阳离子脂质体（通用7篇）
阳离子脂质体 篇1
内皮祖细胞 (Endothelial progenitorcells, EPCs) 可作为转染成血管生长因子基因的靶细胞, 将所载基因定向运送到体内缺血部位并合成行使功能的蛋白质, 促进缺血区功能血管的发生, 加强保护缺血组织的功能, 此即EPCs的基因修饰。但是外源性基因导入EPC的方法还存在许多缺陷, 转染效率较其它细胞明显偏低, 限制了这种基因联合内皮祖细胞治疗缺血性疾病的进一步研究和临床应用。
Invitrogen公司的Lipofectamine 2000具有转染效率高的特点, 应用较为广泛, 而用该脂质体转染EPC的研究尚少。各种影响转染效率的因素在转染EPC的体系中所占的比例、最佳转染EPC脂质体体系以及转染效率尚未见明确报道。本研究以可编码绿色荧光蛋白的质粒pEGFP ( (Enhancement Green Fluorescent Protein) 为阳性指示, 在其它影响转染效率的因素不变的情况下, 对脂质体剂量、DNA质粒剂量两个主要影响因素的不同剂量的水平进行研究, 旨在确定Lipofectamine 2000转染EPCs中脂质体和DNA质粒使用的最佳剂量, 为基因修饰EPCs治疗缺血性疾病提供理论和实验基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验材料、试剂:
SD大鼠 (重庆医科大学实验动物中心提供) , 雄性, 体重80～100g, 清洁级饲养。pEGFP质粒及大肠杆菌JM109均由重庆医科大学感染性疾病分子生物学教育部重点实验室赠送, 脂质体Lipofectamine 2000、DIL-acLDL (Invitrogen公司) , M199基础培养基、南美胎牛血清、双抗 (hyclone公司) , 牛垂体提取物 (BPE Bovine Pituitary Extract, Millipore公司) , 碱性成纤维细胞生长因子 (FGF Peprotech公司) , Fibronectin (Chemicon公司) , 兔抗大鼠CD133抗体 (Abcam公司) , 兔抗大鼠CD34 (millipore公司) , FITC标记山羊抗兔荧光二抗 (中衫金桥公司) , 质粒抽提试剂盒 (Omega公司) , 24孔板 (BD公司) 。
1.1.2 仪器:
CO2细胞培养恒温箱 (美国Forma Scientific公司) , 核酸蛋白分析仪 (Amersham.Biosciences) , 激光共聚焦成像仪 (LCS-SP2, Leica) , 倒置相差显微镜 (Olympus公司) , 倒置荧光显微镜 (Nikon TE2000) 。
1.2 方法
1.2.1 BM-EPCs的采集分离、培养及鉴定:
选用100g左右的雄性SD大鼠, 采用Jalees Rehman[1]等实验方法分离培养大鼠股骨骨髓中EPCs, 并用含20% FCS、1ng/ml FGF-basic、40μg/ml BPE的M199培养液调整细胞浓度至2～4×106个/孔, 接种于Fibronectin (FN) 预铺的24孔板, 置于饱和湿度、37℃、5% CO5细胞培养箱培养。3d后首次换液时间, 其后每隔2d换液, 并分别于培养的第3、5、7、10d对贴壁细胞进行CD133、CD34、DIL-acLDL的免疫荧光标记。
1.2.2 鉴定、扩增质粒pEGFP:
质粒pEGFP经测序鉴定序列正确。转化感受态大肠杆菌JM109, 扩增阳性菌, 质粒抽提后经核酸蛋白分析仪测其浓度和纯度。
1.2.3 pEGFP质粒、脂质体Lipofectamine
2000转染EPCs:试验分组按照正交设计原理设计。两个因素脂质体Lipofectamine 2000剂量和pEGFP质粒质量均有3个水平, 分别为1、5、10μl和 2、4、8μg, 共有9组组合, 每个组合设置3个复孔。24孔板培养EPCs至第9～10d, 细胞融合达70%以上, 进行转染:提前一夜更换无双抗的培养液500μl/孔, 分别用50μl无血清无抗生素的M199稀释质粒和脂质体, 混匀静置5min, 将两种稀释液混匀静置20min。分别加入相应的孔中, 4h后更换含血清、生长因子的培养液。转染后以24h为时间间隔, 荧光倒置显微镜观察各组细胞。以荧光显微镜蓝色激发下呈现绿色荧光的细胞为阳性细胞。采用盲法, 随机计数显微镜下10个视野的阳性细胞数和总细胞数, 两者之比即为转染效率。实验重复2次。
1.3 统计分析
转染效率以均数±标准差表示undefined, 用SPSS16.0统计软件包进行正交设计的结果分析, 当P<0.05时认为差异有统计学意义。
2 结果与分析
2.1 EPCs分离培养
2.1.1 EPCs形态学鉴定
体外分离培养的大鼠骨髓来源的EPCs于2d后开始贴壁变形, 3～5d后部分细胞呈现典型的集落样生长, 培养20d后可见分化为内皮细胞样典型铺路石样改变。
2.1.2 EPCs细胞表面特异性抗原和功能鉴定
体外分离培养的EPCs 3d、5d时细胞表面特异性抗原CD133、CD34呈现阳性表达 (图2A、B) , 7～9d时90%以上呈现Dil-acLDL阳性表达 (图2C) , 表明SD大鼠骨髓来源EPC培养成功。
2.2 pEGFP质粒Lipofectamine 2000转染EPCs
BM-EPCs于转染后24h内已经开始表达绿色荧光蛋白, 在48h内达到高峰。 统计结果表明9组间转染效率均具有显著性差异 (P<0.01) 。当脂质体剂量为1、5和10μl时, 转染效率均随质粒DNA量的增加而增加, 且不同剂量组合间均有显著性差异;脂质体剂量为5μl时的不同组合其转染效率高于1μl和10μl, 且有统计学显著性差异。表明Lipofectamine 2000脂质体剂量为5μl及质粒剂量为8μg的组合转染大鼠BM-EPCs时的转染效率最高, 可以达到39%, 优于其它组合。
3 讨论
1997年, Takayuki Asahara等[2]首次分离并证实人类出生后的外周循环血液中存在能分化成为血管内皮细胞、表面标志为CD34+的细胞并称为EPC, 打破了一直以来认为EPCs增殖分化的血管只存在于胚胎发育期的观点, 开启了对EPCs研究的热潮。尽管对EPCs的鉴定及其分类中早期外生EPCs (early-outgrowth EPCs) 和晚期外生EPCs (late-outgrowth EPCs、OECs) 亚群的界定目前存在很大的争议[3,4,5,6,7,8], 但是EPC参与缺血区血管新生、用来治疗缺血性疾病的研究成果却是有目共睹的。自Christoph Kalka等[9]首次报道, EPC移植可使缺血肢体血流增加、毛细血管密度增加后, 大量研究均证实了EPC参与缺血性组织血管生成, 可用于治疗缺血性疾病[10]。血管新生需要大量细胞数量, 而以EPC作为转染血管生长因子基因的靶细胞, 将所载基因定向运送到体内缺血部位并合成行使功能的蛋白质, 同时进行EPC移植和血管生长因子的传递, 体现出基因修饰EPC的双重作用。不仅提高EPC的“利用率”, 也为基因进入体内找到合适“载体”, 起到事半功倍的治疗效果[11]。
*p<0.05.
