启动子探针载体

启动子探针载体（共5篇）

启动子探针载体 篇1

上皮细胞间质变 (epithelial-mesenchymal transitions, EMT) 是指在特定的生理和病理情况下, 具有极性的上皮细胞向间质细胞转化的现象。EMT这一概念是GREENBURG等[1]在1982年提出的, 他们发现胚胎期和成年期晶状体的上皮细胞在三维胶原凝胶中培养可形成伪足并转变为间质样细胞。上皮细胞表型的丧失和间质细胞特性的获得是EMT发生的主要特征。具体包括: (1) 以E-钙粘素为主的细胞间黏附分子表达减少, 而N-钙粘素表达增多, 从而导致上皮细胞失去细胞间的黏附作用而变得更加疏松; (2) 以角蛋白为主的细胞骨架转变为以波形蛋白为主的细胞骨架, 从而使多角形的上皮细胞转化成纺锤状细胞[2]。这种表型的转化使肿瘤细胞摆脱细胞间黏附, 从而表现得更为疏松而更具侵袭与转移能力。最新的研究报道, EMT是癌细胞获得迁移能力, 从而导致癌细胞转移的始发因素之一。因此, 认为EMT在肿瘤的侵袭与转移过程中发挥着重要的作用, 成为目前解释肿瘤细胞获得侵袭转移能力的机制之一[3,4,5,6]。

然而, 关于EMT的具体分子机制目前尚未完全阐明, 研究表明锌指转录因子Snail家族分子具有促进细胞迁移与转移的作用, 其中最重要的机制是Snail能促进肿瘤细胞发生EMT的改变, 从而参与多种肿瘤的发生发展与转移, 这对肿瘤防治的基础研究具有非常重要的价值, 也是近年来肿瘤研究的热点之一[7]。因此, 本研究拟通过构建Snail启动子荧光素酶报告基因载体, 以期为阐明Snail在调控EMT过程的关键作用提供研究工具, 同时用于体外筛选以snail为靶标的抗肿瘤药物, 实现抗肿瘤药物的快速高通量的筛选目标。

1 材料与方法

1.1 材料

大肠杆菌菌株DH5α和人鼻咽癌细胞株CNE2由中山大学药学院微生物与生化药学实验室保存;质粒p GL3-Basic购自Promega公司, 该质粒能表达绿色荧光蛋白;内参质粒p RL-TK购自Promega公司, 该质粒能表达海肾蛋白。引物由上海生物工程技术服务有限公司合成;基因组DNA提取试剂盒、质粒提取试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒均购自Omega公司;荧光素酶双报告基因检测试剂盒购自Promega公司;Taq Premix、核酸分子量标准1 Kb plus DNA ladder Marker和DL2000 DNA Marker均购自Ta Ka Ra公司;限制性内切酶Kpn I和BglⅡ, T4连接酶均购自Ta Ka Ra公司;琼脂糖粉购自Shanghai Yito Enterprise Company;转染试剂Lipofectamine 2000购自invitrogen公司;其余试剂为国产分析纯以上。

1.2 方法

1.2.1 人血液基因组DNA提取

取人血液并分离白细胞用4℃的冷冻PBS冲洗一遍, 然后用0.25%的胰酶裂解, 收集于离心管中, 用4℃的冷冻PBS冲洗一遍, 2 000 g/min离心5 min, 弃除上清, 最后用200μL的冷冻PBS重悬细胞, 按照基因组DNA提取试剂盒说明提取人血液基因组DNA。

1.2.2 PCR扩增人Snai1启动子序列

取上述人血液细胞中提取出来的基因组DNA为模板进行PCR扩增, 根据文献报道, Snai1的部分启动子序列-78/+59即能完全启动Snai1基因的转录表达[8]。因此, 综合考虑, 本组拟扩增Snai1启动子的部分序列-797/+59构建荧光素酶报告基因载体。从人血液基因组中扩增Snai1的该部分启动子序列, 用于扩增该序列的上游引物为5'-CGGGGTACCCAAAGCAC ACTTCCCTTTGC-3', 包含KpnⅠ酶切位点;下游引物为5'-GGAAGATCTTGGTCGAGGCACTGGGGTC-3', 包含BglⅡ酶切位点, PCR扩增后, PCR产物进行DNA定量, -20℃保存备用。

1.2.3 Snail启动序列荧光素酶报告基因表达载体的构建

首先, 取PCR扩增的Snai1启动序列分别用Kpn I和BglⅡ双酶切, 同时质粒小提试剂盒小提质粒p GL3-Basic Vector, 并经Kpn I和BglⅡ双酶切, 利用凝胶回收试剂盒回收并纯化酶切产物。将上述制备纯化的Snai1启动序列与线性化双粘性末端的p GL3-Basic载体片段以3∶1摩尔比的比例用T4 DNA连接酶于16℃循环水浴连接反应过夜, 连接产物于60℃灭活10 min后转化至感受态大肠埃希菌DH5α, 经氨苄霉素抗性筛选, 挑取阳性克隆提取重组质粒p GL3-Basic-Snai1-luc并进行双酶切鉴定。

1.2.4 重组质粒转染CNE2细胞

转染前一天, 以2×104个/m L的细胞密度接种到96孔培养板上。待细胞汇合率到达80%~90%时进行转染。以25μL无血清培养基+0.5μL Lipofectamine 2000每孔 (温育5 min) 配制溶液1;以25μL无血清培养基+0.2μg质粒每孔 (检测质粒:内参质粒=5∶1) 配置溶液2;将溶液1与溶液2混合, 室温下置20 min。与此同时, 将96孔板中的细胞用无血清培养基冲洗两遍后, 每孔加入50μL RPMI 1640无血清无抗生素培养基。将溶液1与溶液2的混合液逐滴加入孔中, 摇动培养板, 轻轻混匀。在37℃, 5%的二氧化碳中培养4~6 h后把培养基更换为含血清和双抗的完全培养基, 同时加入10 ng/m L的TGF-β1刺激, 并设阴性对照组, 在37℃, 5%的二氧化碳中培养24 h后检测荧光素酶的表达情况。

