分子影像探针(共6篇)
分子影像探针 篇1
1 研究背景
根据世界卫生组织于2014年2月4日世界癌症日发布的2014年《世界癌症报告》[1],癌症已经成为全世界人类的最大致死原因,而中国的癌症发病率已经居于世界首位。随着环境污染,食品安全等各种问题的涌现,人类健康受到很多来自外部环境的威胁,无疑加剧了各种癌症发生的可能。因此如果能实现癌症的早期诊断和个性化的诊疗是非常重要的,可以大大降低癌症的死亡率,同时也提高病人的生存质量。生物医学成像技术在癌症的各个临床阶段中正在发挥越来越重要的作用,包括癌症预测、筛选、指导活检、癌症的分期、转移、预后、治疗计划和复发等各个阶段[2]。目前采用的癌症成像技术有无创的X射线断层扫描(CT),磁共振成像(MRI),超声(US)、正电子发射断层扫描(PET)、单光子发射断层显像(SPECT)和光学成像(Optical imaging)等多种影像手段进行检测。然而,这些成像技术大多数不能用于微观层面上的检测。
与此同时,随着纳米技术的快速发展,越来越多的研究工作者开始利用纳米颗粒作为多模态分子影像探针的载体。以纳米材料作为多模态分子影像探针的载体具有下述几方面的优点:①高的比表面积,可以同时装载生物靶向分子和影像探针分子;②通过负载于纳米颗粒,可以有效改善生物靶向性分子的体内稳定性和探针分子的药代动力学;③适宜的尺寸,可以利用肿瘤组织的高通透性和滞留效应(EPR效应)被动靶向肿瘤,提高影像探针的利用率。目前人们已将现有的光学成像技术与先进的纳米粒子为基础的光学对比剂相结合,实现了高分辨率的活体肿瘤成像。其中,可发射荧光的光学纳米颗粒——量子点,已经应用于多种生物医学成像研究中。本文将主要介绍量子点在癌症成像和早期检测中的应用。
2 量子点的定义以及在成像方面的优势
量子点(Quantum Dots,QDs)是一类由Ⅱ/Ⅵ族或Ⅲ/Ⅴ族元素组成的,直径为2~10 nm,能够接受激光激发产生荧光的半导体纳米微晶体,具有纳米颗粒典型的量子效应和独特的光学特性。与传统的有机染料和荧光蛋白相比,量子点具有荧光强度高,不容易淬灭的特点;此外,其发射的荧光波长可以通过量子点的尺寸,化学组成和晶格结构改变,能够在可见光和红外区的大范围波段进行调制,因此,量子点在生物成像领域有着很多的应用,并且被广泛应用于癌症成像和早期诊断[3]。
3 量子点在癌症成像和检测方面的应用
3.1 细胞成像的应用
研究人员应用量子点在体外检测,标记固定的细胞和组织标本,以及活细胞成像等方面做了很多工作。通过将量子点进行不同类型的功能化,如耦合链霉亲和素,抗体,受体配体如表皮生长因子(EGF)或血清素,识别肽等,可以将量子点靶向标记到细胞表面的蛋白。比如,在很多乳腺癌中都有高表达的HER2受体,将HER2受体的抗体加入已固定的乳腺癌细胞SK-BR-3,就可以用连接了免疫球蛋白IgG抗体的量子点进行成像。也可以将量子点标记在链霉亲和素上,可以靶向结合了生物素的一抗,对乳腺癌细胞进行成像[4]。王贺宁等在量子点表面耦合了透明质酸,通过透明质酸和CD44受体的靶向作用,实现了对CD44受体高表达的乳腺癌细胞MD-MB-231和MCF-7的特异性成像[5]。
除了对固定细胞的成像,量子点的长时间稳定性和高荧光效率,也使得量子点在活细胞成像方面有很大的优势。阮刚等人使用Tat肽结合的量子点(TAT-量子点)来进行活细胞成像,观察了活细胞摄取纳米颗粒以及在细胞内的转运。实验结果表明,该肽偶联的量子点通过巨吞噬作用内化。Tat-量子点首先束缚到囊泡的内表面上,继而被细胞器捕获。此外,他们还发现,TAT-量子点可以与细胞膜上的结构,例如丝状伪足结合,而且包含QD的囊泡能够从丝状伪足的前端夹断。这些结果不仅为Tat肽介导的传送机制提供了新的解释,也可用于纳米粒子探针作为细胞内靶向和成像的发展[6]。
3.2 早期癌症检测
除了用于细胞成像,生物偶联的量子点也用于靶向标记生物组织样本,进行生物标志物的成像。特别是在免疫组织化学中使用的多色量子点探针,是临床上非常重要的应用。将4种不同颜色波长的量子点(565,605,655和705 nm)分别与4种不同的骨转移行为的肿瘤标志物N-钙粘蛋白,EF (延伸因子)-1,E-钙粘蛋白和波形蛋白进行耦合,可以对FFPE前列腺癌的病理组织切片进行多色染色。用图像处理软件分析CCD采集到的图像,通过分析不同颜色量子点的荧光强度,就可以得到对应的病理切片中不同的肿瘤标记物浓度[7]。
3.3 在体成像
肿瘤的在体成像面临着很大的挑战,需要敏感性好,特异性高的探针分子。目前的成像机制一方面是造影剂的被动靶向,即利用肿瘤诱导生成的血管通常结构都不稳定,并且有很大的内皮空隙。这些空隙可以允许大分子通过(≤400 nm),并且由于缺乏有效的淋巴引流,这些大分子可以在肿瘤的微环境聚集。这种增强的渗透保留效应,也叫EPR效应,使得纳米颗粒和纳米治疗剂在肿瘤成像中发挥了很多的作用。
另一方面,癌细胞表面表达的一些特异性的生物分子,如表面受体等,可以用做探针分子主动靶向的分子靶标。在成像探针的研究中,癌抗原(分子成像)的主动靶向在医学领域有了很多的发展,可以用来检测早期癌症及其转移。由于量子点具有很强的荧光信号,并且可以偶联多个分子,可以与多种抗原进行高敏感性和特异性的癌症成像。
2002年Akerman等人最早开展了这方面的工作。他们将量子点与肿瘤细胞和肿瘤血管的亲和性肽进行偶联,通过静脉将这些探针注射进入负载乳腺癌肿瘤的小鼠后,组织切片的显微荧光成像表明量子点可以特异性标记宿主的肿瘤血管系统[8]。之后Gao等人将量子点靶向肿瘤,进行了动物全身尺度的成像。通过将量子点与针对前列腺特异性膜抗原(PSMA)的抗体偶联,静脉注射到荷人类前列腺癌的小鼠皮下,成像结果显示注射了主动靶向量子点的的肿瘤荧光比注射非靶向量子点的荧光信号显著增强[9]。用同样的方法,Yu等人将甲胎蛋白抗体偶联至量子点,能够主动靶向小鼠的肝癌模型[10]。Cai等则采用量子点标记了整合素靶向肽RGD,显著增强了人脑胶质瘤肿瘤对量子点的摄取[11]。
细胞毒性和量子点在标记细胞过程中对细胞和动物体潜在的干扰是目前量子点的应用过程中的主要问题。目前最常使用的量子点的化学成分中含镉等有毒重金属原子[12],而二价镉是有肾毒性的,因此利用量子点进行活细胞和动物的成像具有很大的争议。虽然这些重金属元素被掺入到量子点的核里,外层包裹了生物惰性的硫化锌和稳定的聚合物,但这些在临床上使用作为造影剂是否安全,还需要进一步的考察。由于发表的文章中用了多种不同的合成,增溶和功能化的方法,因此量子点的毒性问题比较复杂。很多文献当中并没有发现量子点在使用的浓度和实验过程中对细胞活力、形态、功能或发育不良的影响(从数小时至数天)。然而也有一些研究工作在较高浓度时,观测到了对胚胎发育的影响[13]。因此,量子点并不能说是完全无害的,但应该存在一个安全剂量范围,使得量子点的应用过程中不影响生物体活性。现在有很多工作通过改变量子点的成分,合成出了不含镉等有毒重金属的量子点,如Ag2S,CuInS2量子点等,大大降低了量子点的毒性,生物相容性有了很大的提高。
4 未来趋势
