩余药液全部通过蠕动泵送到最后一个瓶内。图1为控制流程方案一。

经现场测试, 使用此方案并不能达到设计精度, 且最后一个蒸发瓶内的药液量超标太多。经分析, 蠕动泵的送料软管在运行过程中回弹力度会衰减, 每分钟输送药液量随之减少, 且减少量不可预测。所以, 使用蠕动泵运行时间来计算每个瓶的药液量无法实现准确输送。因此, 依照蠕动泵的运行时间分配的方案不可行, 调试后修改为方案二。

2.3.2 方案二

此系统储液罐使用称重传感器来测量储罐重量, 使用梅特勒托利多高精度称重传感器来测量储罐重量, 精度可以达到0.1%。现使用重量作为整个系统的控制基准, 即:首先使用蠕动泵填充整个管道, 然后记录下重量, 此重量即为填充管道所需的药液量。然后, 在现有储罐重量的基础上计算所减少额定重量的结果, 并打开蒸发瓶阀门输送药液, 因每个蒸发瓶的阀门开关需要一定时间, 且每个阀门的开关时间不一致。所以, 需在每个蒸发瓶的计算量中增加修正量, 当重量达到修订后的减少额定值量时, 此瓶灌装完成, 然后进入下一瓶灌装。依次灌装直至最后完成。图2为控制流程方案二。

用此方案, 可解决蠕动泵输送量不一致的问题, 提高了分配精度, 但精度仍然达不到甲方要求。经分析, 因为顺序开阀门时, 前一个阀门关和后一个阀门开同时进行造成无法判断药液通往哪个阀门, 若两个阀门之间间隔一段时间把阀门开关错开, 又会使管道憋压导致蠕动泵软管破裂。若在停阀门的同时关闭蠕动泵, 也会因蠕动泵的惯性造成软管压力, 同样会发生破裂风险。而且, 整个系统的灭菌使用121 ℃纯蒸汽灭菌, 在灭菌时整个系统处于温度121 ℃压力0.15 MPa的环境中, 在此种温度和压力下灭菌的软管很容易破裂, 造成安全隐患。

因此, 选择修改管道灭菌时跳开此泵, 管道选择在线灭菌, 软管使用离线灭菌。使用此种方式需增加层流罩, 以实现在拆装过程中保证系统在A级区环境。但是, 如暴露在空气中仍然会对整个产品安全造成不可估量的影响, 而且蠕动泵的软管在此种环境下使用消耗也过快, 会大大增加企业使用成本。因此, 此方案也无法达到要求。但是, 分配精度已经有了提高, 现在只要解决蠕动泵的问题即可, 改进后形成了方案三。

2.3.3 方案三

不再使用蠕动泵, 输送药液的动力源更改为洁净压缩氮气, 直接使用不锈钢管道连接整条管道, 增加洁净氮气自动调压阀门, 保证输送罐内压力稳定在60 k Pa。为提高控制精度, 增加阀门打开间隔时间, 在前一个输送料阀门关闭5 s后再打开下一阀门, 稳定称重重量。图3为控制流程方案三。

使用此方案, 经测试满足了精确分配的要求, 彻底解决了之前方案一和方案二遇到的问题, 实现了分配系统的精确分配和配制过程的可重复性, 为后期蒸发瓶均衡调制萃取药液打下了坚实的基础。

3 方案总结

根据上述3种方法的实验和总结, 最终采用的控制流程如图4所示。在上述方法中都需首先填充整个管道, 然后记录下重量, 此重量即为填充管道所需的药液量, 然后在现有储罐重量的基础上计算最后一个蒸发瓶所需的重量值。如果管道填充量大于最后一个蒸发瓶重量, 则填充到倒数第二个旋转蒸发瓶时储罐内药液重量就已经为0, 此时如再按照重量来分配剩余旋转蒸发瓶药液量就不能实现, 就需更改为使用输送时间来进行输送, 计算好当罐内药液为0时倒数第二个蒸发瓶内的重量然后经过多次实验确定输送时间, 当倒数第二个输送完成时, 把管道内的所有参与药液输送到最后一个蒸发瓶中, 在此过程中要保证储罐内压力一致, 当最后一个分配完成后, 打开所有蒸发瓶瓶口阀门, 使瓶口残余的药液流到蒸发瓶中。此时整个分配过程完成。

4 结语

经多次实验证明, 使用此种方法可大大提高分配的平均性和准确度, 使全自动化生产成为可能。全自动控制系统的设计不但提高了药品产量, 而且减少了人工干预的过程, 使药品质量得到了保证, 最终帮助业主顺利通过了GMP验证。

参考文献

[1]METTLER TOLEDO.ICS429用户手册[Z], 2001.