1.2.5 荧光定量PCR

为了在转录水平检测Snail的表达情况, 我们通过荧光定量PCR的方法对其进行检测。首先对培养的CNE2细胞进行不同浓度的TGF-β1刺激处理, 并设阴性对照。然后收集细胞, 利用TRIZOL提取细胞总m RNA, 然后利用逆转录试剂盒 (GIBCO BRL, Grand Island, NY, USA) 进行合成c DNA, 并对其进行定量。通过SYBR Premix Ex Taq II (Takara, Japan) 方法进行荧光定量PCR检测, 从而在转录水平检测Snail在TGF-β1诱导作用下的表达情况。用于荧光定量PCR的Snail的引物如下:上游引物, 5'-GACCACTATGCCGCGCTCTT-3';下游引物, 5'-TCGCTGTAGTTAGGCTTCCGATT-3';用做内参的引物如下:上游引物, β-actin, forward 5'-TGGCACCC AGCACAATGAA-3';下游引物, 5'-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3'。

1.2.6 蛋白免疫印迹

细胞按照实验要求处理后, 弃去细胞培养基, 细胞用冷PBS洗2次, 加入三去污细胞裂解液, 冰上放置15~20 min。收集细胞裂解液于EP管, 最大转速离心20 min, 上清收集于-20℃保存。检测时, 取-20℃保存的蛋白溶液冰上融解后, 用Bio-Rad Protein Assay蛋白定量试剂确定浓度, 以每孔10~20μg蛋白上样量, 电压80~100V进行10%SDS-PAGE电泳分离, 在以100 V, 90min的条件电转到甲醇预处理的PVDF膜上, 5%脱脂奶粉 (PBST配制) 封闭1 h后, 检测抗体以1∶1 000比例与封闭液混合, 加入膜, 4℃孵育过夜, PBST洗涤3次后, 加入HPR标记的羊抗兔Ig G二抗 (1∶10 000) 室温摇床振荡1 h。PBST洗涤3次, 加入ECL发光液用X光片曝光。曝光后洗掉PVDF膜上的发光液后, 加入stripping buffer, 50℃加热45min, PBST洗3次, 5%脱脂奶粉室温封闭1 h, β-actin抗体以1∶5 000比例与封闭液混合, 加入膜, 4℃孵育过夜, PBST洗3次后, 二抗 (羊抗兔-HRP) 以1∶10 000比例加入, 室温摇床振荡1 h, PBST洗三次后, 加入ECL发光液用X光片曝光。

1.2.7荧光素酶活性检测

将96孔板转染了荧光素酶报告基因的细胞培养上清吸弃, 每孔加裂解液75μL, 裂解15 min后, 转移至96孔板白板中, 将96孔板置于荧光检测仪中读板, 保存所读取的数据, 做柱状图并进行统计学分析。

1.2.8 数据统计分析

所有数值均以三次独立实验的平均值±标准差 (±s) 表示。两组间的比较采用双尾不配对学生t检验, 多重比较采用邦弗朗尼检验后进行单向方差分析。这些数据处理使用Graph Pad Prism软件版本4.0 (Graph Pad软件公司) 。P<0.05为差异具有显著性。

2 实验结果

2.1 目的基因PCR扩增结果

用从人血液中提取出来的基因组DNA为模板, 含有Snai1启动子引物的扩增体系中经过PCR扩增后, 发现在Marker DL2000的750~1000 bp中间有一条比较特异的条带。而我们预扩增的Snai1启动子部分大小为856 bp (加两端酶切位点大约为876bp) 。因此, 从图片结果可以看出, PCR扩增出来的条带大小与预扩的Snai1部分启动子大小一致, 从而证明Snai1启动子已经成功扩增出来 (图1) 。

1:Marker DL2000;2:Snai1启动子PCR扩增结果

2.2 载体p GL3-Basic的双酶切结果

载体p GL3-Basic经Kpn I和BglⅡ双酶切后, 取部分酶切体系进行凝胶电泳, 如图显示 (图2) , 在5Kb大小附件, 发现一条明亮的条带, 与载体预期大小一致。

1:1kb ladder marker;2:质粒p GL3-Basic双酶切结果;3:质粒p GL3-Basic

2.3 重组质粒的双酶切鉴定结果

通过限制性内切酶Kpn I和BglⅡ双酶切的Snai1启动子与双酶切的p GL3-Basic Vector在含连接酶的10μL的连接体系中16℃连接过夜, 连接产物热激转化入DH5α感受态细菌中, 在含氨苄的细菌培养平板上涂板过夜。分别挑取3个单克隆菌落, 接入5 m L LB培养基中, 250 r/min摇荡过夜, 分别提取质粒, 并以Kpn I和BglⅡ双酶切, 结果如图所示 (图3) , 可以看出克隆1所提取的质粒能切出大小为5 kb左右和800 bp左右大小的两个片段, 而克隆2和3所提取的质粒经Kpn I和BglⅡ双酶切后只见单一片段, 从而说明, 克隆1是构建成功的p GL3-Basic-Snai1-luc重组质粒, 而克隆2和3则为p GL3-Basic自连所导致的假阳性克隆。为了进一步鉴定克隆1是否是真阳性克隆, 笔者将克隆1所提取的质粒送至上海生物工程技术服务有限公司进行测序, 经BLAST比对, 序列完全正确测序, 从而表明克隆1确实是构建成功的p GL3-Basic-Snai1-luc。重组质粒p GL3-Basic-Snai1-luc构建成功。

2.4 重组质粒p GL3-Basic-Snai1活性鉴定

为了进一步证明本研究构建好的重组质粒p GL3-Basic-Snai1是否具有生物活性, 我们将重组质粒p GL3-Basic-Snai1-luc质粒与内参质粒p RL-TK按5∶1的比例 (摩尔比) 转染入CNE2细胞, 在37℃, 5%的二氧化碳细胞培养箱中培养4~6h, 然后更换为完全培养基后加入10 ng/m L的TGF-β1刺激, 并设阴性对照组, 在37℃, 5%的二氧化碳细胞培养箱中培养24 h后检测荧光素酶的表达情况。结果显示 (附表, 图4) , TGF-β1能显著地增强p GL3-Basic-Snai1-luc荧光素酶的表达活性, 说明Snai1启动子序列已经准确插入到了荧光素酶基因上游, 本研究已经成功地构建了有生物活性的重组质粒p GL3-Basic-Snai1-luc, 该重组质粒可以用于后续的实验研究。