在临床应用中,往往需要对多个诊断指标的联合分析,才能够对疾病进行比较精确的诊断。而单一模态无法提供病灶的全面信息,若单独进行各个模态的成像则需要对患者分别注射影像制剂,进行多次成像,对患者将是一系列的痛苦。如果能有一体化的多模态的分子影像探针,仅需注射一次影像制剂,就可在多模态的成像仪器上一次性得到多个模态的影像结果,充分发挥不同成像模态的优势,获得全方位的更精确的疾病信息。这将大大减少患者的痛苦,对医生也省去了很多工作。因此发展一体化的多模态探针是分子影像探针领域的一个新趋势。
近年来,已经陆续有一些结合了不同成像模态的分子影像探针被报道。例如2010年,Kimura等人将Cy5.5近红外染料和64Cu-DOTA共价连接到Knotiin Peptide上,实现了整合素的特异性标记和小鼠的全身成像[14]。Ting等人将18F和近红外染料结合到Lymphoseek即DTPA修饰的右旋糖苷上,实现了受体特异性的前哨淋巴结(SLN)的成像[15]。将耦合血卟啉的组氨酸螯合99Tcm则可做成荧光/同位素双模态探针的活体成像[16]。
与小的有机荧光分子比较,量子点具有大表面积,因此可以通过多功能的化学修饰来做成双模态或多模态的探针。比如将量子点与其他成像剂(例如,放射性核素或顺磁性探针)和治疗剂(例如,抗癌药物),通过化学连接或通过简单的物理方法连接,从而可以得到多功能纳米结构,实现多模态成像和成像治疗一体化。目前利用量子点制备的双模态探针已有报道。2007年,Schipper等人用64Cu标记800 nm和625 nm波长的氨基-PEG商业化的量子点,量化地研究了量子点在小鼠体内的全身性的分布,实现了PET和荧光的双模态成像[17]。2008年,Ducongé等人将18F标记在磷脂胶束的量子点表面,实现小鼠全身的双模态成像[18]。这两个工作作为将PET同位素和量子点结合的双模态探针最早的尝试,提供了双模态在体成像的可能。也有研究者将InP/ZnS量子点作为核,外围连接MRI分子探针Gd,做成MRI/荧光量子点双模态探针,细胞穿透肽的连接则促进了纳米颗粒进入细胞进行双模态成像[19]。Farokhzad等人报道了将量子点,核酸适体,和小分子抗癌药物阿霉素(DOX)结合的的三元体系,实现了在体外的靶向成像,治疗和传感药物的释放[20],从而使量子点可以作为成像治疗一体化的探针。
此外,由于传统量子点含有有毒重金属成分,因此发展新型的低毒性量子点也是未来的趋势。王强斌课题组合成了量子产率更高、生物相容性更好、尺寸均匀可控的Ag2S近红外量子点,细胞成像实验结果表明,通过在量子点表面修饰不同的特异性生物分子,可实现对不同细胞系进行特异性标记。通过系统的细胞生物安全性评价,包括细胞增殖、坏死和凋亡、活性氧和DNA损伤实验等结果表明,Ag2S近红外量子点几乎没有细胞毒性[21]。此外,高明远等人合成出了CuInS2等量子点,也提高了量子点的生物相容性。同时还合成出了掺Mn的量子点,从而可以进行MRI和荧光的双模态成像,实现了低毒量子点的双模态成像应用[22]。
5 总结
作为一种新型的荧光探针,量子点已经在生物医学成像和癌症检测的领域有了很多的应用。量子点不会取代传统的荧光分子或荧光蛋白融合技术,但量子点的多种优良特性比如更好的耐光性,近红外区域的光谱,以及长时间的单分子灵敏度,将很好地补充传统荧光技术的不足。量子点技术的发展,将可以大大地提高生物成像和检测的能力。
致谢
该项目由国家重大科学仪器专项(2011YQ030114),国家基础研究计划973项目(2011CB707500),国家自然科学基金(11104058),和河北省自然科学基金(A2011201155)支持。
分子影像探针 篇2
1纳米探针的概述
纳米材料是指一维空间尺寸 <100 nm的一类材料[3],由于其特殊的体积及结构使其具有一些特殊性质,例如表面活性好、表面可修饰性强、低毒性、催化能力高以及不易受体内和细胞内各种酶降解等。近年来,纳米技术在生物医学领域得到了广泛应用,如药物研发、生物显像、疫苗制备等,其中纳米材料在分子影像学领域的研究受到广泛且深入的关注。纳米材料的种类非常丰富,用于分子影像学研究领域的纳米材料可分为有机和无机两大类,其中有机纳米材料包括树状聚合物、脂质体、胶团、铁蛋白等;无机纳米材料包括量子点、氧化铁、金纳米颗粒、超顺磁稀土离子等。
纳米探针到达靶组织或细胞的机制可分为被动靶向和主动靶向两种。被动靶向机制是由于肿瘤组织中的血管与正常组织血管不同,其血管内皮细胞之间存在600~800 nm的空隙,且肿瘤组织间淋巴回流不畅,从而形成了增强的通透与滞留效应,纳米颗粒通过血管内皮细胞间隙进入肿瘤组织中,可实现被动靶向运输。主动靶向机制是指将靶向配体、抗体耦联于纳米载体,使其靶向定位于特异性表达或过度表达某种受体或抗原的肿瘤组织中,通过主动靶向运输提高药物的运载效率[4]。
2纳米材料及其特点
2.1量子点量子点(quantum dots,QD)具有独特的光学特性,具有可调的荧光发射波长,荧光发射范围可覆盖波长300~2400 nm的波段,而且可以实现一元激发,多元发射,光化学稳定性好,荧光寿命较长,此外QD具有尺寸较小,体内循环时间长,对肿瘤具有很好的被动靶向效果等优越性质,使得QD作为荧光纳米探针最先被用于活体荧光成像的研究中[5]。但是QD纳米颗粒的荧光显像目前还仅限于小动物研究阶段,要用于人体内分子成像研究还需要解决一些技术问题,如荧光信号穿透性差,QD运输效率较低,因此需要开发颗粒更小、多模态的荧光QD,以利于其临床转化。
2.2超顺磁性氧化铁纳米颗粒超顺磁性氧化铁纳米颗粒(superparamagnetic iron oxide nanoparticles,SPIONs)是应用较广的磁性MRI探针,也是MRI分子影像学发展的新方向。SPIONs在生物体内主要分布于网状内皮细胞丰富的组织和器官,如肝、脾、淋巴结和骨髓等,有助于提高以上部位肿瘤与正常组织的MRI成像对比度,同时由于其高效、安全等特点,具有较强的临床转化潜力,可用于各种肿瘤及其他疾病的检测。但由于SPIONs本身没有特异性,因此有必要在SPIONs表面修饰靶向小分子、多肽或抗体等,从而达到靶向分子显影的目的。
2.3纳米金颗粒纳米金颗粒(gold nanoparticles,Au NPs)具有形态及尺寸可控、表面化学性质温和以及生物相容性好等特点,加上其独特的等离子表面吸收和光散射等物理特性在分子成像方面引起广泛关注。与传统的CT对比剂比较,Au NPs具有以下优点:1较高的原子序数、电子密度以及X线吸收系数,理论上能够提供更加优越的CT对比性能;2无细胞毒性;3表面容易被靶向蛋白、特异性生物标志物等修饰,从而设计一系列能够被不同成像设备显像的分子探针;4正常人或动物体内几乎不含金元素,且金元素容易通过电感耦合等离子体质谱这一常用的元素分析法进行定量和表征,从而更好地与影像学结果进行验证。这些特点使Au NPs日益成为最具潜能的CT分子成像对比剂[6]。
3 多模态分子影像的意义
分子影像技术包括放射性核素显像,如正电子发射断层扫描(positron emission tomography,PET)和单光子发射计算机断层扫描(single photon emission computed tomography,SPECT)、MRI、磁共振 频谱成像(magnetic resonanceimaging,MRS)、光学成像(optical imaging,OI)和超声等。每种显像方法都有各自的优点和缺陷,如PET和SPECT具有高敏感性和可定量分析的优点,但空间分辨率较差;MRI的空间分辨率高,尤其是软组织分辨率好,但敏感性相对减低;OI可以敏感、实时观察活体内的细胞和分子功能,但其采用的近红外光组织穿透性较差,适用于小动物或浅表器官的显像,难以向临床转化[7]。
