细胞连接（精选4篇）
细胞连接 篇1
血脑屏障(blood-brain barrier,BBB)的结构基础是脑微血管内皮细胞(brain microvascular endothelial cell,BMEC),它与普通内皮细胞相比具有内皮细胞紧密连接和胞饮作用微弱等特点,紧密连接是保持BBB完整性及维持BBB功能的重要因素。在脑缺血等许多中枢神经系统疾病中,BBB的破坏与紧密连接的结构、功能的变化密切相关[1]。脑缺血预处理不仅可通过多种机制对脑实质组织产生保护作用,而且对BBB也有保护效应[2]。在体外培养的神经元及离体脑片中已经观察到了脑缺血耐受效应[3],但是还不清楚构成BBB的BMECs在体外氧糖剥夺(oxygen glucose deprivation,OGD)条件下是否也会产生耐受效应。目前,OGD对BBB结构和功能的影响研究还很少。本实验拟观察体外培养的大鼠BMECs在OGD预处理的条件下是否会产生耐受效应及对紧密连接的影响。
1 材料与方法
1.1 主要试剂及仪器
DMEM培养基、无糖DMEM培养液、胎牛血清(Gibco公司)、内皮细胞生长添加物(ECGS,中国医科大学)、明胶(Sigma公司)、胰蛋白酶(Gibco公司)、Ⅱ型胶原酶(Sigma公司)、葡聚糖(Serva公司)、兔抗Ⅷ因子相关抗原抗体、兔抗Occludin抗体(Santa Cruz公司)、兔抗胶质纤维酸性蛋白(GFAP)抗体(北京中杉生物技术有限公司)、鼠抗ZO-1抗体(Chemicon公司)、罗丹明标记鬼笔环肽(TRITC-Phalloidin,Sigma公司)、FITC标记山羊抗大鼠IgG(北京中杉生物技术有限公司)。低氧培养箱(英国RS Biotech公司MiniGalaxy A)、荧光显微镜(日本奥林巴斯BX51TRF)、透射电镜(日本JEM-1200EX)。
1.2 实验方法
1.2.1 大鼠BMECs的分离培养
取出生3～5 d的SD大鼠,无菌条件下取出大鼠脑组织,收集大脑皮质。加入胰酶(0.125%)常温振荡消化1 min。匀浆后通过70目滤网,滤液移入15%葡聚糖溶液中,4℃下5 000 r/min离心10 min,获得底部的“微血管层”。加入1 m L II型胶原酶(1 mg/m L),37℃水浴中震荡消化约10 min,微血管段呈现“串珠样”表现时终止消化,调整微血管密度为8×103/cm2,种植入1%明胶覆盖的培养皿中,置37℃、5%二氧化碳培养箱中孵育,以后每3天换培养液1次,一般7～10 d可以形成单层。细胞形成单层后进行鉴定,细胞传1代后进行其他下述实验。
1.2.2 BMECs的鉴定
取出生长在盖玻片上呈“铺路石样”的细胞,4%多聚甲醛冰上固定15 min。用免疫组织化学法检测Ⅷ因子相关抗原、Occludin及GFAP表达水平。免疫组织化学操作步骤按说明书进行。一抗为兔抗Ⅷ因子相关抗原抗体(1∶100稀释)、兔抗Occludin抗体(1∶200稀释)及兔抗GFAP抗体(1∶100稀释),显色方法采用ABC法,阴性对照采用PBS代替一抗进行染色,结果用数码相机拍照观察。
1.2.3 实验分组及氧糖剥夺预处理
培养的内皮细胞随机分为3组,分别是正常对照(control)组、氧糖剥夺(OGD)组、氧糖剥夺预处理(IP)组,每组6个培养皿。IP组给予OGD(即无糖DMEM培养液,1%氧气/99%氮气,低氧培养箱孵育)0.5 h作为预处理,接着进行24 h正常培养条件(含糖DMEM培养基,5%二氧化碳/95%空气,普通培养箱孵育)培养,然后与OGD组同时给予OGD 2.5 h,其后在正常培养条件下孵育3 h再给氧糖,模拟在体缺血再灌注,观察各项指标的变化。分别取OGD培养前、给予OGD培养时、再给氧糖培养后的细胞培养液2 m L,采用血气分析仪检测培养液的气体分析值(pH、PCO2、PO2、[HCO3-])。
1.2.4 透射电镜观察细胞紧密连接的形态变化
取出生长在盖玻片上的细胞,放入2.5%戊二醛中固定,双蒸水漂洗,锇酸溶液固定,梯度丙酮脱水、浸透,环氧树脂(Epon812)包埋,然后进行超薄切片,透射电镜观察结果。
1.2.5 紧密连接胞质附着蛋白ZO-1的检测
再给氧糖培养细胞3 h后,取出生长在盖玻片上的细胞,4%多聚甲醛冰上固定15 min。用免疫荧光法检测ZO-1的表达变化,封闭血清孵育30 min,加入鼠抗ZO-1抗体(1∶200稀释),4℃孵育过夜。阴性对照采用PBS代替一抗进行染色,加入FITC标记山羊抗大鼠IgG(1∶100)孵育1 h,PBS漂洗2 min,共3次,加1%甘油封片。倒置荧光显微镜观察,数码相机拍照。
1.2.6 细胞骨架蛋白微丝肌动蛋白(filamentous actin,F-actin)的检测
采用罗丹明-鬼笔环肽特异性荧光探针直接标记,因为其有专一性结合微丝骨架应力纤维丝主要成分F-actin的特性,用于显示F-actin的分布。细胞用4%多聚甲醛冰上固定15min,0.1%Triton X-100通透5 min,PBS漂洗,BSA封闭30 min,加入TRITC-Phalloidin 100 ng/L孵育1h,1%甘油封片,倒置荧光显微镜观察,数码相机拍照。
