恶臭假单胞菌

恶臭假单胞菌（精选7篇）

恶臭假单胞菌 篇1

随着人类对矿山的开采以及重金属的冶炼和加工, 环境中的重金属污染越来越严重[1]。重金属离子毒性大, 不能被生物降解, 容易通过食物链被生物富集[2], 严重威胁人类和生物的生存[3], 因此治理与防治重金属污染成为人们研究的热点问题。重金属废水的传统处理方法有化学法、物理法和生物法。化学法和物理法虽然能对重金属离子有较好的去除效果, 但成本高、过程繁琐、容易造成二次污染[4]。生物法是目前处理重金属离子的最好方法之一。生物处理方法中的游离细菌吸附法有较强的吸附作用, 如恶臭假单胞菌野生菌 (Pseudomonas putida) 和藤黄微球菌 (Micrococcus luteus) 等对Cu2+和Pb2+离子都有很强的吸附能力[5,6], 但存在着耗费大、回收难、易造成污染转移等缺陷[7,8]。为解决这一问题, 固定化微生物技术应运而生。

本实验以多孔介质火山岩滤料为载体, 利用吸附作用来固定恶臭假单胞野生菌和恶臭假单胞重组菌 (表面展示金属硫蛋白的恶臭假单胞工程菌) , 通过测量吸附前后OD600值的变化来计算载体固定菌的吸附率, 并对吸附温度、转速、反应器底面积等固定化条件进行了优化, 同时研究了固定化菌吸附溶液中铜离子的效果。

1 材料与方法

1.1 材料、主要仪器和试剂

微生物菌株:恶臭假单胞野生菌 (Pseudomonas putida, 简写为W菌) 、恶臭假单胞重组菌 (表面展示金属硫蛋白的恶臭假单胞工程菌, 简写为R菌) , 系华中农业大学农业微生物学国家重点实验室提供。

滤料:火山岩生物滤料, 购于北京淇方天科技有限公司, 粒径4~6mm。

仪器:恒温摇床 (上海科学仪器厂) 、FA1004B电子天平 (郑州南北仪器设备有限公司) 、SP-02型恒温培养箱 (黄石恒丰医疗器械有限公司) 、TLL-C台式冷冻离心机 (北京四环科学仪器有限公司) 、722S型分光光度计 (无锡科达仪器厂) 、恒温干燥箱 (上海科学仪器厂) 。

LB培养基 (Luria-Bertani) :胰蛋白胨10.0g, NaCl 10.0g, 酵母提取物5.0g, 蒸馏水溶解定容至1.0L, pH 7.0~7.2, 121℃灭菌备用。

试剂:蛋白胨、酵母膏、氯化钠、盐酸、CuCl2标准溶液等均为分析纯, 购于国药集团化学试剂有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 恶臭假单胞菌菌悬液的制备

在文献[9]的基础上进行改进。挑取单菌落于5mL LB培养基中, 30℃、200rpm条件下培养6h, 再按1%的接种量将菌液接到100mL LB培养基中 (重组菌的培养需加终浓度为500μg·mL-1的羧苄青霉素) , 30℃摇床培养24h, 得到菌悬液。

1.2.2 游离菌的收集

恶臭假单胞野生菌 (W菌) 的收集:将配好的150mL LB培养基置于500mL锥形瓶中, 在30℃恒温摇床上培养24h, 将上述菌悬液分装在离心管中, 于10 000rpm离心5min, 收集菌体, 并用适量的无菌蒸馏水稀释菌体使菌悬液的OD600在0.9~1.0。

恶臭假单胞重组菌 (R菌) 的收集:方法基本同上, 不同之处是需在培养基中加入终浓度为500μg·mL-1的羧苄青霉素。

1.2.3 火山岩滤料的处理

将火山岩滤料浸泡在蒸馏水中1h, 清洗干净后置于白瓷盘中, 于110℃烘箱中烘2h, 待用 (空白火山岩滤料) 。

取500g预处理的火山岩滤料, 用0.3mol·L-1的盐酸浸泡24h后倒掉上清液, 再用蒸馏水洗至中性, 灭菌后待用[9]。

1.2.4 火山岩滤料固定W菌和R菌时间的确定

取空白和经盐酸处理的火山岩滤料, 置于500mL锥形瓶。并按照固液比30g∶100mL的比例, 分别加入上述收集的W菌和R菌, 置于30℃, 50rpm恒温摇床中吸附, 每隔0.5h取上清液, 测定0.5、1、1.5、2.5、3.5和4.5h时上清液OD600的值。

1.2.5 吸附率计算

火山岩滤料吸附菌的吸附率的计算公式为:

1.2.6 滤料固定化恶臭假单胞菌的条件优化

(1) 温度对固定化的影响

称取滤料30g于100mL菌悬液中, 分别在20、30、40℃于60rpm摇床下吸附2.5h, 并测量1.0、1.5、2.5h时上清液OD600值, 考察最佳吸附温度。

(2) 转速对固定化的影响

称取滤料30g于100mL菌悬液中, 分别在0、60、120rpm摇床下30℃条件下吸附2.5h, 测量1.0、1.5、2.5h时上清液OD600值。

(3) 反应容器的底面积对固定化的影响

称取滤料30g干重, 分别选用250、500mL三角瓶作为滤料的固定反应容器吸附2.5h, 分别测量1.0、1.5、2.5h时上清液OD600值。

1.2.7 固定化恶臭假单胞菌对Cu2+吸附能力的比较

(1) 溶液中Cu2+浓度的测定

分别配制浓度为0、2、4、6、8、10 mg·L-1的Cu2+标准溶液, 用原子吸收分光光度计测量其吸光度, 绘制Cu2+浓度———吸光度标准曲线。

(2) 固定化重组菌滤料、固定化野生菌滤料及空白滤料对Cu2+的吸附性能比较

将上述在最优条件下固定化菌的滤料和空白滤料分别置于50mL初浓度为10mg·L-1的Cu2+溶液中, 进行吸附实验;每隔一定时间取样测吸光度, 检测样品中残留的Cu2+浓度。不同材料对Cu2+吸附率的计算公式为:

C:Cu2+浓度

2 结果与分析

2.1 火山岩滤料固定W和R菌固定时间的优化

空白滤料和经盐酸处理的滤料分别用来固定化W菌和R菌, 不同时间对其吸附率影响结果见表1。由表中可知, 在相同时间里, 酸处理后的滤料吸附恶臭假单胞菌的能力比空白滤料强, 而且吸附重组菌的能力比吸附野生菌的能力强;酸处理3.5h后滤料吸附野生菌和重组菌的吸附率基本达到了最大。