多模态显像是通过对多种成像技术的联合应用实现优势互补,同时提供高特异性的功能成像信息和高灵敏度、高对比度的解剖成像信息,能够为早期诊断肿瘤提供更加精确、全面的信息。多模态显像是目前分子影像学的研究热点,其中PET/CT和SPECT/CT已经广泛用于临床,PET/MRI也已经面世。多模态分子影像成像的发展对分子探针的设计制备提出了更高的要求,需要构建多靶点、多功能分子探针,以实现多个靶点的同时识别及多种成像技术的联合应用,从而提高肿瘤影像诊断的准确度和灵敏度[8]。多模态分子探针的基本要求包括:1与靶分子具有高度的特异性与亲和力;2具有良好的通透性,能够穿过生物屏障,如血管、细胞膜等,高效、高浓度到达靶细胞;3具有良好的生物相容性,不会引起机体明显的免疫反应,在活体内保持相对稳定,在血液循环中有适当的清除期;4能与多种影像信号分子耦联,并在一定程度上将需要探测的信号进行放大便于成像。
4 放射性核素标记纳米探针在多模态显像中的应用
用于多模态肿瘤显像的放射性核素标记纳米探针由3个主要部分组成:纳米颗粒核心,放射性核素及生物靶向分子。其中放射性核素可以直接标记在纳米颗粒的表面,也可以通过链接物间接标记在纳米颗粒上。链接物可以是一个羟链、一段多肽或一个聚乙二醇单位。纳米颗粒还可以通过螯合剂,如1,4,7- 三氮环壬烷 -1,4,7- 三乙酸(1,4,7-triazacyclononane1,4,7-triacetic acid,NOTA)、1,4,7,10- 四氮杂环十二烷 -1,4,7,10四羧酸(1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid,DOTA)、二乙撑三胺五乙酸(diethylene triamine pentaaceticacid,DTPA)等与64Cu、89Zr、111In等放射性核素进行标记[9,10]。纳米颗粒由于其独特的优势已广泛用于肿瘤的分子影像学研究,随着各种融合影像设备的发展,多模态纳米探针近年来也得到突飞猛进的发展。
4.1 PET/ 近红外荧光显像(near-infrared fluorescence,NIRF)与SPECT/NIRF双模态显像NIRF可以在活体内实时、无创地监测疾病的分子变化水平[11]。NIRF的优点包括空间分辨率高、敏感性高、对活体生物没有电离辐射。但是由于NIRF采用的近红外光组织穿透性差,难以用于临床,PET和SPECT可以提供组织穿透性强和可定量分析的图像,因此将PET或SPECT与NIRF显像融合可以弥补各自的缺陷。
Cai等[12]将能够靶向结合肿瘤细胞及新生血管表皮整合素αVβ3的精氨酸 - 甘氨酸 - 天冬氨酸(arginine-glycine-asparticacid,RGD)多肽与螯合剂DOTA连接在QD表面,并用正电子核素64Cu标记DOTA-QD-RGD,然后用PET/NIRF显像对荷人胶质瘤U87MG裸鼠进行显像和定量分析。结果显示,在注射显 像剂后1~25 h,U87MG肿瘤对64Cu-DOTA-QDRGD都有良好的摄取,PET和NIRF显像的定量研究也显示出良好的线性相关。在随后的另一项研究中,Chen等[13]用靶向肿瘤新生血管的血管内皮生长因子(vascular endothelialgrowth factor,VEGF)取代RGD肽,构建了另一种双模态纳米探针64Cu-DOTA-QD-VEGF,PET和NIRF显像都显示出U87MG肿瘤对64Cu-DOTA-QD-VEGF的摄取明显高于对64Cu-DOTA-QD的摄取。
在另一项研究中,Zhang等[14]用聚乙二醇包裹的交联聚合物胶团(core cross-linked polymeric micelles,CCPM)与111In标记的膜联蛋白A5(annexin A5)结合,合成SPECT/NIRF IRF双模态纳米显像剂111In-DTPA-A5-CCPM。活体显像显示在化疗诱导凋亡的荷瘤动物组中,肿瘤对显像剂的摄取明显高于未经治疗的对照组。此外肿瘤对111In-DTPA-A5CCPM的摄取也显著高于111In-DTPA-CCPM。放射自显影和免疫组化证实了111In-DTPA-A5-CCPM的摄取与肿瘤切片中半胱天冬酶 -3(caspase-3)分布的位置一致。Liang等[15]用链霉亲和素纳米颗粒为载体合成SPECT/NIRF双模态探针,这个新型纳米探针由3个生物素化的部分组成,包括靶向肿瘤细胞的抗人表皮生长因子受体 -2(human epithelial growthfactor receptor 2,HER2)的抗体赫赛汀(Herceptin),用于111In放射性标记的螯合剂DOTA以及用于NIRF显像的荧光基团Cy5.5,通过链霉亲和素载体将这3部分组装在一起。SPECT和NIRF显像结果均显示111In-DOTA/Cy5.5/Herceptin纳米颗粒具有良好的生物体内分布,肿瘤 / 正常组织比值很高,在注射后40 h,肿瘤的放射性摄取达到21 ID%/g,明显高于肝脏、心脏、肾脏、脾脏和肌肉等正常组织。因此推测链霉亲和素作为构建肿瘤多模态显像探针的载体具有巨大的潜力。
4.2 PET/MRI与SPECT/MRI双模态显像MRI的时间分辨率和空间分辨率很高,尤其是软组织分辨率高,因此在神经、骨骼、肌肉以及其他系统肿瘤的诊断方面具有优势,然而MRI的敏感性比放射性核素显像的敏感性低,因此近年来,PET或SPECT与MRI融合显像也得到越来越多的关注。有研究者将RGD肽和DOTA螯合剂联接在氧化铁(iron oxide,IO)纳米颗粒上,然后用64Cu进行标记,将新合成的纳米探针64Cu-DOTA-IO-c(RGDy K)用于荷U87MG裸鼠的PET/MRI显像,结果发现在尾静脉注射显像剂后1~21 h,肿瘤对64Cu-DOTA-IO-c(RGDy K)的摄取都明显高于未联接RGD肽的64Cu-DOTA-IO;将RGD肽与64Cu-DOTA-IO-c(RGDy K)同时注射于动物体内,发现肿瘤的放射性摄取显著减低,提示64Cu-DOTA-IO-c(RGDy K)是特异性结合于肿瘤细胞的。同时T2WI显示,在注射显像剂后4 h,肿瘤部位的信号明显减低,肿瘤的病理切片也显示MRI上的低信号部位有铁染色,进一步证实了MRI与PET显像结果的一致性[16] 。在另一项研究中,Kim等[17]用一种肿瘤靶向分子齐墩果酸(oleanolic acid,OA)与螯合剂NOTA、氧化铁纳米颗粒(IONP)联接,并用68Ga进行标记,制成PET/MRI双模态分子探针68Ga-NOTA-OA-IONA。体外实验显示结肠癌HT29细胞能特异性摄取68Ga-NOTA-OA-IONA,同时68Ga-NOTA-OA-IONA对HT29还有一定的抑制作用。随后对荷结肠癌HT29裸鼠模型进行活体内PET和MRI显像,结果进一步证实肿瘤部位能够摄取显像剂68Ga-NOTA-OA-IONA,并且PET与MRI显像结果一致。