1.3 统计学方法
采用SPSS11.0统计分析软件对实验数据进行处理,实验结果以均数±标准差表示。各组比较采用方差分析,组间比较采用q检验,P<0.05为差异有显著性。
2 结果
2.1 BMECs的鉴定
倒置显微镜观察到分离提取的脑微血管段呈现“串珠样”(见图1A)。内皮细胞沿微血管的周边分裂繁殖,6、7 d的BMECs融合成片,细胞紧密排列,没有向多层生长的趋势,互不重叠,呈现典型的“铺路石”样结构(见图1B)。光镜下见传代的BMECs接种2、3 h即开始贴壁,7、8 d细胞基本成融合状,细胞折光性强,形态变得更加均一,单层生长并有接触抑制现象。Ⅷ因子相关抗原免疫组织化学染色95%以上为阳性细胞,且为胞浆着色(见图1C);紧密连接标志蛋白Occludin的免疫组织化学染色显示BMECs细胞连接处存在Occludin的特异性表达(见图1D),胶质细胞标志蛋白GFAP免疫组织化学染色阴性,表明以上方法获得的细胞为BMECs,且可形成紧密连接,具有BBB特性。
OGD后,PO2显著下降(P<0.01),再给氧糖后,PO2可迅速恢复到正常水平;PCO2也呈现相同的变化趋势,确定了OGD条件(数据未列出)。
A:胶原酶消化后“串珠样”脑微血管段(×100);B:“铺路石”样BMECs(×100);C:VIII因子相关抗原染色(×200);D:紧密连接标志蛋白Occludin的染色(×400)
2.2 透射电镜观察细胞紧密连接形态
电镜观察正常BMECs呈长椭圆或多角形,细胞核内染色质细密,核周胞浆丰富,质膜和核膜完整,内皮细胞间可见光滑、连续、高密度的紧密连接(见图2A)。再给氧糖后,OGD组内皮细胞核染色质边集,凝聚成团块,胞质水肿,胞内脂质体和空泡增加,线粒体肿胀,粗面内质网扩张,内皮细胞间的紧密连接连续性明显破坏,紧密连接明显开放(见图2B)。IP组与OGD组的BMECs相比,OGD后细胞超微结构基本正常,有少许线粒体内室肿胀,内皮细胞间的紧密连接有轻微破坏,开放程度明显降低(见图2C)。
2.3 紧密连接胞质附着蛋白ZO-1的表达
免疫荧光显微镜下观察,在正常BMECs中,ZO-1染色位于细胞间连接处的细胞膜上,成连续性排列(见图3A)。OGD组细胞再给氧糖后ZO-1细胞膜染色明显混乱不连续,胞浆中也有明显着色(见图3B)。IP组细胞再给氧糖后ZO-1染色重分布明显减轻,细胞膜着色为主,胞浆减弱,与正常组细胞相似(见图3C)。
2.4 细胞骨架蛋白F-a ctin的表达
荧光倒置显微镜观察到,未经OGD处理的正常BMECs的F-actin细胞骨架蛋白分布较均匀,着色微丝在BMECs的细胞周边呈网状有序排列,细胞内偶有应力纤维形成(图4A)。OGD作用2.5 h、再给氧糖3.0 h后,BMECs呈明显向心性回缩,F-actin细胞骨架蛋白解聚,微丝网状有序排列消失,并在细胞内形成大量应力纤维(图4B)。用OGD预处理BMECs后,再给氧糖后F-actin细胞骨架蛋白排列改变明显恢复,较对照组无明显变化(图4C)。
3 讨论
本研究结果显示,在体外培养的大鼠BMECs中,给予OGD及再给氧糖模拟在体脑缺血再灌注后,与对照组相比氧糖剥夺组可破坏细胞紧密连接等超微结构,使脑内皮细胞ZO-1和F-actin的膜定位发生改变。氧糖剥夺预处理组与OGD组相比,内皮细胞损伤减轻,ZO-1和F-actin的膜定位改变恢复。首次在培养的大鼠BMECs中证实了氧糖剥夺/再给氧糖可破坏内皮细胞间紧密连接;OGD预处理可诱导缺血耐受产生,对其后的大鼠BMECs的损伤起保护作用。
大量研究表明,脑缺血后除神经细胞外,微血管损伤也十分明显,微血管的损伤常加重神经细胞的损害,在脑缺血后的病理改变中起着重要的作用[4]。保护微血管结构和功能完整对脑缺血的预后有重要意义。一次短暂的脑缺血即缺血预处理能够激发脑组织对再次严重缺血的保护性耐受。目前,关于脑缺血预处理对脑缺血后神经细胞保护作用的相关研究较多[3,5,6],但脑缺血预处理对脑血管损伤影响的研究仍然很少[2,7],因此,本实验旨在体外培养的大鼠BMECs中研究缺血预处理是否会对BMECs产生缺血耐受效应及对内皮细胞紧密连接的影响。BMECs不仅是构成BBB的主要成分,也在脑的物质代谢、纤溶与止血、免疫应答等方面发挥重要作用,与脑缺血的发生发展、脑水肿、脑肿瘤的血管生成等病理过程紧密相关[8,9,10]。本实验成功地建立了胎大鼠脑皮层微血管内皮细胞的体外培养,并且建立了稳定的传代二倍体细胞系,为研究体外脑缺血条件下BBB结构功能的改变奠定了基础。