阳离子脂质体除了具有低细胞毒性、低免疫反应, 无基因大小限制等非病毒载体的优点外, 有其独特的优点:本身带有正电荷, 可以与带有负电荷的质粒DNA通过静电作用紧密结合, 保护DNA不受DNA酶降解;而类细胞膜结构使其在基因转染中具有良好的膜亲和性, 可以增加DNA入膜机率, 从而提高基因转染效率, 因此还成为目前应用最多的非病毒介导的真核细胞基因导入载体。靶细胞不同, 脂质体转染效率存在很大的差异, 此外, 影响转染效率的因素还有:脂质体与DNA的比率、脂质体的总量、细胞密度以及脂质体/DNA复合物与细胞作用的时间等。目前脂质体Lipofectamine 2000转染EPCs研究尚少, 最适转染体系尚未见明确报道。
本研究以CD34+、CD133+、Dil-acLDL+细胞为EPCs, 培养3d～5d后倒置显微镜下观察到两种不同形态的细胞, 一种呈纺锤形或类圆形, 7～9d不形成克隆样增殖;另一种呈短梭形, 形成克隆样增殖, 且20d后内皮细胞呈鹅卵石样融合, 表明大鼠BM-EPC分离后于3d首次换液所收获的EPC为早期、晚期外生EPC亚群的混合细胞群, 与Chang-Hwan Yoon[6,8]等结果一致。
在对EPCs进行转染时, 我们通过控制阳离子脂质体组成 (Lipofectamine 2000) 、细胞密度 (70～80%) 、脂质体/DNA复合物与细胞作用时间 (4h) 这些影响因素, 对脂质体、DNA的量这两个关键因素进行研究。在前期实验中, 据Lipofectamine 2000说明书中建议的剂量下未得到满意的转染效率, 故相应扩大两者的范围, 在脂质体1～10μl、质粒2～8μg范围内取3个水平点进行交叉设计研究。我们发现在本研究的三个水平下, 转染阳性率与质粒呈剂量依赖性, 8μg组转染效率最高达39%;而脂质体的3个不同浓度组中, 转染效率不随脂质体量的增加而增加, 5μl组转染效率最高, 10μl组转染效率虽然高于1μl组, 但较5μl组低;此外, 倒置显微镜中观察到10μl组出现细胞毒性作用, 提示提高脂质体剂量达10μl不仅不能增加其转染效率, 反而出现细胞毒性。故而本研究认为当BM-EPCs密度为70～80%, 脂质体/DNA复合物作用细胞37℃、4h的条件下, 脂质体5μl/DNA8μg转染体系可以安全有效转染SD大鼠BM-EPC。
本研究通过对脂质体Lipofectamine 2000转染SD大鼠BM-EPC的条件进行优化, 为基因修饰EPC、促血管新生治疗及血管新生机制的研究奠定基础。
摘要：目的:探讨阳离子脂质体法对体外分离培养的Sprague-Dawley (SD) 大鼠骨髓来源-血管内皮祖细胞 (Bone Marrow-En-dothelial progenitorcells, BM-EPCs) 进行基因转染时脂质体和DNA质粒安全有效的剂量组合。方法:体外分离、培养SD大鼠BM-EPCs;免疫荧光技术测定CD34、CD133、Dil-acLDL, 对细胞进行鉴定;按照正交设计, 用不同水平的脂质体和质粒pEGFP转染细胞;荧光显微镜下计数阳性转染细胞, 计算转染率。结果:SD大鼠BM-EPCs细胞表面抗原CD133、CD34呈阳性表达并具有吞噬Dil-acLDL的功能, 形态学上两种细胞亚型-早期及晚期外生EPCs共存于其中。Lipofectamine 2000和pEFGP不同剂量组合均可转染大鼠BM-EPCs, 其中脂质体5μl/质粒8μg时的转染效率高于二者其它剂量组合 (P<0.05) 。结论:优化条件后的阳离子脂质体Lipofectamine 2000可安全、有效转染体外分离培养的SD大鼠BM-EPCs。
关键词：内皮祖细胞,转染,阳离子脂质体,基因治疗
参考文献
[1]Jalees Rehman, Jingling Li, Christie M, Orschell, et al.Peripheral Blood“En-dothelial progenitor Cells”Are Derived From Moocyte/Macrophages and SecreteAngiogenic Growth Factors[J].Circulation, 2003, 107:1164-1169.
[2]Takayuki Asahara, Toyoaki Murohara, Alison Sullivan, et al.Isolation of pu-tative progenitor endothelial cell for angiogenesis[J].Science, 1997, 275 (14) :964-967.
[3]Daniel P.Sieveking, Andrew Buckle, David S.Celermajer, et al.Strikingly Different Angiogenic Properties of Endothelial Progenitor Cell Subpopolations[J].J Am Coll Cardiol, 2008, 51:660-668.
[4]Eva Rohde, Christina Malischnik, Daniela Thaler, et al. Blood monocytes mimic endothelial progenitor cells[J]. Stem Cells, 2006, 24: 357-367.
[5]Mervin C.Yoder, Laura E.Mead, Daniel Prater, et al.Redefiningendotheli-al progenitor cells via clonal analysis and hematopoietic stem/progenitor cellprincipals[J].Blood, 2007, 109:1801-1809.
[6]Jin Hur, Han-Mo Yang, Chang-Hwan Yoon, et al.Identificationof a Nov-el Role of T Cells in Postnatal Vasculogenesis:Characterization of EndothelialProgenitor Cell Colonies[J].Circulation, 2007, 116:1671-1682.
[7]David A.Ingram, Theresa R.Krier, Laura E.Mead, et al.Clonogenic Endo-thelial progenitor Cells Are Sensitive to Oxidative Stress[J].Stem Cells, 2007, 25:297-304.
[8]Chang-Hwan Yoon, Jin Hur, Kyung-Woo Park, et al.Synergistic Neovas-cularization by Mixed Transplantation of Early Endothelial Progenitor Cells andLate Outgrowth Endothelial Cells:The Role of Angiogenic Cytokines and MatrixMetalloproteinases[J].Circulation, 2005, 112:1618-1627.
[9]Christoph Kalka, Haruchika Masuda, Tomono Takahashi, et al.Transplant-ation of ex vivo expanded endothelial progenitor cells for therapeutic neovascu-larization[J].PNAS, 2000, 97:3422-3427.
