ELISA试验（精选4篇）
ELISA试验 篇1
猪肺炎支原体(Mhp)是引起猪支原体肺炎(Mycoplasma Pneumoniae of Swine,MPS)(亦称猪气喘病、猪地方流行性肺炎)的主要病原体,是一种接触性、慢性呼吸道传染病。以咳嗽、喘气、生长发育迟缓及饲料转化率低为特征,据估计,该病可使猪的生长速度降低12%~15%,饲料转化率降低10%,育肥期延长1个月。与其它病原如胸膜肺炎放线菌、猪繁殖与呼吸综合征、肺炎巴氏杆菌等混合感染时,情况更为严重[1,2]。本病具有发病率高,死亡率低的特点,在同一猪群的发病率可达100%,特别是在高密度饲养的规模化猪场,一旦爆发该病就难以控制,造成严重的经济损失[3,4]。
本研究应用杂交瘤技术,以Mhp168菌株全菌蛋白作为免疫原,制备单抗。同时,利用全菌蛋白作为包被抗原,建立了间接ELISA方法,并对一定量的临床样品进行检测,同时将单抗阻断ELISA方法和间接ELISA方法进行了对比试验。从而为支原体的抗原分析、血清学诊断、疫苗生产质量检测乃至支原体污染细胞检测奠定了一定的基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
Mhp168F323株、KM2培养基、阴阳性血清(江苏省农科院兽医研究所)、SPA-HRP(武汉博士德试剂公司)、ELIS板(COSTAR公司)、PEG6000(进口分装)、明胶(华美生物工程公司)、TMB(上海丽珠生物工程公司)、Bio photometer分光光度计(eppendorf公司)、SUNRISE酶标仪(TECAN公司)、UP200S超声波破碎仪(Hielscher Gmb H公司)。
1.2 菌体培养收集及膜蛋白制备
将菌株按1∶10的比例接种量接入KM2培养基中,37℃培养并传代。在培养物达到一定数量时(培养基p H降至6.8左右时),先3 000 r/min离心20 min弃去沉淀以除去杂质,再10 000~12 000 r/min离心30 min取沉淀收集菌体,菌体再以p H 7.2的PBS洗涤3~5次,最后将沉淀好的菌体悬浮于p H7.2的PBS中。
将重悬后的菌体于-20℃冰箱反复冻融7~10次,再用超声波破碎仪以50~60 W冰浴超声破碎约20 min,至菌液透亮澄清。然后用分光光度计测其蛋白含量。经此处理后即作为包被抗原。
1.3 单抗腹水的粗提
采用硫酸铵沉淀法,取5 m L小鼠腹水,4℃10 000 r/min离心15 min,除去细胞碎片和其他杂质,将上清移到小烧杯中,缓慢的滴加饱和硫酸铵(p H7.8)2.5 m L,边加边搅拌;搅拌30 min后,10 000 r/min离心15 min,弃上清,沉淀物用1/3饱和硫酸铵悬浮,搅拌作用30 min,同法离心。沉淀溶于1 m L的PBS中,装入透析袋内,4℃透析过夜,其间换液3~4次,直至用Ba Cl2检测不到NH4+和SO42-;移出蛋白质溶液,10 000 r/min离心15 min,收集上清即为粗提的单抗。测定蛋白含量,-20℃保存备用。
1.4 间接ELISA最佳反应条件的确定
1.4.1抗原包被浓度和抗体工作浓度的确定:采用方阵法,确定抗原的最佳稀释度。抗原用p H9.6的碳酸盐缓冲液按1∶400、1∶800、1∶1 600、1∶3 200、1∶6 400、1∶12 800梯度稀释,依次加入各孔中,每孔100μL,每个稀释度2列,4℃过夜,PBST洗涤5次。用2%明胶PBST37℃封闭3 h,每孔200μL。用PBST洗涤3~5次。将标准阳性血清和标准阴性血清按1∶50、1∶100、1∶200、1∶400……倍比稀释加入各孔,每个稀释度加一排,每孔100μL,37℃作用90 min。洗涤5次。加入1∶10 000稀释的酶标SPA。在37℃作用60 min,洗涤5次。加现配TMB底物,避光37℃作用5~10 min后,加终止液,在酶标仪上读取OD450值。以阳性血清OD值接近1,P/N值最大时抗原的稀释倍数为抗原最佳工作浓度。该点对应的血清稀释度为最佳血清稀释度。