2.2 滤料固定化恶臭假单胞菌的条件优化

2.2.1 温度对固定化的影响

温度对酸处理滤料固定化重组菌吸附率的影响见表2。由表2可知, 吸附2.5h时, 不同温度下滤料对重组菌的吸附率分别为30.68%、36.59%和26.98%。其中温度在30℃时吸附率最高, 吸附效果最好, 这跟恶臭假单胞菌重组菌的最适生长条件相一致。

2.2.2 转速对固定化的影响

转速对酸处理滤料固定化重组菌吸附率的影响见表3。由表3可知, 吸附2.5h, 转速分别为0、60、120rpm时, 滤料对重组菌的吸附率依次为:37.74%、36.59%和34.83%, 说明在静置状态下吸附效果最好, 同时也说明酸处理滤料对重组菌的吸附作用是物理吸附, 在有一定转速条件下反而使得吸附上去的菌容易脱落下来。

2.2.3 反应容器的底面积对固定化的影响

反应器底面积对酸处理滤料固定化重组菌吸附率的影响见表4。由表4可知, 吸附2.5h后, 500mL锥形瓶中吸附效果比250mL的吸附效果好, 说明扩大容器底面积, 可以降低单位面积上滤料的密度, 增大滤料与菌液的接触面积, 因此增加了其吸附量。

注:原始OD600为0.973

2.3 固定化恶臭假单胞菌对Cu2+的吸附能力

2.3.1 溶液中Cu2+浓度的测定

测得5mg·L-1 Cu2+溶液的标准曲线的线性方程为y=4.597 3x, 其中R2=0.993 1, 接近于实际标准曲线。

2.3.2 固定化重组菌、固定化野生菌及空白滤料对Cu2+的吸附性能比较

由表5可知, 固定化重组菌、固定化野生菌及空白滤料对Cu2+的吸附11h后, 它们的吸附基本达到平衡。三种不同处理材料对Cu2+的吸附率依次为:74.76%、89.36%、55.09%。结果表明:固定化重组菌和固定化野生菌吸附Cu2+的效果都要比空白滤料的要好, 固定化重组菌对Cu2+去除能力高达89.36%。

3 讨论

实验表明, 火山岩滤料本身对Cu2+具有较强的吸附能力, 固定化重组菌的滤料对Cu2+的吸附效果最好, 这是因为恶臭假单胞菌重组菌表面有金属硫蛋白的缘故。把微生物固定在滤料上处理废水, 能利用它们处理废水的优势, 且可以回收滤料, 研究固定化的最优条件, 有助于了解滤料对恶臭假单胞菌的吸附机理, 并为工业化废水的处理提供参考依据。

吸附Cu2+浓度实验中, 本文只吸附了低浓度的Cu2+废水, 只用一种多孔载体, 未能将多种固定化载体的吸附效果、稳定性等性能进行比较, 此外吸附剂处理重金属污水后需要脱吸附再生, 方才再次投入使用, 同时脱吸附也是回收贵重金属的一个有效途径, 这些内容还有待进一步研究。

参考文献

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[4]邹照华, 何素芳, 韩彩芸, 等.重金属废水处理技术研究进展[J].水处理技术, 2010, 36 (6) :17-21.

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[6]陈明, 赵永红.微生物吸附重金属离子的试验研究[J].南方冶金学院学报, 2001, 22 (3) :168-184.

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椰毒假单胞菌中毒案例 篇2

2012年7月2日下午3时某派出所报称, 袁某家发生中毒, 2日凌晨5时许, 袁某的媳妇苏某在亲戚家中死亡, 12时许, 袁某的孙女死亡, 14时许, 袁某的亲家母白大娘在同村家中死亡。同时袁某的大女儿由于反应严重已送往市人民医院救治, 袁某本人、大儿子、二儿子、二儿子媳妇、二儿子女儿在某镇卫生院治疗, 次日转市人民医院, 5日袁某的大女儿、大儿子在市某医院死亡。

二、调查经过

案情紧急, 现场经勘查后, 发现袁某家中环境脏乱, 家中牛与人共居, 食物与农药放置在一间房内, 灶是地上用石块搭的, 调料放置在地面石块边, 容易出现误食毒物的情况。经法医尸体检验, 其症状与亚硝酸盐类中毒类似, 出现手指发绀等症状, 怀疑为亚硝酸盐类中毒。现场走访中, 反映其家人在村中无明显仇怨, 1日吃饭人员为假日回家亲人。后提取所食用的一切检材进行毒化检验, 并由卫生防疫部门人员提取部分检材作检验。同时, 到医院中对中毒治疗的人员进行访问。在医院中, 由于大女儿反应较重已送市人民医院外, 其它人员在镇医院进行治疗, 多人反映出现头晕、呕吐、心痛、四肢无力症状, 访问中发现其父亲袁某由于同一症状, 在1日并未食用任何食品。同时其大儿子尚神智清醒, 能准确回答问题。据此筛选出可疑食品进行检验。7月5日到市人民医院调查中, 发现大女儿一直昏迷不醒, 大儿子出现狂燥现象, 5日下午, 人民医院通知二人均已死亡。经调查后, 发现这九人前后共同食用的是发醇的玉米面汤圆这一食品。检材经处理后供理化检验, 未发现亚硝酸盐类毒物, 后提取死者的肝、胃、血送州局公安司法鉴定中心检验也未发现常见毒物。至此, 案件陷入困境, 九人发生中毒现象无一个明确的答案。

三、检验经过

分别提取前三名死者的心血、肝、胃、尿液和共同食品汤圆、及其材料 (糖、发醇玉米面) 进行毒物检验, 经检验提取的检材无常见毒物。后送人民医院死亡的一人袁某送省厅公安司法鉴定中心做病理检验, 结论为急性肝坏死, 肺、胃组织、心内膜出血, 脑水肿等。玉米面汤圆经市级卫生防疫站检验也无常见食品中毒种类, 后将检材送省、国家卫生防疫部门进行检验, 最终发现发醇的玉米面中含椰毒假单胞菌, 因食用该物质导致中毒死亡的结论。

四、讨论

经公安民警一系列调查检验后, 排除他杀可能。同时卫生防疫部门也提取相关检材进行检验, 也排除了亚硝酸盐类中毒可能, 经讨论和查询, 怀疑为椰毒假单胞菌中毒。送检材至国家卫生防疫部门检验, 确认为椰毒假单胞菌中毒。

椰毒假单胞菌酵米面亚种 (Psedomonas cocovenenans supsp.farino fermentans) 是我国发现的一种新的食物中毒菌, 它存在于发酵的玉米、糯玉米、黄米、高梁米、变质银耳以及周围环境中, 它是酵米面及变质银耳中毒的病原菌。该菌产生的毒素米酵菌酸是其致病原因。