1:1kb ladder marker;2:克隆1未酶切;3:克隆1双酶切;4:克隆2未酶切;5:克隆2双酶切;6:克隆3未酶切;7:克隆3双酶切

2.5 TGF-β1诱导CNE2细胞Snai1的表达

为了进一步证实p GL3-Basic-Snai1的生物活性, 笔者进一步地通过检查TGF-β1是否通过诱导Snail的转录来诱导Snail蛋白的表达。对CNE2细胞进行不同浓度的TGF-β1处理, 并设阴性对照, 药物作用24 h后, 提取细胞总m RNA进行荧光定量PCR检测, 提取细胞总蛋白进行Western Blotting检测, 从而在转录水平和翻译水平检测Snai1的表达情况。结果发现, 经过TGF-β1作用后, Snai1的m RNA和蛋白水平的表达量远远高于阴性对照组 (图5和6) 。因此, 表明TGF-β1可以通过激活Snail的启动子序列而诱导Snail的m RNA与蛋白的表达。

覮P<0.01;1:对照组;2:TGF-β110 ng/m L;3:TGF-β120 ng/m L

1:TGF-β10 ng/m L;2:TGF-β110 ng/m L;3:TGF-β120 ng/m L

3 讨论

恶性肿瘤的演进是一个多步骤的复杂过程, 包括正常细胞恶性转化、肿瘤细胞恶性增殖、肿瘤细胞的侵袭和转移。上皮细胞来源的癌症在肿瘤中占非常多的比例, 而肿瘤细胞发生转移是肿瘤患者致死的主要原因之一。肿瘤细胞的侵袭是肿瘤发生转移的第一步, 但是目前对其认知尚少。在肿瘤发生发展过程中, EMT能使没有迁移与转移能力的细胞获得浸润的能力并最终是肿瘤细胞转移到其他组织和器官, 从而使肿瘤形成局部浸润和远处转移, 并再次通过间质细胞向上皮细胞转化, 从而形成固定的转移灶。在肿瘤的转移过程中, 肿瘤组织中发生EMT改变的肿瘤细胞数目直接与病变组织的侵袭转移程度密切有关。在动物和人的肿瘤中, Snail参与了肿瘤细胞发生EMT的过程, 是导致EMT的关键性转录因子, 从而促进肿瘤细胞发生侵袭与转移[9,10,11], 目前研究发现Snail通过促进肿瘤细胞发生EMT改变而引起多种肿瘤的转移[12,13,14,15], 此外, 国内学者利用重组腺病毒载体p Ad Easy OSNAI1高效感染Hep G2肝癌细胞株, 诱导外源性Snai1蛋白过表达, 结果表明外源性Snai1蛋白过表达能诱导Hep G2细胞出现EMT样变化, 并且细胞运动、侵袭转移能力明显增强[16]。以上研究均表明, Snail高表达能促进癌细胞发生EMT改变, 使得肿瘤细胞运动及侵袭力增强, 而抑制Snail的表达则能抑制肿瘤细胞发生EMT改变, 从而抑制肿瘤细胞的侵袭与转移, 表明Snail在肿瘤转移过程中发挥着非常重要的作用。目前Snail转录因子已经作为一种肿瘤治疗靶标成为抗肿瘤转移研究的热点之一。

本研究通过PCR技术从人血液基因组中钓出所需要的具有启动子活性的Snai1片段, 双酶切后与双酶切的p GL3-Basic空载体连接成重组体p GL3-Basic-Snai1-luc, 通过转化扩增, 筛选出阳性克隆, 并通过酶切, 测序鉴定及生物学活性的检测, 结果表明, 本组成功地构建了p GL3-Basic-Snai1-luc荧光素酶报告基因载体, 并在CNE2细胞内鉴定了其在TGF-β1的诱导下, 能启动荧光素酶的表达。此外, 通过荧光定量PCR和Western blotting检测表明TGF-β1能显著性的诱导Snail的转录与表达。因此, 充分证明了本组构建的p GL3-Basic-Snai1-luc是具有生物学功能的, 为Snai1在EMT过程中的调控机制研究和以snail为靶标的抗肿瘤药物快速高通量的筛选提供了非常重要的研究工具。

摘要：目的 构建Snail启动子荧光素酶报告基因载体pGL3-Basic-Snai1-luc并对其进行生物活性的鉴定及其初步的应用研究。方法 通过PCR技术从人血液基因组中钓出我们需要的具有启动子活性的Snail片段, 双酶切后与双酶切的pGL3-Basic空载体连接成重组体pGL3-Basic-Snai1-luc, 通过转化扩增, 筛选出阳性克隆, 并通过酶切, 测序及生物学活性检测鉴定构建好的荧光素酶报告基因载体。结果 成功地构建了pGL3-Basic-Snai1-luc荧光素酶报告基因载体, 并在CNE2细胞内鉴定了其在TGF-β1的诱导下, 能启动荧光素酶的表达。此外, 笔者通过Western blotting检测表明TGF-β1能显著性的诱导Snail蛋白的表达, 充分证明了我们构建的pGL3-Basic-Snai1-luc是具有生物学功能的。结论 具有生物活性的pGL3-Basic-Snai1-luc的构建成功为研究Snai1在EMT过程中的调控机制研究和以snail为靶标的抗肿瘤药物快速高通量的筛选提供了非常重要的研究工具。

关键词：上皮细胞间质变,Snail,肿瘤转移,启动子

启动子探针载体 篇2

2002年, Volker Haake等从拟南芥中分离出了CBF转录激活因子家族的又一成员—CBF4基因, 是抗旱转录因子。它与CBF1、CBF2和CBF3相同, 具有保守的AP2区域, 能与CRT/DREDNA (C-repeat/dehydration-responsive element (DRE) DNA binding protein) 调控元件特异结合, 促进启动子中含有这一调控元件的多个冷诱导和脱水诱导基因的表达, 从而激活植物体内的多种耐逆机制。但又与它们不同, CBF4基因的表达不受低温诱导, 而是受干旱诱导[14]。

目前, 我国利用CBF4基因进行抗逆遗传改良研究的报道中所用的启动子基本都是组成型启动子, 应用诱导型启动子调控CBF4基因进行抗逆遗传改良的报道很少。本研究利用已克隆得到的抗旱转录因子CBF4基因及其诱导型启动子CBF4P, 以植物表达载体p3301为基础, 分别构建了由组成型启动子CaMV35s和诱导型启动子CBF4P调控的转录因子CBF4基因的两个植物表达载体p3301-CBF4和p3301-CBF4P, 为今后利用CBF4基因改良苜蓿抗逆性及进一步研究两种启动子的启动效率奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料

