淫羊藿总黄酮（共7篇）
淫羊藿总黄酮 篇1
淫羊藿为小檗科植物淫羊藿、箭叶淫羊藿、柔毛淫羊藿、巫山淫羊藿或朝鲜淫羊藿的干燥地上部分,具有补肾阳、强筋骨、祛风湿的功能[1]。淫羊藿总黄酮是淫羊藿茎叶中淫羊藿苷和淫羊藿次苷等多种黄酮类成分的总称,是淫羊藿的主要有效成分,具有抗心律失常、增强免疫、抗骨质疏松、抗炎、补肾壮阳、抗衰老、抗肿瘤、增强心血管活动、抗心和脑缺血及缺氧等药理作用[2]。淫羊藿总黄酮类化合物的常用提取方法有回流法、水煎法、渗漉法、醇提水沉法、水提醇沉法、超临界流体萃取法、超声波提取法、微波提取法等[3]。试验对水煎法、超声波提取法、回流法提取淫羊藿中总黄酮的结果进行了比较,以期找出简单、快速的总黄酮提取方法,现报道如下。
1 材料与方法
1.1 主要仪器、试剂与药材
紫外-可见光分光光度计(UV-BlueStar Plus),购自北京莱伯泰科仪器有限公司;分析天平(AUW120D),日本岛津公司生产;多管架自动平衡离心机(LD550),购自湘仪离心机仪器有限公司;超声波清洗器(KQ-250型),购自昆山市超声仪器有限公司;常规玻璃仪器,市购。
甲醇、乙醇(分析纯),购自天津市光复精细化工研究所;纯化水、超纯水,自制。
淫羊藿,购自兰州黄河药材市场,经鉴定为淫羊藿的干燥地上部分;淫羊藿苷对照品(批号为110737—200414),购自中国药品生物制品检定所。
1.2 检测波长的选择
精密吸取淫羊藿苷对照品0.84 mg,置于50 mL容量瓶中,加甲醇定容至刻度,以甲醇作空白对照,在210～400 nm波长范围内进行扫描。
1.3 线性关系考察
精密吸取对照品溶液1,2,3,4,5 mL,分别置于10 mL容量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀。以甲醇作空白对照,在1.2所得最大吸收波长处测定吸光度。以吸光度(Y)对淫羊藿苷浓度(X)进行线性回归分析。
1.4 精密度试验
精密吸取对照品溶液2 mL置于10 mL容量瓶中,加甲醇至刻度,在1.2所得最大吸收波长处测定吸光度,连续测定5次。
1.5 供试品溶液的制备
精密称取淫羊藿粉末2 g,平行25份,随机分为5组(水煎组、超声1组、超声2组、超声3组和回流组),每组5个重复。水煎组加纯化水100 mL煎煮30 min,放置至室温,过滤;超声1组、超声2组和超声3组分别加纯化水、甲醇和80%乙醇100 mL超声提取30 min,过滤。回流组加80%乙醇100 mL,回流30 min,放置至室温,过滤。各组滤液均置于200 mL容量瓶中,加提取溶剂至刻度,摇匀,精密吸取0.25 mL置于25 mL容量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀。
1.6 稳定性试验
精密称取淫羊藿2 g,按1.5中水煎组“供试品溶液的制备”方法制成供试品溶液,在1.2所得最大吸收波长处测定吸光度,每隔1 h测定1次,共测8次。
1.7 重复性试验
将水煎组的5份供试品溶液在1.2所得最大吸收波长处测定吸光度,计算样品含量。
1.8 加样回收率试验
精密吸取5份含量为0.532 9 mg/mL的样品溶液0.1 mL,分别加入对照品溶液3.0 mL,置于25 mL容量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,在1.2所得最大吸收波长处测定吸光度,计算样品含量。
1.9 样品总黄酮含量的测定
取供试品溶液,以甲醇作空白对照,在1.2所得最大吸收波长处测定吸光度,计算样品中总黄酮的含量。
2 结果与分析
2.1 检测波长的确定(见图1)
由图1可见,淫羊藿苷在270 nm处有最大吸收峰,故确定检测波长为270 nm。
2.2 线性关系考察结果
以吸光度(Y)对淫羊藿苷浓度(X)进行线性回归,得回归方程为Y = 35.499X - 0.005 4,R2=0.999 6。表明淫羊藿苷在1.68～8.40 μg/mL范围内线性关系良好。标准曲线见图2。
2.3 精密度试验结果
结果表明,吸光度平均值为0.111 94,相对标准偏差(RSD)为0.18%,表明精密度良好。
2.4 稳定性试验结果
结果表明,吸光度平均值为0.173 02,RSD为1.84%,表明供试品溶液在7 h内稳定。
2.5 重复性试验结果
结果表明,5份样品的平均含量为5.09%,RSD为0.16%,表明该方法重复性良好。
2.6 加样回收率试验结果(见表1)
由表1可见,平均回收率为99.86%,RSD为1.58%,表明该方法准确性良好。
2.7 样品总黄酮含量(见表2)
注:同列数据肩注大写字母不同表示差异极显著(P<0.01)。
由表2可见,总黄酮含量依次为回流组>超声3组>超声2组>超声1组>水煎组,回流组和超声3组总黄酮含量极显著高于超声2组、超声1组和水煎组(P<0.01),超声2组总黄酮含量极显著高于超声1组和水煎组(P<0.01),超声1组总黄酮含量极显著高于水煎组(P<0.01),说明采用回流法(用80%乙醇回流)提取淫羊藿总黄酮的提取率最高,水煎法提取率最低。
3 讨论