[2]STEP7软件使用手册[Z], 2004.

黄芩苷脂质体制备及包封率测定 篇6

近年来随着对其活性成分黄芩苷研究的深入,发现其有抗病毒、抗肿瘤、抗感染、抗HIV、抗氧化及清除氧自由基以及治疗心血管疾病等作用[1,2,3],同时脂质体以其良好的生物相容性、生物膜相似性、生物安全性及促进药物吸收等特征,引起人们的高度重视。本文对黄芩苷脂质体的制备工艺进行初步研究。

1 材料

1.1 试剂

卵磷脂(EPC,天津市化学试剂公司分公司),胆固醇(CHOL,中国医药(集团)上海化学试剂公司),氯仿(天津市博迪化工有限公司),黄芩苷标准品(中国生物制品检定所),黄芩苷精制品(自制:纯度99.9%),其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器

RE-52旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂),SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司),UV-9100紫外可见分光光度计(北京瑞利分析仪器公司),KQ-250DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司),85-1恒温磁力搅拌器(国华电器有限公司),XW-80A旋涡混合器(上海青浦泸西仪器厂)。

2 方法与结果

2.1 有机相与水相比例

精密称取EPC 160mg、CHOL 40mg溶于氯仿与异丙醇(14:1)30mL混合溶液为有机相,40mg土温-80溶于磷酸缓冲液(PBS):氯化钠137mmol/L、氯化钾2.6mmol/L、磷酸氢二钠6.4mmol/L、磷酸二氢钾1.4mmol/L为水相,分别取有机相1、2、3、4、5、6、7mL于试管中,再加入1mL PBS溶液,旋涡混合后,超声10min。观察现象为:有机相:水相为3:1时,液体呈乳白色且最稳定最白。

2.2 逆相蒸发法[4]

分别精密称取EPC 160mg、CHOL 40mg溶于氯仿30mL混合溶液中。将黄芩苷10mg、土温-80 40mg溶于磷酸缓冲液(PBS,pH7.0)10mL中。然后将含有药物的PBS与有机相旋涡混合,超声处理(10min),直至形成稳定的W/O型乳剂(水浴温度控制在20℃),然后于旋转蒸发仪中减压蒸发除去有机溶剂,达到胶态后追加2mLPBS,水化,继续减压蒸发,即得淡乳黄色脂质体混悬液。

2.3 包封率测定:透析-紫外分析法

2.3.1 确定检测波长

取少量黄芩苷对照品,PBS溶解,以PBS为空白对照,200～400nm慢速扫描,见图1,采样间隔1nm,选择λmax为含量测定波长。同样,将脂质体透析液进行扫描,见图2,结果显示最大吸收波长为275nm。

2.3.2 标准曲线制备

精密称取黄芩苷标准品2.5mg,用磷酸盐缓冲液(PBS,pH7.0)溶至50mL容量瓶,定容。分别移取0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL定容液于7个10mL容量瓶,并用PBS定容(即浓度依次为0、5、10、15、20、25、30μg/mL),空白对照采用制备脂质体中用的PBS(pH=7.0),紫外分光光度计于λmax处测定吸光度(A),以吸光度(A)对浓度(C)线性回归,得回归方程A=0.048C+0.0113,R=0.9999(n= 7),见图3。结果显示:黄芩苷-PBS溶液浓度在1～30ug/mL范围内吸光度与浓度呈较好的线性关系。