紧密连接主要包括跨膜蛋白、胞质附着蛋白和细胞骨架[1]。Occludin属于紧密连接跨膜蛋白,直接参与了BMECs紧密连接的形成,是BBB特征性蛋白。本研究中分离培养的BMECs特征性表达Occludin,说明具有一定的BBB特性。ZO-1是第1个被证实的紧密连接胞质附着蛋白,可与Occludin的羧基端和闭合蛋白相互作用,将跨膜蛋白与细胞骨架连接在一起,并能识别紧密连接位置和传递各类信号。研究表明,紧密连接的完整性取决于肌动蛋白的组装结构和功能状态。骨架蛋白将由跨膜蛋白和胞质附着蛋白组成的连接复合物固定在细胞内,维持紧密连接的稳定。在正常情况下,紧密连接跨膜成分Occludin和胞质附着蛋白ZO-1沿着细胞膜连续分布。低氧开始时,ZO-1蛋白在细胞膜上表达,但随着缺氧时间的延长,ZO-1逐渐迁移到胞质中,然后进入胞核内[11]。其他实验也证实,低氧主要对ZO-1的分布方式产生影响,紧密连接蛋白在细胞-细胞作用位点上遭到破坏,细胞间通透性增加[12]。有研究表明在缺氧复氧过程中,BBB的破坏和通透性增加主要与细胞骨架蛋白F-actin有关[13,14,15]。其在细胞内的位置重新分布,先后经历肌动蛋白边集、应力纤维丢失以及紧密连接水平上肌动蛋白条带变化。复氧后2 h肌动蛋白表达增加2.3倍,主要表现为应力纤维缠结数量增加,与此相适应的是BBB通透性降低;而闭合蛋白并未参与低氧诱导的通透性改变。复氧后Occludin和ZO-1表达也增加,但与肌动蛋白相比变化并不大[16]。
脑缺血再灌注诱导紧密连接的改变及其细胞机制是近来研究的热点,通过对脑缺血预处理诱导脑缺血耐受这种自发性保护机制的深入研究,发现其中有效的保护效应因子及其剂量,对脑缺血的预防及治疗具有重要的意义。
细胞连接 篇2
1.1 一般资料
选取本院2010年6月～2014年6月间普外科收治的84例胃癌患者,手术后病理确诊。其中男62例,女22例,年龄35～82岁,均无放疗和化疗病史。组织分型：腺癌83例,印戒细胞癌1例。浸润层次：肌层2例,浆膜下层5例,穿出浆膜层77例。
1.2 方法
免疫组织化学染色方法：免疫组化法检测正常胃黏膜组、胃癌组、淋巴结组中Ezrin蛋白的表达。鼠抗人Ezrin蛋白单克隆抗体(工作浓度1∶200),标本经固定、切片,鼠抗人Ezrin蛋白单克隆抗体(工作浓度1∶200)稀释后加样,4℃保存孵育过夜、二氨基联苯胺(DAB)显色,苏木素复染,镜检。结果的判断法,随机选5个高倍镜下(×400)每个视野计数200个细胞,共500个细胞,阳性细胞≤10%为阴性。
1.3 统计学方法
采用SPSS15.0统计学软件对研究数据进行统计分析。计量资料以均数±标准差表示,采用检验；计数资料以率(%)表示,采用χ2检验。P<0.05表示差异具有统计学意义。
2 结果
Ezrin蛋白在正常胃黏膜中的表达阳性率为61.9%低于胃癌组织中的表达阳性率84.5%和胃癌转移淋巴结中的表达阳性率88.9%,差异均有统计学意义(P<0.05)。胃癌中Ezri蛋白的阳性率与年龄、性别及肿瘤体积的大小无关,差异无统计学意义(P>0.05)。Ezrin蛋白在高分化管状腺癌中阳性(93.8%)与低分化腺癌中(71.4%)的表达比较,差异有统计学意义(P<0.05)。见表1,表2。
注：与正常胃黏膜组比较,aP<0.05
3 讨论
Ezrin属于ERM(Ezrin-Radixin-Moesin)的重要组成部分它的基因编码位置于染色体6q25-q26,ERM蛋白质的C端与组成细胞骨架的actin连接,N端通过和细胞表面存在的粘附分子Cadherin相接。Ezrin蛋白主要存在于肌动蛋白含量丰富的细胞绒毛和细胞膜的皱襞中并且参与上皮细胞的膜动力学过程[1]。Ezrin蛋白分布广泛,如胃、小肠、肺、胰腺和肾组织有较高的表达[2]。本研究发现Ezrin蛋白在肠型胃癌中的表达率明显高于弥漫型胃癌的标本率(P<0.05)。Ezrin蛋白最早是在鸡的小肠上皮细胞中发现的,Ezrin与癌组织表面黏附分子的连接有密切关系,它参与了癌细胞的浸润、转移过程,在细胞黏附能力调节方面,以及细胞迁移转移等方面发挥了重要作用。在结肠癌研究中发现了Ezrin蛋白参与形成细胞骨架蛋白的构成,Ezrin表达改变肿瘤细胞的运动能力,从而发挥调控细胞分化、生长停滞等重要生理功能。Ezrin蛋白阳性表达率在胃癌组织中高于正常组织,转移淋巴结中的阳性表达率高于正常组织。高分化胃癌与低分化胃癌表达有差异。Ezrin蛋白表达与肿瘤大小,患者性别、年龄无关。可见Ezrin蛋白高表达提示胃癌转移可能性大。
综上所述,Ezrin蛋白表达可能与胃癌发病、侵袭、转移及预后有密切关系的重要基因,对胃癌发病及转移早期诊断和预后判断有重要指导意义。
摘要：目的 探讨膜-细胞骨架连接分子Ezrin在胃癌组织中的表达及其病理学特征的关系。方法 对84例胃癌组织行免疫组织化学检测,对比不同组织分型中Ezrin蛋白表达的差异。结果 Ezrin蛋白在正常胃黏膜中的表达阳性率为61.9%低于胃癌组织中的表达阳性率84.5%和胃癌转移淋巴结中的表达阳性率88.9%,差异均有统计学意义(P<0.05)。胃癌中Ezrin蛋白的阳性率与年龄、性别及肿瘤体积的大小无关,差异无统计学意义(P>0.05)。Ezrin蛋白在高分化管状腺癌中阳性(93.8%)与低分化腺癌中(71.4%)的表达比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 Ezrin蛋白表达可能与胃癌发病、侵袭、转移及预后有密切关系的重要基因,对胃癌发病及转移早期诊断和预后判断有重要指导意义。