[10]Sang-Mo Kwon, Masamichi Eguchi, Mika Wada, et al. Specific Jagged-1 Signal From Bone Marrow Microenvironment Is Required for Endothelial Progenitor Cell Development for Neovascularization[J].Circulation, 2008, 118:157-165.
[11]Hideki Iwaguro, Jun-ichi Yamaguchi, Christoph Kalka, et al.Endotheli-al Progenitor Cell Vascular Endothelial Growth Factor Gene Transfer for Vascu-lar Regeneration[J].Circulation, 2002, 105:732-738.
脂质体应用的研究进展 篇2
1 脂质体的特点
脂质体具有的独特分子结构和理化性质使其具有如下特点[1]:①靶向性。脂质体能选择性地分布于人体内某些组织和器官, 俗称药物导弹。②缓释性。药物被包在脂质体内, 在组织和血液中的扩散速率降低, 药物作用的时间延长。③长效性。在脂质体双分子层的保护下, 药物可避免氧化、降解和破坏, 药物的疗效延长。④无毒性。脂质体膜与哺乳动物的细胞相似, 对机体无免疫原性, 不会引起局部组织损伤、不诱发过敏反应。⑤与细胞有亲和性。可增加药物通过细胞膜的能力, 起到增强疗效的作用。⑥给药途径多样性。脂质体不仅可静脉给药, 也可通过皮肤、皮下、肌肉、黏膜给药, 还可以将脂质体制成涂擦剂、膏剂、口服液等。⑦可控性。在制备的过程中, 通过改变其表面的性质如颗粒大小、表面电荷等改变脂质体药物的靶向性, 从而控制药物在体内的分布。
2 脂质体的制备方法及分类
脂质体制备方法的研究已有20多年的历史, 形成了很多方法。例如, 薄膜法、逆相蒸发法、复乳法、离心法、钙融合法、注入法、超临界流体技术、pH梯度法等。对前体脂质体制备的方法还有喷雾干燥法、冷冻干燥法、真空干燥法、薄膜沉淀法等。脂质体的分类方法很多, 但没有一种分类方法能包含所有类型的脂质体。如按其性能可分为:①普通脂质体。指一般脂质组成的脂质体。②变形脂质体。指在普通磷脂双分子层中加入某些表面活性剂, 使其具有充分的柔性和变形性, 能大量透过皮肤角质层的脂质体。③长循环脂质体。在普通脂质体表面修饰了聚乙二醇, 使其在血液里的保留时间延长。④智能脂质体。利用机体内外特殊的理化性质而构建的脂质体。例如, 各类敏感脂质体、多糖包覆脂质体、磁性脂质体和免疫脂质体等。智能脂质体目前还处于实验室研究阶段。
3 脂质体的应用
3.1 作为药物载体
现有的药物载体有高分子聚合物载体和脂质载体两类。脂质载体是属于第4阶段的药物制剂。20世纪60年代末, Rahman Y E等人研究发现脂质体可作为生物降解性和生物相容性药物载体。1988年, 第一个脂质体包裹的药物在美国进行临床实验。目前, 我国也有多个以脂质体作载体的新药进入了临床验证阶段, 如阿霉素脂质体和替米考星脂质体等。
3.1.1 作为抗肿瘤药物的载体
抗肿瘤药物一般是细胞毒性化合物, 对肿瘤细胞缺乏特异性, 在杀伤肿瘤细胞的同时也杀伤正常细胞。脂质体抗肿瘤药物的临床应用, 既增加了疗效又降低了药物的不良反应。1974年, Gregoriadis G等首次提出脂质体可作为药物载体用于肿瘤的治疗。1995年, 获得美国食品和药物管理局 (FDA) 批准的阿霉素脂质体, 成为世界上第一个临床应用的抗肿瘤药物脂质体, 也是目前研究较深入的脂质体制剂[2]。由美国Regulon公司开发的顺铂脂质体 (Lipoplatin) 的粒径小于130 nm, 可延长药物在机体内的作用时间, 并对肿瘤组织具有靶向性, 药物浓度是正常组织的2～50倍。临床前的研究表明, 顺铂脂质体在小鼠经腹腔给药过程中, 对肾的毒性明显小于顺铂[3]。英国Skyepharma制药公司将阿糖胞苷利用其脂质体技术平台 (Depofoam) 制成阿糖胞苷脂质体注射剂 (Depocyt®) , 主要用于淋巴性脑膜炎的治疗。目前, 爱尔兰Elan公司研制出了阿霉素柠檬酸盐脂质体注射液 (Myocet®) , 主要用于治疗乳腺癌。我国抗癌药物脂质体的研究始于20世纪80年代。林巧平等对注射用多西他赛脂质体的研究发现, 多西他赛脂质体的平均粒径为 (85.3±4.8) nm, 包封率为 (99.89±0.06) %, 用5%葡萄糖注射液稀释后 8 h内稳定;在1 mol/L水杨酸钠磷酸盐缓冲液中 24 h累积释放约85%, 且对血浆蛋白结合率均高于注射液;多西他赛脂质体对肿瘤细胞的IC50均较注射液低, 对肿瘤细胞的抑制作用强于注射液。2009年, 上海复旦张江生物医药股份有限公司研发的聚乙二醇 (PEG) 化阿霉素脂质体用于临床, 是我国目前首个用于临床的阿霉素脂质体。其采用隐性脂质体技术, 对肿瘤组织具有较精确的靶向性, 不良反应较常规化疗药物小。
3.1.2 作为抗寄生虫、抗菌和抗病毒药物的载体
由于脂质体具有靶向性, 静脉注射后可迅速被网状内皮细胞所摄食, 利用这一特点可以用含药物脂质体治疗内皮系统疾病, 如利什曼病、血吸虫病等。山羊静注吡喹酮脂质体3 mg/kg的药代动力学研究表明, 吡喹酮脂质体在山羊体内的半衰期t1/2β为 (10.00±0.59) h, 比家兔单剂量静注吡喹酮的半衰期延长5倍。家兔单剂量静注吡喹酮脂质体的药动学试验研究表明, 其半衰期t1/2β为 (12.42±0.36) h, 比游离吡喹酮延长5倍[4]。刘伟等[5]用伊维菌素脂质体对猪疥螨病的治疗效果表明, 高、低剂量的伊维菌素脂质体对猪疥螨病的治愈率明显高于伊维菌素, 且用药剂量小、药效时间长和药物残留低。穿心莲内酯在临床上主要用于治疗上呼吸道炎症和细菌类痢疾。于波涛等[6]制备的穿心莲内酯脂质体的体积平均粒径为6.7 μm, 包封率为92.7%, 载药量为9.3%。由美国Aradigm公司开发的吸入性环丙沙星脂质体可减少患者痰中绿脓杆菌的数量。患者在使用穿心莲内酯治疗14 d后, 其痰中绿脓杆菌减少, 治疗结束后1周, 其病菌仍持续减少, 表明脂质体耐受性好, 无严重不良反应[7]。瑞士血清和疫苗研究所研制的脂质体甲肝疫苗含有灭活的甲肝病毒颗粒和流感病毒血凝素, 不仅能诱导甲肝抗原的抗体产生, 而且能在脂质体表面表达流感病毒蛋白。Ahmad N等[8]将鸡蛋卵清蛋白包裹于膜融合脂质体中制备抗感染疫苗并免疫小鼠, 结果表明这种疫苗可以成功诱导细胞毒T淋巴细胞 (CTL) 反应, 杀死被病毒感染的细胞。阿昔洛韦是一种广谱抗病毒药, 但其水溶性很差, 口服吸收少, 生物利用度低, 并容易产生抗药性, 有人将其制成阿昔洛韦脂质体, 包封率达到90%以上。将抗病毒药物制成脂质体可明显提高抗病毒疗效, 降低用量和减少不良反应。
3.2 作为基因转染载体
脂质体用于基因载体始于20世纪70年代末期。通常是将基因包裹在脂质体内并转移至受体细胞以获得表达, 迄今作为转基因载体的脂质体主要是阳离子脂质体。马百超等[9]以阳离子脂质体Lipofectamine 2 000为基因载体, 研究了其对不同细胞的转染效率, 并将其与转染试剂Sofast和DOTAP进行比较, 结果表明随着复合物中转染试剂比例的增加, DNA延滞作用明显增强。当Lipofectamine 2 000与DNA的质量比增至5∶1时, 仅有小部分DNA移出原点。其对SW-480细胞的转染效率明显高于其他3种细胞, 对B16细胞株的转染效果要优于Sofast。脂质体与其他非病毒类基因转运系统一样, 具有制备简便、毒性低、无感染危险等优点。
3.3 用于免疫学检测
脂质体用于免疫学检测主要有荧光抗体脂质体 (FAL) 和脂质体免疫传感器 (LIS) 。荧光抗体脂质体是把荧光性物质、酶活性物质包裹于脂质体中, 再于脂质体上连接特异性抗体, 抗体与抗原的特异性结合会导致脂质体破裂, 释放出荧光素, 然后测定其荧光强度, 即可求出抗原含量。该法可用于定性或定量分析, 操作快速而简便, 现已用于一些病毒和药物的检测。脂质体免疫传感器是把信号物质或生物识别分子连接于脂质体, 再将脂质体与传感器连接, 通过检测脂质体由于结构或性质发生改变而产生的响应信号, 间接测定被检测物质的量。脂质体免疫传感器不仅保持了传统免疫传感器高度的专一性和高效性的优点, 还极大地增强了响应信号。当抗原或抗体与脂质体结合后, 传感器只对抗原与抗体的特异性吸附进行检测, 避免了非特异性吸附的干扰, 从而提高了脂质体传感器的灵敏度。脂质体免疫传感器为临床诊断学、流行病控制、食品安全检测以及环境监测提供了一种新型、快速、高效的分析工具。