大肠杆菌 (E.coli) DH5α, T-CBF4质粒 (含有CBF4基因) 、T-CBF4P质粒 (含有CBF4基因及诱导型启动子) , Bluescript M13 (SK) 、p3301 (携带CaMV35S启动子) 表达载体均由由北京市农林科学院北京农业生物技术研究中心园林实验室提供。

1.1.2 试剂

限制性内切酶、T4 DNA连接酶、Taq DNA聚合酶、Marker等购自TaKaRa公司;质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒等购自上海生工生物工程有限公司;其他试剂均为国产分析纯。

1.1.3 仪器

PCR仪、恒温水浴箱、自动恒温摇床、电泳仪、凝胶自动成像仪等。

1.1.4 培养基

LB培养基 (胰化蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl 10g, pH 7.0) 。

1.2 方法

1.2.1 感受态细胞制备与转化

大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备及转化方法参照文献[15]进行。

1.2.2 植物p3301-CBF4的构建

将T-CBF4质粒先用SalⅠ酶切成线形, 回收约3 700bp的片段, 然后再用EcoRⅠ部分酶切此片段, 回收670bp片段, 同时将SK用SalⅠ和EcoRⅠ双酶切回收2 960bp片段, 将这两个片段用T4 DNA连接酶进行连接, 得到中间载体SK-CBF4。用BamHⅠ和SpeⅠ双酶切中间载体SK-CBF4, 回收670bp片段, 再将p3301先用BglⅡ单酶切, 再用NheⅠ部分酶切, 回收约9 100bp片段, 用T4 DNA连接酶将这两个回收得到的片段连到一起, 构建成p3301-CBF4表达载体。

注:BamHⅠ与BglⅡ为同尾酶, SpeⅠ与NheⅠ为同尾酶。

1.2.3 植物表达载体p3301-CBF4P的构建

将T-CBF4P和SK同时用EcoRⅠ进行酶切, 分别回收2 000bp片段和2 960bp片段, 再将两个片段进行连接形成中间载体SK-CBF4P。再将p3301先用PastⅠ单酶切, 再用NheⅠ部分酶切, 回收约8 500bp片段, 与用PastⅠ和SpeⅠ双酶切SK-CBF4P回收到的2 000bp片段连接, 构建成p3301-CBF4P表达载体。

1.2.4 表达载体构建过程图

植物表达载体p3301-CBF4构建见图1, 植物表达载体p3301-CBF4P构建见图2。

2 结果与分析

2.1 中间载体SK-CBF4的鉴定

2.1.1 PCR检测

用CBF4 3′引物 (ATT ACT CGT CAA AAC TCC AGA GTG) 和CBF4 5′引物 (AAT GAA TCC ATT TTA CTC TAC) 扩增得到了约670bp DNA片段 (图3) , 只有CBF4片段连接到SK上, 才能扩增到约670bp的DNA片段, 所以PCR检测结果初步验证了中间载体SK-CBF4构建成功。

2.1.2 酶切检测

如果构建的SK-CBF4载体正确, 构建的SK-CBF4载体中存在2个PstⅠ酶切位点。用PstⅠ酶切应切出2 960bp和670bp两个DNA片段。从电泳检测的结果来看 (图4) , 酶切所得到的DNA片段与预期结果完全一致, 证明中间载体SK-CBF4构建是正确的, 可用于下一步实验。

1-4 Plasmid ;5 Check positive ;6 Check negative;7 Marker.

1 PastⅠ;2 Marker.

2.2 植物表达载体p3301-CBF4的鉴定

2.2.1 PCR检测

PCR琼脂糖凝胶电泳结果显示 (图5) , 重组质粒的PCR产物中扩增出约670bp的DNA片段, 说明CBF4基因已整合到p3301载体中, 验证了载体p3301-CBF4构建的正确性。

1 Check positive; 2 Check negative; 3 Plasmid; 4 Marker.

2.2.2 酶切检测

如果构建的p3301-CBF4载体正确, 在它上有3个EcoRⅠ酶切位点, 酶切后应分别得到9 000bp、800bp和180bp 左右的3个DNA片段。从电泳检测的结果来看 (图6) , 酶切所得到的DNA片段与预期结果一致, 说明所得到的p3301-CBF4是我们所要构建的含有CBF4基因和组成型启动子CaMV35s的植物表达载体。

1 EcoRⅠ;2 Marker.

2.3 中间载体SK-CBF4P的鉴定

2.3.1 PCR检测

利用CBF4P 3′引物 (ATG TAG AGT AAA ATG GAT TCC TT) 和CBF4 5′引物 (CAG GTG TGA GAG AAC CAA AGT) , 以重组质粒SK-CBF4P为模板进行PCR检测, 电泳分析结果表明, 重组质粒的PCR产物中含有一条1 200bp的DNA片段 (图7) , 验证了中间载体SK-CBF4P构建正确。

1, 2 Plasmid; 3 Check positive; 4 Check negative; 5 Marker.

2.3.2 酶切检测

正确的SK-CBF4P载体应有2个SpeⅠ酶切位点, 酶切后应分别得到3 000bp和2 000bp左右的2个DNA片段。SpeⅠ酶切的电泳结果 (图8) 与预测的结果一致, 从而证明中间载体SK-CBF4P构建是正确的, 可进行后续实验。

1 SpeⅠ;2 Marker.

2.4 植物表达载体p3301-CBF4P的鉴定

2.4.1 PCR检测

琼脂糖凝胶电泳结果显示 (图9) , PCR产物为1 200bp的特异性片段, 与预期片段大小一致。说明CBF4P基因已整合到p3301载体中。

1 Check positive;2 Check negative;3 Plasmid; 4 Marker.

2.4.2 酶切检测

正确的p3301-CBF4P载体上应只有1个PstⅠ酶切位点和1个BglⅡ酶切位点, 酶切后应得到10 000bp和1 300bp 左右的2个DNA片段。用PstⅠ和BglⅡ双酶切的电泳结果 (图10) 与预测的结果一致, 说明所得到的p3301-CBF4P是我们所要构建的含有CBF4基因和诱导型启动子的植物表达载体。