淫羊藿总黄酮的含量测定多采用紫外分光光度法,主要有以淫羊藿苷为指标性成分,在270 nm波长处测定其含量;使黄酮化合物与铝盐络合后,以芦丁为对照品,在510 nm波长处测定其含量;先用聚酰胺柱层析,以选择性地富集含有酚羟基的黄酮类化合物,再以芦丁为对照品在360 nm波长处测定其含量[4]。其中以淫羊藿苷为指标性成分测定总黄酮含量的方法操作较简便、快速,结果准确,为2010版《中国药典》所载方法。试验采用淫羊藿苷对照品的甲醇溶液在波长210～400 nm之间进行扫描,结果在270 nm处检测到最大吸收峰。因此,选择以淫羊藿苷为指标性成分在270 nm波长处进行了总黄酮的含量测定。淫羊藿总黄酮是从淫羊藿提取的总黄酮成分,淫羊藿苷为主要有效成分。为此,试验以淫羊藿苷为对照品建立标准曲线,进行了不同提取方法提取后淫羊藿中总黄酮含量的测定。
在测定中草药含量时,样品的前处理极为重要,尤其是不同提取方法直接关系到含量测定的准确性和前处理时间的长短。目前,对淫羊藿总黄酮的最佳提取工艺报道较多。王洪锐等[5]用8倍量80%乙醇回流,提取3次,每次30 min,提取效果好;赵燕燕等[6]报道,用20倍量70%乙醇提取3次,每次0.5 h提取效果好。本试验结果表明,用80%乙醇回流提取总黄酮含量最高,水煎提取含量最低,说明测定总黄酮含量时以80%乙醇回流提取最好。80%乙醇超声提取后总黄酮含量略低于回流提取,但二者差异不显著(P>0.05),而超声提取法操作简单,是一种较好的前处理方法。
4 结论
采用回流法提取淫羊藿总黄酮提取率高,操作简便、快速,可作为淫羊藿中总黄酮含量测定的首选提取方法。
摘要：为了比较不同提取方法对中药淫羊藿总黄酮含量的影响,试验采用水煎、超声波和回流法进行总黄酮的提取,采用紫外分光光度法测定其含量。结果表明:回流组和超声3组总黄酮含量极显著高于超声2组、超声1组和水煎组(P<0.01),超声2组总黄酮含量极显著高于超声1组和水煎组(P<0.01),超声1组总黄酮含量极显著高于水煎组(P<0.01)。说明采用回流法(用80%乙醇回流)提取淫羊藿总黄酮的提取率最高,水煎法提取率最低。
关键词：总黄酮,回流,超声波,紫外分光光度法
参考文献
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淫羊藿总黄酮 篇2
1 材料
1.1 药材与试剂
淫羊藿(epimedium sagittatum)批号:040910,产地湖北。杜仲(eucommia ulmoides olive)批号:040916,产地湖北。由武汉市神草中药饮片有限责任公司提供。骨松宝颗粒 (贵州建华责任有限责任公司生产,批号:20040408),按人体与动物体表面积等效剂量比值计算,小鼠剂量为9.75 g/kg[2]。维甲酸(retinoic acid,RA),重庆华邦生化制药有限公司产品,批号:20041010,临用前加蒸馏水配成一定浓度的混悬液。羟脯胺酸(HOP)检测试剂盒(批号:20051026)、肌酐(Cr)试剂盒(批号:20051026)、碱性磷酸酶(AKP)试剂盒(批号:20051020)、血清Ca2+试剂盒(批号:20051028),均为南京建成医学生物工程研究所产品。骨钙素(BGP)(批号:20051105)为Rapid Biolab 产品。
1.2 实验动物
昆明种小鼠60只,雌性,3月龄,平均体质量(30±2) g,由武汉生物制品研究所提供,动物合格证号:SCK(鄂)2003-0003。
1.3 主要仪器
JOUAN超低温冰箱,XD生化分析仪(上海讯达医疗仪器公司),岛津UV-160型紫外可见分光光度计,SIGMA-2K15C离心机。
2 方法
2.1 供试药品的制备 取淫羊藿干燥药材粉碎过筛,以10倍量70%乙醇浸泡半小时后超声提取20 min,浸泡12 h,再回流提取2 h,提取2次。提取液浓缩成稠膏,用石油醚脱脂,DA101-1树脂分离提纯,得干燥物。将杜仲提取干燥物及淫羊藿提取干燥物按1∶1混合待用。
2.2 小鼠骨质疏松模型制备 参考吴波等[3]方法,取昆明种小鼠60只,随机分为6组,每组10只。分别为正常组、模型组、骨松宝组、供试药低剂量组、供试药中剂量组、供试药高剂量组。除正常组上午灌胃生理盐水外,其他组上午均灌胃维甲酸(105 mg/kg),连续15 d。
2.3 给药方法 小鼠造模同时下午给药,正常组灌胃等体积的生理盐水,骨松宝组(9.75 g/kg),供试药低剂量组(125 mg/kg)、供试药中剂量组(250 mg/kg)、供试药高剂量组(500 mg/kg)连续灌胃45 d,第46 d处死小鼠。
2.4 生化指标的测定 小鼠称体质量并记录,眼眶取血放入小离心管中,3000 r/min离心10 min,分离血清。按试剂盒说明测定血清Cr、AKP、HOP、Ca2+和BGP。
2.5 统计学处理 用Excel统计软件进行数据处理,实验结果数据均以undefined表示,组间差异的显著性分析采用t检验,P<0.05为差异有统计学意义。
3 结果
由于制模及采血过程中,个别组小鼠出现死亡及溶血等情况,故每组取8只小鼠数据做为有效数据进行统计分析。3.1 各组小鼠体质量变化 模型组小鼠体质量比正常组显著降低(P<0.01),供试药3个剂量组均比模型组显著升高(P<0.01)。见表1。
注:与正常组比较,**P<0.01;与模型组比较,△P<0.05,△△P<0.01