3.4 作为免疫增效剂
1974年, Allison A C发现脂质体对白喉类毒素具有免疫增效作用, 从而揭开了脂质体作为免疫增效剂的序幕。目前, 已经发现脂质体对一系列物质具有免疫增效作用, 如酶、血清蛋白、合成多肽、类脂、脂多糖、单糖、寡糖等, 并成功地用脂质体增强了许多病原微生物及肿瘤抗原的免疫原性。张静等[10]用脂质体包被的轮状病毒基因疫苗pcDNA1/VP7, 经肌注及鼻黏膜两种途径免疫Balb/c小鼠, 并用酶联免疫吸附法 (ELISA) 对其诱导产生的体液免疫应答进行测定后发现, 脂质体在DNA接种中不仅作为质粒DNA疫苗的载体, 而且起到免疫佐剂的作用。脂质体作为疫苗佐剂虽然能够诱导机体产生良好的免疫应答, 但也有轻微的不良反应。
3.5 在其他领域中的应用
脂质体不仅用于疾病的治疗和诊断, 而且在生物化学、生物物理学、免疫学及免疫诊断等许多领域中得到应用[11]。此外, 脂质体还在食品行业、化妆品行业及血液学等方面得到了应用。
3.5.1 脂质体在食品行业中的应用
脂质体日益成为食品体系的一种常见组分载体, 受到越来越多的关注。脂质体在食品工业中主要用于敏感性营养成分的保护性载体。例如, 维生素、微量元素、酶和免疫蛋白等。有研究表明, 脂质体微胶囊化能有效地在胃蛋白酶环境下保护免疫球蛋 (IgY) 活性。有人将脂质体用于肉嫰化包载菠萝蛋白酶, 改善了在肉制品处理过程中酶的稳定性, 并提高了酶的活性。脂质体还可以作为食品中特殊组分的缓释载体。例如, 风味组分、抗菌组分、防腐组分等。
3.5.2 脂质体在化妆品行业中的应用
化妆品脂质体具有皮肤护理和功能性成分载体的作用, 有着非常重要的实际研究和应用价值, 是目前化妆制剂的研究热点[12]。脂质体在化妆品中不仅可作为添加剂, 发挥其独特的作用, 而且还可用作功能性成分的载体, 提高功能性成分的皮肤美容效果。1986年, 迪奥 (Dior) 为法国Lancome公司开发了世界上第一个叫做“capture”的脂质体化妆品, 随后在各国家逐渐推广。目前, 含各种脂质体的化妆品已得到广泛应用。
3.5.3 制作血液替代品
脂质体包封的血红蛋白 (LEH) 是一种血液替代品, 也是第3代人工血红蛋白制品。血红蛋白可有效扩充血容量, 并向组织供氧, 能长期冻干保存, 并能有效地复苏致死性出血性休克的动物, 具有比单纯的血容量扩充剂更好的复苏特性。脂质体包裹血红蛋白不仅可用于常规输血、特殊血液病传播的区域和地震、战争等灾难的救护中, 且在损伤、器官灌注骨髓细胞造血、外科手术、抗休克等方面具有良好的应用前景[13]。
4 脂质体应用研究中存在的问题
胰岛素脂质体制剂研究概况 篇3
脂质体是一种类似生物膜结构的双分子层微小囊泡, 具有生物膜特性和药物传输能力, 胰岛素以脂质体包裹方式给药有利于提高生物利用度和患者用药依从性, 脂质体的内水相能保护胰岛素的结构和构象, 而外部亲脂层有助于改善跨生物膜屏障吸收性能。在胰岛素脂质体中, 胰岛素被包裹在脂质体内部, 可抵抗蛋白酶的降解[4], 脂质体的磷脂双分子层还可以控制胰岛素的释放, 达到比较平稳的降低血糖。笔者对胰岛素脂质体制剂近年来的研究进展进行综述。
1 鼻腔给药胰岛素脂质体
鼻腔黏膜中动、静脉和毛细淋巴管分布十分丰富, 鼻腔呼吸区细胞表面具有大量微小绒毛, 药物对鼻腔黏膜的穿透性较高, 鼻腔内酶相对较少, 对药物的分解作用比胃肠道低, 从而有利于药物的吸收并直接进入体内血液循环, 避免肝脏首过作用。因此, 鼻腔给药是多肽及蛋白质类药物非注射给药途径中最有发展前途的途径。Muramausu等[5]以豆固醇葡糖苷 (SG) 为促进剂, 将胰岛素包封于具有高流动性的二棕榈酰磷酯酰胆碱 (DPPC) /SG (7/4摩尔比) 脂质体中鼻腔给药, 观察到持续8小时高效的降糖作用。吴正红等采用Caco-2细胞模型法和离体肠黏膜法研究了用壳聚糖及其衍生物包覆的脂质体对胰岛素经细胞旁路转运的影响, 结果脂质体可促进胰岛素的跨膜转运, 脂质体用壳聚糖及其衍生物包覆后还可通过打开上皮细胞的紧密连接, 从而进一步的增强胰岛素通过细胞旁路的转运能力[6]。为增加脂质体给药系统在黏膜的吸附性, 增强吸收, Jain等[7]制备表面包有壳聚糖的多室脂质体 (MVL) , 粒径是26～34μm, 胰岛素载药量为58%～62%, 体外释放可维持7～9d, 而一般脂质体只能维持24h, 通过糖尿病大鼠鼻腔给药实验, 黏附性MVL的降血糖效应可维持72h, 维持时间比未包有壳聚糖的MVL和一般的脂质体明显延长。
2 口服给药胰岛素脂质体
口服给药是最方便、最受患者欢迎的给药方式。多肽、蛋白质类药物口服给药面临的主要问题是:胃酸对药物的降解;酶对药物的降解;药物对胃肠道黏膜的穿透性差;肝脏对药物的首过作用。为解决这些问题医药学家做了大量的研究。脂质体能保护胰岛素活性, 增加胰岛素的吸收, 研究口服给药的胰岛素脂质体制剂是比较重要的研究方向。为了提高胰岛素的生物利用度, 近年来, 研究者们在改变脂质体的表面性质和组成成分方面做了许多研究。
Iwanaga等[8]将胰岛素脂质体表面包裹PEG2000, 显著延长了脂质体在大鼠小肠内停留的时间, 使胰岛素与胃肠道黏膜接触的时间和机会明显增多, 促进胰岛素的吸收, 研究者认为大鼠胃肠道黏膜上的Payer's组织与胰岛素吸收的增多有关, 含胰岛素的脂质体粒子从Payer's组织吸收进入血液循环后, 胰岛素从脂质体中缓慢释放, 有一定的缓释作用。
吴正红等[9]考察了分子量、季铵化程度及浓度不同的N-三甲基壳聚糖盐酸盐 (TMC) 对胰岛素脂质体的影响, 胰岛素脂质体用TMC包覆后, 其粒径和ζ电位, 随着TMC季铵化程度的增加而降低, 随TMC浓度增大而增大;TMC的分子量对粒径和ζ电位的影响不明显, TMC的分子量、浓度和季铵化程度对胰岛素包封率影响不大。TMC对胃蛋白酶和胰蛋白酶的抑制作用, 随着TMC的分子量、浓度和季铵化程度的增大而增强, TMC可增强胰岛素口服后的吸收。吴正红等[10]还研究了壳聚糖和壳聚糖-EDTA接合物 (CEC) 双层包覆胰岛素脂质体的性质和降血糖作用, 结果表明在胃蛋白酶、胰蛋白酶和胃肠道内容物中, 壳聚糖-CEC双层包覆胰岛素脂质体对胰岛素有较好的保护作用, 在大鼠降血糖试验中, 血糖在1h降至最初血糖值的45.98%, 作用时间延长, 以皮下注射胰岛素为对照, 其相对生物利用度为17.02%。吴正红等[11]用不同分子质量的聚维酮 (PVP) 制备PVP-胰岛素脂质体, 考察PVP对胰岛素的保护作用, 结果含PVP-K17、PVP-K30和PVP-K90三种分子量的PVP-胰岛素脂质体包封率分别为64.4%、62.8%和57.5%, 对胃蛋白酶都有一定抑制作用, 且随分子量增加有所增强, 但对胰蛋白酶未见有抑制作用, 小鼠口服降血糖试验显示, 含PVP-K30的PVP-胰岛素脂质体有较好降血糖作用, 最大降血糖值达40.4%, 维持25.8%以上降血糖作用可达6h。
张娜等[12]考察了用荆豆凝集素修饰后的胰岛素脂质体对小鼠胰岛素口服吸收的影响。给予糖尿病模型小鼠和正常的小鼠分别灌胃350U/kg的经修饰后的胰岛素脂质体溶液, 并与相同剂量的普通胰岛素脂质体进行比较。对正常的小鼠, 经荆豆凝集素修饰的胰岛素脂质体在4h使血糖降至最初血糖值的 (84±15) %, 8h降至 (78±11) %, 12h为 (90±12) %。而含胰岛素的普通脂质体基本无降血糖作用。对于糖尿病模型小鼠, 经荆豆凝集素修饰的胰岛素脂质体在4h使血糖值降为最初血糖值的 (73±7) %, 8h为 (74±9) %, 12h为 (86±9) %。张娜等[13]采用相同的实验方法考察了经西红柿凝集素修饰的胰岛素脂质体在小鼠肠道中的吸收。对正常的小鼠, 经西红柿凝集素修饰后的胰岛素脂质体组血糖有下降, 而普通的胰岛素脂质体组基本无血糖下降。对于糖尿病模型小鼠, 经西红柿凝集素修饰的胰岛素脂质体在4h血糖值降为最初血糖值的 (38±13) %, 8h为 (50±15) %, 12h降至 (50±16) %。张娜等[14]还研究了麦胚凝集素修饰的胰岛素脂质体对小鼠口服吸收的促进作用。结果表明修饰脂质体显著促进胰岛素的胃肠吸收。