1.4.2 封闭液的选择:
将1%BSA,2%明胶,10%NCS,分别用PBST稀释,37℃作用3 h,加一抗、二抗。终止后在酶标仪上读取OD450值。当阳性血清OD值最低的封闭液确定为最佳。
1.4.3 血清稀释液的选择:
分别用0.1MPBST,4%PEG6000-PBST,生理盐水稀释血清,选取阳性血清值接近1,P/N值最大时为最佳血清稀释液。
1.4.4 抗原抗体结合时间的选择:
分别作用60 min、90 min、120 min,以阳性血清值接近1,P/N值最大时选择为最佳工作时间。
1.4.5 酶结合物最佳稀释度和工作时间的选择:
将各种抗原按最佳稀释度稀释包被96孔酶标板,洗涤后加适当的封闭液进行封闭,200μL/孔,加一定稀释度的阴性和阳性血清,37℃作用90 min。将SPA-HRP按1∶7 500、1∶10 000、1∶20 000稀释加入酶标板中,每个稀释度加4孔。37℃作用60 min,加底物作用10~15 min后,加终止液,在酶标仪上读取OD450 nm值。当阳性血清OD值接近1,P/N值最大时酶结合物的稀释浓度为酶结合物最佳工作浓度。将酶结合物做最佳稀释后,分别将作用时间调整为45 min、60 min、90 min进行ELISA测定,以阳性血清OD值接近1,P/N值最大时为酶结合物最佳作用时间。
1.5 间接ELISA检测猪血清抗体效价与结果判定
将最佳稀释度稀释后的抗原包被96孔ELISA板,100μL每孔,4℃过夜,用PBST洗涤3~5次。加入2%明胶-PBST溶液封闭,200μL每孔,37℃作用3 h,PBST洗涤3~5次。加入倍比稀释的待检测血清样,每列一个样品,100μL每孔,37℃作用1.5 h,洗涤3~5次,加入辣根过氧化物酶标记的SPA(葡萄球菌A蛋白),100μL每孔,37℃作用1 h,洗涤3~5次,加入底物TMB避光显色,作用5~10 min,待反应完全,加入50μL2 mol/L H2SO4终止反应,在酶标仪上450nm处读取OD值[5]。
结果判定:用酶标仪检测OD值,以空白对照调零,P为各检测孔的值,N为阴性对照的平均值,即:
比较不同抗原检测的结果,筛选最佳检测抗原。
1.6 单抗阻断ELISA试验及结果判定
采用硫酸铵沉淀法粗提小鼠腹水,提出Ig G,并透析过夜脱盐,收集上清,并测蛋白浓度。
以方阵法测得菌体蛋白的最佳包被浓度,用碳酸盐缓冲液稀释抗原,4℃过夜包被;用PBST洗涤4次,每次5 min,再用封闭液封闭18 h,然后PBST洗涤。加入1∶50稀释的待检血清样,100μL每孔,再加入1∶1 000稀释的单抗,100μL每孔,37℃孵育2 h,PBST洗涤5次,每次5 min,每孔加入1∶10 000稀释的山羊抗小鼠HRP-Ig G 100μL,37℃孵育1 h,PBST洗涤5次,每次5 min,加入新鲜的TMB显色液,100μL每孔,显色15 min,用2 M H2SO4终止反应,在波长450 nm处测各孔OD值[6]。
结果判定:阻断率%=100-100P/N,阻断率≥50%为阳性。
1.7 对比试验
间接ELISA法和单抗阻断ELISA方法分别对不同时期感染的血清样进行检测,将结果进行对比。
2 结果
2.1 ELISA最佳反应条件的确定
经过方阵试验确定,抗原最佳稀释度1∶1 600(1.5μg/m L),血清最佳稀释度为1∶100。抗原抗体作用最佳时间1.5 h,酶标二抗最佳稀释度为1∶10 000,最佳作用时间为1 h,底物作用时间为5~10 min。
2.2 检测结果的判定