革兰氏阴性短杆菌, 大小为2.5-3μm×0.5-1.0μm, 呈杆状、球杆状或稍弯曲, 两端钝圆, 无芽胞, 有鞭毛 (见图1) 。兼性厌氧, 但易在表面生长。最适生长温度为37℃, 最适产毒温度为26℃。p H5-7范围内生长较好。

本菌抵抗力较弱, 56℃5min即可杀死, 对各种常用消毒剂抵抗力也不强。可产生小分子的脂肪酸类毒素米酵菌酸和毒黄素, 对人和动物细胞均有毒性作用。米酵菌酸为白色晶体, 耐热性强, 一般烹调方法不能破坏其毒性, 但日晒两日后可去除94%以上变质银耳中的毒素。难溶于水, 其产生量远大于毒黄素, 对细胞产生毒性, 损害人的肝、脑、肾等器官, 是引起酵米面和变质银耳等多种食品中毒致病的主要病因。

椰毒假单胞菌酵米面亚种菌的食物中毒又称臭米面中毒。主要在我国东北地区农村偶然发生的一种食物中毒, 近年来, 广西、云南、四川、湖北等地也有发生。中毒者虽不多, 但病死率高达40%-100%。

(一) 中毒食品:

主要为发酵玉米面制品、变质鲜银耳、糯米面汤圆、吊浆粑、马铃薯粉条、甘薯淀粉及其他变质淀粉类 (糯米、小米、高粱米和马铃薯粉等) 制品。

(二) 发病季节:

椰毒假单胞菌酵米面亚种食物中毒多发生在夏、秋季节, 食品因潮湿、阴雨天气, 再加上储存不好, 椰毒假单胞菌在食物中大量地生长繁殖, 吃了这种食物就会发生中毒。

(三) 中毒与进食量多少有关, 未食用者不发病。

(四) 发病急, 潜伏期多数为2-24h。一般在1-1 0 h发病。

椰毒假单胞菌:产生毒素, 严重损害人的肝、肾、脑, 造成消化系统、泌尿系统和神经系统感染。

中毒者有急性胃肠炎症状, 临床表现为进食后2-24h出现上腹不适, 恶心、呕吐, 重者呈咖啡色样物, 轻微腹泻、头晕、全身无力等。严重者可出现呕血、血尿、少尿、皮下出血、黄疸、肝脾肿大、意识不清、烦躁不安、四肢抽搐甚至中毒性休克等而死亡, 体温一般不升高, 病死率高达40%-100%。

椰毒假单胞菌中毒判定原则: (1) 符合本菌的流行病学与临床表现。 (2) 实验室检验各项指标的检定结果与椰毒假单胞菌对照, 最终确诊。

要预防此类中毒的发生应注意:不用霉变的玉米等制备酵米面;谷类浸泡时要勤换水, 保持卫生、无异味;磨浆后要及时晾晒或烘干成粉;贮藏时要通风、防潮, 不要直接接触土壤以防污染。

禁止出售、注意勿食用变质鲜银耳。学会正确辨别银耳的质量。正常干银耳经水泡发后, 朵形完整、较大, 菌片呈白色或微黄, 弹性好, 无异味。变质银耳不成形、发粘、无弹性, 菌片呈深黄至黄褐色, 有异臭味。发好的银耳要充分漂洗, 摘除银耳的基底部。

参考文献

铜绿假单胞菌临床耐药分析 篇3

1材料及方法

1.1 2002年至2005年,本院细菌室从临床送检的各类标本中,经培养分离出铜绿假单胞菌150株。由本院细菌室参照《全国临床检验操作规程》进行细菌培养和分离,采用K-B法常规进行药物敏感试验。铜绿假单胞菌(ATCC27853)质控菌株,购自卫生部临床检验中心。

1.1 对4年来检出的铜绿假单胞菌进行回顾性分析,比较其对常用抗菌素耐药率和药物敏感性试验结果。

2结果

2.1 标本类型与分离的铜绿假单胞菌菌株:

见表1。

2.2 药敏结果

见表2。

2.3铜绿假单胞菌在不同年份对4种抗生素的耐药率:见表

3讨论

铜绿假单胞菌,分布广泛,水、空气、土壤、医院环境中都存在此菌,也是医院内最常见的致病菌,广泛存在于污染的医疗器械中,成为医院感染的重要来源。铜绿假单胞菌几乎可感染人体的任何组织和部位。铜绿假单胞菌的耐药机制复杂,产生高水平染色体介导的AmpCβ-内酰胺酶是铜绿假单胞菌对β-内酰胺类抗菌药物耐药的主要机制。此外,铜绿假单胞菌极易形成生物膜,这是铜绿假单胞菌难以被清除、感染易慢性化的主要原因[1]。铜绿假单胞菌生物膜产生的β-内酰胺酶主要分布在生物膜的表面,可通过结合或水解β-内酰胺类抗菌药物,阻止抗菌药物进入生物膜内部。β-内酰胺酶在生物膜细菌中不仅能够通过降解、灭活抗菌药而发挥作用,还可能与外多糖基质协同作用,降低抗菌药物的渗透[2]。

从表1看出, 150株铜绿假单胞菌中118株来源于痰液,占居首位,其余32株来源于其他标本,可见铜绿假单胞菌是呼吸道感染的主要致病菌之一。这主要是因铜绿假单胞菌的胞膜能产生具有粘附的藻酸盐生物膜,使细菌易附于呼吸道黏膜,不易吞噬,形成物理屏障。而且物理屏障的形成使抗菌药物的渗透性降低,并中和部分抗菌药物,使被膜内的细菌处于生长不活跃期,导致抗菌药物不敏感。因此,引起下呼吸道感染的铜绿假单胞菌在临床上治疗比较困难[3]。所以,对呼吸道感染,尤其是下呼吸道感染,要提高送检意识,及时正确留取标本作病原菌检查及药敏试验,针对性合理用药,规范治疗,并且加强消毒隔离,提高护理水平,减少医院感染的发生。

表2中, 铜绿假单胞菌对氨苄西林、复方磺胺甲基异恶唑、头孢拉定、复方磺胺甲基异恶唑、头孢曲松、头孢噻肟、头孢呋辛耐药率大于80%,复方磺胺甲基异恶唑及喹诺酮类,因其广泛应用而耐药率也较高。因此在治疗时应首先排除此类药物。第三代头孢菌素对铜绿假单胞菌虽有较强的抑菌作用,但随着近年来三代头孢菌素的广泛应用和滥用以及新的β-内酰胺酶出现,导致铜绿假单胞菌对三代头孢菌素的耐药日益严重,本研究显示,铜绿假单胞菌对头孢噻肟的耐药率为90%。