3 肺部给药胰岛素脂质体
肺泡具有表面积大、透过性高和较大循环灌注的特点, 可使药物迅速吸收, 进入血液循环[15]。避免了大分子药物在肠道被消化酶分解及肝脏的首过效应。许多因素会影响肺深部的药物沉积, 包括微粒大小, 微粒速度和空气动力学参数等, 其中微粒大小的控制是影响肺部吸入的主要因素。通常认为, 微粒直径>5μm在到达肺泡前可能沉积在口咽部和上呼吸道, 吞咽比吸入的更多, 若直径<1μm, 则不能达到肺脏深部而随呼气排出, 已建立药物传递至肺泡的最佳空气动力学直径为1～3μm[16,17]。因此, 肺部给药脂质体的粒径要适宜。McGurk等[18]试用磷脂乙醇液或磷脂-氯氟碳混合液放置于加压容器里直接喷雾制备成脂质体气雾剂, 所制得的脂质体粒径比较大, 无法进入到呼吸道内部。目前, 脂质体肺部给药研究最多的是胰岛素脂质体混悬液 (INS-LIP-SP) 经喷雾器雾化以后经肺部给药。通过选用不同的喷雾器, 或改变脂质体的组成及混悬液的黏度, 在一定的温度和雾化气流压力下可制备粒径适宜的脂质体, 适用从肺部给药[19]。江志强等[20]研究发现, 制备的INS-LIP-SP即使不加入渗透促进剂, 给正常Wistar鼠气管滴注后, 其相对生物利用度仍然可达37%, 高于普通INS溶液。这是因为磷脂类物质是一种表面活性剂, 能降低表面张力, 使得液滴迅速在肺泡的表面铺展, 脂质体解体, 有利于药物在肺泡表面的吸收而产生作用。胰岛素脂质体肺部给药有相当广阔的前景。
4 口腔黏膜给药胰岛素脂质体
口腔黏膜较鼻黏膜厚, 但表层不象皮肤那样角质化, 由于面颊部血管丰富, 药物吸收后可经颈静脉、上腔静脉直接进入全身循环, 可避免胃肠道消化液的影响及肝的首过作用。通过改进药物的膜穿透性, 胰岛素也可以经口腔黏膜给药。杨天智等[21]用反相蒸发法制备胰岛素柔性纳米脂质体, 以家免为动物模型, 口腔给药后, 进行体内降血糖试验。结果给药1h血糖降至 (42±23) %, 给药10h血糖仍未完全回到初值, 说明胰岛素柔性纳米脂质体具有持久的降血糖作用。
5 经皮给药胰岛素脂质体
皮肤的水解酶活性相当小, 有利于多肽及蛋白质类药物保持稳定, 经皮给药可维持恒定的血药浓度, 可自主给药, 安全方便, 还可避免肝脏首过作用和胃肠道的降解。但面临的最大问题是药物对皮肤的穿透性太弱。郭建新等[22]制备含有胆酸钠的脂溶性环多肽-环孢素柔性脂质体, 这种脂质体可促进胰岛素的经皮吸收, 给小鼠皮肤用药后, 降血糖作用相当明显和持久, 与普通的胰岛素脂质体比较有显著差异 (P<0.05) , 其促进渗透的机制可能为, 胆酸钠可插入磷脂双分子层中, 使磷脂分子之间的距离增大, 磷脂酰基链的顺序被扰乱, 使其流动性增强。此柔性脂质体皮肤穿透作用比较强, 可能会成为大分子药物经皮吸收的有效载体。
6 结语
中药脂质体制备的研究进展 篇4
关键词：中药脂质体制备,临床应用,生命科学
脂质体进入人体内部之后会作为一个“入侵者”而启动人体的免疫机制, 被网状内皮系统吞噬, 从而在肝、脾、肺和骨髓等组织中靶向性地富集。这就是脂质体的被动靶向性。通过在脂质体膜中掺入一些靶向物质, 可以使脂质体在生物或者物理因素的引导下向特定部位靶向集中, 这就是主动靶向脂质体, 目前已经出现的脂质体主动靶向机制有:热敏脂质体、磁导向脂质体和抗体导向脂质体等[1,2,3]。
1 中药脂质体的制备方法
1.1 注入法:主要用于制备单室脂质体, 少数为多室脂质体, 其粒径绝大多数在2m以下。
1.2 薄膜分散法:主要用于制备多室或大单室脂质体, 超声后以单室脂质体为主。
1.3 超声波分散法:主要用于制备以单室为主单室脂质体。
1.4 逆相蒸发法:
将磷脂溶于有机溶剂, 加入含药物的缓冲液, 超声使成稳定w/o乳剂, 减压除去有机溶剂在旋转器壁上形成薄膜, 加入缓冲液使凝胶脱落, 制得水性混悬液, 通过凝胶色谱法或超速离心法, 除去未包入的药物, 即得大单室脂质体。
1.5 冷冻干燥法:适合于热敏感的药物。
1.6 重建脂质体:
单室或多室型。是目前国外应用最为广泛的制备方法之一。其具有工艺稳定、适合于工业化生产、质量易于控制、产品稳定性好等特点。
2 影响脂质体产品稳定性的因素
脂质体做成注射剂有几个问题, 一是如果减小粒径达到注射剂的要求, 二是如何保证脂质体的稳定性, 脂质体放时间长了都会融合, 粒径变大, 所以上市产品都将其做成冻干制剂, 但冻干剂再水化又会遇到粒径变大的问题, 若是水溶性药物, 包封率还会下降, 大凡科研单位都在用旋转蒸发仪制备脂质体, 通过超声减小粒径, 研发阶段确实比较方便实用。但这种方法可能很难上大生产。一下分析脂质体不稳定的因素。
2.1 生物体液
全血、血浆和血清影响脂质体的稳定性, 高密度脂蛋白 (HDL) 使脂质体不稳定, 可能通过从脂质双层组分子层中去除磷脂。富含胆固醇的脂质体对抗 (HDL) 的作用。脂质体在全血中比在血清中稳定, 这可能是由于HDL与红细胞相互作用先于HDL与脂质体相互作用, 也可能是胆固醇从红细胞转移到了脂质体。
2.2 光和金属污染
重金属和光催化不饱和磷脂发生氧化。可以通过加入金属鳌合剂EDTA, 在无氧环境下低温避光存储并加人生育酚抑制氧化作用等方法清除其氧化作用。
2.3 蛋白质的作用
蛋白质与脂质体表面结合严重影响脂质体的稳定性。脂质体膜对包封葡萄糖通透性的增加与蛋白质结合成直线关系, 脂质表面结合蛋白质的脂质体在磷脂相变温度的区域通透性比正常区域更高。这提示当磷脂的胶相和液晶相共存时通透性最高, 脂质双层错位是通透性增加的机制。脂质体内部包裹蛋自质也对脂质体稳定性起重要作用, 蛋白质可以与脂质双层内侧和外侧相互作用或跨过脂质双层。
2.4 多聚磷脂的作用
在多聚磷脂的脂肪酰基中含有能聚合的基团, 磷脂制备的多聚脂质体对超声、去污剂、有机溶剂、血浆蛋白的作用非常稳定。冰冻干燥不改变多聚脂质体结构或大小分布。多聚脂质体用于缓慢释放内容物, 然而, 日前对这种脂质体的毒性和生物降解了解较少。
2.5 非离子表面活性剂
在脂质双层掺入非离子表面活性剂如聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯 (吐温80) 制备立体化学性稳定脂质体, 这种脂质体无毒, 比传统的胆固醇稳定脂质体或多聚脂质体更稳定, 其理论是当两个体稳定的脂质体接近时, 由于存在水溶性链, 脂质体间的化学能降低, 因此, 由于渗透作用, 脂质体之间进入大量的水而分离。
2.6 醇类的作用
当乙醇浓度增加时, 漏出率增加。乙烯二醇和甘油对漏出率无影响。
3 脂质体的前沿研究
目前, 有许多公司正在开发阳离子脂质体、高相转移脂质体、聚乙二醇聚合物包裹脂质体等避免免疫应答的修饰性脂质体研究, 用于转基因治疗中DNA的导入。Sequus Pharmaceuticals公司的第一个改进的脂质体产品Doxic已在美国和欧洲上市, 用于治疗卡波济肉瘤。其中, 由于新系统安全性和靶向性显著提高, 阳离子脂质体转移系统的研究正掀起一股新热潮, 而多价表面修饰的阳离子脂质体也被业界认为, 可能将成为保证脂质体包埋复合物在血清中稳定的极有潜力的技术。
开发疗效高、生物利用度高、毒副作用低、患者顺应性高的新型给药系统是各大医药公司竞争的一大热点。脂质体包埋已经成为新的靶向性给药系统, 并已被业界广为接受。然而, 由于投入风险大、工业化存在困难等原因, 至今国内上市的品种仍然较少。
参考文献
[1]姜华, 高原, 杨景明.中药脂质体的研究进展[J].当代医学, 2009, 15 (28) :12-13.
[2]李晓君.中药脂质体靶向给药的研究进展[J].辽宁医学院学报, 2009, 30 (1) :78-81.