Misri等[18]将111In标记的抗间皮素抗体(111In-m Ab MB)与SPIONs结合起来,形成SPECT/MRI的双模态纳米探针。生物分布实验结果提示,内皮素阳性的A431K5肿瘤能够特异性摄取111In-m Ab MB-SPIONs ;MRI显像与生物分布实验结果一致,注射显像剂后肿瘤部位的信号发生了明显变化。
4.3 PET/MRI/NIRF与SPECT/MRI/NIRF多模态显像Xie等[19]用多巴胺修饰氧化铁纳米颗粒表面,并与人血清白蛋白相联接,然后分别用放射性核素64Cu和荧光染料Cy5.5进行标记,从而形成一种新型PET/MRI/NIFR多模态分子探针,并且用荷U87MG瘤裸鼠模型进行PET/MRI/NIFR多模态显像。NIRF显像结果显示,在注射显像剂后1 h就可以清楚看到肿瘤显影,并且肿瘤的荧光强度随时间延长而增高。1 h的肿瘤 / 肌肉比值为1.98±0.20,4 h升至2.52±0.27,18 h继续升高至3.08±0.28。PET显像也显示在注射后不同时间点肿瘤的摄取逐步上升;与NIRF相比,根据PET图像定量分析计算的肿瘤 / 肌肉比值更高,这主要是因为PET图像上的本底更低。MRI图像显示在注射显像剂后18 h,肿瘤部位的信号明显下降,而且MRI显示肿瘤部位的显像剂分布不均匀。此外,在肝脏中也发现大量的显像剂聚集。
Hwang等[20]报道了用钴 - 铁素体纳米颗粒联接AS1411适配子制备多模态纳米探针MFR-AS1411,其中AS1411能靶向定位于肿瘤细胞膜表面高度表达的核仁蛋白,用红色荧光染料罗丹明包裹该纳米颗粒,并通过螯合剂与放射性核素67Ga标记。该纳米颗粒在核仁蛋白表达阳性的C6细胞中表现出特异性的荧光信号,随着MFR-AS1411纳米颗粒浓度的增加,细胞中罗丹明荧光强度及67Ga放射性活度都随之增高。活体SPECT显像提示注射显像剂后,肿瘤部位出现特异性的摄取。活体MRI显像及离体光学显像的结果与SPECT显像结果匹配良好,在注射纳米探针前后分别对荷瘤鼠进行MRI扫描,显示肿瘤部位的信号显著增高。
5 展望
以放射性核素标记纳米颗粒为基础的多模态分子新探针和多模态影像技术的开发不断提高了对肿瘤发生、发展机制研究的水平,推动了肿瘤诊断和治疗的发展,具有广阔的临床应用前景。但是目前多模态纳米分子探针还存在以下一些问题亟待解决:1纳米颗粒在肝脏、脾脏等网状内皮系统(reticuloendothelial system,RES)中的摄取是影响活体显像效果的主要因素,纳米颗粒的理化特征如尺寸、极性、弹性及表面电荷都会影响其在活体内的生物分布和清除。直径 <6 nm的球形纳米颗粒容易通过肾脏系统排出,直径4~8 nm的纳米颗粒会很快被RES摄取,并通过肝胆系统排泄[21]。因此,相对较小的纳米颗粒在RES中的摄取更低,可以获得更高质量的图像。2放射性核素,特别是一些金属离子,可能会与纳米颗粒表面修饰的螯合剂或者聚合物脱离,从而导致正常器官对游离放射性核素的摄取,降低肿瘤的特异性摄取。因此在设计放射性标记多模态纳米探针时,需要考虑其在活体内的稳定性[22,23]。3为了提高分子探针在肿瘤组织中的特异性结合能力,需要谨慎地选择靶向肿瘤的成分,如多肽、抗体等。4在设计放射性核素标记多模态分子探针时,还需要认真考虑纳米探针的生物安全性,在纳米探针用于人体临床研究之前,需要深入研究其潜在毒性,一些无机的含有重金属如钆、镉的纳米颗粒已经被证实有一定的毒性,另外,一些以碳为基础的纳米颗粒也显示出一定的生物毒性[24,25]。总体而言,具有生物相容性的有机纳米材料比重金属、无机的纳米材料更适合用于人体研究。
分子影像探针 篇3
1 3-或4-取代的7-羟基香豆素类
香豆素的基本结构苯并吡喃酮并没有荧光, 但如果在7-引入推电子基团, 3-或4-引入吸电子基团, 形成推-拉电子体系, 便得到强荧光物质[7]。3-或4-取代的7-羟基香豆素类可以采用Pechmann和Knoevenagel合成, 以间苯二酚、苯甲酰乙酸乙酯和一水硫酸氢钠混合均匀, 至于微波反应器上回流 (400W, 8 min) , 经后处理得到深绿色固体4-苯基-7-羟基香豆素 (1) 。类似地, 3-乙酰基-7-羟基香豆素 (2) 和3-乙氧羰基-7-羟基香豆素 (3) 按如上方法可得, 通过3-或4-引入不同吸电子基团, 表现出不同荧光性质, 用于荧光探针的研究[8]。合成路线如图1:
2 4-甲基-8-甲酰基-7-羟基香豆素类
文献报道通过改变香豆素荧光团上的识别基团, 可以形成具有不同识别功能的荧光探针, 如香豆素类金属离子和阴离子探针[9,10]。以乙酰乙酸乙酯和间苯二酚为起始原料, 在一水硫酸氢钠的催化作用下, 微波加热反应, 得4-甲基-7-羟基香豆素, 随后与六亚甲基四胺在乙酸为溶剂的条件下反应, 水解得4-甲基-8-甲酰基-7-羟基香豆素 (4) 。通过在香豆素环中引入羟基和醛基, 醛基与CN-反应产生强烈荧光, 有望用于CN-的检测。合成路线如图2所示[11]。
3 7-氨基-4-甲基香豆素类
具有7-氨基取代的香豆素类化合物是重要的荧光物质, 因易与肽链末端的羧基缩合生成酰胺键, 生成多肽-香豆素的荧光底物, 在免疫检测、多肽合成上有重要用途。以间氨基苯酚和氯甲酸乙酯为起始原料, 得到的无色针状结晶与乙酰乙酸乙酯悬浮于70%硫酸中反应, 最后得到7-氨基-4-甲基香豆素 (5) 。合成路线如图3所示[12]。
4 结束语
随着香豆素类化学、合成化学、荧光化学的发展, 可望有更多的香豆素类衍生物的活性被认识和发现。寻找有效的骨架构建出高效低毒的荧光探针分子来研究人类生命过程, 从而为疾病治疗奠定基础, 俨然已经成为药物研发的重要方向之一。显然, 香豆素类化合物为其提供了一个新的途径。
参考文献
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分子影像探针 篇4
肿瘤是目前严重危害人类健康的疾病之一, 虽然随着科技的进步, 现代医学对肿瘤的诊断水平不断提高, 但是肿瘤患者的5年生存率和生活质量仍不太理想, 其中最重要的原因之一是缺乏从分子水平获得早期肿瘤诊断信息的方法。目前, 临床上对肿瘤的诊断主要依赖于临床症状、血清学检查、常规影像学检测等方法, 如X线、X线计算机断层摄影 (CT) 、放射性核素显像、磁共振成像 (MRI) 和超声诊断 (US) , 但是肿瘤发病的早期症状隐匿, 血清学检测特异性较差, 常规的影像学检查手段虽然有许多优点, 但从分子水平进行早期诊断还存在许多不足之处, 因此, 如何从分子水平对肿瘤的发生发展进行早期诊断就成为目前研究的热点。
