杂交瘤细胞

杂交瘤细胞（精选6篇）

杂交瘤细胞 篇1

细胞融合技术是一随机的、复杂的、周期长的操作过程。难免受操作者主观因素和一些客观因素的影响。在制备单克隆抗体的过程中, 有目的地对这些影响因素进行对比观察、归纳总结现将这些影响因素综述如下。

1 瘤细胞的生长状态及与脾细胞的比例

在研究过程中发现, 骨髓瘤细胞sp2/0随着培养时间的延长, 其用于细胞融合的成功率越来越低, 实验所用sp2/0细胞连续培养一般不要超过3~4周。刚从液氮复苏的细胞, 时间不太长细胞的生长状态也不好, 复苏后应维持对数生长期培养2周左右。使瘤细胞在对数生长期状态下进行融合, 此时细胞镜下状态典型, 细胞大而圆、边缘光滑、胞浆丰满明亮、胎盼兰计数活细胞99%以上。融合前一天, 应换新鲜培养基, 且细胞的密度不要太大, 细胞的汇合度维持在60~70%比较合适。切忌在融合前一天对细胞进行传代。另外, 在其它合适条件保持不变的情况下, 经过多次实验操作, 瘤细胞与脾细胞的比例在1:5左右融合率较高。

2 牛血清的质量

牛血清是细胞营养及必需成分的来源, 牛血清的质量是融合成败的一个关键因素, 在支持杂交瘤细胞生长方面, 新生牛血清和胎牛血清没有明显区别, 但不同厂家、不同批号的血清差别很大。正确地选择合理使用血清十分重要。除了常规要求的无菌、无支原体、无细胞毒素外, 要选择在无饲养细胞存在条件下, 能支持单个杂交瘤细胞较快生长的血清。

3 促融剂PEG对细胞的影响

聚乙二醇 (PEG) 是乙二醇的多聚复合物, 存在一系列不同分子量的聚合体。PEG与水分子借氢键结合, 导致细胞脱水而发生质膜结构的改变, 从而引起融合。PEG作为促溶剂的优点是:方法简单, 容易获取, 融合效果好[1、2、3]。为了发挥PEG的促进细胞融合效率, 必须采用较高的浓度。但PEG在高浓度下, 对细胞的损伤较大。因此, 不同批号的PEG对细胞的影响不同, 有的批号的PEG对细胞的毒性大, 用来做融合便会失败。PEG的分子量不同, 浓度不同对细胞的影响也不同。一般分子量选择1000~4000, 常用浓度为50%[4]。选择合适批号的PEG是细胞融合成败的一个关键因素。PEG作为融合剂有很多成功的报道1989年, Kyozuka利用PEG在水稻上获取了胞质雄性不育系[5], 1995年夏光敏等[6]利用小麦与高冰草的对称融合获取了杂种植株。

4 PH、融合时间与温度对融合率的影响

PH、温度和作用时间是PEG诱导细胞融合过程中的三大影响因素, 偏碱环境更利于细胞融合。PH8.0-8.2时, 细胞融合率最高[7]。一定范围内的温度升高也有利于细胞的融合。在融合过程中, 我们采用了在37℃的水浴环境下操作, 使PEG沿离心管壁在1分钟内缓慢加完, sp2/0与脾细胞作用时间为1分钟, 一达到较充分的作用效果。通过多次的实验观察, 在保持其它合适的条件不便的情况下, 融合率可达到80~90%。当sp2/0与脾细胞作用时间延长到90秒时, 虽然融合率可达到90%以上, 但融合后杂交瘤细胞的状态较差, 生长缓慢。提示控制好温度和PEG作用时间是融合成败的一个关键因素[8]。

5 其它因素对细胞融合率的影响

除上述因素外, 其它条件对细胞的融合率, 及融合后杂交瘤细胞的生长也有一定的影响。使用的RPMI1640的质量, 培养液的PH和渗透压对维持杂交瘤细胞的生长也十分重要, 适合杂交瘤细胞生长的PH在7.2~7.4之间。PH和渗透压不合适触台便会失败。培养基里的添加剂L-谷胺酰氨在水溶液状态下1~2周便会失效, 一般情况下我们将其200m M的母液, 放在-20℃冰箱保存, 在-20℃冰箱保存不超过1.5个月, 配完全培养基时临时加入。另外做融合时使用的滴管、离心管、培养瓶等玻璃器皿的洁净度对融合率, 及融合后杂交瘤细胞的生长也有一定的影响。

6 提高杂交瘤细胞生长的措施

使用同系小鼠的腹腔巨噬细胞作为饲养细胞;培养液内加入刺激杂交瘤细胞生长的物质如在1L RPMI1640培养基内加入2.5g的葡萄糖可以刺激杂交瘤细胞的过快生长;培养基内加入B淋巴细胞促分裂素 (STM) 对融合后杂交瘤细胞的生长有促进作用[9];融合后24小时后加入HAT选择性培养基, 使杂交瘤细胞的生成量显著增加;保持亲代B淋巴细胞处于融合状态。新近刺激的B淋巴细胞易于融合, 融合前3天加强免疫一次, 刺激B淋巴细胞分化, 成为激活状态。

参考文献

[1]Piliszeka, Moldlinski JA, Pysniakk, et al.Foetal fibroblasts introduced to cleaving mouse embryos contribute to full-term development[J]Reproduetion, 2007 133, (1) :207-218.

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[8]Kohler G.Hybridoma Techniques EMBO, SKMA Course.Basel:1980

[9]李键强.提高细胞融合率和促进杂交瘤细胞过快生长的方法[J].西北农业大学学报, 1988, 16 (2) :18-22.