脂质体包封率测定方法的研究运用 篇5
1 分子排阻色谱法
分子排组色谱法是一种能够有效对脂质体包封率进行测定的一种研究方法, 在生物科技中主要分为凝胶过滤色谱法以及凝胶渗透色谱法两种, 二者所在用的溶剂存在着部分区别, 前者主要使用水溶液以及缓冲液作为流动相, 而后者所采用的是一种有机溶剂作为流动相。在进行使用的过程总, 分子排组色谱法主要适用于对于未来未知产品的探索以及分离, 该方法的实际使用效率非常高, 能够在极短的实践内将需要研究样品的内部脂质层进行排列分析, 并通过对该物质的分析辨别其混合物的复杂类型, 为分子量的计算提供理论依据。这种分离方法在使用的过程中, 不适宜选择分子大小相似或者大小差异比较小的样组进行分析研究, 但是在脂质体包封率的研究过程中却比较适用。
分子排阻色谱是利用脂质体与游离药物分子质量和粒径大小的差异进行分离, 较广泛地用于测定脂质体的包封率。分子排阻色谱常用的分离介质是葡聚糖凝胶和琼脂糖凝胶, 把其装入柱子中分离游离药物与脂质体, 故也称为凝胶柱法或柱层析法。其基本方法是先将溶胀好的凝胶装入柱子中, 用洗脱液冲洗柱子至平衡后, 将脂质体上柱, 洗脱。脂质体由于粒径较大先被洗脱下来, 而游离的药物粒径较小, 渗透到凝胶的内部空隙, 较后被洗脱下来, 使得脂质体与游离药物分开。
用3种不同型号的葡聚糖凝胶, 采用正交设计法, 对测定替加氟脂质体包封率的条件进行了筛选, 实验结果表明葡聚糖凝胶的径高比、洗脱流速、上样量都影响脂质体与游离药物的分离效果, 且3种凝胶中以粒径为100~300m的Sephadex G50最适于脂质体包封率的测定。用带有蠕动泵系统的Sephadex G75柱分离脂质体和游离药物白细胞介素2, 所用的柱长为27cm, 流速为0.05m L*min-1, 洗脱液为枸橼酸缓冲液, 上样前先用空白脂质体饱和凝胶, 之后用荧光法测定游离药物与包在脂质体中的药物, 算出包封率。用空白脂质体预先饱和凝胶的目的是为了消除凝胶对脂质体的吸附作用。用凝胶柱分离游离的槲寄生凝集素 (ML) 和包封在脂质体内的ML, 所用的柱子为300mm*8mm, 流速为1m L·min-1, 用PBS洗脱, 收集40流份, 每份0.5m L, 脂质体在9~12管流出, 第10管的浓度最大。游离药物从第14管开始流出, 主要集中在15~17管, 因此能够分离脂质体和游离药物。
综上所述, 该方法在进行脂质体包封率的测定过程中可以通过分组对照的方式进行试验, 提高试验的可信度, 并尽可能的将试验过程中所能产生的变量进行一一的对比分析, 提高脂质体包封率的测定效率。该方法的使用, 虽然具有一定的误差, 但是精确度已经值得信任。
2 超滤离心法
飞速增长的经济指标以及相应的社会发展成果, 是建立在破坏原有的生态环境基础之上进行的, 或者说有一部分的建设成果从本质上将就没有达到国家的规定标准, 这就出现了人们在生活过程中需要面临潜在的生活危险。以上问题的出现, 直接导致了大量问题的产生, 这些社会发展遗留的疾病, 往往会演变成现实对人们的身体健康造成威胁。为了提高人们的健康生活质量, 减少相关疾病给人们造成的痛苦, 在进行根源防治的过程中, 还需要进行药物的研制, 而脂质体作为一种药物的承载体, 其所具有的独特优越性为医学的发展建设带来了帮助。
超滤离心所用的离心管一般是一次性的, 所以这种方法的成本较高。超滤需要预先考查超滤膜对药物的吸附和对脂质体的截留情况。用超滤法测定灯盏花素脂质体的包封率, 其药物在超滤膜中的回收率大于95%, 超滤膜对脂质体能够完全截留, 脂质体不经稀释可直接测定, 所用样品量少, 证明超滤法测包封率简单、快速、重现性好。采用超滤和凝胶柱2种方法测定脂质体的包封率, 考察药物在脂质体内的滞留情况, 发现用凝胶柱法测得的氢化泼尼松 (PLS) 脂质体的包封率比用超滤法降低了很多, 而用这两种方法测棕榈酰氢化泼尼松脂质体的包封率没有显著不同, 从而证明在凝胶柱中随着洗脱液的洗脱, 脂质体被稀释, PLS会从稀释的脂质体中渗漏出来, 而超滤法是测定脂质体包封率快速、简便的方法, 且制备脂质体后可以迅速测定包封率。
综上所述, 超滤离心法是当代科学技术发展过程中衍生出来的一种生物研究技术, 通过使用先进的仪器设备对脂质体包封率进行研究分析, 该种技术在包封率的测定过程中具有一定的可信价值。
3 展望
在进行脂质体包封率的测定过程中, 明确包封率是整个脂质研究的重点, 并在研究过程中提高包封率在脂质研究中的技术, 将提高脂质体在未来进行包封率研究的能力。虽然在进行包封率研究过程中受到的影响因素较多, 但是由于药物性质本身就存在差异, 所以研究过程中必然存在不同。
在提高包封率方法中, 药物结构改造具有一定的局限性, 因为并非所有药物均能制成符合条件的脂溶性或水溶性增强的药物;在双分子层膜中加人保护剂, 虽然提高了膜的强度, 但是寻求合适的保护剂很困难;通过调整类脂的组成和比例, 控制p H值、离子强度和选择适当的制备方法等, 也可制得高包封率的脂质体。因此, 深人研究包载过程中药物与脂质体膜相互作用, 将成为新的技术和方法的理论依据, 促进脂质体作为药物载体的开发和使用。
结束语
完善脂质体包封率的检测, 提高检测过程中测定方法的准确率, 减少不必要误差的出现, 对于现代生物技术的发展将具有显著的促进作用。面对生物技术广阔的发展前景, 完善脂质体包封率测定方法的研究, 对于未来生物制药产业的发展也具有一定的推动作用。
摘要：在经济飞速增长的今天, 人们的生活质量得到了有效提升, 但是随着社会工业化发展速度的不断加快、各行业之间竞争力度的不断加强, 大量的先进科学技术不断的被人们研制而出, 进而起到了促进社会经济发展的作用。面对在进行药物研制过程中脂质体所特有的性质, 其有效的推动了医药学科的进步以及发展, 为各类疑难杂病药品的制备提供了保障。
关键词：脂质体,包封率,测定方法
参考文献
紫杉醇脂质体自动化生产探索 篇6
恶性肿瘤是世界公认的对人类健康危害最严重的疾病之一, 随着人类生存环境和生活习性的改变, 在不良外部环境和一些不利因素的作用下, 肿瘤病人呈总体增长趋势, 且肿瘤发病者呈年轻化趋势, 使得市场对肿瘤药的需求急剧上升。然而, 传统的紫杉醇脂质体生产工艺中的薄膜分散过程, 成膜水化一直是脂质体工业化的瓶颈所在, 原方法使用人工操作, 把药剂装填到旋转蒸发瓶中, 通过水浴减压蒸干除去有机溶剂, 然后加入洗膜液, 得到多室脂质体 (MLV) 。在此过程中, 需使用大量人工操作, 不仅产量受限, 而且药液与外界接触增多, 药品的质量不稳定, 也不满足新版GMP的要求。基于原有方法的不足, 使用全自动控制药液的生产来进行中试放大, 不仅可以减少人工干预, 增加药品稳定性, 满足GMP要求, 而且能大幅增加产量。
1 问题分析
本文根据某公司提供的紫杉醇脂质体薄膜分散工艺进行自控设计。整个系统包含:1个300 L的制膜液配制罐, 在此罐中进行紫杉醇脂质体的配制;1个300 L的洗膜液配制罐, 在此罐中进行紫杉醇脂质体洗膜液的配制, 因配制过程中会接触乙醇, 所以整套设备安置在防爆间中。随后, 在制模间中有1个200 L的制膜液分配储罐, 1个200 L的洗膜液分配储罐, 还有30台旋转蒸发仪及配套的抽真空设备, 生产出来的脂质体通过真空输送到均质间。均质间有两个150 L的均质罐, 并有20台均质机对储罐内的脂质体进行均质操作, 均质完的药液输送到暂存间。暂存间有1个200 L的不锈钢储罐, 随后通过灌装机和冻干机把脂质体灌装冻干。