2.3.3 黄芩苷脂质体包封率测定

采用透析法分离-紫外比色方法测定

黄芩苷脂质体包封率,分别吸取空白脂质体、黄芩苷脂质体1.0mL,加入无水乙醇破膜,并定容至50mL,在275nm处测吸光值,记为A1,同时另取空白脂质体、黄芩苷脂质体1.0mL,加入一定长度的透析袋内, 两端用绳子固定, 放在盛有15mL 相应PBS透析介质的烧杯中,将此烧杯置于定时恒温磁力搅拌器上搅拌1小时,共3次,将透析液合并定容至50mL,在275nm处测吸光值,记为A2,将A1、A2代入回归方程,计算出m总和m游,按下式计算包封率:包封率=(m总-m游)/m总×100%。

2.4 EPC:CHOL比例对黄芩苷脂质体包封率的影响

加CHOL 后对减少脂质的流动性,提高脂质体的密闭性能以及减少渗漏有很大帮助。实验表明当(mEPC和mCHOL的比例) 在4:1 左右时,包封率较高,见图4。

2.5 黄芩苷浓度对黄芩苷脂质体包封率的影响

用逆相蒸发法,mEPC和mCHOL的比为4:1,包封不同浓度的黄芩苷溶液。实验表明不同浓度的黄芩苷溶液对包封率有一定的影响,以1.5 mg/mL最佳浓度,其脂质体的包封率见图5。

2.6 不同PBS浓度对黄芩苷脂质体包封率的影响

用逆相蒸发法,当m EPC 和m CHOL为4:1,黄芩苷浓度为1.5 mg/mL,采用不同浓度的PBS溶液制得脂质体,其包封率见图6。

3 结论及展望

3.1 结论

以mEPC和mCHOL为4:1,有机相:水相为3:1,黄芩苷浓度1.5mg/mL,所制得黄芩苷脂质体粒径均匀、制备量大,包封率达40.4%。

3.2 展望

黄芩苷脂质体的制备方法有注入法[5]、薄膜分散法和反相蒸发法等,可采用任何一种方法制备,但重点要分析脂质体的稳定性。如果药物在体外从脂质体中迅速渗漏或在体内未到达靶组织之前渗漏,将大大限制其作为药物载体的应用,胆固醇可以使磷脂在膜中排列更紧密,防止磷脂丢失,从而提高脂质体膜稳定作用。所以今后研究黄芩苷脂质体制备工艺,需对其稳定性进行考察,以便临床应用。

摘要：采用逆相蒸发法,利用卵磷脂制备黄芩苷脂质体,以紫外法测定黄芩苷浓度,透析法测定黄芩苷包封率。结果表明:卵磷脂:胆固醇(m/m)为4:1,有机相:水相为3:1,黄芩苷浓度1.5mg/mL,所制得黄芩苷脂质体粒径均匀、制备量大,包封率达40.4%。

关键词：黄芩苷,脂质体,逆相蒸发法,包封率

参考文献

[1]延卫东,王瑞君,等.黄芩苷药理作用研究进展[J].陕西中医,2002,23(12):1127-1129.

[2]瞿佐发.黄芩的药理作用及临床应用[J].时珍国医国药,2002,13(5):316-317.

[3]侯艳宁,朱秀媛,等.黄芩苷的抗炎机理[J].药学学报,2000,35(3):161-164.

[4]张伟光,高树刚,安红.大豆磷脂阿奇霉素脂质体的制备及包封率测定[J].精细化工,2008,25(4):369-371.

磁性脂质体 篇7

1 壳聚糖及其衍生物包覆脂质体

1.1 壳聚糖包覆脂质体

壳聚糖(chitosan)是一种天然聚阳离子碱性多糖,具有很好的生物相容性和生物可降解性,近几年在药物制剂中的应用越来越广泛[2]。有研究表明:质子化的壳聚糖能通过正、负电荷的作用打开黏膜紧密接口,从而使药物穿透黏膜,促进药物的吸收[3]。

Guo J等[4]分别用高纯度磷脂和低纯度磷脂制备醋酸亮丙瑞林脂质体后用不同浓度的壳聚糖包覆,发现浓度大于1%的壳聚糖溶液包覆脂质体可制备稳定的壳聚糖包覆脂质体。用壳聚糖包覆脂质体,阳离子型的壳聚糖与阴离子型脂质体发生电荷吸引作用,壳聚糖通过将残余的酰基插入脂质体的磷脂膜中,镶嵌在脂质体膜的表面,形成壳聚糖脂质体复合体,从而增加了脂质体的稳定性和药物的靶向性,也使黏膜上皮细胞更容易吸收药物分子[5,6]。