杂交瘤细胞 篇2

1 材料与方法

1.1 材料

BALB/C小鼠由我校实验中心提供,SP2/0细胞系由我校保存传代培养,PEG(分子量4 000)、 HAT(次黄嘌呤,氨基喋呤,胸腺嘧啶核苷)、 HT(次黄嘌呤,胸腺嘧啶核苷)、DMEM、RPM1640 培养液为Gibco产品。

1.2 方法

1.2.1 杂交瘤细胞制备:

取小鼠脾细胞(具有分泌抗体的能力)与骨髓瘤细胞SP2/0细胞系(经复苏和培养,具有无限繁殖的能力)在PEG的介导下进行常规融合,加入到含有HAT培养液的96孔板中,根据情况2～3d换液一次,2周后,用HT培养液培养,培养2周后加到24孔板中,其中12孔板加入RPM1640培养液,另12孔板加入DMEM培养液,分别进行培养,在倒置显微镜下观察细胞生长情况。

1.2.2 杂交瘤细胞染色体制备:

选择在DMEM培养液中培养的杂交瘤细胞进行染色体制备,即将杂交瘤细胞传代72h,其中实验组的6孔在收获染色体前1h加入0.04μg/ml的秋水仙素,对照组的6孔在收获前4～6h加入0.04μg/ml的秋水仙素,将实验组和对照组细胞分别移入离心管进行离心,1 000r/min,8min后弃上清液,加入已预热到37℃的0.075mol/L的KCL溶液5ml低渗, 用甲醇冰醋酸固定液固定两次,再离心,弃上清,滴冰片,经Giemsa染色,蒸馏水冲洗,干燥后镜下选择分散好、无重叠、无散失的细胞计数分析100个,进行观察。

2 结果

2.1 培养液的区别

在RPM1640培养液中培养的细胞生长状态欠佳,倒置显微镜下观察细胞轮廓增强,胞质中偶见颗粒,细胞增殖缓慢;在DMEM培养液中培养的细胞生长旺盛,胞质透亮,轮廓正常,形态规则,细胞增殖率高。

2.2 加入秋水仙素后培养时间对染色体形态和数目的影响

在染色体形态上,实验组的染色体中长形态的偏多,而对照组的染色体中短形态的偏多(如图1、2所示)。在染色体数目上,实验组的染色体数目为92～98条,而对照组的染色体数目为88～104条。

3 讨论

3.1 杂交瘤细胞具有半悬浮半贴壁生长的特点,应用DMEM培养液培养的24孔板的杂交瘤细胞生长良好,此种培养基的葡萄糖选择的是高糖,对生长速度快、附着性稍差的肿瘤细胞生长有利,倒置显微镜下观察细胞轮廓正常,形态规则,细胞分散好;而在RPM1640培养液中培养的细胞生长欠佳,这主要是此种培养基不含高糖,使肿瘤细胞易脱离原来的生长点,细胞分散稍差,易产生变形,增殖能力明显低于前者。

3.2 实验组中用秋水仙素继续培养1h,既缩短了实验时间,又提高了实验效率,染色体的形态和数目发生变化少,这主要是因为秋水仙素作用时间过长,可使染色体缩短和发生异常分裂现象,染色体断片增多,影响真实的实验结果。秋水仙素的作用主要是破坏纺锤丝,使细胞分裂停留在中期阶段,产生类似提高分裂指数的效应。所以,在收获染色体前用秋水仙素培养1h比培养4～6h得到的染色体形态清晰,断片少,更接近两种亲本细胞。克服了由于断片增多而影响染色体计数的缺点,从而为单克隆抗体实验提供了省时、准确、效率高的实验方法。

利用B淋巴细胞杂交瘤技术生产单克隆抗体是Köhler和Mlistein[4]于1975年创立的具有划时代意义的新技术。采用这种技术制备出的单克隆抗体具有性质纯、效价高、特异性强、少或无血清交叉反应等优点。随着杂交瘤技术的迅速发展,已成为基础临床研究的重要工具,目前已广泛应用于临床疾病的早期诊断和治疗的研究,如在抗人结肠癌相关抗原单克隆抗体的制备和研究[5]等。杂交瘤染色体的成功制备是鉴定单克隆抗体成功制备的重要手段,改进染色体的制备方法,为制备单克隆抗体提供了一个行之有效的便利的实验途径。

摘要：目的:改进杂交瘤细胞培养及染色体制备方法。方法:取小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0常规融合,用不同的培养基制备杂交瘤细胞,并在制备杂交瘤染色体时改变秋水仙素作用的时间。结果:12孔板中加入DMEM培养液的杂交瘤细胞株生长良好,其中6孔板加秋水仙素培养1h,染色体形态最佳,数目稳定。结论:DMEM培养液更适合此种杂交瘤细胞的培养。制作染色体时缩短秋水仙素培养时间,使得杂交瘤细胞染色体形态更接近于两种亲本细胞。

关键词：杂交瘤细胞,染色体

参考文献

[1]焦宝明,李志梁,陆青,等.人心肌肌钙蛋白I单克隆抗体及杂交瘤细胞株的建立(J).第二军医大学学报,2001,22(4):376-377.

[2]张海珠,冯元春,宋晓荣,等.人心肌肌钙蛋白T单克隆抗体及杂交瘤细胞株的建立(J).郑州大学学报(医学版),2003,3:369-371.

[3]鄂征,主编.组织培养技术(M).北京:人民卫生出版社,1986.236-237.

[4]金伯泉,主编.细胞和分子免疫学(M).北京:科学出版社,2001.439-443.

《植物体细胞杂交》教学设计 篇3

人教版高中生物教材《现代生物科技专题 (选修3) 》中“植物体细胞杂交”, 虽然考纲不做要求, 但是, 是发展探究能力, 提高科学素养的良好素材。该内容主要涉及植物体细胞杂交技术的过程和应用。体细胞克隆羊多利的问世, 不仅给克隆技术带来重大突破, 也使更多的人开始关注细胞工程技术。近几十年来, 细胞工程技术获得突飞猛进的发展, 许多成果已渗入到我们的日常生产和生活中。通过本专题的学习, 学生可以了解细胞工程的原理、应用及其发展前景。为了激发学生的学习兴趣, 教学方法主要采用探究式教学, 结合学生的合作式学习, 通过层层设疑, 提出问题并解决问题。

二、教学目标

1.知识与技能。

简述植物体细胞杂交技术及其应用。

2.过程与方法。

通过复习旧知识引出新知识, 能够深入理解知识的内在联系, 掌握知识迁移的学习方法;通过合作学习、探究学习, 掌握植物体细胞杂交技术的流程和应用。

3.情感态度与价值观。

通过植物体细胞杂交技术过程的学习, 讨论细胞工程技术的社会意义, 认同细胞学基础理论研究与技术开发之间的关系, 关注细胞工程的研究发展和应用前景。

三、学情分析

细胞工程是建立在对细胞结构、功能、生理等研究基础上的新技术, 在必修模块《分子与细胞》中, 学生已学过动植物细胞的结构和功能、细胞的分化和全能性;在必修模块《遗传和进化》中, 学生已学过生物变异在育种上的应用;这些都是学习本专题的知识基础。更主要的是刚学过的植物组织的培养为植物体细胞杂交技术奠定了基础。

四、教学方法

本节课采用探究式教学, 教师通过创设一种良好的情景, 启发学生提出问题, 利用学生已有的知识和其他交叉学科的思想, 通过合理的想象, 分析问题, 解决问题。

五、教学过程

1.创设情境, 激情导课

【教师活动】教师通过幻灯片放映日本博览会上的一棵枝叶覆盖面积达14平方米, 果实数量达13000只的番茄树以及马铃薯的地下块茎。提出问题:通过合理的想象, 结合我们学过的知识, 想想如何充分发挥植物的潜能, 让地上部分结番茄, 地下部分结马铃薯?