间接ELISA方法结果根据阴性平均值确定,P/N≥2.1时判定为阳性。单抗阻断ELISA方法结果阻断率%=100-100P/N,阻断率≥50%为阳性。采用不同方法检测常州、六合、海南等地猪血清样品共136份。结果见表:
从结果可以看出,单抗阻断ELISA与IDEXX试剂盒测定的符合率较高,间接ELISA也有较好的敏感性。
2.3 对比试验
自然感染和人工发病的猪群血清样品共用两种方法进行检测,结果如表:
从上表看出,阻断ELISA对早期感染病料的检测优于间接ELISA方法。10周左右时,是抗体产生的高峰期,此时检测的结果基本一致。
3 讨论
由于本病在全世界范围内都广泛流行,而且可诱发多种继发症,所以建立一种敏感、稳定的检测方法对本病的检测和监控及流行病学调查具有重要的意义。
国内外建立了多种血清学检测方法如免疫琼扩、间接血凝等,免疫琼扩、间接血凝试验虽操作简单,但存在敏感性不高的问题。ELISA方法敏感性高,特异性好,可作为检测的有效手段。
3.1 抗原收获与处理
经过试验发现,Mhp每批次的抗原生长状态有很大差异,使用前要注意选择。抗原处理参考了一些文献方法[7~9]略加改进,取得一定效果。其中关键是要洗涤干净抗原,因Mhp培养中需血清,而血清中的杂质也较多,因此本试验离心时先低速离心去除大部分血清中的杂质,再高速离心获得菌体。
3.2 阳性对照与阴性对照
在ELISA反应中,阳性血清和阴性血清的筛选至关重要,是方法是否可信的重要证据之一。经过试验,将4%PEG6000加入样品稀释液中,可有效提高阳性值而阴性值基本变化不大。
3.3 与多种方法对照
试验建立的单抗阻断ELISA方法对猪群早期感染的检测优于间接ELISA方法检测的结果。全菌的间接ELISA方法对抗体产生高峰期的血清样品的检测结果也与其他方法(IHA、PCR方法)检测结果符合。
4 结论
4.1 建立Mhp抗体间接ELISA方法,经试验证明对抗体产生高峰期的血清样品检测有较好的效果。
4.2利用获得的单克隆抗体,建立单抗阻断ELISA方法,对血清样品进行检测,发现单抗阻断ELISA对早期感染的血清样有较高的检出率,并比间接ELISA的敏感性高。
参考文献
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[4]邵国青,蔡宝祥.猪肺炎支原体的分子生物学研究进展.中国人兽共患病杂志,1999,15(2):68～73
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[6]Feld NC,Qvist P,Ahren P,et al.A monoclonal blocking ELISA detecting serum antibodies to Mycoplasma hyopneumoniae.Vet Microbiol,1992,30:35～46
[7]张淑改,聂向庭,张映,等.猪肺炎霉形体细胞膜蛋白毒性及其电泳分析.中国兽医科技,1997,27(2):27～29
[8]张映,王肇悦.猪肺炎支原体膜蛋白的SDS-PAGE和免疫印迹分析.第五届支原体会议论文集,2001
[9]张映.霉形体膜蛋白制备方法的选择及对膜活性的研究.山西大学学报,1996(19):119～120
ELISA试验 篇2
1 对象和方法
1.1 研究对象
2006年1月—2010年12月我中心检验科出现“花板”的48次ELISA试验, 结果出现空白、阴性和阳性对照、质控结果正常, 而检测标本结果出现大量弱阳性时判定为“花板”。
1.2 研究方法
分析查找采用FAME全自动酶联免疫检测系统进行ELISA试验产生“花板”的原因, 制定相应对策。统计2011年1月—2014年12月的“花板”发生率, 与实施对策前进行比较。
1.3 统计学方法