3.2 各组小鼠血清相关生化指标的变化 与正常组相比,模型组小鼠的BGP、Ca2+、HOP/Cr显著升高(P<0.05或P<0.01);同时AKP降低(P<0.05)。与模型组相比,供试药高剂量组小鼠的BGP,供试药中、低剂量组小鼠的Ca2+、供试药中剂量组小鼠的HOP/Cr显著下降(P<0.05或P<0.01);同时供试药高剂量组小鼠的AKP(P<0.01) 显著升高。见表2。
4 讨论
RA诱导的小鼠OP模型在发病症状、组织形态学表现和对雌激素的骨反应等方面与人类有较好的相似性,具有操作简单,造模周期短,成功率高等优点。本实验给小鼠喂服RA后,模型组小鼠体质量显著低于正常组,血清骨代谢生化指标AKP模型组显著低于正常组,HOP/Cr值、BGP、Ca2+值模型组显著高于正常组,与Mulder等[4]报道基本一致,说明小鼠OP实验模型成功。
注:与正常组比较,*P<0.05,**P<0.01;与模型组比较,△P<0.05,△△P<0.01
BGP具有骨代谢调节激素的功能,是反映骨更新情况的一项特异性生化指标。BGP水平增高,常见于高转换型OP[5]。本实验造模后小鼠呈高转换型OP,给小鼠灌服供试药物后骨转换水平下降,其中中剂量组小鼠血清BGP显著降低。
血清AKP主要由成骨细胞产生,成骨活动增强时,可出现AKP活性升高[6]。本实验各组间AKP比较,模型组比正常组显著降低,表明造模后小鼠骨形成活性降低,而供试药组与模型组相比升高,说明给小鼠灌服供试药后骨形成活性增强,其中高剂量组显著升高。
HOP是反映骨组织中胶原代谢变化的指标,HOP/Cr值可反映骨胶原分解程度,从而显示全身骨质流失的情况[6]。本实验中模型组血清HOP/Cr值比正常组升高,表明造模后小鼠骨吸收活动增强,骨胶原的分解代谢加快。而供试药各剂量组与模型组相比HOP/Cr值降低,表明给小鼠灌服供试药后骨吸收活动受到抑制。
杜仲是我国传统的名贵中药,在《神农本草经》中列为上品药材,具有强筋骨、补肝肾之功效。王大为等[7]研究了杜仲对成骨样细胞增殖的作用,表明杜仲中可能含有直接作用于成骨细胞的活性成分。杜仲水提物和杜仲醇提物通过促进骨髓基质细胞增殖、向成骨细胞分化,从而促进成骨作用,有利于骨愈合、骨修复。淫羊藿总黄酮可降低BGP,其机制可能为:①淫羊藿具有补肾功效,肾脏损害的加重致使尿中钙、磷排出增加,血钙浓度降低,刺激甲状旁腺激素(PTH)分泌增加,溶骨作用增强,同时 PTH 增高会导致降钙素分泌减少[7]。②总黄酮为植物雌激素,能结合并激活哺乳类动物及人类的雌激素受体,通过作用于体内的激素受体而抑制破骨细胞的作用,本实验初步显示灌服淫羊藿总黄酮、杜仲总黄酮对RA造成的小鼠OP有一定的防治作用,其作用机制以及协同作用还需进一步研究。
参考文献
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淫羊藿总黄酮 篇3
1 材料与方法
1.1实验材料
9周龄清洁级雄性SD大鼠, 体重230～280g, 购于南京中医药大学动物中心。美托洛尔:Astra Zeneca, 批号:0604045;淫羊藿总黄酮:购自南京崇原生物科技有限公司, 淫羊藿苷含量16.0%。盐酸异丙基肾上腺素 (ISO) :购自美国Sigma公司, 批号:I5627;RPMI1640培养基:Life Technologies, Grand Island, NY;New bovine serum (NBS) :杭州四季青;dithiothreitol (DTT) :Sigma;Mouse anti-Bcl-2 monoclonal antibody、mouse anti-Bax monoclonal antibody and anti-α-tubulin:购自Santa Cruz Biotechnology公司;Cleaved caspase-3 and cleaved caspase-9 antibody:购自Cell Signaling Technology公司。
1.2 动物模型制备、分组及给药
造模组45只, 皮下注射ISO 0.25ml (170mg·kg-1, 分2次, 间隔24小时[3]) ;正常组15只, 皮下注射生理盐水0.25ml。于实验第6周应用彩色超声监测仪 (型号:HP sonos5500, 探头频率7.5MHz, 产地:美国) 测量LVEF, 测定值为5个心动周期的均值。以LVEF≤45%为造模成功[4]。将造模成功大鼠 (n=41) 随机分为心衰模型组 (NS 0.1ml/kg·d-1灌胃, n=13) 、美托洛尔组 (metoprolol 8mg/kg·d-1灌胃, n=14) 和淫羊藿总黄酮组 (TFE 200mg/kg·d-1灌胃, n=12) , 共18周, 观察大鼠的饮食、毛色、活动、紫绀、水肿等一般性状, 每周称量体重 (BW) 。
1.3 观察指标及检测
1.3.1血流动力学检测
18周实验结束, 将大鼠以戊巴比妥钠 (30mg·kg-1) 腹腔注射麻醉后, 应用左心导管插入左心室, 通过压力换能器输入BL-410生物机能实验系统 (成都泰盟科技有限公司) , 由实验系统软件处理获得左心室舒张末压力 (LVEDP) 、左心室内压峰值 (LVSP) 、左心室压力上升/下降最大速率 (±dp/dtmax) 、心率 (HR) 。
1.3.2心脏重量指数检测