最新研究表明, 光学分子成像技术 (Optical Molecular Imaging) 将成为未来诊疗技术发展的新方向, 是继传统的分子成像方式之后, 又一新的影像技术, 将成为临床医生的好助手。其原理是利用生物发光、荧光蛋白或荧光染料, 标记在体生命大分子, 进行定性和定量研究, 与磁共振、核素成像等技术相比, 具有无创性、高敏感性、成像价格低、特异性强等优点[1]。光学分子成像技术主要分为以下几大类:荧光成像 (Fluorescence Imaging, FMI) 、生物发光成像 (Bioluminescence Imaging, BLI) , 拉曼成像 (Raman Imaging, RI) , 光声成像 (Photoacoustic Imaging, PAI) , 活体显微镜 (Intravital Microscopy, IVM) 和光频域成像等 (Optical Frequency Domain Imaging, OFDI) , 其中目前应用最为广泛的是FMI和BLI[2]。
光学分子探针是光学分子成像技术的核心理论和方法, 是进行分子影像学研究的先决条件。广义的分子探针是指能在机体内某些部位聚集, 并产生影像学信号可供体外设备检测的物质。理想的分子探针具有的生物学特性有[3]: (1) 与靶向分子有高特异性和亲和力; (2) 分子量较小, 容易穿过机体内的生理屏障, 并能反映体内靶向分子的数量及空间分布; (3) 无毒副作用及免疫排斥反应、性质稳定和血液清除速度快; (4) 容易制备合成。
2 光学分子探针的分类与结构
根据探针的作用原理, 光学分子探针分为:非特异性光学分子探针、可激活光学分子探针和特异性光学分子探针[4]。
2.1非特异性光学分子探针
非特异性光学分子探针通常是指一些小分子游离荧光基团, 经血管裂隙分布于细胞外组织中, 由于病变和正常组织的灌注率或血管通透性不同, 非特异性探针进入病变组织和正常组织的数量明显不同, 因而可根据不同的光学分子影像进行靶向目标的识别, 但这种探针对靶向目标缺乏特异性, 导致目标-背景信噪比低, 成像效果差[5]。
2.2 可激活光学分子探针
可激活光学分子探针也称作智能探针, 其在初始状态下不发出光学信号, 而一旦达到靶向目标被特定的生化或物理因子激活后即可发出强烈的光学信号而被检测[6]。
2.3 特异性光学分子探针
特异性光学分子探针又称为靶向性探针, 是指与靶向目标具有亲和性的配体经过特定方法与生物素和荧光素等对比剂连接而组成。特异性光学分子探针由三部分组成:报告基团 (Reporter Group) 、连接基团 (Spacer) 和识别基团 (Receptor) , 部分探针可不含有连接基团, 且连接基团和识别基团连接后不应当影响识别基团的生物活性[7]。
2.3.1 报告基团
也称作信号基团, 其作用是可以快速地富集在体内某一部位而被光学成像设备检测到信号。光学分子探针常见的报告基团有荧光素、荧光染料和量子点 (Quantum Dots, QDs) 等。
2.3.2 连接基团
也称作连接体, 是指连接报告基团和识别基团的部分, 因报告基团和识别基团一般结构较为复杂, 两者如相距太近可能会导致彼此生物活性的改变, 因此连接体可以减少信号基团和识别基团之间的相互反应。更为重要的是, 连接体可以优化探针的药物代谢动力学特性。连接基团通常会对探针和靶向目标蛋白的结合产生重要影响, 其长度、亲水性及所带电荷等方面都是影响探针活性的关键因素[8]。常用的连接基团有长链烷基和聚乙二醇等。长链烷基可以改善分子探针的脂溶性, 有利于探针进入细胞;聚乙二醇则可改善分子探针的水溶性, 有利于减少探针和非靶向目标蛋白的非特异性结合。脂溶性好的分子探针一般经过肝胆系统代谢, 而水溶性好的分子探针一般通过泌尿系统清除[9]。
2.3.3 识别基团
也称作靶向基团, 是指可以识别靶向目标蛋白并与之紧密结合, 形成蛋白-探针复合物, 是整个探针的核心部分。目前, 科学家已经开发出多种靶向基团, 包括抗体、多肽和小分子化合物等[10]。
2.3.3.1 抗体
抗体因为可以产生理想的配体-受体结合反应, 且对靶向目标有极高的特异性及亲和性, 作用机制明确, 因此被广泛批准应用于临床。如前列腺特异性膜抗原 (Prostate-specific Membrane Antigen, PMSA) 在前列腺癌的诊断、治疗及预后评估等方面都发挥着重要作用, Liu等[11]应用PMSA抗原抗体成功制备了Cy5.5-CTT-54.2特异性近红外荧光探针, 经实验表明可被用于前列腺肿瘤的靶向体外光学成像。但是抗体分子量较大, 影响了探针的组织穿透力, 异种抗体容易诱导机体产生不良的免疫反应, 并且体内代谢缓慢, 这些缺点限制了其在临床上的应用[12]。为了改善上述不利因素, 抗体片段被开发应用, 大大改善了探针的药代动力学特性, 但此类探针相对于完整的抗体, 其制备工艺更加复杂, 价格昂贵, 目前临床上应用较少[13,14]。
2.3.3.2 多肽
多肽是多个氨基酸残基组成的肽段。小分子多肽有许多优点: (1) 易于化学合成, 克服了抗体异源性问题; (2) 制备技术可控, 能够保证探针的物理化学及生物性能; (3) 具有高度亲和力; (4) 分子量小, 可以较容易地通过生理屏障, 血液清除速度快[15,16]。因此小分子多肽可以作为理想的探针应用于光学成像。有些肿瘤可以高表达某些受体, 而表皮生长因子 (EGF) 、奥曲肽等天然多肽能够与这些受体特异性的结合, 可用于肿瘤的检测。王可铮等[17]用近红外荧光染料Cy5.5标记EGF合成了探针 (Cy5.5-EGF) , 对乳腺癌裸鼠移植瘤模型进行活体光学成像, 表明探针Cy5.5-EGF可以与乳腺癌细胞表面的表皮生长因子受体 (EDFR) 特异性结合而用于乳腺癌的靶向诊断。Lanzardo等[18]应用近红外荧光染料标记RGD环肽作为光学探针, 用来评价整合素αvβ3受体高表达的U87MG胶质母细胞瘤细胞移植裸鼠模型, 体外和体内实验都证实, 在U87MG细胞中RGD环肽与αvβ3整合素受体具有较高的特异性和亲和力, 表明NIRF-RGD能灵敏而特异地探测胶质母细胞瘤。但是随着研究的深入, 天然多肽已经无法满足分子影像学的需求, 因此开发针对不同肿瘤、不同表面抗原更具特异性的多肽已成为当今研究的热点。
Smith等[19]于1985年报道了外源多肽在单链噬菌体表面表达的现象, 从而使噬菌体展示文库技术成为筛选肿瘤特异性多肽重要的工具并迅速应用。Chen等[20]应用噬菌体展示文库技术筛选得到恶性神经胶质瘤U87MG细胞系导向肽CGNSNPKSC九肽序列, 命名为GX1, 并用近红外荧光染料Cy5.5标记此多肽制备成了Cy5.5-CGNSNPKSC特异性光学分子探针, 经体内体外实验证实, 该探针能特异性的与U87MG肿瘤结合, 可用于恶性神经胶质瘤的靶向诊断。小分子多肽虽有许多优点, 但其在体内易降解, 部分靶点未知等缺点也是目前亟待解决的问题。
2.3.3.3 小分子化合物
某些小分子化合物如叶酸、双磷酸盐等能够和肿瘤细胞膜表面一些特异性受体靶向结合, 可以作为特异性靶向探针的识别基团。如叶酸受体 (FR) 可在大部分恶性肿瘤, 如卵巢癌、子宫癌、睾丸癌、肾癌、结肠癌等表面过量表达, 叶酸 (FA) 可与叶酸受体特异性结合从而用于检测相关恶性肿瘤。邓大伟等[21]成功制备了叶酸-PEG-ICG-Der-01近红外荧光靶向探针, 并与过度表达叶酸受体的肿瘤靶向结合, 定位准确, 说明该探针具有肿瘤靶向的特性, 对肿瘤的早期诊断有十分重要的意义。但小分子化合物易受体内原有分子的影响, 显像基团标记化合物后药代动力学可能会有改变。
3 靶向光学分子探针设计的基本原则