采用SPSS13.0统计学软件进行数据分析, 计数资料采用χ2检验, P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 5年间“花板”48次, 原因及对策见表1。
2.2 提出相应对策前后“花板”情况比较见表2。
3 讨论
“花板”现象是在ELISA试验中出现的令检验人员很头疼的事情, 出现“花板”后实验结果必须放弃, 重新进行, 不仅浪费物料和时间, 而且还会出现样本量的缺少、交叉污染、报告延迟等一系列问题。本文通过回顾性分析2006年1月—2010年12月5年间的48次“花板”现象, 总结原因, 并提出了相应的对策严格执行。
首先, “花板”原因主要集中在洗板。ELISA试验中洗板的目的主要是利用洗液中的亲水基团和疏水基团以一定浓度和冲洗次数洗掉非特异性吸附物和游离的酶类[1]。酶可以催化显色剂 (底物) 发生氧化还原反应而显色, 如果洗板过程中残留酶, 即使是少量也会显色。洗液浓度过高和洗板次数过多会使包被抗原或抗体脱离吸附而减弱显色造成假阴性, 若浓度过低而洗板次数过少则会增加特异性物质的干扰而造成假阳性。其预防对策: (1) 严格保证洗液配制质量。避免因浓缩洗液结晶、配制用离子浓度过高、配制比例不当等影响洗液浓度。 (2) 科学设定洗板次数。尤其注意吐板后准确判断试验进程, 避免减少或增加洗板次数, 造成洗板不均匀。 (3) 及时清洁洗液桶和管路。工作中发现洗液放置过久, 洗液桶壁和管路中会出现附壁絮状物或结晶沉淀等物质。这些物质会造成注液和吸液不畅甚至堵塞, 导致洗板不均出现“花板”。 (4) 注意板条和托架平整。进板前板条不平整或者托加上异物等造成的微板放置不平均, 会导致洗板针注吸液偏离造成吸板不均。
其次, 影响“花板”的原因为试剂分配。主要对策: (1) 给予充足的试剂, 避免试剂中气泡存在。FAME虽然会在缺少试剂时报警, 但有时由于气泡存在、感应器不灵敏等出现不报或报警被忽略等情况, 造成试剂少加或漏加, 出现显色不均。 (2) 规范手工加样时移液器的使用和试剂的核对。在吐板后, 实验需转手工操作, 由于移液器距离微孔距离太近甚至进入微孔的液体中, 会造成污染也会产生显色的连续或不连续的变化。由于移液器一次的移液量通常不够1板的使用量, 就会造成错加试剂而造成“花板”。
再次, 试剂和标本质量也是造成“花板”发生的原因。其中试剂质量的对策有: (1) 严格使用前核对, 避免失效和异常试剂使用。 (2) 避免试剂槽的交叉清洗。由于试剂槽中的试剂成分不同, 酶或中止液的残留均会造成“花板”甚至“白板”的发生。 (3) 避免不同试剂的交叉使用。相同厂家的试剂如A液和B液为了方便有时会混用, 其实这也是造成“花板”的原因。由于其批号、浓度等不同也会造成“花板”, 所以应该杜绝。标本质量的对策主要是认真检查标本质量和严格执行样本处理规程。样本不足量导致加样针被分离胶堵塞, 离心不充分样本中的细胞、纤维蛋白、Ig G等造成加样时样本污染或加样不准, 以及非特异性吸附[2]等都会引起“花板”。
通过总结和分析“花板”原因, 我们实施了相应的对策。在2006年1月—2010年12月共进行ELISA试验微板数5 229块, 发生“花板”48次, “花板”率0.92%;实施对策后2011年1月—2014年12月共进行4 912块, “花板”12次, 发生率为0.24%, 有了显著的减少 (P<0.01) 。表明加强洗液配制、管路清洁、试剂及样本质量检查、微板放置, 规范手工操作, 不断总结和制定相应对策, 能够降低“花板”现象的发生。
综上所述, 通过加强标本的实验前处理, 设备的定期维护, 实验前试剂和洗液的准备等措施, 能够很好地降低应用全自动酶联免疫分析系统进行ELISA试验时发生“花板”的现象。
参考文献
[1]李金明.临床酶免疫检测技术[M].北京:人民军医出版社, 2006:87-95.