血流动力学检测完毕后利用脱颈法处死大鼠, 迅速打开胸腔摘取心脏, 肉眼观察后, 剪去周围大血管, 在冰生理盐水中洗净血液, 滤纸吸干, 沿房室交界处去除左右心房, 用电子天平 (精确度0.0001g) 称取心室重量 (VW) , 再剪去右心室游离壁, 保留左心室及室间隔, 称取左心室重量 (LVW) , 分别计算心室重量指数VWI (VW/BW) 、左心室重量指数LVWI (LVW/BW) 。称完后在乳头肌水平下方室间隔及左室游离壁分别取全层心肌组织4～6块 (备用) 。
1.3.3心脏病理评分
所有标本于10%福尔马林中固定24小时 (4℃) , 常规取材、脱水、石蜡包埋, 沿左室长轴线每隔1mm横断面切取5张 (层厚4μm) 切片, 切片经HE染色, Masson三色染色。光学显微镜下观察。 (1) 心肌纤维有无肥大、变性、坏死; (2) 间质有无充血、水肿、炎细胞浸润、结缔组织增生; (3) 心内膜、心外膜有无充血、水肿、炎细胞浸润。各种病变由轻到重的程度分别评分为1、2、3、4分, 无病变为0分[5], 累加每组每只动物所有分数, 并进行统计学处理。
1.3.4 DNA断片化测定 琼脂糖凝胶电泳。
将所取心肌组织匀浆, 蛋白裂解, 进行DNA沉淀溶解后, 在含有5μg/ml EB的1%agrose凝胶上电泳1小时后, 用UVP成像系统进行拍照。电泳过程中用DNAmaker指示DNA片断。
1.3.5 Bcl-2、Bax、Caspase-9、Caspase-3表达的测定
免疫印迹分析 (Western blot analysis) 。
1.4统计方法
采用SPSS11.5软件进行统计学分析。计量资料以均数±标准差表示, 各组均数间的比较采用方差分析, 组间两两比较用LSD法。
2 结果
2.1 一般情况
与正常组相比, 模型组大鼠普遍出现:毛色暗黄, 纳食减少, 体重增加, 运动缓慢, 口、鼻紫绀, 有血性分泌物, 呼吸有明显气喘, 足爪水肿, 活动减少, 抓取反应差等。药物组经治疗后上述症状较模型组好转。
2.2 各组大鼠血流动力学检测结果 见表1。
与正常组比较*P<0.05, **P<0.01;与模型组比较#P<0.05, ##P<0.01
2.3 各组大鼠心室重量指数、左室重量指数及病理评分 见表2。
2.4 各组大鼠心肌凋亡相关蛋白的测定 见图1。
如图1所示, 模型组大鼠心肌相关凋亡蛋白被明显激活, Bax、活化形式的Caspase-9和活化形式的Caspase-3的合成均明显增加, Bcl-2的合成则明显下降。而TFE及美托洛尔明显提高了抗凋亡蛋白Bcl-2的合成, 以及下调了促凋亡蛋白Bax的合成, 并且, 凋亡通路中关键的分子Caspase-9和Caspase-3的活化均被药物不同程度下调。
2.5 各组大鼠心肌DNA断片化的改变
与模型组相比, TFE组降低大鼠心肌的DNA梯状条带 (DNAladder) 的出现。见图2。
3 讨论
细胞凋亡是遗传基因控制的细胞自主性死亡过程, 是机体清除严重受损的细胞、不需要的细胞及癌变细胞的自身防御性机制。心肌细胞凋亡受Bcl-2家族蛋白的调控和胱氨酸蛋白酶、丝氨酸蛋白酶等的激活和caspase家族调控[6]。研究表明过度表达的Bax则促进了细胞色素C的释放, 从而激活caspases家族, 降解DNA, 使细胞发生不可逆的凋亡改变;相反, 过度表达的Bcl-2阻止细胞色素C的释放从而阻止了凋亡的传导途径;并且在凋亡刺激因素的条件下, 促凋亡和抗凋亡蛋白的比例则是决定细胞凋亡的一个重要因素[7]。而氧自由基、细胞内钙离子超负荷和AngII、ALD、ET等神经内分泌激素的持续异常激活以及细胞因子如TNF、IFN-γ、IL-1、TGF-β1等是引起凋亡蛋白比例改变的重要因素[8]。
作为传统的补肾壮阳药淫羊藿的提取物, TFE已被证实其具有抗氧化、拮抗钙离子等多种心血管系统药理作用, 对心血管系统有很好的保护作用, 因而被广泛应用于实验和临床[9]。有研究报道TFE还具有β受体阻滞剂样作用[10];并且以淫羊藿为主的中药复方具有抑制心肌TGF-β1等细胞因子及AngII、ALD等神经内分泌激素的激活, 降低心肌细胞的凋亡而逆转心室肥厚, 延缓心力衰竭的进程等作用[11]。
本实验采用皮下注射大剂量ISO方法复制CHF大鼠模型[5];模型组与正常组大鼠相比较心脏表现为扩张性的改变, 心功能显著下降, 心肌DNA断片化及心肌凋亡相关蛋白表达提高, 表明ISO诱导CHF大鼠的心肌有大量的心肌细胞凋亡, 心功能下降及心肌重构显著;提示心肌细胞凋亡是实验性CHF心功能下降及心肌重构的主要原因之一。应用TFE干预后心肌DNA断片化改变及心肌凋亡相关蛋白表达明显下降, 心功能及心室肥大显著好转, 并且和美托洛尔具有相同的作用。
本研究发现, ISO诱导CHF大鼠的心肌细胞凋亡显著, 提示心肌细胞凋亡在实验性CHF的发病机制中发挥着重要作用。而TFE具有抑制促细胞凋亡蛋白合成, 促进抑制细胞凋亡蛋白合成, 从而能够降低心肌细胞凋亡, 改善实验性CHF大鼠的心功能及心室重构。
参考文献
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淫羊藿总黄酮 篇4
1 仪器与试药
Agilengt 1200型高效液相色谱仪;Agilengt1200化学工作站;BP-211D型电子天平 (德国Satorius) ;KQ3200B型超声波清洗器 (昆山市仪器有限公司) ;BJA-500型高速多功能粉碎机 (浙江爱雪厨房设备有限公司) 。