其他β-内酰胺类抗菌药的耐药率为氨曲南37.3%、哌拉西林34.7%、头孢他啶31.3%,这些药可考虑选用。

而耐药率较低的阿米卡星16.7%、左氧氟沙星16.7%、亚胺培南14.6%、呋喃妥因12.6%,可作为首选,但在氨基糖甙类药物中,阿米卡星的耐药率16.7%,与其较强的耳毒性及肾毒性 而在临床较少应用有关。左氧氟沙星为氧氟沙星的左旋异构体,与沿用的氟喹喏酮类抗菌药物相比保持了对需氧革兰氏阴性杆菌的良好抗菌作用,增强了对革兰氏阳性菌的抗菌活性,对呼吸系统感染的常见致病菌具有高度抗菌活性。本研究中,其耐药率低,为16.7%,临床应用效果明显。

铜绿假单胞菌是临床常见的重要致病菌,对多种抗菌药物天然耐药,临床可供选择的治疗药物较少,是抗感染治疗的严峻挑战[4]。亚胺培南是目前治疗产ESBLs和AmpCβ-内酰胺酶的肠杆菌科和非发酵菌感染中占有重要地位。但随着亚胺培南的临床应用,铜绿假单胞菌对其耐药性逐年增加,并且亚胺培南耐药菌株可引起医院感染的发生。不可忽视的是,对革兰阴性杆菌最敏感的亚胺培南的耐药率为14.6%,说明产金属酶及碳青酶烯水解酶的铜绿假单胞菌占相当比例,随着亚胺培南临床治疗使用的增加,必须筛选出更多耐碳青酶菌株,因此,虽然对亚胺培南耐药率较低,临床也要注意亚胺培南的长期使用问题,严格掌握用药指征,减少抗菌药物选择性压力[5]。建议亚胺培南应限制在下列情况使用:多重微生物混合感染(特别是合并厌氧菌感染)铜绿假单胞菌对其他抗菌药物耐药; 应用亚胺培南应经常进行细菌培养和药敏试验,以尽早发现亚胺培南耐药菌株[6]。

表3中,铜绿假单胞菌的耐药较为严重,铜绿假单胞菌耐药范围大,其耐药性变异发展较快,分析不同年份铜绿假单胞菌耐药率,对亚胺培南、头孢他啶、哌拉西林、阿米卡星逐年上升,其对亚胺培南耐药率相对较低。

通过对150株铜绿假单胞菌的分析,希望临床医师在治疗铜绿假单胞菌的感染过程中,充分考虑其耐药机制,选用耐药率低的抗菌药物,治疗上建议用氨基糖甙类抗菌药物提高对外膜的通透性,加上联合使用耐酶的β-内酰胺类抗菌药物,可以有效地控制感染,避免诱导铜绿假单胞菌产生β-内酰胺酶而对抗菌药物广泛耐药[7]。

有些医师根据经验用药,直接选用抗菌素进行治疗,显然,这是耐药现象明显的一个重要原因,再者,临床为控制感染,往往采用大剂量抗菌素,且长期使用,势必降低药物效能,使耐药菌株增加,耐药种类增加。因此,遇有可疑细菌感染性疾病,首先考虑做常规细菌培养和药敏试验,治疗铜绿假单胞菌感染应严格掌握抗菌药物的适应证,根据药敏结果选择抗菌药物,监测铜绿假单胞菌耐药率以指导临床用药,选择有效抗菌药物联合用药。合理应用抗菌素,并尽可能减少可致铜绿假单胞菌定植或感染的医源性操作,以预防或减少医院感染。

摘要：目的了解本院铜绿假单胞菌的分布及耐药情况。方法对本院细菌室从2002-2005年临床各科标本中分离的150株铜绿假单胞菌进行药敏试验。结果对头孢拉定、复方磺胺甲基异恶唑、头孢曲松、头孢噻肟、头孢呋辛、头孢西丁耐药率很高。虽然对阿米卡星、左氧氟沙星、亚胺培南等耐药率较低(分别为16.7%、16.7%、14.6%),临床用药也应注意。结论重视细菌培养,合理使用抗菌素,减少耐药菌株,减少医院感染。

关键词：铜绿假单胞菌,抗菌素,耐药性,医院感染

参考文献

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铜绿假单胞菌临床分离菌株分析 篇4

1材料与方法

1.1 菌株来源

2009年1月至2011年12月本院临床各科室送检标本中共分离到356株铜绿假单胞菌, 排除同一患者重复分离相同菌株。质控菌株铜绿假单胞菌 (ATCC27853) 来自卫生部临检中心。

1.2 菌种鉴定与药敏试验

使用法国生物梅里埃公司生产的鉴定试剂和ATB Expression系统进行菌种鉴定, 采用K-B纸片扩散法进行药敏试验, 所有结果判断均按照美国CLSI/NCCLS推荐的标准进行, 药敏纸片购自于英国OXOID公司。

1.3 统计学方法

使用WHONET5.4软件系统进行统计分析。

2结果

2.1 菌株在临床标本中的分布

3年内本院共分离出356株铜绿假单胞菌, 按照标本来源类型进行分类, 以痰液标本为主, 共分离出237株, 占66.6%, 从分泌物中分离出38株, 占10.7%, 其余为中段尿、血液、穿刺液等, 结果如表1所示。

2.2 铜绿假单胞菌在临床各科室分布

铜绿假单胞菌在ICU科室分离率最高, 占68.8%, 其次为呼吸内科和神经外科, 比例分别为15.2%和7.3%, 结果如表2所示。

2.3 铜绿假单胞菌的耐药率

铜绿假单胞菌对9种抗菌药物的耐药情况如表3所示。

3讨论

铜绿假单胞菌在自然界中分布广泛, 也是人体的正常菌群, 它广泛存在于人体的呼吸道、消化道、肠道等部位, 一旦机体应用免疫抑制剂、抗肿瘤药物和广谱抗生素导致机体免疫力低下, 会引起严重的感染。抗生素的大量应用也使得耐药菌株越来越多, 多重耐药更加严重[2]。这一菌株可以感染人体的任何部位, 主要引起呼吸系统感染, 本研究结果显示, 痰是分离铜绿假单胞菌最多的标本, 达到66.6%, 且主要集中在ICU和呼吸内科科室, 与国内外很多文献报道一致[3,4], 可能与这些科室的住院患者类型有关, 这些患者多为老年患者, 对多种抗生素反应不是很敏感, 而且免疫力低下多见, 更易于感染和分离出铜绿假单胞菌。