1 PstⅠ+BglⅡ ; 2 Marker.

3 讨论

启动子探针载体 篇3

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

p GL3-Basic质粒、海肾荧光素酶表达质粒p RL-SV40、DNA纯化试剂盒和荧光素酶双报道试剂盒均为Promega公司产品;质粒提取试剂盒、基因组DNA提取试剂盒购自Qiagen;高保真DNA聚合酶、T4DNA连接酶购于Takara公司;胶回收试剂盒为Dongsheng Biotech公司产品;限制性内切酶Kpn I、HindⅢ购自NEB公司;脂质体Lipofectine 2000为Invitrogen公司产品;DMEM、胎牛血清购自Gibco;细胞系OVCAR3、SKOV3、ES-2来源于ATCC;HO-8910购于中国科学院细胞库, 均为本实验组保存, 培养于含有10%FBS的DMEM培养基中, PCR引物由上海生物工程有限公司合成。

1.2 实验方法

1.2.1 C-MET启动子序列扩增及纯化

按Qiagen试剂盒说明书提取卵巢癌细胞系OVCAR3细胞基因组DNA, 经核酸定量仪定量后置于-20℃备用。根据C-MET基因序列AF046925 (Gen Bank) , 设计2条扩增C-MET启动子核心区域 (-223~+60) 的引物, 上游:CGGGGTACCCAGACTGCCTGAGCTGGGG GA;下游:CCCAAGCTTGCGACCAGACTGAGGCGCT C, 上游引物包含Kpn I酶切位点, 下游引物包含HindⅢ酶切位点, 划线部分为酶切位点。扩增片段全长283 bp, 包括转录起始点上游223 bp和下游60 bp。以基因组DNA为模板, 采用25μL反应体系进行PCR扩增, 循环参数为:94℃5 min, 94℃30 s, 62℃30 s, 72℃30 s, 30个循环, 72℃5 min。取5μL PCR产物行1.5%琼脂糖凝胶电泳, 并对目的条带进行胶回收。

1.2.2 荧光素酶报告基因质粒的构建及鉴定

PCR产物和p GL3-Basic质粒均以Kpn I和HindⅢ双酶切, 对目的条带采用胶回收并进行纯化。纯化过的DNA片段和质粒按3︰2的比例, 在T4DNA连接酶作用下连接2 h, 得到重组质粒p GL3-C-MET-Promoter。将重组质粒转化DH5α细菌, 于含氨苄青霉素的LB培养基平皿上进行选择培养。挑取其中3个克隆扩增并经KpnⅠ、HindⅢ双酶切和测序鉴定。测序工作由北京华大公司完成。

1.2.3 细胞转染及荧光素酶转录活性测定

将处于对数生长期的OVCAR3、SKOV3、ES-2、HO-8910细胞经胰酶消化后重悬, 细胞密度为1.5×105个/m L, 各取200 m L/孔接种于48孔板内, 置于37℃、5%二氧化碳 (CO2) 孵育箱中培养。细胞汇合度为80%左右时, 将重组质粒p GL3-C-MET-Promoter转染各组细胞, 为校正孔间转染效率, 各组均用表达海肾荧光素酶报告基因质粒p RL-SV40同时进行转染。转染采用脂质体法:首先形成Lipofectine-DNA复合物, 室温静置20 min后, 将Lipofectine-DNA复合物加入细胞培养液中, 培养6 h后更换成含10%血清的培养基继续培养24 h。细胞裂解后测定荧光素酶活性和海肾荧光素酶活性, 以二者比值为校正后的结果, 实验重复3次。

1.3 统计学方法

采用SPSS 17.0软件进行统计学分析, 所有数据以均数±标准差 (±s) 表示, 采用单因素ANOVA分析, 检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 C-MET启动子序列的PCR扩增

以提取的卵巢癌细胞中基因组DNA为模版进行PCR扩增, 取扩增产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳, 紫外灯下可见一条明显的DNA条带位于250 bp附近, 与所需扩增片段大小相符, 且无非特异性扩增片段, 此条带即为设计扩增的目的片段 (见图1) 。

2.2 C-MET启动子与p GL3-Basic质粒连接及鉴定

PCR产物与质粒均经酶切后连接, 重组质粒转染大肠杆菌克隆、培养, 随机挑取3个单菌落中的少许菌体为模板进行扩增并经Kpn I和HindⅢ双酶切鉴定, 结果见图2, 得到大小为5 kb左右的p GL3质粒片段和含C-MET启动子区的目的条带。1号克隆送公司测序分析, 其测序结果与Gen Bank中的C-MET基因启动子序列比对后完全一致, 证实重组质粒载体构建成功。

2.3 荧光素酶报告基因转录活性

将重组质粒p GL3-C-MET-Promoter及p RL-SV40共转染卵巢癌细胞株, 24 h后进行荧光素酶活性检测发现, C-MET启动子在OVCAR3、SKOV3、ES-2、HO-8910细胞中的相对转录活性为 (31.4±2.5) 、 (20.1±2.6) 、 (14.5±1.9) 和 (3.6±1.5) (见图3) , 各组之间比较均有统计学意义 (P<0.05) 。

M:DL2000 DNA Marker;1:PCR扩增产物

M1:1 kb DNA Ladder Marker;1和2:分别为C-MET-3的质粒与酶切后产物;3和4:分别为C-MET-2的质粒与酶切后产物;5和6:分别为C-MET-1的质粒与酶切后产物;M2:DL2000 DNA Marker