淫羊藿苷对照品 (批号为110737-200415, 中国食品药品检定研究院) ;淫羊藿药材购自成都荷花池中药材市场, 经成都中医药大学药学院胡昌江教授鉴定为小檗科植物淫羊藿Epimedium brevicornu Maxim.、箭叶淫羊藿Epimedium sagittatum (Sieb.et Zucc.) Maxim.、柔毛淫羊藿Epimedium pubescens.Maxim.或朝鲜淫羊藿Epimedium koreanum Nakai的干燥叶。乙腈 (色谱纯, 迪马公司) , 水为乐百氏纯净水, 其他试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 色谱条件与系统适应性
色谱柱:Phenomenex C18柱 (250mm×4.6mm, 5μm) , 流动相:乙腈-水 (30∶70) , 检测波长:270nm, 流速:1.0mL/min, 柱温:30℃。在上述色谱条件下, 淫羊藿苷和样品中其他组分色谱峰可基线分离, 淫羊藿苷与相邻色谱峰的分离度R>1.50, 按淫羊藿苷色谱峰计算, 理论塔板数 (N) >1 500[3,4,5,6]。对照品溶液和供试品溶液色谱见图1。
(A.淫羊藿苷;B.淫羊藿)
2.2 供试品制备
取淫羊藿苷对照品适量, 精密称定, 置于100mL棕色量瓶中, 用甲醇溶解并稀释至刻度, 摇匀, 作为对照品溶液 (每1mL含淫羊藿苷对照品0.106 4mg) 。取淫羊藿粉末 (过三号筛) 约0.2g, 精密称定, 置于具塞锥形瓶中, 精密加入稀乙醇20mL, 称定重量, 超声处理1h, 再称定重量, 用稀乙醇补足减失的重量, 摇匀, 用微孔滤膜 (0.45μm) 滤过, 即为供试品[7,8,9,10]。
2.3 方法学考察
2.3.1 线性关系考察
按照上述色谱条件, 配置不同浓度的淫羊藿苷对照品溶液, 分别为21.28、42.56、63.84、85.12、106.40、127.68μg/mL, 分别吸取10μL注入液相色谱仪, 测定峰面积。以峰面积值 (A) 对进样量 (C) 进行线性回归, 得标准曲线方程A=2 287.7X-8.533 3 (r=0.999 9) 。结果表明, 淫羊藿苷进样量在0.212 8~1.276 8mg进样量范围内与峰面积积分呈良好的线性关系。
2.3.2 精密度试验
精密吸取上述对照品溶液10μL, 重复进样5次, 结果表明淫羊藿苷的色谱峰峰面积RSD为1.63%, 表明仪器的精密度良好。
2.3.3 重现性试验
取同一批样品5份, 分别按照供试品溶液制备方法制备, 取供试品溶液进样10μL, 测定峰面积, 计算淫羊藿苷含量。结果测得淫羊藿苷含量RSD为1.02%, 表明该方法重现性良好。
2.3.4 稳定性试验
取同一供试品溶液, 分别于0、2、4、6、8h进样10μL, 测定峰面积, 计算淫羊藿苷含量。结果测得淫羊藿苷含量RSD为1.10%, 表明供试品溶液在8h内稳定。
2.3.5 加样回收率试验
取9份已知淫羊藿苷含量的样品 (淫羊藿苷含量为5.388 9mg/g) , 精密称定, 分为3组, 每组3份, 分别添加样品淫羊藿苷含量50%、100%、150%的对照品溶液 (淫羊藿苷为0.112 5mg/mL的乙醇溶液) 。按上述方法制备供试品溶液, 进样10μL, 测定峰面积, 计算加样回收率, 结果见表1。
(n=6)
2.4 样品含量测定
取14个产地淫羊藿样品, 按照上述方法制备供试品溶液, 分别进样10μL, 测定峰面积, 每个产地测定平行2次, 计算淫羊藿苷平均含量, 结果见表2。
3 讨论
本实验采用HPLC法测定了14个产地淫羊藿中淫羊藿苷的含量, 结果表明该法精密度、重现性、稳定性均较好。《中国药典》2010版淫羊藿含量测定项下规定本品按干燥品计算, 含淫羊藿苷 (C33H40O15) 不得少于0.50%[1]。但结果表明14个产地中仅有6个产地淫羊藿符合《中国药典》含量测定标准, 合格率为42.9%。因此在临床选用中药时, 为保证临床效果, 应尽量选用道地药材。
参考文献
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淫羊藿药理作用的研究进展 篇5
1 降血糖及减轻糖尿病并发症
张洁等[2]给小鼠腹腔注射四氧嘧啶造成糖尿病模型, 以淫羊藿总黄酮50mg/kg和100mg/kg的剂量给小鼠灌胃, 结果发现高低剂量的淫羊藿总黄酮均能降低糖尿病小鼠的血糖;淫羊藿苷能改善链脲霉素诱导的大鼠糖尿病视网膜病变[3], 能通过调节转化生长因子β1和IV型胶原蛋白的表达对实验性糖尿病肾病 (链脲佐菌素诱导的) 产生保护作用[4], 包慧兰等[5]用淫羊藿苷灌胃给大鼠, 给药8周后, 发现淫羊藿苷能抑制糖尿病引起的体重下降, 减少了左心室内压最大上升和下降速度, 降低左室舒张末压, 可显著提高糖尿病大鼠的心脏功能。
2 对骨骼系统的影响
淫羊藿可以通过提高性激素水平, 调节骨相关蛋白及RNA的表达等来改善骨损伤, 促进成骨细胞及软骨细胞增殖, 抑制破骨细胞[6]。
3 对生殖系统的影响