此项工程的难点在制膜间, 制膜间整体设备包含1个制膜液储罐、1个洗膜液储罐、两个定容蠕动泵、30个旋转蒸发仪和30个水浴锅。MLV的生产过程为分配药液至30个旋转蒸发瓶, 然后下降到水浴锅中加热, 对旋转蒸发仪进行抽真空, 通过蒸发瓶旋转均匀加热将膜液蒸干成膜, 然后注入洗膜液进行脱膜制成MLV。在整个过程中, 影响整体药品质量的关键点在于制膜液分配到各个蒸发瓶的平均度, 只有每个瓶子一样的药液才能保证30个旋转蒸发瓶旋转蒸发时间一致和可控。同样, 洗膜液的平均分配也直接影响薄膜洗脱时间的一致性和可控性, 只有在每个旋转瓶中重量精确一致, 才能有效保证药品生产的标准化和质量稳定性。
2 方案整体设计
自动控制方案使用S7-300控制器, 用于工艺过程控制, 通过15寸平板电脑完成对该区域现场设备的操作和数据记录, I/O模块完成对现场信号的数据采集和工艺上的控制要求, 控制器通过以太网完成向HMI (操作屏) 的数据交换, 利用HMI的组态软件完成数据的显示、趋势、记录和报警等一系列功能。整个硬件及操作系统完全符合国际工业标准, 具有开放性强、实时性高、数据吞吐量大、运行安全稳定、操作方便等特点。系统具有良好的可扩充性, 更易于升级换代。制膜间内包含两个储罐、两个蠕动泵、30个旋转蒸发仪以及配套管道阀门, 阀门选用气动隔膜阀, 电气柜内使用先导阀对阀门进行开关控制。
制膜罐内药液重量大概150 kg, 前期设计30个旋转蒸发仪根据药液重量平均分配, 制模液输送药液管道长度大概在50 m。为达到自控分配的目标, 整个分配系统分为以下3个部分。
2.1分配前准备
分配前, 首先要静置整个储罐, 称量出储罐内药液净重量, 选择可以正常使用的旋转蒸发仪, 因整个系统在某几个设备出现故障时仍然可以正常使用, 所以要剔除有故障的设备, 统计能正常使用的旋转蒸发仪的数量, 用整个储罐内药液的重量除以能正常使用的旋转蒸发瓶的数量, 计算出每个旋转蒸发仪应加入的药液量, 接着确认蠕动泵的输送频率, 确定蠕动泵每分钟输送的药液量, 根据之前算出的重量计算出每个旋转蒸发瓶的输送时间。
2.2填充输送管道
要保证填充管道, 是为了在打开旋转蒸发瓶时保证输送的药液都送到了蒸发瓶内, 而不是输送到空的管道中。打开罐底阀门和最后1个蒸发瓶进料阀门, 然后启动蠕动泵把药液填充到管道中。当最后一个瓶口有稳定的药液流出时, 则可以保证输送管道内已完全填满。然后进入下一步。
2.3药液平均分配
需对30个旋转蒸发瓶平均分配药液, 该系统为整个配制系统中最重要的子系统, 药液分配的平均度关系到整个产品的质量, 要求每个蒸发瓶分配5 L, 每个瓶内药液的误差在0.5%以内, 即在25 m L以内。
2.3.1 方案一
要依靠现场设备做好初步计划, 使用定容量蠕动泵进行药液分配, 以控制蠕动速度和蠕动时间, 进而控制每个瓶的分配量。然后, 打开第一个开始填充蒸发瓶并计时, 当计时达到时则关闭此蒸发瓶阀门, 此后再打开后一个, 以此类推, 直到倒数第二个瓶内药液灌装完成。最后, 把剩余药液全部通过蠕动泵送到最后一个瓶内。图1为控制流程方案一。
经现场测试, 使用此方案并不能达到设计精度, 且最后一个蒸发瓶内的药液量超标太多。经分析, 蠕动泵的送料软管在运行过程中回弹力度会衰减, 每分钟输送药液量随之减少, 且减少量不可预测。所以, 使用蠕动泵运行时间来计算每个瓶的药液量无法实现准确输送。因此, 依照蠕动泵的运行时间分配的方案不可行, 调试后修改为方案二。
2.3.2 方案二
此系统储液罐使用称重传感器来测量储罐重量, 使用梅特勒托利多高精度称重传感器来测量储罐重量, 精度可以达到0.1%。现使用重量作为整个系统的控制基准, 即:首先使用蠕动泵填充整个管道, 然后记录下重量, 此重量即为填充管道所需的药液量。然后, 在现有储罐重量的基础上计算所减少额定重量的结果, 并打开蒸发瓶阀门输送药液, 因每个蒸发瓶的阀门开关需要一定时间, 且每个阀门的开关时间不一致。所以, 需在每个蒸发瓶的计算量中增加修正量, 当重量达到修订后的减少额定值量时, 此瓶灌装完成, 然后进入下一瓶灌装。依次灌装直至最后完成。图2为控制流程方案二。
用此方案, 可解决蠕动泵输送量不一致的问题, 提高了分配精度, 但精度仍然达不到甲方要求。经分析, 因为顺序开阀门时, 前一个阀门关和后一个阀门开同时进行造成无法判断药液通往哪个阀门, 若两个阀门之间间隔一段时间把阀门开关错开, 又会使管道憋压导致蠕动泵软管破裂。若在停阀门的同时关闭蠕动泵, 也会因蠕动泵的惯性造成软管压力, 同样会发生破裂风险。而且, 整个系统的灭菌使用121 ℃纯蒸汽灭菌, 在灭菌时整个系统处于温度121 ℃压力0.15 MPa的环境中, 在此种温度和压力下灭菌的软管很容易破裂, 造成安全隐患。
因此, 选择修改管道灭菌时跳开此泵, 管道选择在线灭菌, 软管使用离线灭菌。使用此种方式需增加层流罩, 以实现在拆装过程中保证系统在A级区环境。但是, 如暴露在空气中仍然会对整个产品安全造成不可估量的影响, 而且蠕动泵的软管在此种环境下使用消耗也过快, 会大大增加企业使用成本。因此, 此方案也无法达到要求。但是, 分配精度已经有了提高, 现在只要解决蠕动泵的问题即可, 改进后形成了方案三。
2.3.3 方案三
不再使用蠕动泵, 输送药液的动力源更改为洁净压缩氮气, 直接使用不锈钢管道连接整条管道, 增加洁净氮气自动调压阀门, 保证输送罐内压力稳定在60 k Pa。为提高控制精度, 增加阀门打开间隔时间, 在前一个输送料阀门关闭5 s后再打开下一阀门, 稳定称重重量。图3为控制流程方案三。
使用此方案, 经测试满足了精确分配的要求, 彻底解决了之前方案一和方案二遇到的问题, 实现了分配系统的精确分配和配制过程的可重复性, 为后期蒸发瓶均衡调制萃取药液打下了坚实的基础。
3 方案总结
根据上述3种方法的实验和总结, 最终采用的控制流程如图4所示。在上述方法中都需首先填充整个管道, 然后记录下重量, 此重量即为填充管道所需的药液量, 然后在现有储罐重量的基础上计算最后一个蒸发瓶所需的重量值。如果管道填充量大于最后一个蒸发瓶重量, 则填充到倒数第二个旋转蒸发瓶时储罐内药液重量就已经为0, 此时如再按照重量来分配剩余旋转蒸发瓶药液量就不能实现, 就需更改为使用输送时间来进行输送, 计算好当罐内药液为0时倒数第二个蒸发瓶内的重量然后经过多次实验确定输送时间, 当倒数第二个输送完成时, 把管道内的所有参与药液输送到最后一个蒸发瓶中, 在此过程中要保证储罐内压力一致, 当最后一个分配完成后, 打开所有蒸发瓶瓶口阀门, 使瓶口残余的药液流到蒸发瓶中。此时整个分配过程完成。
4 结语
经多次实验证明, 使用此种方法可大大提高分配的平均性和准确度, 使全自动化生产成为可能。全自动控制系统的设计不但提高了药品产量, 而且减少了人工干预的过程, 使药品质量得到了保证, 最终帮助业主顺利通过了GMP验证。
参考文献
[1]METTLER TOLEDO.ICS429用户手册[Z], 2001.
[2]STEP7软件使用手册[Z], 2004.