关键词：膜-细胞骨架连接分子,胃癌组织,表达,临床意义
参考文献
[1]Sitabkhan Y,Frankfater A.Differences in the expression of cathepsin in 16 melanoma merastatic variants depend on transctiption Sp1.DNA Cell Biol,2007,26(9):673-682.
细胞连接 篇3
关键词：转分化,近端小管上皮细胞,整合素连接激酶,QLT0267
肾小管上皮细胞是一种稳定细胞,在生理情况下增殖不明显,但受到炎症、损伤等刺激时,会发生肾小管上皮细胞肌成纤维细胞转分化(tubularepithelial-myofibroblasttransdifferentiation,TEMT),TEMT后的肌成纤维细胞(Myofibroblast,Myo F)具有分泌细胞外基质(extracellular matrix,ECM)的能力,引起细胞外基质病理性沉积,打破肾间质中ECM生成与清除间的平衡,最终引发肾间质纤维化(renal interstitial fibrosis,RIF)。因此,寻找抑制TEMT过程的作用靶点对保护肾脏功能、延缓慢性肾脏病(chronic kidney disease,CKD)进展至关重要。研究发现,糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)TEMT过程中整合素连接激酶(integrin-linked kinase,ILK)表达增高[1],而正常情况下,肾小管上皮细胞中仅有少量ILK表达,据此估计ILK与TEMT关系密切。故本研究用ILK特异性抑制剂QLT0267,抑制ILK的活化,观察其在高糖下诱导TEMT的作用,探讨DN过程中TEMT的发病机制,为DN的临床治疗奠定实验基础。
1 材料与方法
1.1 主要材料与仪器
1.1.1 实验材料
HK-2细胞(上海通派公司),胎牛血清(fetal calf serum,FBS)(以色列BI公司),达尔伯克必需基本培养基(dulbecco's minimum essential medium,DMEM)(无糖)/F12培养基(美国Gibico公司),0.25%胰蛋白酶+乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid,EDTA)(美国Heclon公司),噻唑蓝(北京Solarbio公司),QLT0267、二甲基亚砜(上海前尘生物科技有限公司,QLT0267溶剂),兔抗人ILK抗体(英国Abcam公司),兔抗人蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)抗体(美国Cell Signaling公司),兔抗人磷酸化蛋白激酶B(phospho-protein kinase B,P-AKT)抗体(美国Cell Signaling公司),鼠抗人α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)抗体(英国Abcam公司),多聚甲醛(武汉博士德生物公司),山羊血清(北京中杉金桥公司),Trizol(美国Invitrogen公司),Thermo逆转录试剂盒(美国Thermo Fisher Scientific公司)。
1.1.2 实验仪器
x Mark酶联免疫检测仪(美国Bio-Rad公司),显微镜(日本Olympus公司),LSM510 META共聚焦显微镜(德国ZEISS公司),XR+凝胶成像仪(美国Bio-Rad公司)。
1.2 实验方法
1.2.1 细胞培养及分组
①细胞培养:HK-2细胞购置于上海通派公司,复苏后用含10%FBS的DMEM(无糖)/F12培养液于37℃、5%二氧化碳CO2培养箱中培养,当细胞融合度达75%~80%时,用0.25%胰蛋白酶+EDTA消化,传代培养,取第2~7代细胞用于实验。②细胞分组:吕智美等[2]实验及本课题组前期研究均证实30 mmol/L葡萄糖可以诱导HK-2细胞转分化;LI等[3]报道,在HKC细胞中,1~10μmol/L QLT0267可以发挥有效的抑制作用。故本实验分为4组:对照组、高糖组(30 mmol/L葡萄糖)、QLT0267组(30 mmol/L葡萄糖+10μmol/L QLT0267)、高渗组(30 mmol/L甘露醇)作用48 h后,倒置相差显微镜下观察细胞形态。
1.2.2 逆转录聚合酶链式反应(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)检测HK-2细胞中ILK、纤维粘连蛋白(Fibronectin,FN)、α-SMA的表达