淫羊藿的主要成分为淫羊藿苷, 淫羊藿苷为磷酸二酯酶Ⅴ型抑制剂, 可以显著增加一氧化氮 (NO) -环磷酸鸟苷 (c GMP) 信号通路活性, 从而增加阴茎的勃起功能[7]。淫羊藿苷对雌性性腺也具有“助阳”作用, 可以提高雌性激素的水平;淫羊藿苷还可以通过刺激下丘脑和垂体间接提高血清中的睾酮水平, 产生壮阳作用[8]。
4 对心血管系统的作用
淫羊藿具有抗心力衰竭、抗心肌缺血、抗心律失常、降血压的作用[9,10]。
5 抗肿瘤作用及抗氧化作用
王婷等人[11]对六种淫羊藿中的黄酮 (木犀草素、金丝桃苷、朝藿素、淫羊藿苷、宝藿苷Ⅰ、宝藿苷Ⅱ) 进行了抗氧化与抗肿瘤活性的研究, 以DPPH清除率为指标时, 木犀草素、金丝桃苷和朝藿素具有较强的抗氧化作用, 且抗氧化作用大于维生素C;而离体实验表明, 淫羊藿苷、木犀草素、朝藿素和宝藿苷Ⅰ能抑制人乳腺癌细胞株 (MCF-7) 和人肝癌细胞株 (Hep G2) 的增殖。
6 对血液系统的作用
CFS是促进人或动物骨髓细胞增殖、分化和成熟的一类糖蛋白, 以小鼠为研究对象, 淫羊藿苷能使脾淋巴细胞产生CFS样活性, 提高小鼠的造血功能[12];米健国等人研究发现, 以康力龙为阳性对照药, 淫羊藿能够影响慢性再障模型大鼠的造血调控因子, 从而能够促进大鼠骨髓造血功能的恢复[13]。
7 其他作用
三种常见淫羊藿伪品的鉴别 篇6
1材料
1.1样品
样品1采自于四川芦山县万家坝,样品2和样品3采自于河南信阳贤山。经信阳农林学院植物学专业周巍教授鉴定,样品1为宝兴淫羊藿( Epimedium davidii Franch. ) ,样品2为加拿大杨树( Populus canadensis Moench. ) 的叶片,样品3为板栗( Castanea mollissima Blume. ) 的叶片。各样品存放于河南信阳农林学院中药标本室。
1.2主要试剂
淫羊藿苷对照品( 批号为110737 - 200415) ,购自中国食品药品鉴定研究院,置五氧化二磷干燥器中减压干燥12 h后使用,含量以百分百计; 乙腈( 色谱纯) ,天津市巴斯夫化工有限公司生产; 乙醇、乙酸乙酯、甲酸、丁酮、甲醇、三氯化铝甘油、水合氯醛等均为分析纯。
1.3主要仪器
体视显微镜( 型号为XTL - 3200) ,上海巴拓仪器有限公司生产; 显微镜( 型号为103i) ,重庆澳浦光电技术有 限公司生 产; 超声波清 洗机 ( 型号为QCE10260) ,天津奇美科技有限公司生产; 紫外 - 可见分光光度计( 型号为TU - 1810) 、高效液相色谱仪 ( 型号为L600 - DP6) ,北京普析通用仪器有限公司生产。
2结果
2.1性状鉴别
2. 1. 1宝兴淫羊藿干燥后叶面呈黄绿色,叶背呈灰白色; 小叶柄呈淡黄色,圆柱形,长约为5 mm,直径近1 mm; 纸质; 叶片为宽卵形或卵形,长6 ~ 12 cm, 宽2 ~ 5 cm; 先端钝或急尖,基部为心形,两侧近相等; 叶缘具呈黄色,长为1 mm,其上有刺状细锯齿; 叶背被稀疏柔毛; 叶两面基出脉或网脉显著,三级叶脉为网状; 略呈革质。
2. 1. 2加拿大杨树叶干燥后叶面及叶背均呈黄棕色; 叶柄呈棕褐色,扁圆柱形,直径2 ~ 3 mm; 叶片为三角形或三角状卵形,长7 ~ 10 cm,有的长10 ~ 20 cm; 先端渐尖,基部为截形或宽楔形; 叶缘半透明, 有圆锯齿[3],近基部较疏,具短缘毛; 叶背面叶脉及叶缘有毛茸; 三级叶脉为网状; 革质。
2. 1. 3板栗树叶干燥后叶面及叶背呈深灰绿色至灰棕色; 叶柄呈棕褐色,扁圆柱形,正面凹入,背面突出,长1 ~ 3 cm,直径为1. 0 ~ 1. 5 mm,木质; 叶片为椭圆形至长圆形,长11 ~ 17 cm,宽为3 ~ 7 cm; 先端渐尖,基部为近平截形或楔形; 叶缘具长为3 mm,其上有刺芒状尖锯齿; 叶背面有众多星状毛或几无毛[3]; 叶脉上有稀疏单绒毛; 三级叶脉平行; 厚革质。
2.2体视显微镜下的鉴别
体视显微镜下对比分析三者叶脉、叶缘的区别。
2. 2. 1宝兴淫羊藿叶脉上有异型非腺毛; 叶缘有长刺状锯齿,其上无毛茸; 锯齿无叶脉通过。
2. 2. 2加拿大杨树叶叶脉上未见非腺毛; 叶缘有波状锯齿,锯齿钝,头部向内卷曲,其上有单细胞腺毛; 锯齿有叶脉通过。
2. 2. 3板栗树叶叶脉上可见明显星状非腺毛; 叶缘有长刺状锯齿,锯齿基部星状毛众多。
2.3光学显微镜下的鉴别
分别制备稀甘油和水合氯醛,装片,光学显微镜下对比分析三者粉末的显微特征。
2. 3. 1宝兴淫羊藿上表皮细胞为1列,无气孔,细胞壁呈深波状弯曲。下表皮细胞壁呈波状弯曲,不定式气孔众多,有副卫细胞3 ~ 6个。栅状细胞不明显。 有两种非腺毛。一种较短,长为24 ~ 86 μm,与叶面细胞成直角,细胞壁较厚,平滑或微有点状突起。另一种叶脉上有特异非腺毛[4],长为73 ~ 865 μm,由4 ~ 11个细胞组成,与下部细胞不成直角,外壁呈波状、网状、螺旋状或特异角质层加厚,充满黄色物,部分细胞连接处膨大或缢缩成节状,叶脉上有晶鞘纤维,草酸钙柱晶直径为9 ~ 17 μm,长为72 μm,整齐排列成1列,透化后部分分散。宝兴淫羊藿粉末的显微特征见301页彩图1。
2. 3. 2加拿大杨树叶上表皮细胞为多角形,细胞壁平直。下表皮细胞为多角形,平轴式气孔众多。等面叶,上表皮下栅状细胞有2列,下表皮下栅状细胞有1列。叶片上非 腺毛多,单细胞,长为220 ~ 566 μm。叶缘腺毛密集,长为163 ~ 282 μm。头部多弯曲,细胞壁光滑,胞腔明显,腺毛断落后留下圆形囊状腺体,周围多有黄色分泌物。晶鞘纤维多见,结晶为草酸钙方晶,直径为18 ~ 46 μm。薄壁细胞中含草酸钙簇晶,直径为9 ~ 44 μm。草酸钙簇晶多排成1列,透化后方晶、簇晶分散。加拿大杨树叶粉末的显微特征见301页彩图2。