356株铜绿假单胞菌对9种抗菌药物的药敏结果显示, 此菌对多种抗菌药物均有不同程度的耐药, 并且有多重耐药, 这可能与此菌的多重耐药机制和长期不合理应用大量抗生素有关[5]。本院分离的铜绿假单胞菌对喹诺酮类的药物左氧氟沙星耐药率最高, 达到57.0%, 可能与近几年来此类药物的广泛使用有关, 由于很多患者在没有看医生的情况下自行使用抗菌药物, 导致耐药率增加。有文献报道[6], 铜绿假单胞菌起初对β-内酰胺类的抗生素敏感, 常常被用来治疗此菌的感染。但是, 近年来许多菌株已经产生多重耐药机制, 本研究显示铜绿假单胞菌对β-内酰胺类的药物氨曲南有43.3%的耐药率, 仅次于左氧氟沙星。以亚胺培南为代表的碳青霉烯类的抗菌药物被公认为是控制铜绿假单胞菌感染的首选药物之一[3], 但是本院中此菌对亚胺培南的耐药率为中等耐药, 达到29.5%, 可能与此类药物在临床广泛应用, 导致铜绿假单胞菌外膜孔蛋白 (OprD2) 缺失有关, 因为该蛋白的表达降低或缺失会引起亚胺培南耐药。本院研究中对铜绿假单胞菌相对敏感的是三代头孢抗菌药物头孢哌酮/舒巴坦和氨基糖苷类药物, 所以临床经验性用药应首选这两类药物。

因此, 在临床用药中, 不能盲目应用不恰当的抗生素, 应进行药敏试验选择合适的抗菌药物。此研究对本院三年内分离的铜绿假单胞菌进行分析, 可以指导临床医生合理治疗和经验性用药, 有效的控制细菌的耐药趋势, 降低耐药菌株的产生, 同时监测此菌的临床流行情况, 对有效预防以及治疗该菌引起的感染也具有重要的指导意义。

参考文献

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[2]吴容, 府伟灵.重庆地区铜绿假单胞菌医院感染及耐药性分析.中华医院感染学杂志, 2004, 14 (1) :97-99

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[5]周齐艳.265株铜绿假单胞菌临床感染的分布与耐药性分析.2008, 3 (27) :40-41.

铜绿假单胞菌耐药机制的分析 篇5

1 材料与方法

1.1 标本来源

收集2011年11月至2012年12月本院住院患者的各类送检标本中分离的的铜绿假单胞菌154株。

1.2 检测方法

(1) 仪器试剂:仪器为长沙天地人自动微生物鉴定仪。MH琼脂、血琼脂、各种生化鉴定微量管购自杭州天和微生物有限公司;药敏纸片购自英国Oxoid公司。 (2) 方法:常规培养方法, 药敏结果判断标准参照CLsi2011年的标准。

2 结果

2.1 铜绿假单胞菌的分布情况:

从住院患者标本分离的154株铜绿假单胞菌中, 痰标本127株, 各种分泌物26株, 尿液1株。可见分离菌主要来自呼吸道标本。

2.2 铜绿假单胞菌在临床各科的分布情况:

154株铜绿假单胞菌中来自呼吸内科的52株, 内分泌科6株, 康复科46株, 干部科11株, 外科16株, 儿科7株, ICU10株, 五官科6株。可见, 铜绿假单胞菌主要分布于呼吸内科, 其次是康复科的慢性病患者。

2.3 铜绿假单胞菌对常用抗菌药物的耐药情况:

铜绿假单胞菌对米诺环素、头孢曲松、头孢唑肟耐药率达到50%以上, 对氟喹诺酮类、氨基糖苷类均低于20%, 对碳青霉烯类的美洛培南耐药率达到了7.8%。具体见表1。

3 讨论

铜绿假单胞菌在自然界中分布广泛, 为土壤中存在的最常见的细菌之一。各种水、空气、正常人皮肤、呼吸道和肠道等都有其存在。在水及潮湿的环境中极易生长, 并对抗生素和消毒剂有天然耐药质粒。随着侵入性医学治疗的发展, 本菌已成为医院内感染的主要致病菌[2]。本室通过追溯性统计分析, 了解铜绿假单胞菌对常用抗菌药物的耐药情况, 本地区的铜绿假单胞菌对米诺环素、头孢曲松、头孢唑肟的耐药率超过了50%。目前铜绿假单胞菌对头孢类抗菌素耐药机制报道最多的是, 细菌产生头孢菌素酶 (Ampc酶) , 此类酶是由染色体介导的。目前已发现50多种, 表现为对第一代至第三代头孢菌素、头霉类、氨基糖苷类和抗假单胞青霉素均耐药, 对四代头孢可显示敏感[3]。

分析发现有12株对碳青霉烯类耐药的铜绿假单胞菌, 产金属B-内酰胺酶是引起碳青霉烯类抗生素耐药的原因。金属B-内酰胺酶 (MBLs) 是一组活性部位为金属离子 (主要为Zn2+等) , 且必须依赖它们的存在才能发挥催化活性的酶类。能水解大多的B-内酰胺抗生素, 包括青霉素、头孢菌素、头霉素、碳青霉烯类, 从而造成耐药。自从1988年由日本发现的第一株以来, MBLs已发现了十多种[4], 给铜绿假单胞菌感染的治疗带来很大的困难。现在对碳青霉烯类的耐药机制是微生物界的热门课题, 在今后的学习工作中, 多注意这方面的知识更新。

本地区的铜绿假单胞菌对氟喹诺酮类抗生素耐药性都低于20%。氟喹诺酮类药物通过形成DNA-拓扑异构酶-氟喹诺酮类药物三元复合物, 阻止DNA-拓扑异构酶变化, 妨碍细菌DNA复制、转录, 以达到杀菌的目的。而拓扑异构酶的突变, 改变了三元复合物的亲和力, 抑制了氟喹诺酮的活性而产生耐药[5]。

总之, 铜绿假单胞菌的耐药机制极为复杂, 对抗生素的耐药不是由单一的因素造成的, 特别是多重耐药株的出现, 使其耐药机制更为复杂, 常是多重机制协同作用。这次分析中出现了5株全耐的泛耐药株, 给临床治疗带来很大困难。因此, 遏制抗生素滥用, 重视微生物检验, 规范药敏试验是关键。这更促使我们微生物工作者提高业务水平, 加快检验速度, 为临床的合理用药出一份力。

参考文献

[1]朱任媛, 张小江, 赵颖, 等.CHINET2011年北京协和医院细菌耐药性监测[J].中国感染与化疗杂志, 2012, 12 (6) :428-434.

[2]施凯舜, 赵先胜.医院耐亚胺培南铜绿假单胞菌的耐药机制研究[J].中华医院感染学杂志, 2010, 20 (14) :2005-2008.

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[4]郭仲辉, 黎毓光, 卓超.抗生素压力下铜绿假单胞菌耐药机制变化的动态研究[J].中国抗生素杂志, 2010, 35 (9) :715-720.