1:OVCAR3;2:SKOV3;3:ES-2;4:HO-8910

3 讨论

卵巢癌为最常见的妇科恶性肿瘤之一, 是引起妇女死亡的第5大原因。由于起病隐匿和缺乏有效的早期筛查手段, 75%的患者就诊时已为卵巢癌晚期[5]。手术治疗及化疗药物为当前治疗卵巢癌的主要手段, 但不能有效地预防或延迟肿瘤的转移播散, 肿瘤转移仍为治疗卵巢癌的主要挑战。因此, 更好地了解肿瘤侵袭转移的机制是开发有效药物的关键, 从而提高卵巢癌患者的生存率及完全治愈率。C-MET为肝细胞生长因子受体, 在卵巢癌等多种肿瘤中高表达, 促进肿瘤的侵袭和转移。刘等[6]研究发现, 与对应的正常食管组织相比, 部分食管鳞癌组织中C-MET呈高表达, 且与肿瘤浸润深度、淋巴结转移及TNM分期显著相关。最近有学者报道[7], C-MET在胃癌形成过程中起着重要的作用, 其表达的高低可作为肠上皮化生发展到非典型增生的癌前病变的一个预测指标。对卵巢癌的研究表明[8], 在具有遗传性卵巢癌综合征的妇女中存在HGF/C-MET的自分泌调节环, 从而增加了该类妇女患卵巢癌的易感性。卵巢癌组织中C-MET水平上调与肿瘤分期有关, 且C-MET高表达的ⅢC卵巢癌患者更容易形成腹主动脉旁淋巴结转移, 具有更差的总体生存率, 由此推测C-MET表达水平可能为晚期卵巢癌患者潜在的预后因子。应用小分子干扰RAN沉默C-MET后, 可明显减轻卵巢癌动物模型的肿瘤负荷、减少腹水形成及腹膜植入的数量, 也可抑制腹膜播散和侵袭[9,10,11]。卵巢癌细胞株SKOV3、OVCAR3、HO-8910均为上皮性卵巢腺癌患者腹水中提取的细胞, ES-2为卵巢透明癌细胞。既往研究证明, OVCAR3细胞具有较强的体外侵袭转移能力。对C-MET基因启动子区域研究分析显示, -223~+60片段为转录调控的核心区域, 为正性调控原件。本研究通过PCR技术获取含C-MET核心调控区域的启动子片段, 并应用基因重组技术构建含该启动子片段的荧光素酶报告基因质粒, 经酶切及测序鉴定证实重组质粒构建成功。将重组质粒瞬时转染卵巢癌细胞株发现, 转移能力强的OVCAR3细胞中荧光素酶的活性最高。由此推测, C-MET活性的高低可能与细胞的侵袭转移能力相关, 转录因子在转录水平对C-MET进行激活, 从而引起HGF/C-MET通路活化, 导致肿瘤发生、发展。本质粒的构建为更好地研究C-MET的结构及生物学功能, 以及为研究卵巢癌的侵袭转移机制提供有力的证据。

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启动子探针载体 篇4

关键词：PAI-1,启动子,荧光素酶报告基因,载体连接

基因重组技术是我们在分子生物学研究中较常使用到的基本技术, 也是分子生物学实验的基础, 它在现代中医药的研究中应用越来越广泛。载体构建是将外源性DNA目的片段通过重组技术转化入受体细胞中繁殖及表达, 人工构建为需要的目的质粒, 为进一步实验做基础[1,2]。当外源性DNA片段插入到相应载体内时, 由于操作方法繁琐, 所需时间长, 人为性因素较大, 容易导致实验难以继续。本文根据自身操作, 在扩增、酶切及连接问题上进行总结, 现报道如下。

1实验材料

1.1试剂

报告基因表达载体p GL-3Basic (Promega E6721) 、PUC19T载体 (TAKARA公司D) ;大肠杆菌DH5α感受态菌株 (TAKARA公司D9057A) 、人血基因组DNA提取试剂盒 (北京天根生化科技公司) 、PCR扩增mix (北京康为公司CW0069) 、DNA marker V、500 bp DNA marker (上海莱枫生物科技有限公司) ;DNA凝胶回收试剂盒 (GX50) 、DNA质粒小量提取试剂盒 (Axygen公司AP-MN) ;限制性内切酶BglⅡ (Fermentas公司ER0561) 和MluⅠ (Fermentas公司ER0081) 、T4 DNA连接酶 (Fermentas公司ER0041) ;琼脂糖 (美国Invitrogen公司) 。

1.2仪器

PCR仪 (美国Applied Biosystems公司) , 电泳系统 (美国BioRad公司) , UVIpro型凝胶成像分析系统 (英国Silver Uvitec公司) , Milli-Q型超纯水仪 (美国Milipore公司) , Thermo-I368超低温冰箱, 高速低温离心机 (德国heraus公司) , 恒温培养箱 (DNP-9082型上海精宏实验设备有限公司) , 微量离心机 (Thermo公司MICR017) 。

2方法

2.1 PAI-1 1100片断的扩增

按试剂盒操作提取人全血基因组DNA, 根据设计的引物PCR扩增目的基因组DNA, 1.1kb上游:5‘CGACGCGTGAGCCTAACTTTCC GACTG3’;下游:5‘GAAGATCTTCTGCCCTCTGCCTGTG3’, 反应体系:PCR mix25μL, 上游引物:1μL, 下游引物1μL, 模板DNA 10μL, dd H2O 13μL, 总反应体系50μL。反应条件:95℃, 预变性3 min, 95℃变性30 s, 55℃退火30 s, 72℃延伸5 min, 35个循环。取5 u PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳, 在紫外透射灯下观察电泳条带并用凝胶成像分析系统拍照[3]。

2.2 PUC19T-PAI-1 1100连接反应

获取表达载体的信息, 根据试剂盒操作进行连接反应。连接体系:PUC19T 1μL, solutionⅠ5μL, DNA产物:4μL, 总10μL, 16度连接3 h, 见图1、图2。

2.3 PUC19T-PAI-1 1100及PGL-3 Basic质粒的提取

将连接的PUC19T-PAI-1 1100及p GL-3 Basic转入大肠杆菌DH5a中。具体操作步骤如下:取3支100μL感受态细菌于冰上融化, 在其中2支分别小心加入连接产物, 另一支阳性对照, 轻轻混匀, 冰水浴30 min, 42℃热休克90 s, 快速冰浴5 min, 使其骤冷。加入800μL不含Amp的液体LB培养基, 37℃摇床150 rpm培养1 h。3000 rpm离心3 min, 弃上清, 余200μL液体使沉淀重悬, 涂布于含Amp的固体LB平板上, 待液体完全吸收后, 37℃恒温培养箱过夜培养。第2天挑取阳性克隆, 使用质粒小提试剂盒抽提质粒, 进行双酶切, 电泳鉴定后, 纯化PAI-1 1100片段和p GL-3 basic质粒, 获得目的质粒[4]。