Trizol法提取细胞总RNA,测定HK-2细胞中总RNA含量及纯度。在逆转录酶催化下合成c DNA,以c DNA为模板进行扩增。FN正向引物:5'-CCTCACCAACCTCACTCCAG-3',反向引物:5'-TCCCTCGGAACATCAGAAAC-3',扩增产物117 bp;α-SMA正向引物:5'-CCTGACTGAGCGTGGCTATT-3',反向引物:5'-CAAGGGAGGTAGAGGTAGC-3',扩增产物134 bp;引物由上海生工生物工程有限公司合成,同时扩增管家基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)为内参照组。α-SMA和FN扩增反应条件:95℃预变性5 min,94℃变性30 s,59℃/60℃退火30 s,72℃延伸30 s,共32个循环,72℃继续延伸5 min。聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)产物在2%琼脂糖凝胶中电泳,在凝胶成像仪中扫描采图,以各目的基因与GAPDH比值代表各目的基因的相对表达量。
1.2.3 Westernblot检测HK-2细胞中AKT、P-AKT、α-SMA的表达
取对数期细胞种板,按上述分组加药,干预48 h后冰上裂解并收集细胞,4℃、12 000 r离心25 min,提取蛋白,二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)试剂盒测蛋白浓度,配平后加入5×loading buffer,混匀后100℃、8 min煮沸,蛋白变性,上样电泳,聚偏二氟乙烯膜转膜,5%脱脂奶粉或牛血清白蛋白室温封闭2 h,使用兔抗人单克隆AKT、P-AKT抗体(1∶1 000)或鼠抗人单克隆α-SMA抗体(1∶500)4℃孵育过夜,二抗(1∶20 000)室温孵育2 h,暗室曝光,凝胶成像和Gel-Pro analyzer分析系统进行灰度分析。
1.3 统计学方法
采用SPSS 17.0统计软件进行数据分析,计量资料以均数±标准差(±s)表示,多组间比较用单因素方差分析,两两比较用LSD法,P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 倒置相差显微镜下HK-2细胞形态学观察
对照组中,HK-2细胞为多边鹅卵石状,胞核居中,细胞间连接紧密,呈岛屿状生长;30 mmol/L葡萄糖使HK-2细胞逐渐由卵圆形、三角形向长梭型转变,细胞间紧密连接消失,失去原有极性;QLT0267组中,细胞数量较高糖组减少,细胞呈现长卵圆形,胞体略增大,可出现凋亡小体;高渗组中细胞形态较对照组无明显变化。见图1。
2.2 QLT0267干预48 h对HK-2细胞中ILK表达的影响
Western blot检测各组ILK表达水平,经单因素方差分析,差异有统计学意义(F=732.525,P=0.000),各组ILK表达水平有差异,对照组中可见ILK条带较细和弱,进一步两两比较结果,①高渗组ILK蛋白相对表达量与对照组比较,差异无统计学意义(t=1.094,P=0.306);②对照组与高糖组、QLT0267组ILK灰度比较,差异有统计学意义(t=47.580和29.428,P=0.000),高糖组、QLT0267组ILK灰度较对照组增高;③高糖组ILK表达量与QLT0267组比较,差异无统计学意义(t=1.162,P=0.279)。见图2。
A:对照组;B:高糖组;C:QLT0267组;D:高渗组
2.3 QLT0267干预48h对HK-2细胞中AKT、P-AKT表达的影响
Western blot检测各组AKT、P-AKT表达情况。4组AKT蛋白相对表达量比较,经单因素方差分析,差异无统计学意义(F=1.839,P=0.181)。各组P-AKT表达水平比较,经单因素方差分析,差异有统计学意义(F=590.355,P=0.000)。对照组中可见P-AKT条带较细和弱,进一步两两结果比较,①对照组P-AKT蛋白相对表达量与高渗组比较,差异无统计学意义(t=1.584,P=0.152);②对照组与高糖组、QLT0267组P-AKT灰度比较,差异有统计学意义(t=47.580和21.293,P=0.000),高糖组、QLT0267组P-AKT灰度较对照组增高;③高糖组P-AKT表达量与QLT0267组比较,差异有统计学意义(t=4.748,P=0.003),QLT0267组P-AKT表达量较高糖组降低。见图3。
1)与对照组比较,P=0.000;2)与高糖组比较,P=0.279
2.4 QLT0267干预48 h对HK-2细胞中FN表达的影响