ELISA试验 篇3
1 标本、试剂、仪器
1.1 标本
本单位门诊、住院部乙肝两对半阴性的病人标本 (一式三份) 。
1.2 试剂
荣盛公司ELISA乙肝表面抗原试剂, 批号:20070503。
1.3 仪器离心机
LD4-2型;微量加样器;酶标仪:百特。
2 方法
所有患者标本都经过金标试剂的检测, 其结果均为阴性而留下的试验标本。标本用离心机离心之后, 用加样器加样, 严格按照Hbs Ag试剂说明书的要求进行试验, 用百特酶标仪进行读数。离心有3个不同程序:转数1800转/分钟 (rpm) , 时间5min;转数2500 rpm, 时间10min;转数2500rpm, 时间15min。结果见表1。
3 讨论
加样器、酶标仪等都处于正常状态, 试验步骤均严格按照HbsAg试剂说明书的要求进行试验。从而排除试验仪器、操作步骤对试验结果的影响, 试验的空白和阴阳性对照, 以及室内质控孔都正常, 只有血液标本孔的结果异常。因此, 原因可能在标本方面, 所有患者在留取试验标本前都经过了金标试剂的检测, 其结果均为阴性, 在HbsAg (ELISA) 试验中标本的阳性率不应该很高, 因此, 标本的离心处理就成为影响试验结果的主要可凝因素。当标本在1800转离心5min后检测, 每板44份标本中就有5~10份出现阳性结果。同一标本在2500转离心10min后检测, 每板44份标本中就有0~2份出现阳性结果。标本在2500转离心15min后检测, 每板44份标本中就有0~2份出现阳性结果。由此可见, 当标本被充分离心之后可得到理想的试验结果, 这就说明标本的离心处理确实是影响结果的主要因素。
ELISA试验 篇4
笔者首次利用液相阻断ELISA试验检测牛羊O型口蹄疫免疫效果, 检测牛45头份, 羊45只份, 现将检测结果报告如下。
1 材料与方法
1.1 检测样品
1.1.1 郭勒木德镇的拖拉海村和阿拉尔生态畜牧业合作社分别无菌采集牛血45份, 羊血45份, 共计牛90份, 羊90份。
1.1.2 倾斜试管静止24 h, 待血清自然析出, 分装、标记、冷藏保存运送至实验室。
1.2 器材准备
1.2.1 移液器。0.2~10 u L、5~50 u L、50~200 u L、50~300 u L12道移液器各一把;U型微量血凝板18块。
1.2.2 纯水仪制作纯净水。
1.3 试剂
1.3.1 从2℃~8℃冰箱取出口蹄疫O型液相阻断ELISA抗体检测试剂盒回归室温 (20℃~25℃) 30min。该试剂盒由青海省动物疫病预防控制中心提供, 中国农业科学院兰州兽医研究所生产, 有效期为6个月, 批号:2014120901-3。
1.3.2 将本试剂盒配备的25倍PBST浓缩液用纯净水稀释成1倍PBST:按1∶25倍稀释 (1份浓缩液加入24份纯净水进行稀释) 。
1.3.3 底物溶液的配制。取一片柠檬酸-磷酸盐片剂溶于100m L纯净水中, 溶化后, 取50 m L本溶液, 再加一片邻苯二胺 (OPD) 片剂, 充分溶解, 分装, 避光, 临用前加每1 m L底物溶液加10u L3%双氧水。
2 操作方法
2.1 抗原抗体反应
在U型反应板上, A1-A10孔每孔加75 u L的1x PBST和25 u L被检血清, 以50 u L/孔的量稀释至1∶512;在A11孔加50 u L1x PBST和50 u L标准阳性血清, 以50u L/孔的量稀释至1∶1 024;A12孔和B12孔稀释阴性对照血清, 从1∶2稀释至1∶4;E12-H12孔为病毒抗原对照。
2.2 加病毒抗原
将病毒抗原用1x PBST稀释至1∶5的工作浓度, 以50 u L/孔量加入到被检血清、阴阳性对照的每一个孔中, 4孔病毒抗原对照仅加入100 u L/孔稀释好的病毒抗原。每孔加入50u L病毒抗原, 封板, 振荡, 置4℃冰箱过夜。
2.3 移板
将抗原抗体混合液从U型板上按次序以50u L/孔的量移至已包被口蹄疫O型兔抗的ELISA板上, 封板, 37℃温育60min。
2.4 加豚鼠抗体工作液
洗板5次, 甩干, 以50u L/孔加口蹄疫O型豚鼠抗体工作液, 封板, 置37℃温箱温育30min。
2.5 加兔抗豚鼠Ig G-HRP工作液
洗板5次, 甩干, 以50 u L/孔加兔抗豚鼠Ig G-HRP工作液, 封板, 置37℃温箱温育30 min.