Takeuchi H等[7,8,9,10]以降血钙素为模型蛋白质类药物,制备不同粒径的降血钙素脂质体后再以壳聚糖包覆得到壳聚糖包覆降血钙素脂质体。大鼠灌胃后切去肠道,用激光共聚焦显微镜观察比较包覆脂质体和未包覆脂质体进入黏膜情况,测定降血钙素释放速度和吸收程度。发现与未包覆降血钙素脂质体相比,壳聚糖包覆降血钙素脂质体具有更好的进入肠道黏膜的能力,能有效促进肠黏膜细胞对蛋白质药物的吸收,有效延长药物的释放时间,克服了未包覆脂质体作为口服类药物载体在胃肠道的p H值、胆汁盐、胰脂肪酶存在条件下不稳定的缺点,延长了脂质体药物的体内循环时间。

魏农农等[11]以氟尿嘧啶为模式药物,制备正电性和负电性的氟尿嘧啶脂质体混悬液后用壳聚糖包覆。用罗丹明B异硫氰酸(RBITC)和Bodipy-PC分别标记壳聚糖和磷脂,测定壳聚糖对正电性、中性和负电性脂质体的包封率分别为61%、73%和99%,可见壳聚糖可以包覆不同电性的脂质体。分别将包覆和未包覆的氟尿嘧啶脂质体放入透析袋中,在37℃下模拟胃液、模拟肠液和模拟结肠液中进行体外释放,发现未包覆脂质体在胃液中2 h药物完全释放,包覆脂质体4 h释药6.82%,并符合零级释药方程;而在模拟结肠液(p H 7.8)中,包覆脂质体的释药速率大为加快,因为结肠部位的β-2葡萄糖苷酶降解了包覆材料壳聚糖,说明可利用结肠部位存在结肠厌氧菌分泌β-2葡萄糖苷酶降解壳聚糖这一特性达到口服壳聚糖包覆氟尿嘧啶脂质体结肠靶向释药的目的。

1.2 N-三甲基壳聚糖盐酸盐包覆脂质体

壳聚糖是一种碱性多糖,在弱酸性条件下溶解,而在中性和碱性条件下沉淀,因此其吸收促进剂的作用在大肠、结肠和直肠等碱性环境中受到限制。N-三甲基壳聚糖盐酸盐(N-trimethyl chitosan chloride,TMC)作为壳聚糖部分季铵化的衍生物具有与壳聚糖相似的生物学性质,但其水溶性明显改善,在p H中性时也能溶解,还可以通过其C-2位上带正电的季铵基团与黏膜上皮细胞上带负电的糖蛋白作用,促进药物的黏膜吸收。

吴正红等[12]制备N-三甲基壳聚糖盐酸盐包覆胰岛素脂质体混悬液,用胃蛋白酶和胰蛋白酶溶液考查TMC包覆脂质体对胰岛素的保护作用,发现TMC包覆胰岛素脂质体对胰岛素的保护作用随TMC相对分子质量、季铵化程度和浓度的增加而增强。大鼠、小鼠灌胃后,测定大、小鼠血糖值,发现最大降血糖值分别为35.25%和82.83%。大鼠维持28.58%以上的降血糖值达2 h;小鼠维持52.32%以上的降血糖值达4 h。实验表明:TMC对胃蛋白酶和胰蛋白酶有一定的抑制作用,并可促进胰岛素的口服吸收,TMC包覆的胰岛素脂质体与未包覆的胰岛素脂质体及胰岛素醋酸缓冲液相比,具有更好的降血糖作用。