光学分子成像探针可以看作是药物的一个亚类, 因此传统药物设计时所用到的知识和经验, 可以用于光学分子成像探针的设计。分子探针的理化性质, 如电离常数 (p Ka值) , 脂溶性的和稳定性, 被普遍认为是影响探针在体内的药代动力学的关键因素, 包括探针的吸收、分布、代谢和排泄。因此在成像探针的设计和开发初期应当认真考虑这些问题。分子探针的电离作用和溶解度与细胞膜的通透性密切相关。许多分子成像探针含有不同的离子基团, 在生理p H值范围内带有不同的电荷, 分子探针的总电荷或电荷分布会影响其在体内的溶解度, 渗透性以及与活性位点的亲和性。
3.1 生物特异性与生物活性策略
为了设计出靶向特异性光学分子探针, 识别基团应当能够与靶向目标特异性结合, 而不与背景组织结合[22]。而且由于分子探针结构中既包括核心部分识别基团, 也包括连接基团和报告基团, 合成后得到的分子探针其生物学特性可能发生改变。因此在合成探针以前, 应当对探针结构的各个组成部分与生物活性之间进行构效关系研究, 在不改变探针各部分生物学活性的情况下再进行探针的合成[7]。
3.2 药代动力学策略
传统的靶向分子探针无论是否与靶向目标结合均能发出信号, 导致目标-背景信噪比较低, 成像效果不佳, 必须经过一段时间的代谢, 大部分未结合的游离探针被机体清除后, 目标-背景信噪比增强, 才能达到最佳成像效果[6]。应用此类探针需要设法尽快洗去未结合的探针, 使游离探针的清除时间尽量缩短, 但在实际操作中并不容易做到。新型的“可激活”靶向分子探针只有与靶向目标特异性结合之后才发出信号, 因此可以有更长的清除时间, 使探针在靶向组织或细胞中充分富集, 目标-背景信噪比可增加数百倍。例如, 利用单克隆抗体Ig G合成传统的靶向分子探针, 其清除时间较长, 导致了高背景信号和低目标-背景信噪比。然而, 应用同样的单克隆抗体Ig G, 与可激活信号载体结合后, 即使未结合的探针仍然在循环中却依然可以达到高目标-背景信噪比。
光学分子探针在进行体外实验时通常具有较好的靶向性, 但是在体内应用往往效果不佳, 这是因为机体是一个非常精密的系统, 许多复杂的防御机制会阻碍外源性分子在体内发挥作用。因此, 理想的光学分子探针必须能够穿过生理或药理学屏障, 以合适的浓度到达特定靶向目标并滞留一定的时间, 以便在体外被光学成像手段检测到。首先, 探针必须在体内循环中保持活性并避免被网状内皮系统 (RES) 摄取;其次, 探针必须能够到达靶组织内并在此富集;最后, 如果探针的作用靶点在细胞内部, 那么探针必须能够穿透细胞膜。
4 靶向光学分子探针的结构设计
靶向光学分子探针的结构设计可以用 (图1) 来表示。最常见的方式是识别基团通过一个连接基团与报告基团相连 (图1a) , 而且一种识别基团可以同时连接几个报告基团形成分子探针进行多模态分子成像[23]。另外, 多个识别基团与一个或多个报告基团连接后能与多个靶向目标特异性结合, 此类探针可用于多靶向分子成像[24]。此外, 许多有机或无机的纳米颗粒可以同时作为识别基团和运输载体来行使功能[25]。最新研究证实, 碳纳米管经表面功能化处理后, 具有可以携带蛋白质、核酸片段及小肽段等生物分子进入细胞的能力, 是一种非常有前途的运载工具。周非凡等[26]以单壁碳纳米管 (SWNT) 作为载体和光吸收剂, 制备了SWNT-PEG-m Ab靶向性光热转换探针, 经体内实验证实该探针可以进入靶细胞内, 从而达到靶向杀伤肿瘤细胞, 降低正常组织损伤的目的。此外, 识别基团和报告基团还可以被耦合到纳米颗粒表面或内部来改善探针的信号敏感性和光稳定性[27]。第二种方式是两种报告基团连接一种识别基团 (图1b) , 可激活探针或智能探针属于此类探针范畴[28], 智能探针结构中距离较近的两个报告基团可能会导致自淬灭 (Self-quenching) , 当探针到达靶向目标后被相应的酶激活才会发出荧光信号。第三种方式是一种报告基团作为核心, 两种或多种识别基团与其连接 (图1c) 。总的来说, 探针设计方式的选择是由多种因素共同决定的, 包括具体的靶向目标以及所采用的成像方式等, 为了合成理想的靶向特异性光学分子探针, 探针的每一个组成部分都必须认真考虑。
5 小结与展望
分子影像探针 篇5
关键词:苝,分子探针,氨基酸,合成,识别
氨基酸是重要的增味剂和营养增补剂,与我们生活息息相关,发展简便的、选择性高的检测氨基酸的方法具有重要意义。目前检测氨基酸的常见方法有化学分析法,层析法,鼻塞发,气相色谱法,氨基酸自动分析仪,但这些分析方法存在干扰因素,操作步骤复 杂,分析的灵 敏度和选 择性较差 等缺点[1]。分子探针技术用于检测氨基酸具有灵敏度高,准确度高等优点,在检测上显示了其优越性[2]。苝系衍生物具有优异的光热和化学稳定性,量子产率高等优点,是当前有机电致发光材料和有机分子探针的重要研究方向之一[3,4,5]。带有羧基的苝酰亚胺型荧光染料具有其显著的优点: 苝骨架使其具备亲脂性,羧基兼具亲水性,使其能渗透到细胞内,可用于活体组织内氨基酸的测定。同时其斯托克斯位移较大可避免吸收光谱干扰发射光谱,从而提高测试的灵敏度与准确性。因此将带有羧基的苝酰亚胺类染料开发作为分子探针具有重要的应用价值和广阔的发展前景[6,7]. 基于此,本文设计合成了水溶性的含苏氨酸基元的苝分子探针,并研究了其作为氨基酸探针的光谱特性及其对组氨酸的识别性能。合成路线如图1所示。
1 实验部分
1. 1 仪器与试剂
Varian Unity 500 ( 500 MHz) 核磁共振仪; AVATAR360型红外光谱仪; 瓦里安紫外可见分光光度计; 所有试剂均从百灵威公司购买,均为分析纯直接使用。
1. 2 标题化合物的合成
N2保护下,准确称取0. 3950 g ( 1 mmol) 苝四酸二酐与0. 2409 g( 2 mmol) 苏氨酸于圆底烧瓶中,并加入3 g咪唑作溶剂,磁力搅拌下加热回流。固体在100 ℃ 时初溶,在110 ℃ 时全溶。设置温度为100 ℃ 继续搅拌、回流过夜。16 h后停止反应,冷却至室温,有红棕色 固体生成。加入50 m L浓度为0. 05 mol / L的盐酸溶液溶解固体,调节p H至酸性,有大量红棕色絮状物析出。离心除去大部分水溶液,过夜晾干,将产物置于真空干燥箱干燥得0. 50 g标题化合物。取少量样品在浓硫酸中测定其紫外可见吸收光谱,在510 nm、547 nm左右苝四酸酐的特征吸收峰消失,在558 nm、600 nm左右出现苝四羧酸二酰亚胺的特征峰,初步证明合成目标产物。该产物结构进一步通过IR光谱与1H NMR光谱证实。FTIR( KBr) ,v / cm- 1: 3420与3141( 酰胺N - H伸缩振动) 、2973( 苝环C - H伸缩振动) 、 2850( 饱和C - H伸缩振动 ) 、1692 ( 羧酸C = O伸缩振动 ) 、1586( 苝环C = C伸缩振动 ) 、1403 ( C - N ) 、1048 ( C - O ) 、 763、627、552 ( C - H非平面摇 摆 ) 。1H NMR ( D2O,TMS, ppm) : δ 10. 11 ( bs,2H,COOH) ,8. 88 ( d,4H,Ar H) ,8. 01 ( d,4H,Ar H) ,4. 86 ( d,2H,CH) ,4. 65 ( m,2H,CH) ,2. 67 ( bs,2H,OH) ,2. 11 ( d,6H,CH3) 。