2.4 p GL3 Basic-PAI-1 1100的连接

双酶切PAI-1 1100片断及p GL-3 Basic质粒, 取5μL琼脂糖凝胶分析后, 进行纯化回收, 再次电泳鉴定后, 根据试剂盒操作进行连接反应。连接体系:T4DNA Ligase 2μL, T4 buffer 1μL, DNA产物:13μL, p GL-3 Basic 4μL, 总20μL, 16度连接过夜。

2.5 p GL3 Basic-PAI-1 1100的转化:按2.3步骤进行。

2.6质粒小提试剂盒抽提质粒DNA并酶切鉴定, 待第2天观察连接转化的固体LB平板, 如果长出单个菌落, 挑菌摇菌小提后酶切初步鉴定。

3结果

实验证明, 扩增时DNA浓度问题, 感受态问题, 内切酶问题及连接产物质量比等都会导致实验室败。

3.1扩增条件及结果分析

扩增PAI-1 1100启动子片段, 并将之与PUC19T载体连接, 提取后酶切纯化, 获得目的片段。

3.2连接产物酶切纯化后电泳

见图3、图4。

3.3连接后转化

将酶切后的质粒与片段连接后, 经反复实验, LB平板上仍长不出菌斑 (图5) , 提示载体未与目的片段连接成功 (图6) 。

4讨论

基因重组技术是分子生物学的核心技术, 它从基因组DNA的提取, 载体的选择, 目的片段的扩增, 限制酶的切割, 载体的连接, 大肠杆菌的转化, 质粒的提取, 每一步都可能产生问题, 导致载体与目的片段不能正常连接, 现分析如下:

4.1①DNA模板量过大会导致PCR产物电泳出现多聚体 (图4) 在基因重组实验中, 基因组DNA的质量是后续所有实验的基础, 所以, 首先应保证提取高浓度的基因组DNA。人基因组DNA多存在于血白细胞内, 因此, 应从白细胞中提取高浓度的DNA。②胶回收问题, 如果切胶时目的片段切不完全, 或者切到杂带, 可能导致回收到的不是目的片段。切胶时, 要保证回收到目的片段, 而且胶不能再紫外线下暴露过长时间, 融胶时间不能太短, 以免融胶不完全, 堵塞柱子, 影响回收效率[5]。

4.2感受态问题, 由于使用效率不高的感受态, 造成空载 (图5) 。感受态细胞是处理后容易接受外来DNA进入的细胞, 因此, 应选择高效率的感受态, 才能使连接产物容易转化入感受态内。建议在铺板时同时取20μL感受态铺于Amp阴性LB平板上, 观察感受态生长状况, 确保没有因感受态问题影响实验进行。

4.3 LB平板的问题, 主要是铺板加入Amp时温度的问题, 加入Amp时温度过高, 就会导致Amp抗性失活, 从而导致克隆菌斑无法筛选出来 (图6) 。一般选择将消毒好的培养基放入60℃水浴锅中, 待培养基温度降至60℃时加入Amp, 以保证Amp的未失活。

4.4内切酶问题

①因公用buffer体积错误而导致酶切不开 (图7) 限制酶的选择非常重要, 酶切位点选择好后, 就要选择效率高的内切酶, 了解酶的特征, 注意双酶切时公用buffer的体积问题, 确定合适的酶切体系。可用两管质粒同时进行, 一管双酶切, 另一管先单酶切, 然后再用另一个酶单切, 判断酶切质量, 保证酶切效率[6]。②酶切时间问题, 酶切时间过长可能引起酶切太过, 导致酶切产物丢失 (图8) , 应根据试剂盒选择酶切温度及时间, 一般用16℃过夜或者37℃过夜, 其实酶切时间3 h就足够了。酶切完纯化回收后, 跑胶确定目的片段和载体回收回来, 确保目的片段及载体仍在。

4.5载体与目的片段的质量比问题

如果连接时载体量过大, 或者载体去磷酸化, 或者连接上其他目的片段的载体, 可能导致连接的不是目的片段 (图9) 。连接时一般载体和目的片段的比例是1∶ (3~10) , 如果连接时效率不高, 排除感受态问题后, 就要反复试验载体与目的片段的摩尔比, 最好电泳一下由亮度判断载体与目的片段大致体积, 或者测一下分别的浓度再选择用量。

经长期反复实验总结, DNA的提取及模板量, 胶回收, 感受态质量, 平板质量, 到内切酶用量及时间, 以及载体的连接整个过程都应时刻注意。但是, 由于一定的局限性, 我们对载体构建原理及应用, 实验结果分析的能力都有很大的不足, 因此, 我们应严格操作, 尽量避免实验中的各种问题才得出正确的结果 (图10) 。

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启动子探针载体 篇5

人载脂蛋白A-I(apolipoprotein A-I,apo A-I)是载脂蛋白A家族中的一种重要组分,主要作为高密度脂蛋白的配体参与胆固醇的逆向转运过程[6,7]。人载脂蛋白A-I主要在肝脏中进行合成与代谢,而apo A-I基因的表达主要受转录水平的调控,具有肝脏特异性[8]。这提示apo A-I启动子可能特异性地在肝细胞中启动外源基因的表达,从而实现肝病基因治疗的靶向性,同时降低基因治疗对非靶组织的毒副作用。

本研究通过PCR扩增apo A-I基因启动子序列,并将其克隆至绿色荧光表达载体p EGFP,构建肝靶向重组载体p AE。通过将重组质粒分别转染肝癌细胞株SMMC-7221和肺癌细胞株A549,以绿色荧光蛋白的表达为标志检测其转录活性的组织特异性。

1 资料与方法

1.1 材料

含有apo A-I启动子序列的载体p AI-W由美国贝勒医学院KAZUHIRO OKA副教授惠赠;绿色荧光报告载体p EGFP由本实验室构建及保存;人肝癌细胞株SMMC-7721由河南省医学科学研究所惠赠;人肺癌细胞株A549由本实验室保存;大肠杆菌TOP 10由郑州大学基础医学院赵国强教授惠赠。

T4 DNA连接酶、pfu DNA聚合酶购自Promega公司;Ex Gen500体外转染试剂,限制性内切酶Bam H I、Nhe I、Vsp I和Bgl II均购自Fermentas公司;Taq DNA聚合酶、DNA Marker和DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司;DMEM培养基购自Hy Clone公司;胎牛血清购自海克隆生物化学制品(北京)有限公司;引物合成及测序均由北京赛百胜公司完成。