【设计意图】激发学生兴趣。

【学生活动】学生根据学过的关于作物育种等相关知识, 提出可能的方案。

【教师活动】评价学生的方法, 同时提出新的问题, 用传统的杂交育种的方法能得到番茄—马铃薯的杂种植株吗?为什么?

【设计意图】复习关于植物育种的相关知识。

【教师活动】杂交育种的方法不能得到番茄马铃薯的杂种植株, 因为不同物种之间存在生殖隔离, 采用什么方法能得到二者的杂种植株呢?为了实现这个构想, 科学家在不断地努力, 随着科学的发展, 一项新的技术使这个构想得以实施, 那就是植物体细胞杂交。

2.层层设疑, 引导探究

【教师活动】植物体细胞杂交技术遇到了哪些困难, 科学家又是如何逐一解决这些困难, 最终得到番茄——马铃薯杂种植株的?

(1) 艰难的实施历程——去除细胞壁

【教师活动】体细胞的杂交, 不同于植物自然生长过程中产生的两性生殖细胞的受精过程, 而是已经分化的体细胞间的融合成功。那么遇到的第一重困难就是如何去掉植物细胞的细胞壁。请同学们根据植物细胞细胞壁的成分, 思考去除之法。

【学生活动】思考并回答相关问题

【教师活动】对学生回答的方法深入发掘。利用酶去除细胞壁, 这种方法利用了酶的什么特性, 酸或者碱也能去除细胞壁, 请同学们分析一下, 哪种方法更好?

【学生活动】思考并回答相关问题。

【设计意图】体现学科交叉的思想, 进一步强化酶解法的妙用。

(2) 诱导原生质体融合

【教师活动】利用酶的专一性去除细胞壁, 还不会破坏膜的结构及其内部的活性成分。去除细胞壁后的植物细胞称为原生质体, 第二道困难就是如何能使原生质体融合。展示必修一教材P67图4-5荧光标记的小鼠细胞和人细胞融合实验示意图, 提示学生不同细胞是可以融合的, 并引导学生回答不同细胞可以融合的理论基础是细胞膜的流动性。

虽然不同细胞可以融合, 但是, 由于不同种的细胞其细胞膜是有差异的, 需要用一定的方法诱导融合。研究表明可用物理和化学等方法诱导原生质体融合。物理法包括离心、震荡、电击等;化学法一般用聚乙二醇 (PEG) 作为诱导剂来诱导原生质体融合。

融合后的原生质体的膜重新排列形成一个统一整体, 细胞核也融合为一个, 得到了两种不同细胞的遗传物质, 从植物细胞结构完整性来看, 融合的原生质体算是一个真正的植物细胞吗?请同学们思考并回答。

【学生活动】再生细胞壁后才能算作完整的植物细胞。

【教师活动】为了提高原生质体融合的效率, 操作时许多番茄和马铃薯的原生质体放在一起促融, 这样得到的融合细胞都是番茄马铃薯的杂种细胞吗如果不是, 还有哪些要想得到杂种细胞还要进行什么活动

【设计意图】激发学生发散的思维。

(3) 培育杂种植株

【教师活动】请同学们回想一下, 我们最初的目标:得到杂种植物。现在我们得到的仅是杂种细胞, 请同学们回顾上节课我们学习的内容, 思考利用什么技术可以培养杂种植株, 并简述该技术的过程。

【学生活动】回答相关问题, 画出技术流程图

【设计意图】植物组织培养是考纲要求的考点, 复习强化该知识点。

3.归纳小结, 巩固认识

【教师活动】克服上述的重重困难后, 得到了杂种植物。回顾艰难的历程, 请给植物体细胞杂交下一个定义。

【学生活动】归纳总结植物体细胞杂交的定义。

4.头脑风暴, 发散思维

【教师活动】科学家历尽千辛万苦得到的番茄—马铃薯的杂种植株, 最终修成正果了吗

让我们看看科学结果:展示科学家实验结果 (请一个同学阅读) 。思考:为什么番茄—马铃薯没有像人们预期的那样, 地上结番茄, 地下结马铃薯四人为一组展开讨论, 并发布讨论结果。

【学生活动】讨论, 发布讨论结果。

【教师活动】评价学生的答案, 并讲述“在众多的可能性中, 科学家分析后给出这样一种解释:生物基因的表达不是孤立的, 它们之间是相互调控、相互影响的, 所以番茄—马铃薯杂交植株的细胞中虽然具备两个物种的遗传物质, 但这些遗传物质的表达相互干扰, 不能再像马铃薯或番茄植株中的遗传物质一样有序表达, 所以杂交植株不能地上长番茄, 地下结马铃薯就是很自然的了”。

尽管番茄—马铃薯没有像人们预期的那样地上结番茄, 地下结马铃薯, 但是杂种植物的获得, 说明不同属间的植物能够实现体细胞杂交, 他的意义在于植物体细胞杂交能够克服远缘杂交不亲和的障碍。

这项技术已经取得了很多成果, 如白菜—甘蓝, 胡萝卜—羊角芹, 烟草—海盗烟草。

【教师活动】 (展示图片) 眼虫, 一种含有叶绿体的原生生物, 这说明植物的细胞器同样可以在某些动物细胞中存活。一头牛的异想天开:要是把牛的细胞与植物细胞杂交得到绿色的小奶牛, 那岂不是只要晒晒太阳就可以挤出牛奶了如果理论上可行, 请同学们试着设计出具体实验方案。