2. 3. 3板栗树叶上表皮细胞略似长方形,细胞壁平直,排列较整齐。下表皮细胞为多角形,不等式或不定式气孔,直径为8 ~ 19 μm,不易察见。上表皮下栅状细胞有2列。偶有单个细胞或多个细胞组成的非腺毛,个别极长,含棕色分泌物; 有众多星状毛,长为133 ~ 274 μm,星状毛多碎断,细胞壁光滑,基部膨大处可见胞腔。叶脉上含方晶石细胞,且纵向排成行。石细胞多为方形、长方形,三角形少见,直径为42 ~ 87 μm,细胞壁厚为18 ~ 42 μm,胞腔大而明显, 单个或成群散在。叶柄木薄壁细胞散在或成群,为类长方形,细胞壁增厚,纹孔较大,类圆形或稍延长,呈网状。叶柄中柱鞘纤维的纤维壁厚为9 ~ 26 μm,一端胞腔明显。薄壁细胞含草酸钙簇晶,直径为11 ~ 46 μm。板栗树叶粉末的显微特征见301页彩图3。
2.4薄层色谱鉴别
按照《中华人民共和国药典》( 2010年版一部) 淫羊藿鉴别项下进行 鉴别,在紫外光 灯 ( 波长为365 nm) 下检视。结果显示,样品1在与淫羊藿苷对照品色谱相应的位置上,有相同的暗红色斑点; 喷以三氯化铝试液,再置紫外光灯( 波长为365 nm) 下检视,可见相同的橙红色荧光斑点。样品2和样品3在与淫羊藿对照品色谱相应的位置上,无斑点; 喷以三氯化铝试液,再置紫外光灯( 波长为365 nm) 下检视,仍无明显斑点。
2.5紫外-可见分光光度法检测
按照《中华人民共和国药典》( 2010年版一部) 淫羊藿含量测定总黄酮项下进行检测,结果3个样品在波长为270 nm处均有吸收,样品1总黄酮以淫羊藿苷( C33H40O15) 计,含量为4. 0% ,低于《中华人民共和国药典》规定标准; 而样品2和样品3不含相同成分的黄酮。
2.6HPLC法检测
按照《中华人民共和国药典》( 2010年版一部) 淫羊藿项下含量测定法进行检测,结果见图4。
由图4可知,样品1在淫羊藿苷对照品相同位置出现相应吸 收峰,淫羊藿苷 ( C33H40O15) 含量为0. 629% ,而样品2和样品3在淫羊藿苷对照品相同位置未出现相应色谱峰。
3讨论
除《中华人民共和国药典》规定的来源外,市场上常见的淫羊藿类药材有30多种,包括毡毛淫羊藿、 尖叶淫羊藿、四川淫羊藿、湖南淫羊藿、光叶淫羊藿、 宽序淫羊藿、天平山淫羊藿、川鄂淫羊藿、膜叶淫羊藿、茂汶淫羊藿、单叶淫羊藿、川西淫羊藿、宝兴淫羊藿等,但含量都达不到《中华人民共和国药典》规定[5],如何进一步开发同属植物的药用价值,值得研究。
淫羊藿叶俗称“羊叶”,市场上常见用杨树叶片伪充,包括加拿大杨、钻天杨、山杨、小叶杨、毛白杨、 小钻杨等; 也见用栎树叶片伪充,包括板栗、麻栎、椎栗、茅栗、小叶青冈、青冈栎等。杨树含有芦丁等黄酮类物质[6],加拿大杨和板栎均含有胡萝卜素等有益物质[6,7],均可开发利用,但不宜作为淫羊藿的代用品。
加拿大杨树叶和板栗树叶切碎呈条状或粉碎为粉末后,商家多卖给兽药企业,两大类伪品在270 nm波长处都有吸收,用紫外 - 可见分光光度法难以鉴别。而显微鉴别无需标准品,用量少,检验方法经济快速,三者非腺毛及腺毛区别显著。
4结论
综合性状鉴别、显微鉴别、薄层色谱鉴别,以紫外 - 可见分光光度法、HPLC法进行含量分析可知: 宝兴淫羊藿总黄酮含量低于《中华人民共和国药典》 规定,但淫羊藿苷含量符合规定; 而加拿大杨树叶和板栗树叶不含淫羊藿苷,不能入药。
A. 上表皮细胞( × 400) ; B. 气孔和下表皮细胞 ( × 400) ; C - 1. 普通非腺毛( × 100) ; C - 2. 特异( × 400) ; D. 草酸钙柱晶( × 400) 。
A. 上表皮细胞( × 400) ; B. 气孔( × 400) ; C. 叶缘腺毛 ( × 400) ; D. 腺毛脱落后叶片上基部细胞( × 400) ; E - 1. 晶鞘纤维( × 100) ; E - 2. 草酸钙方晶( × 400) ; F. 草酸钙簇晶( × 400) 。
A. 上表皮细胞( × 100) ; B. 气孔( × 400) ; C. 草酸钙方晶及含方晶石细胞( × 100 ) ; D. 石细胞( × 400 ) ; E. 叶片组织( 示栅栏组织、叶背星状非腺毛,× 100) ; F. 叶片组织( 示草酸钙簇晶,×100) ; G. 叶柄木薄壁细胞 ( × 400) ; I. 叶脉上非腺毛( × 100) ; H. 叶柄中柱鞘纤维( × 400) 。
摘要：为了减少药材市场上补阳药淫羊藿伪品的掺杂,试验采用来源鉴定、性状鉴定、显微鉴定、理化鉴别、含量测定等方法进行真伪鉴别,并检查各样品中是否含有淫羊藿苷。结果表明:宝兴淫羊藿中总黄酮含量低于《中华人民共和国药典》标准,但淫羊藿苷含量高于《中华人民共和国药典》标准,加拿大杨树叶、板栗树叶不含淫羊藿苷。说明宝兴淫羊藿及同属其他植物在保持持续性发展的基础上可以进行开发和综合利用,其他植物叶片不宜作为淫羊藿入药。
补肾强身片中淫羊藿苷的含量测定 篇7
1 仪器与试药
1.1 仪器