1.2 方法

1.2.1 肝靶向性重组质粒p AE的构建

根据文献[7]及Gen Bank收录的apo A-I启动子序列(Gen Bank登陆号J04066)设计PCR扩增引物。上游引物(U290):5'-GAATTAATAGGGGAAGGGGATGAGTG-3'(下划线表示Vsp I的识别序列);下游引物(D209):5'-CCCTAGCTAGCGAGAAGAAGGGCCTGGCTGA-3'(下划线表示Nhe I的识别序列)。以质粒p AI-W为模板进行PCR扩增,产物用酚抽提-乙醇沉淀的方法进行纯化。

将纯化的PCR产物及p EGFP载体分别用限制性内切酶Vsp I和Nhe I消化,目的片段以琼脂糖凝胶回收试剂盒回收后进行连接,将apo A-I启动子定向插入到GFP报告基因上游。重组质粒分别进行酶切、PCR鉴定,阳性克隆进行测序。

1.2.2 重组载体的转染

肝癌细胞SMMC-7721和肺癌细胞A549在含10%胎牛血清的DMEM培养基和37℃、5%二氧化碳条件下常规培养。转染前16 h按1.2×104个/孔接种于96孔板,培养过夜,细胞贴壁生长到50%~70%融合时,用体外转染试剂Ex Gen 500将纯化的p AE及对照质粒p EGFP分别转染肝癌细胞和肺癌细胞:将0.3μg DNA溶解在20μL 150 mmol/L的Na Cl中,涡旋混匀,加入0.99μL转染试剂迅速涡旋10 s,室温温育10 min后,将Ex Gen500/DNA混合物加入培养基中。转染48 h后,倒置荧光显微镜进行观察。

2 结果

2.1 a po A-I基因启动子的P CR扩增结果

以p AI-W质粒为模板进行PCR扩增,经0.7%琼脂糖凝胶电泳显示,见图1:在500 bp处有特异性目的片段,与预期值一致(498 bp),同时图中未见其它非特异性扩增条带出现。

2.2 肝靶向性真核表达载体p AE的鉴定

酶切鉴定,见图2:将质粒用Vsp I/Nhe I进行双酶切,出现预想的两条片段。Vsp I、Nhe I、Pst I进行单酶切鉴定,实验结果与预想结果相同,说明质粒构建成功。

PCR鉴定,见图3:根据p EGFP载体序列设计鉴定引物G1(5'-CGTCGCCGTCCAGCTCGACCAG-3')。以酶切验证阳性的重组质粒为模板,以引物G1和引物U290进行PCR扩增,PCR产物的琼脂糖凝胶电泳分析见图2:在600 bp处有特异性目的片段,与预期值一致(581 bp),同时图中未见其它非特异性扩增条带出现,表明含有apo A-I启动子序列正向克隆至载体p EGFP。

测序:经酶切及PCR验证的阳性克隆送北京赛百胜公司进行测序,测序结果见图4。测序结果与Gen Bank数据库中的序列完全一致。

2.3 a po A-I基因启动子转录活性鉴定

将重组目的质粒p AE转染细胞48 h后进行荧光显微观察,在SMMC-7721肝癌细胞中有明显的绿色荧光,A549肺癌细胞中没有绿色荧光。转染带有CMV启动子的p EGFP对照质粒48 h后,SMMC-7721和A549细胞都呈现出较强的绿色荧光。上述结果表明,apo A-I启动子能够特异性启动绿色荧光蛋白在肝癌细胞中表达,而在肺癌细胞中不表达。

3 讨论

人apo A-I基因位于11号染色体长臂末端,对apo A-I 5'端上游基因组DNA序列分析结果表明,该序列缺乏典型TATA box,仅在-30~-24 bp区域有TATA盒样结构;特征的GC box存在于-250~-199 bp区域,该区域的缺失能显著降低启动子的转录活性[9]。apo A-I基因的在肝脏中的特异性表达属于转录调节机制,主要受位于-256~-41 bp区域的三个不连续肝脏特异性增强子的调控(-214~-192bp,-169~-146 bp,以及-134~-119 bp)[10]。因此,在研究中我们选择-290~+209 bp区域的作为apo A-I启动子克隆目标。由于绿色荧光蛋白具有灵敏性高,检测方便等优点,因此我们将apo A-I启动子克隆至绿色荧光报告载体中进行启动子转录活性研究。细胞实验发现,apo A-I启动子调控的绿色荧光蛋白只在肝癌细胞SMMC-7221中表达,而在肺癌细胞A549中不表达,这表明apo A-I启动子具有较强的肝细胞组织特异性,为肝组织靶向性基因治疗奠定了实验基础。

基因治疗的一个重要研究方向就是肿瘤的基因治疗[11,12]。肝组织特异性的apo A-I启动子不仅能在肝癌细胞中被激活,同时也可以在肝细胞中被激活,因此在杀灭肝癌细胞的同时,也可能造成对正常组织的损伤,这将严重限制其在肿瘤基因治疗中的应用。对于这个问题可以采用一定方式解决。一种方法就是使治疗基因具有肿瘤特异性,例如在RNAi研究中,采用具有肿瘤特异性的人端粒酶逆转录酶m RNA作为靶标。另外,在下一步工作中,我们还将对apo A-I启动子进行肿瘤特异性修饰,使其成为肝肿瘤特异性的启动子,为进一步探索不同肿瘤的靶向基因治疗提供基础。

摘要：目的构建载脂蛋白A-I启动子调控的肝特异性真核表达载体。方法PCR扩增载脂蛋白A-I组织特异性启动子序列,将其亚克隆至绿色荧光真核表达载体中。将重组载体以及对照载体转染肝癌细胞株SMMC-7221和肺癌细胞株A549。结果载脂蛋白A-I启动子调控的绿色荧光蛋白在肝癌细胞中表达,而在肺癌细胞中没有表达。CMV启动子调控的绿色荧光蛋白在两种细胞株中都呈现高效表达。结论载脂蛋白A-I启动子调控的绿色荧光蛋白可以进行组织特异性表达,成功构建具有肝靶向性的真核表达载体。

关键词：apoA-I启动子,肝癌,绿色荧光蛋白,基因治疗

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