杂交瘤细胞 篇4

关键词：酵母双杂交,cDNA文库,Vero细胞,同源重组,构建,鉴定

酵母双杂交是目前常用于检测蛋白与蛋白相互作用的一种方法,最初由S. Fields等[1]在进行真核基因转录调控研究时建立。M. Liu等[2]通过酵母双杂交技术发现,牛外周血单核细胞的 β - 肌动蛋白等蛋白质和附红细胞体 α - 烯醇化酶相互作用。Y.Wang等[3]通过酵母双杂交技术发现,小鼠的LAMTOR1 和RNase H2B与弓形虫的MIC2 蛋白相互作用,可能参与弓形虫与宿主细胞的黏附。

Vero细胞系是由日本千叶大学的Y. Yasumura和Y. Kawakita于1962 年从健康成年非洲绿猴的肾脏上皮细胞中分离培养出来的。Vero细胞作为病原体的细胞宿主,被广泛用于麻疹病毒、狂犬病病毒、犬瘟热病毒等多种病毒的培养,也被广泛用于弓形虫、新孢子虫等真核寄生虫的培养。

新孢子虫病( neosporosis) 是由新孢子虫( Neospora caninum) 引起的多种动物共患的血液原虫病,以神经、肌肉功能障碍,以及孕畜流产、死胎、弱胎等为主要临床特征。新孢子虫入侵宿主细胞时,需要和宿主细胞蛋白黏附,发生相互作用,引起新孢子虫感染产生致病性。酵母双杂交系统是研究蛋白质和蛋白质之间相互作用的方法,利用该方法可以筛选到与新孢子虫相互作用的宿主细胞未知蛋白。本试验构建了Vero细胞的酵母双杂交c DNA文库,旨在为研究新孢子虫和Vero宿主细胞的相互作用蛋白奠定基础。

1材料与方法

1.1主要试剂

Vero细胞( ATCC CCL - 81) ,由延边大学动物医学实验室保存; MatchmakerTMGold Yeast Two - Hybrid System试剂盒、CHROMA SPINT TE - 400 Columns纯化柱、SD/ - Leu培养基、YPDA培养基等,均购自Clontech公司; RNeasy Plus Mini Kit,购自Qiagen公司; Ta KaRa LA Taq Hot Start Version,购自宝生物工程( 大连) 有限公司。

1. 2 文库鉴定引物

p GADT7 - Rec通用鉴定引物,引物序列: 5' AD primer 5' - CTATTCGATGATGAAGATACCCCACCAAACCC - 3' 和3' AD primer 5' - GTGAACTTGCGGGGTTTTTCAGTATCTACGAT - 3',由上海英骏生物技术有限公司合成。

1. 3 细胞总RNA的提取及鉴定

当有90% Vero细胞铺满75 cm2培养瓶时,弃去培养液,收集Vero细胞,按照RNeasy Plus Mini Kit方法提取总RNA,溶解于30 μL RNase - free water中。用超微量紫外分光光度计测量其浓度和纯度,取7 μL总RNA用1% 琼脂糖凝胶电泳鉴定。

1. 4 c DNA文库的构建

1.4.1 c DNA第一链的合成

按照c DNA文库构建试剂盒操作说明书将Vero细胞总RNA反转录成c DNA第一链。即在0. 5 m L PCR管中加入2 μL质量为3. 9 μg的总RNA、1 μL CDS Ⅲ/6 引物( 随机引物) 、1 μL RNase free water,72 ℃ 孵育2 min,冰上孵育2 min; 瞬离,加入2 μL 5 × First strand Buffer、1 μL DTT( 100 mmol / L) 、1 μL d NTPs Mixs和1 μL SMART MMLV,25 ℃ 孵育10 min; 瞬离,42 ℃ 作用10 min; 加入1 μL SMART Ⅲ - modified oligo,轻轻混匀后于42 ℃ 作用1 h。 待反转录完成后于75 ℃ 作用10 min; 加入1 μL RNase H终止第一链合成,此时完成了文库第一链的合成。

1.4.2双链c DNA的扩增和纯化

按照c DNA文库构建试剂盒操作说明书,将反转录得到的第一链c DNA经长距离PCR ( LD - PCR) 合成双链c DNA。即PCR管中加入5 μL c DNA第一链、5 μL 10 × PCR Buffer、1 μLd NTPs Mixs、1 μL 5' AD primer、1 μL AD3' primer、1 μL Ta KaRa Ex Taq HS、36 μL RNase free water。PCR反应条件: 94 ℃ 1 min; 98 ℃ 10 s,68 ℃8 min,每次循环增加5 s,共30 个循环; 最后68 ℃ 延伸5 min。取扩增得到的双链c DNA用CHROMA SPINT TE - 400 Columns纯化柱纯化,然后各取7 μL未纯化和纯化的双链c DNA用1% 琼脂糖凝胶电泳鉴定。

1.4.3文库的构建和收获

用酵母双杂交试剂盒提供的PEG/Li Ac方法制备酵母Y187 感受态细胞,然后每600 μL感受态细胞中加入双链c DNA 20 μL( 485 ng /μL) 、p GADT7 - Rec 4 μL ( 0. 5 μg /μL) 和Yeastmaker carrier DNA 20 μL,用玻璃珠将转化的菌液均匀涂布于30 块直径为120 mm的SD/ - Leu平板上,30 ℃倒置培养3 ~ 5 d,直至长出菌落; 待出现菌落后,将培养皿于4 ℃ 放置3 ~ 4 h; 然后用20 m L预冷的冻存液( 含25% 甘油的YPDA液体培养基) 收获文库,分装到1 m L离心管中,- 70 ℃保存,备用。

1.4.4文库的质量评价

对文库按照1∶100 000和1∶10 000比例稀释并涂布于SD/-Leu平板上,30℃倒置培养,计数生长的单个菌落,计算文库转化效率和文库容量。

随机挑取24 个单个菌落,用文库通用鉴定引物5' AD primer和3' AD primer对菌落进行PCR扩增,分析文库插入片段的大小及重组率。PCR反应条件: 95 ℃ 5 min; 95 ℃ 40 s,60 ℃ 40 s,72 ℃ 2 min,共30 个循环; 72 ℃ 再延伸10 min。