铜绿假单胞菌感染50例临床分析 篇6

关键词：铜绿假单胞菌,感染,临床

铜绿假单胞菌 (PA) 是临床常见的条件致病菌之一, 已成为医院感染的重要病原菌, 由于该菌对多种抗生素耐药, 而直接影响治疗及其预后, 因此临床应根据药敏结果合理使用抗生素是很有必要的, 现对我院2008年2月-2009年12月住院并发PA感染患者进行回顾性分析, 现报告如下。

1资料与方法

1.1 一般资料

2008年2月-2009年12月在我院住院的急危重患者及恶性肿瘤患者中并发PA感染共50例, 其中男32例, 女18例, 年龄2～81岁, 平均年龄41.5岁, ≥60岁16例。

1.2 诊断标准

诊断标准按《医院感染学》标准[1], 患者入院时不存在感染, 入院48h后发生的感染为医院感染, 所有病例均有细菌学培养阳性。

1.3 检测标本及方法

取痰、咽拭子、伤口分泌物、尿、血及胸腹水等进行分离培养及体外药敏试验, 培养物在血琼脂平板上经18～24h的培养, 形成扁、湿润、有金属光泽、有特殊气味的灰绿色或蓝绿色菌落, 菌落周围有透明溶血环, 凝为PA, 用法同梅里埃1032GN鉴定卡鉴定, 标准的质控菌株为ATCC27853, 药敏试验采用NCCIS推荐的K-B法测定, 药敏纸片采用北京天坊生物技术公司产品。

2结果

2.1 住院患者主要疾病

50例PA感染中, 鼻咽癌8例, 肺癌9例、结直肠癌3例, 脑干胶质母细胞癌2例, 重症肺炎9例, 烧伤15例, 重症脑外伤3例, 急性坏疽性阑尾炎1例。

2.2 PA感染发生部位

以呼吸道感染多见, 共26例占52.0%, 其次皮肤17例占34.0%, 消化道3例占6%, 尿2例占4%, 血液2例占4%。其中2例为多系统性, 均为烧伤患者, 见于烧伤创面、分泌物、血液等。

2.3 PA感染的危险因素

PA感染主要以白细胞下降、低蛋白血症和侵入性操作有关, 见表1。

2.4 药敏结果

多种抗生素纸片对所分离出的PA进行药敏试验, 其结果见表2。

2.5 治疗效果

治愈12例, 好转27例, 无效5例, 死亡6例。

3讨论

PA是人体皮肤正常菌群, 在机体免疫力下降及抗生素药物的作用下, 致使该菌生存空间增大而引起感染, 近来, 该菌的检出率不断增加, 且耐药性问题严重, 其耐药性发展速度之快, 与广泛不合理用药密切相关[2,3], 近2年PA在我院分离的致病菌中占第二位, 标本最多的是痰, 占52.0%, 说明PA已成为呼吸道感染的主要病原菌之一。

PA属G-杆菌假单胞菌属[4], 在自然界中广泛存在, 对人类属条件致病菌, 具有内毒素、外毒素、肠毒素、溶血素、弹性蛋白酶、DNA酶等多种毒力因子[5], 在某些条件下可以是人类正常菌群的一部分, 在健康人群中PA的携带率很低, 而在住院患者中, PA的携带率明显升高, 特别是重症患者、癌症放化疗患者、烧伤患者及手术后长期卧床患者感染机会更大, 主要以白细胞下降、低蛋白血症、侵入性操作等因素有关。 (1) 重症患者侵入性操作如:气管插管、气管切开、应用呼吸机等, 使支气管黏膜屏障的破坏。 (2) 癌症患者因放、化疗产生骨髓抑制, 中性粒细胞减少, 降低机体免疫功能和生理防御屏障作用, 同时又影响患者的营养状态及消化系统功能, 从而使机体抵抗力进一步下降。 (3) 烧伤患者因失血浆过多, 造成低蛋白血症, 加上广谱抗生素的不合理使用, 使交叉感染的机会增大。 (4) 手术后长期卧床患者由于营养差, 机体免疫力低。

根据结果显示, PA对抗生素的药敏情况, 氨苄PG敏感率为42%, 头孢他啶38%, 头孢呋辛28%, 丁胺卡那38%, 新霉素12%, 复方新诺明48%。多粘菌素B及泰能敏感率最高, 均达90%以上。其中对一、二、三代头孢类敏感性低, 耐药性较强, 这与临床长期持续应用头孢类药物治疗感染有关, 同时也与PA的机理有关。PA主要耐药机制有: (1) 产生抗菌药物灭活酶或抗菌药物修饰酶, 如产β-内酰胺酶、氨基糖苷钝化酶等。 (2) 改变抗菌药物作用的靶位, 从而逃避抗菌药物的抗药作用, 如PBPS和DNA螺旋酶等, 结构发生变化。 (3) 膜屏障主动外排, 限制药物达到其作用靶值。 (4) 形成生物膜[6], 同时, 该菌所具有的强大的运输、代谢和外排功能, 复杂的趋化性和调节机制使其能在不同的生态环境下生存[7], 因此对产酶菌株不应选择β-内酰胺类抗菌药物, 应首选多粘菌素B、泰能等。由于PA感染疗效和预后较差, 故应重视对PA感染的预防, 加强各种管理, 加强消毒隔离, 阻断传播媒介, 必须了解急危重患者, 癌症放、化疗患者及烧伤患者医院感染的易患因素, 预防白细胞下降、增强机体免疫力及临床医师根据药敏试验结果合理使用抗生素等, 对于预防PA感染是具有很重要的意义。

参考文献

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假单胞菌代谢尼古丁研究进展 篇7

关键词：尼古丁,假单胞菌,代谢途径,代谢相关基因,酶学性质

尼古丁(nicotine)属于吡啶族生物碱,又名烟碱,是多种烟草植物中所特有的、最重要的一种生物碱,是烟叶、卷烟烟气以及烟草废弃物中的主要有害成分,还是烟草主要致癌成分-亚硝胺的重要前体,早在1994年美国环保局就将尼古丁列入了有毒物质释放目录(Toxics Release Inventory, TRI);而且烟草加工过程中会产生大量含高浓度尼古丁的固、液、气态废弃物,这种废弃物在1999年被欧盟认定为“有毒有害废弃物”(“toxic and hazardous wastes”)[1],可见,尼古丁如不加处理将会严重污染环境并危及人类健康。

在这种情况下,去除烟草以及环境中的尼古丁就显得尤为重要,这其中生物学方法尤其是微生物转化的方法以其安全、高效、可持续性和能产生高附加值产品等优点显示出了巨大潜力。早在20世纪三四十年代,就有报道称已经从环境样品中分离出可降解尼古丁的微生物,从那以后,越来越多的具有尼古丁降解能力的微生物被分离出来。在已经报道的菌株中,一半以上属于节杆菌属(Arthrobacter sp.)和假单胞菌属(Pseudomonas sp.)[2,3]。目前,节杆菌属降解尼古丁的代谢途径、分子生物学和生物化学机制已经基本明确(Brandsch, 2006)[3],而假单胞菌属微生物降解尼古丁的研究还不甚完善,直到近期才取得突破性进展。