阳离子脂质体 篇7
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验材料
Caco-2细胞株购自美国组织培养收集库(ATCC)。重组质粒pU6H1-GFP-FAK为作者实验室设计、百奥生物技术有限公司(南通)构建,为5.5kb,含GFP报告基因,双启动子U6和H1之间插入人FAK(Focal adhesion kinase)siRNA靶序列。
1.1.2 试剂
脂质体Lipofectamine 2000购自美国Invitrogen公司。青霉素、链霉素、庆大霉素及胰蛋白酶:Amresco公司。DMSO购自Sigma公司。质粒抽提纯化试剂盒购自美国Omega公司。其它试剂均为国产分析纯。
1.1.3 仪器
超净工作台:苏州净化设备有限公司;倒置荧光显微镜:德国Zeiss;pH测定仪:德国Sartorius公司;CO2恒温培养箱:Sheldon Manufacturing, Inc(USA)公司。
1.1.4 培养基
细胞培养基为含10%胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)的RPMI 1640(美国Gibco公司)培养基。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养
于6孔培养板,把Caco-2细胞接种于含10%胎牛血清,100U/mL青霉素、100μg/ml链霉素,100μg/mL庆大霉素的RPMI 1640培养基,置于5% CO2、饱和湿度、37℃孵箱培养,3~4d传代。
1.2.2 质粒制备
将含有pU6H1-GFP-FAK的菌液用LB培养基扩大培养,质粒抽提纯化试剂盒提取质粒。所得质粒A260/A280比值在1.8~2.0之间,制备浓度为2.95μg/μL。
1.2.3 细胞转染
(1)6孔细胞培养板,每孔2mL RPMI 1640培养基(不含抗生素,10%胎牛血清或无血清)。Caco-2细胞接种密度:1~3×105/孔。
(2)37℃、5% CO2、饱和湿度培养24h。
(3)参照Lipofectamine 2000脂质体说明书,在灭菌的1.5mL离心管中制备溶液Ⅰ:将1~6μg 的pU6H1-GFP-FAK与250μL RPMI 1640培养液(无抗生素、血清)混合;溶液Ⅱ:分别制备2、4、8、10、12μL脂质体与250μL RPMI 1640培养液(无抗生素、血清)的混合物,室温静置10min。每个脂质体浓度备5管。
(4)分别混合溶液Ⅰ和溶液Ⅱ,每个脂质体浓度分别室温放置5、10、20、30、60min使形成脂质体-DNA复合物。
(5)用无菌PBS漂洗过夜培养细胞2遍,加入1.5mL无抗生素、血清或无抗生素、含血清的RPMI 1640培养液,将上述脂质体-DNA复合物分别加入各孔,轻轻混匀。
(6)继续培养4、6、8、12、18、24h后更换为含10%胎牛血清及抗生素的RPMI 1640培养液。
1.2.4 GFP表达的检测及转染效率评价
转染后细胞于激发波长为488nm的荧光倒置显微镜下检测GFP的表达情况。以放大100倍的视野为标准,计5个视野表达绿色荧光的细胞数和总细胞数,求GFP表达率:GFP表达率=发绿色荧光细胞数/细胞总数。数据以平均数±标准差(±SD)表示,数据分析采用SPSS 15.0软件进行方差分析。
2 结果与分析
2.1 细胞接种量对转染效率的影响
采用复苏后传至2代的Caco-2细胞,六孔板每孔细胞接种梯度:1×105、1.5×105、2×105、2.5×105、3×105。用4μg质粒DNA、10μL脂质体、500μL无血清RPMI1640分别转染上述不同接种数量的细胞,室温孵育时间为8h。转染后24h检测转染情况(见图1)。结果分析(图2)显示2×105细胞接种密度时,转染效率达到最高(P<0.01)。实验结果还表明,应用Lipofectamine 2000脂质体转染在细胞汇合度达到85%左右时转染效率会较高,这可能是转染后需要留有一定空间使转染细胞短期内得以迅速生长。
2.2 DNA剂量对转染效率的影响
六孔板每孔细胞接种密度为2×105,各孔DNA量分别为:1μg、2μg、3μg、4μg、5μg、6μg;脂质体用量为10μL,使用无血清RPMI1640培养基,室温孵育时间8h。转染后24h检测转染效率。结果如图3所示,4μg DNA为最佳剂量。
2.3 脂质体与DNA的比例对转染效率的影响
采用4μg DNA,使用以下脂质体与DNA比例:0.5∶1、1∶1、2∶1、2.5∶1、3∶1。转染后结果显示(图4),2.5∶1比例转染效率最高(P<0.05)。
2.4 脂质体复合物形成时间对转染效率的影响
六孔板每孔2×105细胞,每孔4μg DNA,脂质体与DNA比例为2.5∶1,细胞与复合物孵育时间为6h,脂质体与DNA复合物形成时间分别为5、10、20、30、60min,以确定脂质体复合物形成所需最佳时间。结果如图5所示,30min为最佳时间(P<0.01)。
2.5 孵育时间对转染效率的影响
接种细胞数、DNA用量、脂质体与DNA比例等均用上述最佳筛选结果。细胞与脂质体-DNA孵育时间从4h~24h,结果(图6)显示6h为最佳孵育时间(P<0.01)。
2.6 细胞传代次数及血清对转染效率的影响
采用同批复苏后传代1~9次的细胞,采用上述实验所得最佳方案进行转染,并在转染时分别采用含10%FBS和无血清的RPMI 1640培养基。结果(图7)提示2~5次传代细胞转染效率较高(P<0.05)。有血清组与无血清组转染效率无显著性差异(P>0.05),说明本实验条件下,血清的存在与否不影响转染效率。
3 讨论
阳离子脂质体是目前研究最为广泛的非病毒载体系统,相对于其他非病毒载体系统,其转染效率具有明显优势,而且与病毒载体系统比较又具有低免疫原性、低致瘤性的优点[3],现在广泛应用于基因转染等实验研究。对于如何提高其转染效率,国内外已进行了大量的研究。本实验采用较难转染的Caco-2细胞,从细胞接种密度、DNA用量及脂质体与其比例、脂质体-DNA复合物形成时间、细胞与脂质体复合物的孵育时间、血清的有无及细胞的传代次数等方面研究了如何提高脂质体介导法转染体细胞的效率。
维持转染细胞的生长和健康旺盛的状态是提高转染效率的重要条件,因此,细胞接种密度以及细胞传代次数的把握对转染效率有一定的影响。最适合转染的细胞是经几次传代达指数生长的细胞,老化的细胞可能导致和转染效率相关的细胞行为的变化而不易于转染。我们选择在转染前一天进行接种,使细胞处于分裂旺盛的状态,这样有利于外源分子与靶分子作用,但细胞密度过高或过低均会使转染效率降低[5],我们在本文所述实验条件下以细胞铺板密度达85%左右、2~5次传代得到了最佳转染效率。
研究表明一定量级的DNA是高转染率所必需的[6]。本实验中转染效率随DNA剂量增加达到峰值后不再升高,说明细胞吸收DNA有一定的饱和度。过高浓度的 DNA也会是抑制转染效率的重要因素,这可能是过量DNA对细胞毒性所致[7]。脂质体与DNA比例对脂质体-DNA复合物的粒径和形态有影响,随着脂质体:DNA比例的增加,脂质体复合物的粒径及电荷比例也会相应的增加[8],进而影响到转染效率[9]。对于本实验使用的细胞,2.5∶1的比例是最佳比例。粒径较大的脂质体复合物可以提高转染效率,原因可能有以下两点:(1)延迟DNA与脂质体的解离;(2)粒径较大的脂质体复合物被细胞吸收后形成的大囊泡更易崩解,可释放大量DNA入胞质。但随着脂质体对DNA比例的过量增加,转染效率反而呈下降趋势,这说明过大粒径的脂质体复合物会对细胞产生一定的毒性[10]。当脂质体与DNA的比例以及剂量一定时,随着细胞与脂质体-DNA复合物孵育时间的延长,转染效率逐渐升高,到达峰值后下降,这说明过长时间与复合物的孵育可能对细胞产生毒性而使转染效率降低,本实验条件下6h孵育时间获得了最高转染效率。有研究表明阳离子脂质体与DNA在复合物形成过程中会增加其对细胞的毒性而易于诱发细胞凋亡[11]。稀释的DNA、脂质体二者混合后,不会立即形成脂质体复合物。本实验通过采用不同时间点来优化转染效率,发现30min为最佳复合物形成时间,时间过长会使其活性降低,不利于转染。
血清对脂质体转染的抑制很大部分是由于血清中带有负电荷的蛋白可中和脂质体复合物中的正电荷,抑制脂质体复合物粒径的增加,使转染效率下降[12]。近年有人发现在转染过程中使用血清可以提高转染效率,降低炎症反应[13]。L Vitiello等人首次报道了DODAC脂质体复合物的形成可以完全不受血清的影响[14]。转染产品配方几经革新后,主流转染试剂对血清的存在已经不敏感,甚至还有助于提高转染效率。国内一些学者的研究表明,如果脂质体-DNA复合物是在无血清条件下制备的,那么血清存在下阳离子脂质体是可以成功转染的[15],并且血清能够提高细胞存活率而不影响转染效率[16,17]。不同性质的脂质体可能对血清的存在与否有不同要求,我们的实验结果也提示血清对转染效率没有产生明显影响,血清可提高细胞存活率,维持较为健康的细胞形态而不影响转染效率,并且简化了实验步骤。