RT-PCT反应检测各组FN m RNA的表达,各组FN m RNA表达水平比较,经单因素方差分析,差异有统计学意义(F=227.047,P=0.000)。对照组中可见FN m RNA条带较细和浅,进一步两两结果比较,①对照组FN m RNA相对表达量与高渗组比较,差异无统计学意义(t=1.782,P=0.125);②对照组与高糖组、QLT0267组FN m RNA相对表达量比较,差异有统计学意义(t=15.616和14.429,P=0.000),高糖组、QLT0267组FN m RNA相对表达量较对照组增高;③高糖组FN m RNA相对表达量与QLT0267组比较,差异有统计学意义(t=9.447,P=0.002),QLT0267组FN m RNA相对表达量较高糖组降低。见图4。
2.5 QLT0267干预48 h对HK-2细胞中α-SMAm RNA表达的影响
RT-PCR反应检测各组中α-SMA的表达,各组α-SMA m RNA表达水平比较,经单因素方差分析,差异有统计学意义(F=40.715,P=0.001)。对照组中可见α-SMA m RNA条带较细和浅,进一步两两结果比较,①对照组α-SMA m RNA相对表达量与高渗组比较,差异无统计学意义(t=0.265,P=0.800);②对照组与高糖组、QLT0267组α-SMA m RNA相对表达量比较,差异有统计学意义(t=10.844和4.270,P=0.001和0.005),高糖组、QLT0267组α-SMA m RNA相对表达量较对照组增高;③高糖组α-SMA m RNA相对表达量与QLT0267组比较,差异有统计学意义(t=5.987,P=0.001),QLT0267组α-SMA m RNA相对表达量较高糖组降低。见图5。
A:Western blot检测各组HK-2细胞中AKT、P-AKT的表达;B:Western blot检测各组HK-2细胞中AKT的表达;C:Western blot检测各组HK-2细胞中P-AKT的表达。1)与对照组比较,P=0.000;2)与高糖组比较,P=0.003
2.6 QLT0267干预48 h对HK-2细胞中α-SMA表达的影响
Western blot检测各组中α-SMA的表达。各组α-SMA蛋白相对表达量比较,经单因素方差分析,差异有统计学意义(F=869.841,P=0.000)。对照组中可见α-SMA条带较细和浅,进一步两两结果比较,①对照组α-SMA蛋白相对表达量与高渗组比较,差异无统计学意义(t=1.747,P=0.119);②对照组与高糖组、QLT0267组α-SMA蛋白相对表达量比较,差异有统计学意义(t=46.042和18.585,P=0.000),高糖组、QLT0267组α-SMA蛋白相对表达量较对照组增高;③高糖组α-SMA蛋白相对表达量与QLT0267组比较,差异有统计学意义(t=19.244,P=0.000),QLT0267组α-SMA蛋白相对表达量较高糖组降低。见图6。
1)与对照组比较,P=0.000;2)与高糖组比较,P=0.002
1)与对照组比较,P=0.001;2)与高糖组比较,P=0.001
1)与对照组比较,P=0.000;2)与高糖组比较,P=0.000
3 讨论
近年来,随着对DN过程中RIF研究的不断深入,TEMT在CKD发展为终末期肾脏疾病过程中的作用受到广泛关注。研究发现,DN病程发展过程中,高糖可以通过活化TGF-β信号通路诱导TEMT,其特征为肾小管上皮细胞原有表型特征丧失,失去其原有黏附特性,转化为表达α-SMA的Myo F,而α-SMA的出现是TEMT开始的标志[4],其表达量与TEMT严重程度密切相关[5]。本研究证实,30 mmol/L葡萄糖作用48h,可使HK-2中α-SMA表达增高,然而30mmol/L葡萄糖亦是高渗溶液,因此设置30 mmol/L甘露醇组,以鉴别在TEMT过程中,渗透压增高是否也是诱导HK-2细胞转分化的独立因素。实验结果证实,30 mmol/L甘露醇作用48 h不能使HK-2细胞中α-SMA表达增高,与GU等[6]研究结果基本一致。在该过程中,ILK在高糖组中表达亦增高,佐证ILK可能与DN过程中TEMT关系密切。
ILK是细胞基质粘连的核心组成部分和整合功能的重要调节器[7],参与细胞黏附、细胞形态变化、调节细胞外基质沉积等多种病理、生理过程[8,9],如激活和维持静态毛囊干细胞稳定、防止阻止癌变、抑制乳腺癌干细胞的生长等[10,11]。在肾脏中,高糖可能可以通过引起ILK高表达,诱发足细胞、HK-2细胞转分化,而大黄酸可能通过下调ILK,延缓该疾病过程[12,13]。因此,寻找有效阻断ILK信号通路的医药制剂对延缓TEMT过程至关重要。
QLT0267是目前公认的ILK特异性抑制剂,通过抑制ILK下游AKT(ser473)磷酸化起效[14],不改变ILK的表达量,与本研究结果一致。其可能机制为:①P-AKT表达量降低,可以直接抑制细胞分裂、增生;②P-AKT表达下降可以激活糖原合酶激酶3,降低β-链结素/T细胞转录因子的转录活性,抑制细胞增生[14]。在体内QLT0267可以抑制肿瘤细胞生长,抑制瘢痕形成,降低糖尿病大鼠尿白蛋白/肌酐比值[15,16,17,18],参与多种病理生理过程。那么QLT0267在TEMT过程中是否也能起到保护作用呢?