本文将主要针对假单胞菌,从菌株种类、代谢途径、代谢相关基因和酶学机制等方面阐述假单胞菌属微生物降解尼古丁的研究进展。

1 可降解尼古丁的假单胞菌种类

对假单胞菌属微生物降解尼古丁的研究始于1953年,Wada和Yamasaki从土壤中分离到Pseudomonas sp. No.41,并开始研究其代谢途径[4,5]。1978年,Thacker等分离出尼古丁降解菌株Pseudomonas convexa Pc1,开始研究其分子生物学机制[6]。而直到2004年,王书宁等分离出尼古丁高效降解菌Pseudomonas putida S16[7]后,才陆续有新的拥有尼古丁降解能力的假单胞菌属微生物被报道出来:2005年,研究者报道分离出Pseudomonas sp. HF-1 [8],之后,Pseudomonas putida J5[9]、Pseudomonas putida ZUTSKD [10]、Pseudomonas sp. Nic22 [11]、Pseudomonas putida ZB-16A [12]、Pseudomonas sp. HZN6[13]以及Pseudomonas sp. CS3[14]等多株假单胞菌菌株被发现具有尼古丁降解能力。这些菌株大都能以尼古丁作为唯一碳氮源,都是嗜中温菌,最佳生长温度一般在30 ℃,最适生长pH在7左右(6.4～7.5)。在这些菌株中,耐受尼古丁能力最强的是P. putida ZB-16A和S16,最高能耐受6 g/L的尼古丁,其次是P. putida ZUTSKD,其最高耐受尼古丁浓度为5.8 g/L[10],除了Pseudomonas sp. HF-1对尼古丁的耐受浓度为1.6 g/L之外,其他菌株的耐受浓度则一般在4 g/L左右。目前已经报道的可降解尼古丁的假单胞菌属菌株如表1所示。

2 假单胞菌降解尼古丁的代谢途径

以前的研究发现,微生物降解尼古丁主要有三种途径:吡啶途径(Pyridine pathway)、吡咯途径(Pyrrolidine pathway)和脱甲基化途径(Me pathway)[2,3,15]。随着对微生物降解尼古丁的研究日益深入,现在又有不同的代谢途径和中间代谢产物被报道出来。

对假单胞菌属微生物尼古丁代谢途径的研究始于1953年,Wada和Yamasaki研究Pseudomonas sp. No.41时提出尼古丁的代谢或从吡啶环的羟基化作用,或从吡咯烷的脱氢作用开始,并推测了尼古丁的代谢途径[4,5]。1978年,Thacker等在P.convexa Pc1中发现了中间代谢产物假氧化尼古丁(pseudooxynicotine,PN)、3-琥珀酰吡啶(3-succinoyl pyridine,SP)、6-羟基-3-琥珀酰吡啶(6-hydroxy-3-succinoyl pyridine,HSP)、2,5-二羟基吡啶(2,5-dihydroxy pyridine,DHP)等[6,16]。但是之后关于假单胞菌属代谢尼古丁的研究几乎停滞。

2004年研究者从烟草土壤环境中筛选到一株尼古丁高效降解菌株P.putida S16,并在生长体系、休止细胞体系和粗酶液体系中分别验证了该菌株代谢尼古丁的途径,并对各种产物进行分析鉴定,最终明确了关键代谢产物的结构,如SP、HSP、DHP,也成功检测到了PN、N-甲基麦喔斯明(N-methylmyosmine,P)、3-羟基丁酸(3-hydroxybutyric acid)和琥珀酸(succinic acid),值得注意的是,1-丁酮-4-羟基-1-(3-吡啶)(1-butanone, 4-hydroxy-1-(3-pyridinyl))作为尼古丁代谢过程中的新物质也被检测出来。至此,尼古丁代谢的吡咯途径被完整地推测出来,这也验证了上世纪Wada等提出的代谢途径[17]。如图一所示:该途径从尼古丁的吡咯烷脱氢生成P并进一步打开生成PN开始,PN通过氧化和去甲胺生成SP,之后吡啶环通过羟基化生成DHP,再经由氧化反应而打开。

2005年,研究者在分离到的尼古丁高效降解菌株Pseudomonas sp. HF-1的中间代谢产物中检测到了哺乳动物细胞代谢尼古丁的标志性产物可替宁(cotinine)、去甲基尼古丁(nornicotine)和麦喔斯明(myosmine),并首次在假单胞菌中检测到尼古提林(nicotyrine),同时还鉴定出了与P.putida S16中间代谢产物一致的SP和HSP,但是并未检测到P.putida S16的中间代谢产物P[8,18],这说明假单胞菌属中还存在多种不同的代谢途径,但是这些代谢途径之间又有一定的相似性。有趣的是,研究者还发现用尼古丁液体培养基和尼古丁平板培养Pseudomonas sp. HF-1时,培养液都会变成淡绿色,并发现这是因为在尼古丁代谢过程中生成了一种淡绿色素[8]。

2008年,研究者在Pseudomonas sp. ZUTSKD的尼古丁降解过程中检测到了四种中间代谢产物:2,3-二吡啶(2,3-bipyridine)、可替宁、3-羧基-吡啶(3-pyridinecarboxylic acid)以及尼古丁去甲基生成的3-(2,3,4-三氢-5-吡咯基)-吡啶(3-(3,4-dihydro-2H-pyrrol-5-y1)-pyridine)[10]。除此以外,研究者在Pseudomonas sp. Nic22的代谢产物中也检测到了麦喔斯明、2,3-二吡啶和可替宁,这与Pseudomonas sp. HF-1的代谢产物十分类似[11]。2011年,研究者发现尼古丁降解菌Pseudomonas sp. CS3的代谢产物中也检测到(2,3,4-三氢-5-吡咯基)-吡啶、1-methyl-5-(3-pyridyl) pyrrolidine-2-ol 以及可替宁 [14]。说明这株菌可能采用一条全新的代谢途径。

2011年,研究者发现菌株Pseudomonas sp. HZN6尼古丁代谢采用吡咯途径,并检测到与已报道的S16中间代谢产物一致的PN、SP和HSP,还首次证明了在尼古丁代谢中存在3-琥珀酰半醛吡啶(3-succinoylsemialdehyde-pyridine,SAP)[13,19]。