2 结果与分析

2. 1 Vero细胞总RNA的提取

总RNA经超微量紫外分光光度计测定,其浓度为1. 85 μg /μL,OD260/ OD280值为1. 96,比值处于1. 8 ~ 2. 0 之间,说明RNA纯度较高。经1% 琼脂糖凝胶电泳显示,有28 S、18 S和5. 8 S共3 条特异性条带,见图1,说明RNA样品质量良好,可用于后续的文库构建工作。

M.DL-2 000 Marker;1.Vero细胞总RNA。

2. 2 双链c DNA产物的琼脂糖凝胶电泳

对纯化后的双链c DNA和纯化前的双链c DNA进行琼脂糖凝胶电泳,结果见图2。

由图2 可知,纯化前的双链c DNA呈现弥散状条带,而过柱纯化后200 bp以下片段基本去除了,双链c DNA集中在500 ~ 2 000 bp之间。

2. 3 c DNA文库容量的测定

M1.DL-2 000 Marker;1.纯化后的双链c DNA;2.纯化前的双链c DNA;M2.DL-15 000 Marker。

对1∶100 000 和1∶10 000 倍稀释的SD/ - Leu平板进行单个菌落计数,经计算文库效价为7. 1 ×108cfu / m L,总体积为26 m L,文库容量为1. 8 ×1010cfu。

2. 4 c DNA文库的PCR扩增

从SD/ - Leu平板上随机挑取24 个单个菌落进行PCR鉴定,琼脂糖凝胶电泳结果显示,文库插入片段为500 ~ 2 000 bp,经计算重组率为100% ,见图3。

M.DL-2 000 Marker;1~21.随机挑取的单个菌落。

3 讨论

原虫的感染、致病性通常和原虫与宿主相互作用有关。国内外学者开展了原虫与宿主相互作用的研究以探索新孢子虫感染与致病机制。新孢子虫编码蛋白与宿主相互作用的研究取得如下发现: 新孢子虫表面蛋白位于虫体表面,以糖磷脂酰化形式锚定在宿主细胞膜上,并与宿主细胞发生黏附作用,帮助虫体顺利完成入侵过程。一些微线体蛋白或微线体蛋白复合物可以和宿主细胞唾液酸残基( sialic acid residues) 结合,成为潜在的治疗靶点。因此,研究新孢子虫与宿主细胞蛋白的相互作用对阐明虫体的入侵和增殖具有意义。

自1989 年酵母双杂交方法建立以来,该方法立即被广大研究者认为是一种研究蛋白质之间相互作用的非常有力的工具。酵母双杂交方法是在酵母细胞中进行的,利用酵母生长迅速、操作方便的特点,筛选和验证蛋白质之间的相互作用。目前,酵母双杂交技术已经应用于很多领域,如药物的发现、病原入侵机制、蛋白质相互作用图谱等[4,5]。A. Ueno等[6]利用酵母双杂交方法筛选到与弓形虫缓殖子特异性蛋白Dna K - TPR相互作用的p23 蛋白,p23 蛋白参与了速殖子向缓殖子的转变。杨永军等[7]利用酵母双杂交技术验证了甘蓝SCR、THL与SRK的交替相互作用。

为了获得c DNA全长序列,采用Oligo - capping[8]、Cap - trapper[9]等方法构建不同物种的c DNA文库,这几种方法需要充足的高质量的起始原料mRNA和多次酶促反应。本研究通过SMART方法构建c DNA文库,以总RNA为反转录模板,避免因mRNA在分离纯化时的降解和多次酶促反应时造成的基因丢失,从而保证了文库的容量。段志强等[10]采用SMART技术构建的鸡胚成纤维细胞c DNA文库容量为3. 0 × 106cfu,重组率为100% 。本试验构建的Vero细胞酵母双杂交c DNA文库效价为7. 1 ×108cfu / m L,文库容量为1. 8 × 1010cfu,重组率为100% ,插入片段长度在500 ~ 2 000 bp之间,达到了合格文库的条件,可以用于新孢子虫与Vero细胞相互作用蛋白的研究。

参考文献

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杂交瘤细胞 篇5

青龙斑是以斜带石斑鱼为母本、鞍带石斑鱼为父本杂交的子代,是具有生长速度快、养殖周期短、抗病力强、饵料系数低等杂种优势的新品种[6]。目前,国内外学者已对青龙斑杂交育种生产做了一些研究[7,8,9],对消化道粘液细胞和胃泌素(gastrin,Gas)细胞的研究还未见报道。鱼类的粘液细胞(mucous cell)在整个消化道都可见,其能分泌多种化学物质,如酸性粘多糖、中性粘多糖、胃蛋白酶等[10],这些分泌物对鱼类的消化道生理功能有重要影响。鱼类的胃肠道是重要的消化器官,也是其最大的内分泌器官,胃肠道内分泌细胞对肠道的蠕动及消化吸收等具有重要的意义[11]。该文利用组织化学和链霉亲和素-生物素过氧化物酶(Strept Avidin-Biotin-Complex,SABC)免疫组织化学技术的方法分别对青龙斑幼鱼消化道的粘液细胞和Gas分泌细胞的分布进行系统的研究,进一步了解消化道的生理生化功能,旨在为青龙斑幼鱼培育过程中人工投喂所需的营养提供科学的参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验所用的5尾38日龄青龙斑幼鱼取自南海水产研究所深圳试验基地,幼鱼全长(2.52±0.22)cm,体质量(0.21±0.05)g,将幼鱼置于实验室的水槽中暂养24 h,以排空消化道中的食物,麻醉后,解剖分离出食道、贲门部、胃体部、幽门部、前肠、中肠和后肠,放入固定液中固定。

1.2 粘液细胞染色

将样品置于Carnoy液中固定24 h,梯度乙醇脱水,二甲苯透明以及石蜡包埋,连续横向切片,厚度5μm。高碘酸-雪夫(periodic acid-Schiff,PAS)反应能使消化道中的中性粘多糖呈红色,阿尔新蓝(alcian blue,AB)染液能显示消化道中的酸性粘多糖,使其呈蓝色。