2.6 加底物溶液
洗板5次, 直接加底物溶液每孔50 u L (加底物溶液之前, 按1 m L底物溶液加10 u L3%双氧水) , 37℃温箱温育15 min。
2.7 加终止液
每孔直接加50 u L终止液, 置酶标仪上读取OD492nm值。
3 结果判定
3.1 判定试验是否成立
设立的4孔病毒抗原对照OD492nm值均在1.0~2.0内;阳性对照效价在1∶1024滴度以内;阴性对照抗体效价<1∶8。故而本次试验成立。
3.2 判定被检血清抗体效价
病毒抗原4孔, 弃去最高和最低OD492nm值, 剩余2孔的平均值除以2, 即为50%对照值, 该值就表示阻断50%反应的对照OD492nm值即临界值。被检血清的OD492nm值大于临界值的孔为阴性孔, 小于等于临界值的孔为阳性孔。若临界值与稀释倍数最高阳性孔的OD492nm值相同, 则以被检血清阳性孔的最高稀释倍数作为该份血清的抗体效价;若临界值处于两个孔之间, 抗体效价取上下两孔稀释倍数的反对数中间值。
3.3 判定检测结果
被检血清抗体效价大于或等于1∶128判为口蹄疫O型抗体阳性;小于1∶128判为抗体效价阴性[1]。据统计共检测牛血清45份, 抗体阳性34份, 阳性 (合格) 率75.6%;检测羊血清45份, 抗体阳性42份, 阳性 (合格) 率93.3%。
4 结果分析
此次引用液相阻断ELISA试验检测牛羊O型口蹄疫免疫抗体各45份, 抗体效价均达到农业部规定的标准 (群体抗体效价70%) 。抽检样品的群体均在2014年10月份注射过口蹄疫双价苗, 截止液相阻断ELISA试验操作虽比正向间接血凝试验 (PHA) 繁琐, 但它的精确性、稳定性远远高于正向间接血凝试验[2]。在操作中几个关键点把握不好, 也会导致实验结果发生偏差或试验失败, 笔者简要介绍液相阻断ELISA操作中的几点注意事项。
5 小结
5.1 试剂的回温及室温孵育试剂盒中所有试剂, 包括包被反应板, 在使用之前恢复至室温 (20℃~25℃) , 特别是冬季气温较低, 充分的回温尤为重要。室温孵育时, 控制室温在20℃~25℃, 避免在冷气、光照、热源或通风口等温度不均匀的位置进行检测, 注意不要把反应板直接放在冰冷的实验桌面上, 可以垫上东西作为缓冲[3]。
5.2 反应时间每次加样最好按统一顺序加, 计时要准确。反应板多时, 要记得依次加样。
摘要：利用液相阻断ELISA方法检测郭勒木德镇拖拉海村和阿拉尔村的健康牛、羊O型口蹄疫免疫抗体牛45头份、羊45只份, 检出牛血清样品阳性 (合格) 34份, 阳性 (合格) 率75.6%;检出羊血清样品阳性 (合格) 42份, 阳性 (合格) 率93.3%。
关键词：液相阻断ELISA,检测,免疫抗体
参考文献
[1]马军武, 刘湘涛, 胡弘博, 等.液相阻断ELISA检测口蹄疫病毒抗体方法的建立[C].中国畜牧兽医学会第九次全国口蹄疫学术研讨会论文集.兰州:中国畜牧兽医学会口蹄疫分会, 2003, 364~368.
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