众所周知,正常情况下,ECM在维持肾脏结构与功能、细胞生长与分化过程中起着非常重要的作用,处于不断更新和降解的动态平衡中。TEMT后ECM在肾间质内过度集聚,引起RIF。ECM的主要成分是Ⅰ型、Ⅲ型胶原、FN及层黏蛋白等,因此,FN与ILK介导的TEMT关系密切。本研究结果证实,高糖诱导ILK表达增高的同时亦上调FN m RNA,与笔者前期报道内容一致[18],同时本研究还发现,FN与α-SMA同步表达,即在对照组、高渗组中少量表达,在高糖组中表达量均显著升高,10μmol/L QLT0267在抑制ILK下游AKT活化的同时,下调FN和α-SMA的表达,证实QLT0267在抑制TEMT的疾病过程具有一定的治疗效果。
细胞连接 篇4
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试剂
三七皂苷由云南三七制药有限公司生产,缬沙坦由北京诺华制药有限公司提供。细胞培养液DMEM(dulbecco minimum essentia medium)由美国GIBICO提供;胎牛血清(fetus calf serum,FCS)天津生物制品公司生产;FN试剂盒购自武汉博士德公司;TGF-β1酶联免疫检测板由深圳晶美公司提供;马兜铃酸Ⅰ(aristolochic acid I,AA-Ⅰ)(纯度>98%)由湖北中医药大学提供,溶解于二甲基亚砜(DM-SO,美国Fluka公司)中,储液浓度为5g/L,于4℃保存。
1.1.2 仪器
450酶标仪,美国伯乐公司产品。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养
仿文献方法并加以改进[3]。人类近端肾小管上皮细胞系(HK-2)购自美国ATCC公司。用含10%(体积分数,以下百分比均为体积分数)FCS的DMEM培养基培养于在37℃恒温、5%二氧化碳孵箱中。细胞生长至95%融合后,换用含0.05%)FCS的DMEM培养液,继续培养24h,当细胞处于相对静止生长期后,然后根据不同干预组别加入AA-I(2.5mg/L)刺激48h。
1.2.2 干预实验
细胞生长至95%融合后,换用含0.05%FCS的DMEM培养液生长过夜,共分为5组,即空白组、对照组、缬沙坦干预组、三七皂苷干预组、三七皂苷联合缬沙坦干预组,空白组仅加培养液;对照组除培养液外加入2.5mg/L的AA-Ⅰ;缬沙坦干预组、三七皂苷干预组、三七皂苷联合缬沙坦干预组经2.5mg/L的AA-Ⅰ刺激后分别给予缬沙坦0.1mg/L、三七皂苷0.2mg/L、三七皂苷联合缬沙坦干预48h后收集细胞上清液,进行FN和TGF-β1分泌量的检测与分析。
1.2.3 TGF-β1测定
采用双抗体夹心ELISA法检测。取各组细胞培养上清液为标本,严格按照试剂盒操作要求进行。各组样品每次测定复孔,取均值。结果表达单位为μg/L。
1.2.4 FN测定
采用间接竞争抑制ELISA法检测。取各组细胞培养上清液为标本,严格按试剂盒操作要求进行。各组样品每次测定复孔,取均值。结果表达单位为mg/L。
1.3 统计学处理
各组实验分别重复4~5次,结果以均数±标准差表示,用SPSS10.0软件分析,两组以上样本间的比较,采用单因素方差分析,两样本之间的比较,采用t检验,P<0.05表示差异有统计学意义。
2 结果
2.1 三七皂苷对AA-I诱导HK-2细胞TGF-β1的影响
三七皂苷组能有效地抑制TGF-β1的分泌,与对照组有非常显著性差异、与缬沙坦组、空白组间无显著性差异,三七皂苷联合缬沙坦组抑制程度最明显、与缬沙坦组有显著性差异、与空白组无差异。具体结果见表1。
2.2 三七皂苷对AA-I诱导HK-2细胞FN的影响
三七皂苷组能有效地抑制FN的分泌,与对照组有非常显著性差异、与缬沙坦组间无显著性差异,三七皂苷联合缬沙坦组抑制程度最明显、与缬沙坦组有显著性差异、与空白组无差异。具体结果见表1。
与空白组比较*P<0.05,**P<0.01;与对照组比较#P<0.05,##P<0.01;与缬沙坦组比较▲P<0.05,▲*P<0.01