利用AB-PAS染色方法,按照安利国和王钦东[12]、区又君等[13]的分类方法,将青龙斑幼鱼消化道中的粘液细胞分成4类:1)Ⅰ型粘液细胞。PAS反应阳性,AB-PAS染色呈红色,分泌的粘液为中性粘多糖;2)Ⅱ型粘液细胞。AB反应阳性,AB-PAS染色呈蓝色,分泌的粘液为酸性粘多糖;3)Ⅲ型粘液细胞。AB和PAS反应均为阳性,AB-PAS染色呈紫红色,分泌的粘液以中性粘多糖为主,有少量的酸性粘多糖;4)Ⅳ型粘液细胞。AB和PAS反应均为阳性,AB-PAS染色呈蓝紫色,分泌的粘液以酸性粘多糖为主,有少量的中性粘多糖。

在Carl Zeiss显微镜下观察切片,对每个取材部位切片随机取10个视野,用目微尺测量并计算横切面的面积。观察粘液细胞的形态和着色情况,并对粘液细胞的分布密度、类型进行观察和统计(个·mm-2)。共计数5尾鱼取其平均值。

1.3 SABC免疫组织化学方法

将样品放入4℃Bouin氏液中固定24 h,常规石蜡包埋,切片厚度5μm,贴附于经多聚赖氨酸处理的载玻片上。切片经脱蜡至水,3%过氧化氢(H2O2)室温10 min以灭活内源性过氧化氢酶活力。蒸馏水浸洗,0.01 mol·L-1枸橼酸盐缓冲液进行抗原修复,PBS洗涤,滴加第一抗体为兔抗胃泌素(Gas)抗体,工作浓度为1∶100,在4℃孵育24h,PBS洗涤后滴加生物素标记羊抗兔抗体,室温孵育20 min,加入SABC复合物,室温孵育20min,试验均在湿盒中进行,PBS洗4次,DAB显色,在镜下控制反应时间(5~10 min),蒸馏水充分洗涤以终止反应,以上试剂均购自武汉博士德生物公司(BOSTER),苏木素轻度复染,脱水、透明、封片。阴性对照切片为相邻的切片,并用PBS替代一抗,其余步骤与上述试验相同。

2 结果

2.1 青龙斑消化道粘液细胞的类型

2.1.1 青龙斑食道中粘液细胞的类型

AB-PAS染色结果显示青龙斑消化道的粘液细胞呈红色、蓝色、紫红色和蓝紫色4种颜色,由此可知青龙斑幼鱼食道中有Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ型粘液细胞,且Ⅰ型居多,少量的Ⅲ和Ⅳ型粘液细胞,Ⅱ型粘液细胞数量则介于两者之间。食道中含中性粘多糖和酸性粘多糖,粘液细胞分泌物较多,少数细胞界限不明显(图1-a)。

2.1.2 青龙斑胃中粘液细胞的类型

青龙斑的贲门部和胃体部胃腺发达,幽门部无胃腺。AB-PAS染色结果显示贲门部和胃体部都含有中性粘多糖和酸性粘多糖,贲门胃粘液细胞有Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ等3种类型,Ⅰ型粘液细胞最多,粘液细胞界线不明显,以红色为主,胃体部有Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ型粘液细胞,未见Ⅱ型粘液细胞,其中也是以Ⅰ型粘液细胞最多,同时发现在胃腺的周围含有较多的Ⅰ和Ⅳ型粘液细胞。而幽门胃中只有Ⅰ型粘液细胞,只含有中性粘多糖(图1-b~d)。

2.1.3 青龙斑幽门盲囊和肠道中粘液细胞的类型

青龙斑的幽门盲囊和肠道都含有中性粘多糖和酸性粘多糖。幽门盲囊以Ⅱ型粘液细胞最多,Ⅲ型粘液细胞少量(图1-e)。前肠、中肠和后肠均有4种类型的粘液细胞,前肠中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ型细胞均较少,中肠Ⅰ和Ⅱ型粘液细胞较多,Ⅲ和Ⅳ型粘液细胞较少,后肠Ⅰ和Ⅱ型粘液细胞较多,Ⅲ和Ⅳ型细胞很少(图1-f~h)。青龙斑幼鱼肠道中粘液细胞的总数为中肠>后肠>前肠(表1)。

表1 青龙斑消化道粘液细胞的类型和密度Tab.1 Type and destiny of mucous cells in intestine of Qinglong grouper

注:-.阴性反应;+.粘液细胞数量<10个·mm-2;++.粘液细胞数量10~30个·mm-2;+++.粘液细胞数量>30个·mm-2Note:-.negative reaction;+.mucus cell numbers(<10 cell·mm-2);++.mucus cell numbers(10~30 cell·mm-2);+++.mucus cell numbers(>30 cell·mm-2)

2.2 青龙斑Gas免疫活性细胞的形态和分布

免疫组化结果显示青龙斑Gas免疫阳性细胞存在于幽门盲囊和肠道中,幽门盲囊中阳性细胞最多,从前肠至后肠细胞数量逐渐减少,青龙斑幼鱼的胃部(贲门部、胃体部、幽门部)都未发现Gas细胞的存在(图2-a~b),同时阴性对照试验均未发现Gas免疫阳性细胞。幽门盲囊中有锥形开放型细胞和卵圆形的封闭型细胞(图2-c);青龙斑幼鱼的肠道中有卵圆形、瓶颈形、椭圆形等形态的Gas细胞,主要夹杂于肠道粘膜层的柱状上皮细胞之间,前肠中有瓶颈形开放型细胞,细胞胞突伸向肠腔(图2-d),中肠有较多的椭圆形Gas细胞(图2-e),后肠Gas免疫活性细胞明显减少,以封闭型细胞为主(图2-f)。