1.3 氯化壳聚糖包覆脂质体

氯化壳聚糖(chitosan chloride)是壳聚糖的水溶性衍生物,生理条件下,肿瘤细胞表面带有较多的负电荷,用带正电荷的氯化壳聚糖包覆脂质体,静电作用可增加脂质体药物对肿瘤细胞的靶向性。周本宏等[13]制备得到平均粒径为91.9 nm,包封率为61.2%的氯化壳聚糖包覆羟基喜树碱脂质体,透析法考察药物体外释药性质,发现氯化壳聚糖包覆脂质体外释药符合Higuchi方程;48 h后,未包覆的羟基喜树碱脂质体积累释药60%以上,而包覆脂质体则不足20%。可见氯化壳聚糖包覆脂质体对模型药物的包封率高,稳定性好,对模型药物有更好的缓释作用。

2 海藻酸盐包覆脂质体

海藻酸盐(alginate)是从褐藻中提取加工得到的聚阴离子天然多糖,无臭,无味,易溶于水,持水性能好。它具备药物制剂辅料所需的稳定性、溶解性和安全性。将海藻酸钠溶液逐滴加入Ca Cl2溶液中,即形成具有规则形状和粒径大小的海藻酸钙球形凝胶,称为“海藻酸盐微球”(alginate bead)。海藻酸盐微球作药物载体在正常生理条件下可降解或溶解,膨胀后可保护多肽类药物免于胃酸和酶降解,增加药物吸收。但是,海藻酸盐微球自身作为药物载体存在对小分子药物、水溶性药物包封率较低,药物释放速度过快的缺点。Liu X等[14]以蜂毒为模型药物,制备海藻酸盐凝胶微球包覆蜂毒脂质体,然后再以Euderagit S100包覆海藻酸钙微球。模拟胃、小肠、结肠环境,研究其作为结肠靶向给药系统的体外释药特性,发现:Eudragit S100在p H 6.8时溶解,可以抑制药物在胃肠道上部的释放,随后海藻酸钙凝胶微球暴露、溶胀、蚀解,蜂毒脂质体释放出来,达到了结肠靶向给药的效果。在p H 1.2的条件下,蜂毒蛋白的释放过程可达8 h。用99 m TcMIBI标记蜂毒蛋白,γ射线显影法研究其在体内的转运和释药过程,发现约3.5 h后,蜂毒蛋白到达小肠;4.0 h到达结肠部位;4 h后,蜂毒蛋白在结肠部位释放出来达到了结肠靶向给药的目的,说明海藻酸盐包覆脂质体是结肠靶向给药的良好药物载体。

3 O-棕榈酰小核菌葡聚糖包覆脂质体

小核菌葡聚糖(scleroglucan)是由小核菌属真菌产生的一组胞外中性葡聚糖,这种多糖具有一些优良的理化性能和抗肿瘤活性,在医药、食品等领域有广泛的应用。

Carafa M等[15]以醋酸亮丙瑞林为模型药物,考查小核菌葡聚糖及其衍生物O-棕榈酰小核菌葡聚糖包覆脂质体作为口服蛋白质药物载体的可行性。差示扫描量热法(DSC)分析显示:O-棕榈酰小核菌葡聚糖分子插入到脂质体磷脂双分子层中,包覆在脂质体表面。将脂质体、小核菌葡聚糖包覆脂质体和O-棕榈酰小核菌葡聚糖包覆脂质体三者置于小牛血清、模拟胃液、肠液、胰液和胆酸钠溶液中比较三者的稳定性,发现除在小牛血清中三者稳定性差异不大之外,在其他溶液中包覆脂质体较未包覆脂质体的稳定性明显增加。在胆酸钠溶液中,未包覆脂质体和小核菌葡聚糖包覆脂质体明显出现药物泄露,而O-棕榈酰小核菌葡聚糖包覆脂质体内药物只有微量泄露。可见,O-棕榈酰小核菌葡聚糖包覆增强了脂质体在模拟体内释药环境中的稳定性。

4 干果寡糖(Oligomannose)包覆脂质体

Kojima N等[16]以卵清蛋白为模型抗原,C57BL/6小鼠皮下注射干果寡糖包覆卵清蛋白脂质体免疫后,转染OVA抗原的EL4细胞系E-G7-OVA肿瘤细胞,发现所有注射干果寡糖包覆卵清蛋白脂质体的C57BL/6小鼠都排斥E-G7-O-VA肿瘤。小鼠脾细胞的细胞毒活性对E-G7-OVA肿瘤细胞非常高,但对其亲本EL4细胞并不排斥。当肿瘤组织长到8~10 mm时,注射1μg干果寡糖包覆OVA脂质体,考察其治疗效果,发现肿瘤的生长得到有效的抑制,40%注射小鼠的肿瘤彻底消失。用EL4细胞系细胞裂解液作为模型抗原,处理细胞E42肿瘤也得到了类似的效果。实验证明:干果寡糖包覆抗原脂质体,可以作为有效的抗肿瘤疫苗药物载体。