1. 3 实验方法
取0. 055 g产物加入10 m L蒸馏水稀 释,配置成9 × 10- 4mol / L的水溶液,取10份,每份0. 1 m L,加入同浓度的0. 1 m L的亮氨酸、色氨酸、组氨酸、赖氨酸、苏氨酸、精氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、等氨基酸水溶液,使其物质的量之比为1∶1,再稀释100 m L,静置过夜测定其紫外可见吸收光谱。
再分别将产物和组氨酸配成1 × 10- 5mol / L的标准溶液。 分别向6个10 m L的容量瓶中加入1 m L产物作为主体分子溶液,同时依次加入一定体积的组氨酸分子溶液 ( 0、0. 2、0. 4、 0. 6、0. 8、1. 0 m L) 用水溶剂定容摇匀,配制成一系列主体分子浓度1 × 10- 6mol / L客体分子浓度逐渐增加的配合溶液。静置过夜,测定其紫外光谱。
用Benesi - Hildebrand方程计算出其配合比、配合常数Ks和相关系数R2。计算公式如下:
公式中,[H]和[G]分别是主客体分子浓度,n是配合比, Ks为配合常数,Δε 是摩尔吸光系数,ΔA是最大吸收波长处的吸光度变化值。
2 结果与讨论
2. 1 产物与氨基酸作用的紫外可见吸收光谱研究
图2为标题化合物与各种氨基酸的紫外可见配合光谱。从图2可以看出产物在480 ~ 580 nm范围内出现两个较强的吸收峰,最强峰位置在535 nm,另一峰位置在500 nm,所有的氨基酸都使产物的吸收强度增加,且535 nm处吸收峰较500 nm处吸收峰的比值有所增加。对于苝系衍生物来说,电子振动吸收具有自身的特点,0→0跃迁增加,说明苝四羧酸根单体因发生了 π - π 作用而聚集,但不同的氨基酸使产物的吸收峰增加的程度不同,其增加程度由大到小的顺序是: 精氨酸 > 亮氨酸 > 组氨酸 > 色氨酸 > 赖氨酸 > 天冬氨酸 > 苏氨酸 > 谷氨酸,其中精氨酸、 亮氨酸、组氨酸、色氨酸的0→0跃迁吸收的比率明显的增大, 534 nm处吸收峰发生红移,最终在整个检测波段内出现吸收强度变化较大,这说明此四者较其它氨基酸与产物具有较强的作用。
2. 2 标题化合物与不同浓度的组氨酸配合的紫外可 见光谱
为深入了解标题化合物与氨基酸的配合性能,我们考察了标题化合物与不同浓度的组氨酸的紫外配合光谱。结果如图3所示,随着组氨酸的加入,吸光度不断增强,组氨酸浓度在0 ~ 4 × 10- 7mol / L范围内,吸光度增强幅度较快,其0→1和0 →0跃迁吸收的比率增加较快,浓度增至6 × 10- 7mol / L时,吸光度增加幅度明显减弱,其0→1和0→0跃迁吸收的比率增加较慢,当组氨酸浓度继续增至8 × 10- 7mol / L时,吸光度及0 →1和0→0跃迁吸收比率变化不明显,组氨酸浓度增至10 × 10- 7mol / L时,吸收曲线形状不再变化,吸光度略微增加,这是因为组氨酸和产物生成了稳定的配合物。根据Benesi - Hildebrand方程计算出其配合比、配合常数Ks和相关系数R2分别为1∶ 1、4. 1 × 105L / mol、0. 958。其较高的配合常数也说明主客体间有较强的识别作用。
3 结 论
本文合成了新型含苏氨酸基元的水溶性苝分子探针。氨基酸客体识别实验表明,该探针能有效识别各种氨基酸,对组氨酸识别效应最强,主客体配合比为1∶1,配合常数Ks为4. 1 × 105L / mol。
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分子影像探针 篇6
1 材料与方法
1.1 仪器与试剂
Gd-DTPA为爱尔兰Amersham Health公司产品, 荧光素标记的针对HER2的七肽分子FITC-LTVSPWY由苏州特瑞药业有限公司负责合成, 荧光显像使用日本Olympus公司的倒置荧光显微镜。细胞培养瓶及培养皿为美国Fisher Scientific公司产品。DMEM培养液及胎牛血清购自美国Hyclone公司, 采用美国GE公司的HDx 3.0T MRI仪。其余实验材料均为美国Sigma公司产品。表达HER2的人乳腺癌细胞株SKBR3、MCF-7及HER2表达阴性的乳腺癌细胞株MDA-MB-231由西安交通大学第一附属医院转化医学中心刘培军教授惠赠。
1.2 制备靶向探针FITC-LTVSPWY-Gd-DTPA
取0.2 ml过碘酸钠 (Na IO4) 干燥粉末溶于11.1 mg蒸馏水中, 充分混匀;取1 ml Gd-DTPA加入Na IO4溶液, 室温下摇匀并放置30 min, 随即加入1 ml乙二醇还原液, 摇匀, 室温放置30 min后加入5 mg FITC-LTVSPWY, 混匀过夜, 取1 mg硼氢化钠干燥粉末溶于100μl蒸馏水中, 混匀后加入上一步制备的溶液中, 于4℃冰箱放置2 h, 即获得靶向分子探针FITC-LTVSPWY-Gd-DTPA。
1.3 琼脂糖凝胶电泳分析
灌制1%琼脂糖凝胶, 分别加入3μl靶向分子探针FITC-LTVSPWY-Gd-DTPA和非靶向探针FITC-LTVSPWY进行琼脂糖凝胶电泳分离, 电压70 V, 电泳时间60 min。
1.4 靶向探针弛豫率检测
将FITC-LTVSPWY-GdDTPA和Gd-DTPA以浓度为6.25、12.5、25、50、100、200μg/ml分别溶于去离子水中, 采用腕关节线圈, 运用后台感兴趣区测量工具测出T1值, 计算弛豫率。扫描参数:视野120 mm, 矩阵256×128, 层厚1.5 mm, TE7.8 ms, TR3000 ms, 层间距0, 翻转角90°, 采集次数4次, 扫描时间15~20 min。
1.5 乳腺癌细胞爬片的制备与荧光染色
用89%DMEM、10%胎牛血清和1%抗生素培养基培养HER2表达阳性的乳腺癌细胞MCF-7, 待其生长至对数生长期, 用1 ml 0.25%胰酶消化3 min后, 再用含胎牛血清的培养基中和, 调整细胞浓度至1×105/ml。将细胞接种于载玻片上孵育24 h, 待细胞贴壁后用丙酮固定30 min, 以磷酸盐缓冲液 (PBS) 洗涤5次、每次5 min后备用。将5 mmol/L FITC-LTVSPWY-Gd-DTPA滴至制备好的乳腺癌细胞爬片上, 37℃孵育30 min, 用PBS反复冲洗后于倒置荧光显微镜下观察细胞表面的荧光分布。
1.6 细胞体外MRI
于培养瓶中培养HER2表达阳性的人乳腺癌细胞SKBR3、MCF-7及HER2表达阴性的乳腺癌细胞MDA-MB-231, 待细胞均生长至对数生长期时, 分别加入30、60、120、240 nmol/ml靶向探针FITC-LTVSPWY-Gd-DTPA作为实验组和非靶向探针Gd-DTPA作为对照组, 以不添加任何探针的细胞作为空白组, 每组3个平行管。将各组细胞37℃孵育一定时间后弃去培养基, PBS冲洗3次, 每次5 min后用胰酶消化3 min, 再以800 r/min离心5 min, 在所得细胞团块内加入1%琼脂糖和800μl PBS充分混匀, 装入1.5 ml EP管中, 进行MRI。采用腕关节线圈, 选择快速自旋回波序列进行T1WI扫描, 扫描参数:TR440 ms, TE 149 ms, 视野60 mm, 层厚2 mm, 无间距扫描, 矩阵256×192, 采集次数4, 翻转角90°。由2名MRI主任医师采用双盲法观察并确定各组细胞T1WI信号的差异, 意见不一致时协商达成一致。