3 讨论

3.1 青龙斑幼鱼消化道粘液细胞的分布与功能的关系

在鱼类消化系统不同部位,粘液细胞的种类及数量分布有较大差异,食道中一般都有中性和酸性的粘多糖,同时食道上皮中粘液细胞的数量与鱼类的食性有一定的关系,草食性鱼类>杂食性鱼类>肉食性鱼类[14]。该研究中青龙斑幼鱼食道中粘液细胞数也较少,4种类型的粘液细胞都有,含中性粘多糖和酸性粘多糖,这与黄鳍鲷[15](Sparus latus)、褐牙鲆[16](Paralichthys olivaceus)食道中粘液细胞的分布相同,在卵形鲳鲹[14](Trachinotus ovatus)食道中也存在中性和酸性的粘多糖,而通过对黄姑鱼[17](Nibea albiflora)消化道粘液细胞的研究发现,黄姑鱼幼鱼食道组织中有Ⅲ、Ⅳ型粘液细胞分布,但是在成鱼中只有Ⅳ型粘液细胞分布。食道中酸性粘液物质可以增加粘液的粘性,起到润滑作用,这将有利于食物顺利地从食道转移到胃里,粘液细胞可以起到润滑食物,缓冲摄取的食物对粘膜的损伤[14]。石戈等[18]对褐菖鲉(Sebastiscus marmoratus)消化道研究显示食道上众多的杯状细胞和粘液分泌细胞不仅有利于食物的吞咽,粘液细胞内的嗜酸性颗粒还可能参与消化作用,同时粘液细胞分泌的粘液具有一定的抗菌作用。

a.食道(×200);b.贲门胃(×200);c.胃体(×200);d.幽门胃(×200);e.幽门盲囊(×200);f.前肠(×200);g.中肠(×200);h.后肠(×200);Ⅰ.Ⅰ型粘液细胞;Ⅱ.Ⅱ型粘液细胞;Ⅲ.Ⅲ型粘液细胞;Ⅳ.Ⅳ型粘液细胞a.esophagus(×200);b.cardiac stomach(×200);c.fundic stomach(×200);d.pyloric stomach(×200);e.pyloric caeca(×200);f.foregut(×200);g.midgut(×200);h.hindgut(×200);Ⅰ.TypeⅠmucous cell;Ⅱ.TypeⅡmucous cell;Ⅲ.TypeⅢmucous cell;Ⅳ.TypeⅣmucous cell

图1 青龙斑消化道粘液细胞的显微观察(AB-PAS染色)Fig.1 Light microscopical observation of mucous cells in digestive tract of Qinglong grouper(AB-PAS staining)

在鱼类胃中粘液细胞的分布差异较大,该试验青龙斑幼鱼幽门胃中只有Ⅰ型粘液细胞,贲门部和胃体部的粘液细胞分别为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型和Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型,即贲门部和胃体部有中性粘多糖和酸性粘多糖,幽门部只有中性粘多糖,这与黄鳍鲷[15]的研究结果相似,胃中含有的中性粘多糖,可以调节胃中过量的酸性胃液,起平衡p H值的作用,还可以对高浓度酸性胃容物起到一定的缓冲作用[19],同时胃分泌的中性粘液物质可形成一层对胃粘膜上皮细胞具有保护作用的粘膜,对于防止胃酸和胃蛋白酶对上皮细胞的侵蚀起到重要作用[20]。

青龙斑幼鱼肠道粘液细胞的数量是:中肠>后肠>前肠,前肠和幽门盲囊粘液细胞密度相差不大,勾效伟等[21]对平鲷(Rhabdosargus sarba)的研究显示,中肠的粘液细胞总数也最多,其中又以Ⅱ型粘液细胞最多,肠道粘液细胞数量:中肠>后肠>幽门盲囊>前肠,区又君等[22]对黄斑篮子鱼(Siganus oramin)消化道粘液细胞研究也表明中肠和后肠的粘液细胞要多于前肠和幽门盲囊。同时研究发现,青龙斑肠道和幽门盲囊中均具有较多的酸性粘多糖,这可能是因为肠道和幽门盲囊是蛋白质消化的主要场所,酸性粘多糖有利于未消化的食物向后肠的推进[15]。辛俭等[17]认为不同部位粘液细胞的类型及密度各不相同,这可能与各部位的功能不同有关,谢湘筠等[23]认为不同鱼类粘液细胞分布不同还与食性有关。

a.胃体部阴性反应(×100);b.幽门部阴性反应(×200);c.幽门盲囊Gas细胞(×400);d.前肠Gas细胞(×400);e.中肠Gas细胞(×400);f.后肠Gas细胞(×400)a.negative reaction in fundic stomach(×100);b.negative reaction in pyloric stomach(×200);c.Gas cells in pyloric caeca(×400);d.Gas cells in foregut(×400);e.Gas cells in midgut(×400);f.Gas cells in hindgut(×400)

图2 青龙斑消化道Gas细胞的定位(SABC)Fig.2 Location of Gas cells in digestive tract of Qinglong grouper

3.2 消化道中Gas细胞的分布和功能

鱼类的胃肠道内分泌细胞对肠道蠕动、消化吸收等具有重要的意义[11],在硬骨鱼的胃肠道中已经发现了15种免疫活性内分泌细胞[24]。研究表明鱼类和哺乳动物的胃肠道激素内分泌细胞(Gastrin、Neuropeptide Y、Substance P等)具有很高的保守性[25,26,27,28],因此国内外学者都将哺乳动物胃肠道的抗血清用于鱼类胃肠道免疫细胞化学鉴别和定位[29,30,31,32]。Gas具有调节胃酸分泌、肠道蠕动、胃蛋白酶和肠消化酶等消化因子的分泌,这种调节模式是受肠道中机械或者化学物质的刺激(如蛋白质)产生的[33]。青龙斑幼鱼的整个肠道和幽门盲囊均有Gas细胞的存在,食道和胃中都未发现Gas免疫阳性细胞。

不同鱼类中Gas细胞的分布在胃肠道中存在一定的差异,HERNNDEZD等[34]对克林雷氏鲇(Rhamdia quelen)幼鱼消化道内分泌细胞研究发现Gas内分泌细胞只存在于肠道粘膜层上皮中,在食道、胃中并没有检测到Gas的阳性细胞。但是在鲻[35](Mugil cephalus)、黑鲷[36](S.macrocephalus)、斜带石斑鱼[37]的幽门胃中发现有Gas细胞。青龙斑幼鱼Gas细胞的分布与克林雷氏鲇、中华乌塘鳢(Bostrichthys sinensis)、黄鳍鲷、褐篮子鱼[38](Sigauns fuscesens)以及长鳍篮子鱼[39](S.canaliculatus)消化道胃泌素免疫活性细胞分布相似。青龙斑幼鱼的肠道中有较多的Gas细胞,这可能是因为肠道是青龙斑幼鱼食物消化吸收的主要场所。青龙斑幼鱼消化道的Gas细胞也有2种类型:开放型细胞和封闭型细胞[40],开放型细胞通过直接感受消化腔内容物的刺激而分泌,从而调节胃肠功能的活动,而闭合型细胞可能是通过感受局部组织内环境变化和消化腔内容物压力的刺激而分泌。