TU-1901双光束紫外可见分光光度计 (北京普析通用仪器有限责任公司) ;B200迷你型超声波清洗机 (上海恒奇仪器仪表有限公司) ;XP105DR电子分析天平 (北京博远祥德科学仪器有限公司) ;UV-6双光束扫描型紫外可见分光光度计 (上海美谱达仪器有限公司) ;i Chrom5100高效液相色谱仪 (大连依利特分析仪器有限公司) 。
1.2 色谱柱
Aeris PEPTIDE XB-C18 (广州菲罗门科学仪器有限公司) 。
1.3 对照品
淫羊藿苷购自中国药品生物制品检定所。
1.4 试剂
甲醇为色谱纯;水为纯化水, 其它试剂均为分析纯。
1.5 试药
补肾强身片。
2 测定方法确定
2.1 色谱条件
依据查阅文献及考查的结果[1,2,3], 确定色谱条件如下。流动相:乙腈-水-磷酸 (28∶72∶0.01) , 检测波长:270nm, 流速:1.0m·min-1。柱温:35℃。理论板数按淫羊藿苷峰计算应不得低于3000。
2.2 对照品溶液的制备
精密称取淫羊藿苷对照品适量, 置容量瓶中, 加60%甲醇制成每1m L含5μg的溶液, 即得。
2.3 提取方法确定
2.3.1 提取溶媒的选择
在供试品溶液制备中, 分别选用了水、60%甲醇、甲醇进行超声提取, 结果表明甲醇分离效果、峰形及含量为最好, 所以选择甲醇进行超声提取。
2.3.2 提取时间的选择
取供试品适量, 用60%甲醇溶解, 超声波振荡分别提取15、25、35分钟, 制备供试品溶液, 含量结果表明:三种提取时间结果无明显差异, 为保证提取完全并缩短处理时间, 采用超声提取25分钟。
2.3.3 供试品溶液的制备
取补肾强身片研细, 精密称取1.5g, 置具塞锥形瓶中, 精密加入60%甲醇50m L, 密塞, 精密称定重量, 超声处理 (240W, 40k Hz) 25min, 放冷, 精密称定, 用60%甲醇补足重量, 摇匀, 滤过。取续滤液, 即得。
2.4 专属性试验
依照处方取女贞子、金樱子、狗脊 (制) 、菟丝子, 按样品制备工艺制成阴性对照样品, 照2.3.3项下供试品溶液的制备方法制成阴性液, 依上述方法测定, 结果在淫羊藿苷出峰处阴性液无色谱峰, 结果阴性试验没有干扰, 表明本方法专属性良好。
2.5 精密度试验
精密称取淫羊藿苷对照品适量, 加60%甲醇使溶解, 制成浓度为5μg·m L-1的供试品溶液。照上述色谱条件, 精密吸取10μl, 连续进样6次, 记录峰面积。结果, RSD=0.52%, 表明本方法精密度良好。
2.6 对照品的线性考察
精密称取淫羊藿苷对照品20.0mg, 置100ml容量瓶中, 加入60%甲醇溶液使溶解并稀释至刻度, 摇匀, 分别精密吸取1、2、4、6、8m L, 置于100m L量瓶中, 加60%甲醇稀释至刻度, 摇匀。分别精密上述溶液吸取10μL, 注人液相色谱仪, 依照2.1项下的色谱条件测定, 记录色谱峰。以峰面积 (Y) 为纵坐标, 对照品进样量 (X) 为横坐标, 绘制标准曲线。结果表明, 淫羊藿苷在2~16μg·m L-1范围内呈良好的线性关系。
2.7 重现性试验
称取同一批的补肾强身片样品6份, 按测定方法项下的方法制备供试品溶液, 测定含量, 并计算样品的RSD值, 结果RSD为0.56%, 结果表明此方法的重现性良好。
2.8 准确度试验
精密称取已知含量的样品6份, 分别加入一定量的淫羊藿苷对照品, 上述方法进行测定, 计算回收率, 平均回收率分别为98.21%, RSD为0.61%。
2.9 样品稳定性试验
取同一批补肾强身片样品, 按2.3项下的供试品制备方法制备供试品, 将供试品置室温下放置, 分别于第0、2、4、6、8小时, 精密吸取供试品溶液10μl注入液相色谱仪中, 记录色谱图。测定补肾强身片中淫羊藿苷的RSD=0.55%。结果表明供试品8小时内稳定。
3 讨论
分别考察乙腈-水-磷酸 (35∶65∶0.01) , 甲醇-水-三乙胺 (46∶43∶1) , 乙腈-水-磷酸 (28∶72∶0.01) 不同比例的流动相, 结果以乙腈-水-磷酸 (28∶72∶0.01) 为流动相, 供试品各峰分离效果最好, 故选用, 乙腈-水-磷酸 (28∶72∶0.01) 为流动相。淫羊藿苷为箭叶淫羊藿、柔毛淫羊藿、巫山淫羊藿等干燥茎叶提取物, 淡黄色针状结晶, 溶于乙醇、乙酸乙酯。淫羊藿苷具有促进造血功能、免疫功能、强心、降血压、抗心律失常、增加脑血流量、抑菌、抗病毒、抗炎、降血脂、增加心脑血管血流量、促进造血功能、免疫功能及骨代谢、抗衰老、抗肿瘤等功效。淫羊藿具有较高的药用和保健价值。淫羊藿有可能成为具有良好开发前景的增强免疫功能和免疫调节、抗骨质疏松、治疗心脑血管疾病的药物, 具有广阔的应用前景。
摘要：建立反相高效液相色谱法测定补肾强身片中淫羊藿苷的含量。方法:采用Aeris PEPTIDE XB-C18 (广州菲罗门科学仪器有限公司) , 乙腈-水-磷酸 (28∶72∶0.01) , 检测波长为270nm, 流速为1.0ml/min, 柱温为30℃。淫羊藿苷在2～16μg.mL-1范围内呈良好的线性关系 (r=0.99993) 。淫羊藿苷平均回收率分别为98.21%。结论:本法简便、准确, 可用于补肾强身片中淫羊藿苷的含量测定。
关键词：补肾强身片,含量,测定
参考文献
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