5 茁霉多糖衍生物包覆脂质体

茁霉多糖(pullulan)是由出芽短梗霉分泌的胞外多糖,主要由麦芽三糖通过α-1,6-糖苷键聚合而成,是一种天然的自然降解的水溶性葡聚糖;它无色、无味、无毒,可以保护生物膜,减轻渗透压、离子强度等理化因素对生物膜的刺激。茁霉多糖不引起任何生物学毒性和异常状态,可以安全可靠地用于食品和医药行业。茁霉多糖包覆脂质体在被稀释条件下容易从脂质体表面脱落,但一定条件下将茁霉多糖与棕榈酸酰氯酯化反应连接上疏水性分子链,制备得到棕榈酰茁霉多糖(OPP)可以与脂质体牢固结合。

通常脂质体用于口服免疫疫苗。Venkatesan N等[17]以牛血清(BSA)为模型抗原,制备棕榈酰茁霉多糖包覆BSA脂质体,然后动物口服进行免疫试验,发现其产生的血清Ig G和Ig A明显高于BSA-氢氧化铝口服免疫组和未包覆BSA脂质体口服免疫组,表明OPP包覆脂质体确能抑制脂质体泄漏,保护疫苗免受胃酸和胃肠道内的酶降解,提高疫苗的口服吸收效果。

6 聚乙烯醇衍生物包覆脂质体

聚乙烯醇(PVA)是无毒、可生物降解的水溶性高分子。在PVA分子末端连接疏水性烃基长链(C16H33-S-)生成PVA-R。PVA-R包覆脂质体能减少被内皮网状系统中巨噬细胞摄取,延长脂质体药物在体内的循环时间。

Nakano K等[18]制备直径范围在161.2~182.2 nm的PVA-R包覆脂质体,荧光染料标记脂质体,将不同指标的未包覆脂质体和包覆脂质体加入到体外培养的J774巨噬细胞培养基中培养,用流式细胞仪和激光共聚焦显微镜观察荧光强度,以测定比较PVA-R包覆和未包覆脂质体与J774巨噬细胞的吸附反应。实验发现:除蛋黄卵磷脂与胆固醇比例为5∶5的PVA-R包覆脂质体较未包覆脂质体与J774巨噬细胞反应更为强烈外,其他比例的PVA-R包覆脂质体较未包覆脂质体与J774巨噬细胞反应都弱,说明PVA-R包覆脂质体较未包覆脂质体更能抑制巨噬细胞的吸附,从而延长脂质体药物的释放时间。

7 S层蛋白包覆脂质体

目前已发现400多种细菌和古细菌有S层蛋白,S层蛋白在菌体表面自装配形成规则晶格的单分子层,称为S层。S层蛋白也是含量最丰富的细胞蛋白之一,占菌体总蛋白的10%~20%[19]。Hollmann A等[20]初步考查了从L.brevis和L.kef两种益生菌中分离的S层蛋白包覆脂质体作为口服型疫苗药物载体的可行性。制备正电性脂质体后,分别用从L.brevis、L.kefir两种乳酸菌中提取的S层蛋白包覆,制备S层蛋白包覆脂质体。以羧基荧光素、钙黄绿素为模型药物和示踪物,测定两种S层蛋白包覆脂质体与未包覆脂质体在不同温度、不同p H和不同的模拟释药环境下的释药量,以考查包覆脂质体的稳定性,发现两种蛋白包覆脂质体稳定性明显增加,其中在p H 7条件下L.brevis的S层蛋白包覆脂质体比L.kefir的S层蛋白包覆脂质体更稳定。实验证明,两种益生菌中的S层蛋白包覆脂质体后,脂质体的稳定性大大提高,可作为口服型疫苗的良好药物载体。

8 讨论与展望