杂交瘤细胞 篇6

1 材料和方法

1.1一般资料 U251胶质瘤细胞基体使用含有10%的胎牛血清DMEM培养液来进行日常培养, 顺铂诱导后的耐药细胞株U251/CP2也使用同样的DMEM培养液进行培养, 两种培养液均使用2μg/ml的顺铂常规培养也进行分析培养。实验前使用同样的10%胎牛血清DMEM来进行同植株的子代培养。

1.2研究方法

1. 2. 1 DNA提取: 本次提取的参考试验标准为Maniatis提供的技术方法, 将已收集细胞进行提取液缓冲提取, 缓冲液为10mmol / L的Tris-CL溶液, 0. 1mol / L的EDTA溶液, 以及0. 5% 的SDS溶液, 经混合摇匀后, 加入蛋白酶进行浓度调和后进行分析研究, 通过水浴共振过夜进行等体积的抽提, 再经离心收集后进行品相上的等体积混合物进行二次抽提, 再经离心机进行积水相合。经抽提后, 通过等体积氯仿进行分离。加入0. 1 倍体积的乙酸钠酸性溶液 ( p H = 5. 2 的溶液) 和2. 2 倍体积的低温无水乙醇 ( - 20℃ ) 来进行混合提取, 在室温环境下进行离心处理5min, 弃去混合溶液的上清液, 在空气中将DNA荣誉TE溶液中, TE溶液的p H为7. 5, 确保DNA溶液中无RNA的才刘, 经蛋白酶K处理1h后, 使用酚氯仿进行第三次提取。

1. 2. 2ACCH标记: 本次标记是采取缺口平移法来进行的DNA标记。肿瘤靶细胞的DNA使用红色分子探针来进行标记选择, 经标记后的DNA可以通过琼脂糖电泳技术来进行片段筛选, 筛除300bp的基因片段, 而关于肿瘤靶细胞的DNA选择, 则通过对500 ~ 700ng的DNA片段进行选择。通过混合探针在进行80℃ 的水浴中让目标DNA和含有Cot-1DNA的微芯片进行杂交混合, 经2h的处理后进行分析研究, 再经转移到Ampli Onc I microarray的溶液中在体温 ( 37℃ ) 的环境下放置一夜。经50% 的甲酰胺和标准柠檬酸钠缓冲液在40℃ 的环境下洗涤10min, 连续进行3 次洗涤后, 在避光环境下进行干燥处理, 使用蓝色荧光基因进行二次染色。染色后, 根据荧光基团的图像来进行系统鉴别。

1. 2. 3RNA提取反转录: 经Trizol进行了细胞的RNA提取后, 根据反转录后, 可将靶细胞RNA转录为c DNA, 进而进行备份使用, 保存于- 70℃ 的冷库中进行备份。在操作反转录的试剂过程中, 根据厂家对产品的使用说明书来进行严格的执行操作, 避免出现差错。

1. 2. 4RT-PCR技术: 在进行引物操作中, 本次试验采用的是Invitrogrn公司提供的试剂, 经检测后, 主要的序列如下: IL-7Reverse: 5'-GGCAAVAGAACAAGGATCAGG-3', GAPDH Reverse: 5'-CGCTCTCTGCTCCTCCTGTTC-3'。 在经过了IL-7 和GAPDH的引导后, 经过不同温度的多个循环进行处理研究, 可对PCR的产物进行琼脂糖电泳拍照来进行分析。

1. 2. 5 荧光定量PCR: 使用SYBR进行引物分析, 其使用步骤如RT-PCR的方法进行。经多次循环鉴定分析后, 对结果进行分析。

2 结果

在对顺铂的剂量梯度提升对敏感度的U251 细胞进行诱导抗性细胞研究中, 通过对耐药U251 /CP2 细胞的研究, 得出了以下几点结果。

2. 1a CGH方面研究结果 在进行U251 的细胞DNA研究中, 通过探针进行检测后, 得到了补体因子的相关蛋白基因, 但是在进行研究中, 其主要的DNA片段, 在进行剪辑中, 遗失了90% 的基因信息, 而和补体因子相关的蛋白研究中, 其丢失信息不足80% 。这表明在进行U251 细胞的基因信息拷贝研究中, U251 /CP2 靶细胞的研究结果则如下图的基因片段整合信息所示。

2. 2 RT-PCR的荧光定量检测结果 在挑选基因的过程中, 使用荧光标记法来进行实时检测, 通过分析定量的ACGH的实验研究结果来进行研究, 其分析结果中表明, 各项处理措施中, 对PCR的结果研究效果, 其中U251 /CP2 细胞中的蛋白表达达到了U251 靶细胞中的11. 3 倍。

3 讨论

化疗是现在治疗癌症的最主要治疗手段之一, 在对病体进行了切除以后, 通过化疗进行康复治疗, 已成为治疗的癌症患者的主要治疗手段[2,3]。而在进行这一研究中, DNA芯片技术是近年来发展的最新高科技生物基因技术, 在进行基因研究中, 通过这一技术实现了基因剪辑技术, 完成了对大量基因疾病的研究。胶质瘤细胞是脑胶质中较为常见的一种恶性瘤体疾病, 在以往的治疗中, 主要依照手术为主要的治疗手段, 但是由于这种治疗手术比较单一, 在治疗后还需要进行联合化疗来进行后续的综合治疗[4,5]。肿瘤差异性也导致了在进行化疗过程中, 产生了很大的差异, 因为脑胶质瘤的最佳治疗方法, 应该依据个人体质来进行综合治疗, 才能够发挥出相应的效益。作为现在抑制癌细胞分化的主要药物之一的顺铂, 在针对治疗神经肿瘤化疗的过程中, 极容易导致癌细胞出现耐药现象, 进而致使化疗的效果大打折扣, 这都会影响到患者治疗中的效果[6]。

综上所述, 在进行芯片—基因的杂交技术对胶质瘤细胞的抗药分析中, CFHR1 /CFHR3 和IL-7 三个胶质基因均可能和胶质瘤细胞的抗药性有关, 由于现有的设施仍存在一定的缺陷, 本次实验仅供参考。

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