2 结果
2.1 琼脂糖凝胶电泳分析结果
琼脂糖凝胶电泳结果显示, 非靶向探针Gd-DTPA条带迁移速度较快, 形成较亮片段;靶向探针FITC-LTVSPWY-Gd-DTPA条带基本未迁移, 见图1。由此证明两种探针的分子量及电荷均不同。
图1琼脂糖凝胶电泳图。泳道1为非靶向探针Gd-DTPA, 迁移速度较快, 形成高亮片段;泳道2为靶向探针FITC-LTVSPWY-GdDTPA, 条带处于初始孔, 基本未迁移
2.2 探针弛豫率检测与荧光染色结果
MRI结果显示随着溶液中Gd离子浓度的增高, T1WI序列的弛豫时间变短, 信号变亮。运用后台程序测量各管的T1值计算出Gd-DTPA和FITC-LTVSPWY-Gd-DTPA的弛豫率分别为4.560 L/ (mmol-s) 和5.330 L/ (mmol-s) 。制备的MCF-7细胞爬片显微镜下示细胞分布均匀, 形态结构清晰, 生存状态良好 (图2) 。与靶向探针FITC-LTSPWY-Gd-DTPA共同孵育后于倒置荧光显微镜下观察细胞形态良好, 分布均一, 细胞膜表面清晰, 可见均匀分布的绿色荧光, 细胞内荧光较弱 (图3) , 由此证明靶向探针FITC-LTSPWY-Gd-DTPA可以与膜受体HER2特异性地结合。
图2倒置显微镜下观察MCF-7细胞爬片, 细胞形态结构清晰, 状态良好, 分布均匀
2.3 细胞MRI结果
实验组、对照组与空白组细胞经MRI扫描示靶向探针FITC-LTVSPWY-Gd-DTPA处理的HER2表达阳性的SKBR3与MCF-7细胞在同一TE下均呈明显短T1高信号, 2种细胞的信号视觉差异不明显, 而HER2表达阴性的MDA-MB-231细胞经靶向探针处理后在同一TE下呈等T1信号, 其与HER2表
图4 HER2高表达的SKBR-3细胞、中等表达的MCF-7细胞和HER2阴性的MDA-MB-231细胞的T1WI结果。同一种细胞靶向探针呈明显高信号, 非靶向探针呈稍高信号, 空白组呈等信号
3 讨论
肿瘤标志物靶向治疗药物的选择与个体化治疗一直是研究的热点问题[8]。与大分子抗体相比, 小分子多肽具有分子量小、易穿透肿瘤组织、不产生机体免疫反应及便于修饰改造等优点, 更具有发展与应用前景[9,10]。LTVSPWY是Shadidi等[11]通过噬菌体库筛选技术筛选出的一种针对HER2包含7个氨基酸的短肽。Wang等[12]证实通过将LTVSPWY与α-TOS结合, 可以使MDA-MB-453细胞出现明显凋亡, 为制备LTVSPWY与MR顺磁性分子耦联物用于MR靶向成像提供了理论依据。
Gd-DTPA是经美国FDA批准并广泛应用于临床的成熟的MR阳性对比剂, 属于细胞外间隙造影剂, 达阳性细胞的MR信号有明显的视觉差异;非靶向探针Gd-DTPA处理的对照组3种细胞均呈T1稍高信号, 细胞间视觉差异不明显;空白组及背景琼脂糖MR扫描均呈T1等信号, 不同种类细胞间的信号强度差异不明显 (图4、5) 。每组设立的3个平行管之间信号均无明显视觉差异。在低浓度状态时对机体T1弛豫时间影响较大, 通过缩短氢质子的弛豫时间而影响被引入组织的T1弛豫时间, 且Gd III与DTPA螯合后可以减少其在体内的毒副作用[13,14,15]。然而, Gd-DTPA血浆渗透压较大, 进入机体后在动脉相能够快速进入细胞外间隙, 浓度达到峰值而使组织背景信号增强, 当细胞间隙对比剂浓度降低时, T1WI信号强度随之衰减。在整个MRI增强扫描过程中, 钆对比剂仅在动脉、毛细血管网、细胞外间隙和静脉内存在, 不能进入细胞内, 因而无法实现针对病变组织的靶向成像[15,16,17]。基于此, 课题组计划选择能与HER2特异性地结合的七肽小分子LTVSPWY与顺磁性粒子Gd通过DTPA连接后获得具有成像靶向性的MR分子探针。
图3荧光显微镜下观察MCF-7细胞爬片与靶向探针孵育结果, 绿色荧光均匀分布于细胞表面, 细胞内较弱, 证明靶向探针可以与HER2阳性细胞特异性地结合
图5不同浓度探针与SKBR3细胞的体外T2WI图。在同一探针浓度下, 靶向探针呈明显高信号, 非靶向探针呈稍高信号, 空白组呈等信号。同一组内, 随着探针孵育浓度的增大, 信号逐渐增强
在制备靶向探针前, 为了进一步证明七肽分子LTVSPWY具有针对HER2的靶向性, 本研究采用荧光标记LTVSPWY, 与HER2高表达乳腺癌细胞共同孵育后, 在荧光显微镜下观察到乳腺癌细胞表面均匀分布的绿色荧光, 从而进一步证实了LTVSPWY对HER2的靶向性。
DTPA是常用的耦联剂, 研究中先经Na IO4将DTPA的氨基氧化为醛基, 再使醛基与酪氨酸的氨基反应生成shifft碱, 生成物化学性质稳定, 且该反应在液相一步合成, 操作简单, 耦联效率高。琼脂糖凝胶电泳结果显示所制备的靶向探针符合预期分子量。在MRI仪下检测靶向探针FITC-LTVSPWY-Gd-DTPA的弛豫率高于非靶向探针Gd-DTPA, 其原因在于靶向探针分子量大, 侧链增长后分子体积变大, 使分子旋转相关时间延长, 从而使弛豫率增加。理论上弛豫率越大, 对比性越好, 成像效果越佳。进一步对HER2表达阳性的肿瘤细胞进行MR体外成像, 结果显示同一种细胞在同一TE下, 加入靶向探针的2种乳腺癌细胞的T1弛豫时间较加入非靶向探针的肿瘤细胞明显缩短, 呈高亮信号。经非靶向探针Gd-DTPA处理过的细胞T1WI呈稍高信号, 可能是由于Gd-DTPA沉积在细胞间隙未能被PBS彻底洗涤所致。
此外, 作为探索性研究, 本实验未探讨探针浓度、成像时间及肿瘤HER2表达水平与MRI信号之间相关性, 需在后续实验中进一步深入研究课题。
总之, 本课题组通过耦联技术自行制备的MR靶向探针具有良好的物理和磁学特性, 体外细胞成像显示出针对乳腺癌HER2靶向成像效果, 为下一步进行体内成像研究奠定了基础。
摘要:目的 以乳腺癌表皮生长因子受体2 (HER2) 为靶点, 制备以顺磁性粒子钆为载体的MR分子探针, 通过MR靶向成像为乳腺癌个体化治疗提供影像学依据。材料与方法 利用课题组前期制备的针对HER2的荧光标记探针FITC-LTVSPWY与钆喷替酸葡甲胺 (Gd-DTPA) 耦联获得MR靶向探针。以表达HER2阳性的人乳腺癌细胞SKBR3、MCF-7及HER2阴性的MDA-MB-231细胞为观察对象, 加入靶向探针FITC-LTVSPWY-Gd-DTPA共同孵育作为实验组, 细胞加入Gd-DTPA作为对照组, 不添加任何探针的细胞作为空白组, 利用MRI行体外细胞成像;T1WI序列采集图像, 进行视觉分析与比较各组细胞MRI信号。结果 细胞体外MRI结果显示, 实验组细胞T1WI呈高信号, 对照组与空白组细胞均呈等信号, 且存在视觉差异。结论 课题组构建的以HER2为靶点的MR分子探针具有良好的磁学特性, 体外可以与HER2阳性乳腺癌细胞特异性地结合, 为体内成像研究奠定了基础。