3 讨论
目前,关于肾小球疾病时肾小管间质损害的防治研究尚很薄弱,肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAS)的激活在促进慢性肾病进展中发挥非常重要的作用,因此,血管紧张素转换酶抑制剂及受体阻滞剂的肾保护作用外得到了广泛的认可,而其他许多药物的肾脏保护作用尚处于实验研究阶段。缬沙坦属于血管紧张素受体亚型(AT1)拮抗剂,通过阻断肾脏中高表达的AT1受体直接完全阻断AngⅡ,血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)是RAS中生物活性最强的物质。此外,还有研究表明AngⅡ能刺激肾小球系膜细胞合成ECM成分及诱导的TGF-β1高表达[4]。目前认为,肾间质成纤维细胞是纤维形成的主要效应细胞,其大量增殖、活化是产生过量细胞外间质(ECM)的先导,在增加ECM成分合成中发挥重要作用[5]。近年来有关中医药在防治慢性肾功能衰竭的研究越来越多,并在防治肾间质纤维化方面有着不可忽略的作用。其中三七具有活血化瘀、消肿止痛等功效,主要活性成分为三七皂苷,现代药理研究认为其具有抗凝、抑制血小板聚集、改善微循环、降血脂和抗纤维化等功能[6]。在临床上广泛应用于心脑血管疾病,疗效确切,副作用小;近年来有报到三七治疗糖尿病肾病、肾病综合征等肾脏疾病,认为三七皂苷能明显降低糖尿病肾病模型大鼠血糖水平,改善肾功能指标尿素氮、血清肌酐水平,尿微量蛋白排出也明显减少;防止或延缓糖尿病肾病的发生。
本研究中三七皂苷能明显地抑制FN,FN是细胞外基质主要成分之一。成纤维细胞在一些因素的刺激下被活化并发生功能和表型转化,转变为表达肾小管间质骨架蛋白α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的肌成纤维细胞(myofibroblas,MFB),MFB合成ECM的能力大大增强。在此期间,MFB首先分泌FN,为其他基质成分的沉积和胶原纤维的形成提供支架[7,8,9],然后分泌胶原成分(主要是Ⅰ型和Ⅲ型胶原)、层黏连蛋白和蛋白聚糖等。因此,FN作为始动因素,可以诱导Ⅳ胶原的形成、促进肾间质纤维化并促进肾小球硬化。同时FN还被认为是反映细胞外基质早期变化的敏感指标之一。此外,本研究还提示三七皂苷能有效地抑制TGF-β1,TGF-β1目前被认为是最重要的促纤维化因子,在肾小球硬化和肾间质纤维化中扮演着极为重要的角色[10],其最重要的生物学作用为增加肾小球系膜区ECM的合成、抑制ECM的降解,导致肾小球硬化,肾功能衰竭。从本研究的结果分析,三七皂苷联合血管紧张受体拮抗剂在抑制TGF-β1、FN的分泌作用更强,具有更好的防治肾间质纤维化的作用。
综上所述,三七皂苷尤其是联合血管紧张受体拮抗剂可通过抑制TGF-β1、FN的表达,从而抑制细胞外基质的形成,并进一步减轻肾间质的病理性损伤,有效的防治肾间质纤维化的发生。随着对肾小球疾病引起肾小管间质损害发病机制研究的逐渐深入,为防治其发展提供了许多新的思路、新的耙点。对肾小球疾病中肾小管间质损害的机制及防治措施的研究,将给临床治疗肾小球疾病、减轻或延缓其慢性化进展带来新的曙光。
摘要：目的 探讨三七皂苷干预肾小管间质损害的效果及机制。方法 通过体外培养人类近端肾小管上皮细胞,用三七皂苷等干预后,采用ELISA法检测纤维连接蛋白和转化生长因子-β1。结果 三七皂苷尤其是三七皂苷联合缬沙坦能抑制纤维连接蛋白和转化生长因子-β1的分泌。结论 三七皂苷尤其是联合血管紧张受体拮抗剂可通过抑制FN、TGF-β1的表达,从而抑制细胞外基质的形成,并进一步减轻肾间质的病理性损伤,有效的防治肾间质纤维化的发生。
关键词：三七皂苷,上皮细胞,肾小管,纤维连接蛋白,转化生长因子-β1
参考文献
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