这些都为假单胞菌尼古丁代谢途径的多样性提供了有力证据。图1为目前假单胞菌属报道的尼古丁代谢途径。

3 假单胞菌尼古丁代谢的相关基因

1953年,Wada和Yamasaki发现尼古丁降解菌Pseudomonas sp. No.41在葡萄糖和铵盐存在时不能利用尼古丁,并由此推测该菌株代谢尼古丁可能是诱导的结果[4,5]。

1978年,Thacker等用丝裂霉素消除质粒和接合转移的方法证明菌株P. convexa Pc1对尼古丁和烟酸的降解是由NIC质粒介导的,并发现该质粒与P.putida中的其它代谢质粒如CAM、OCT、NAH、SAL和TOL有很好的相容性;随后又通过转导的方法发现当NIC质粒从菌株P.convexa Pc1转移到P.putida PpG1中时会解离为能够带动染色体基因转移的独立育性因子T和非转移性的NIC结构基因质粒[6,16],但后来未见到关于该菌深入研究的进一步报道。

2008年,假单胞菌降解尼古丁的分子生物学研究又取得了新的进展。研究者用构建P.putida S16基因组文库的方法筛选出了具有尼古丁降解能力的阳性克隆GTPF,它含有降解尼古丁的nic基因簇(4879 bp),能够将尼古丁转化为P、PN、SP、HSP和DHP。分析nic基因簇发现,它包含三个ORF,其中936 bp的ORF2编码的6-羟基-3-琥珀酰吡啶羟化酶HspA(6-hydroxyl-3-succinoylpyridine hydroxylase, HSP hydroxylase)能够催化HSP直接生成DHP[20]。ORF1位于ORF2的下游,编码尼古丁氧化还原酶NicA,在该酶的作用下,尼古丁通过PN的中间过渡形成了SP [21]。之后对野生蛋白纯化获得的HspB蛋白进行N端测序并配合P.putida S16基因组的数据找到了编码该酶的基因hspB,发现该酶是HspA的同工酶,同时又通过基因突变的方法找到了HspB的FAD结合域。基因敲除实验中,由于hspA的敲除突变株与S16野生型在尼古丁培养基中的生长情况基本一致,其降解HSP的速率与野生型也没有显著差别;而hspB的敲除突变株却不能在尼古丁培养基中生长,同时,该突变株基本丧失了HSP降解能力,说明hspB是P.putida S16降解尼古丁和HSP转化过程中的关键基因[22]。2011年,P.putida S16的全基因组测序和拼接工作完成,显示P.putida S16的基因组包含有一个长度为5984790 bp的环状染色体,GC含量为62.3%,不包含质粒[23]。

2009年,通过丝裂霉素处理等方法处理Pseudomonas sp. HF-1获得了该菌株的质粒缺失突变株6-13,该突变株缺失了尼古丁降解能力,回复突变之后又获得了尼古丁降解能力,导入该质粒的E.coli Top10也获得了尼古丁降解能力,说明Pseudomonas sp. HF-1的尼古丁降解基因位于该质粒上,并将其命名为pMH1[24]。之后采用SEFA-PCR技术完成了质粒pMH1的全序列测定,其大小为23315 bp,G+C含量分析显示其可在环境中持久稳定存在。通过生物信息学方法进行序列分析和功能预测,发现该质粒上不仅含有与质粒复制和转移有关的基因,还含有催化HSP转化为DHP的基因hsp以及催化PN生成SP和甲胺的基因amo,其中hsp在质粒上有2个拷贝,该基因也是S16的一个关键基因。含有一个小而稳定存在的降解质粒,并包含多部分尼古丁降解基因的重复序列,这可能是Pseudomonas sp. HF-1快速降解尼古丁的主要分子机制[24,25]。

2009年,通过研究尼古丁降解菌P.putida J5,利用mini-Tn5转座子插入突变技术获得了一个尼古丁降解缺陷型突变株,该突变株不能在尼古丁作为唯一碳源的培养基上生长,但在添加葡萄糖的情况下能够生长。通过序列分析,发现Tn5转座子的插入位点位于酮泛酸羟甲基转移酶(ketopantoate hydroxymethyltransferase,panB)的编码区内,并和E.coil K-12菌株的panB基因有54%的同源性。当panB基因缺失时,P.putida J5失去了降解尼古丁的能力,而重新转入panB基因后,该突变株能够恢复到野生型菌株降解尼古丁的活性水平,说明panB基因编码了P.putida J5降解尼古丁过程中的一个关键性酶[26]。

2011年,研究者通过Tn5转座子插入突变技术获得了Pseudomonas sp. HZN6的一个插入突变株N6m1,该突变株的尼古丁降解在生成SP之后被阻断了。又通过SEFA-PCR等方法找到该突变位点所在的一个长4583 bp的DNA片段,并在该基因簇上发现了基因orfC,该基因与Pseudomonas stutzeri A1501的硫转移酶同源基因sirA2的氨基酸序列有高达89%的相似性。研究者发现orfC的突变株丧失了降解SP的能力,而通过回补实验将orfC基因和KT2440的sirA2基因分别重新导入HZN6后,突变株恢复了SP降解能力,证明orfC基因对HZN6降解尼古丁过程中SP的代谢至关重要[13]。2012年,该课题组又通过构建基因组的Tn5转座子随机突变文库,筛选到尼古丁降解能力缺陷型突变株N6mC8,该突变株可转化尼古丁积累PN,通过SEFA-PCR技术得到了一段3874 bp的DNA片段并从中分析出两个ORF,再采用生物信息学分析方法确定了Pseudomonas sp. HZN6中的两个与尼古丁代谢相关的ORF:pao 和 sap。其中pao基因是一段1494 bp的序列,与Arthrobacter nicotinovorans的6-羟基-L-尼古丁氧化还原酶基因有29%的相似性,与菌株Bartonella henselae的乙醛脱氢酶基因有49%的相似性。该基因编码了假氧化尼古丁胺氧化酶(PNAO),催化PN去甲胺生成SAP。pao基因的敲除突变株不能以尼古丁或PN为唯一碳氮源生长,但是能将尼古丁转化为PN,在回补了pao基因后,该菌株在尼古丁中的生长状态与野生型一致,说明pao基因是HZN6尼古丁代谢的关键基因。sap基因长1434 bp,编码了依赖于NADP+的3-琥珀酰半醛-吡啶脱氢酶(SAPD),催化SAP生成SP,sap的敲除菌株在尼古丁中的生长情况与野生型菌株相差不大,仍能以尼古丁为唯一碳氮源生长,由此推断sap基因不是HZN6中尼古丁代谢的关键基因。这些都补充了假单胞菌属尼古丁代谢的分子机制[19]。

4 假单胞菌降解尼古丁的酶学机制

目前已经报道了P.putida S16中的3个尼古丁代谢相关酶,分别为尼古丁氧化还原酶NicA、6-羟基-3-琥珀酰吡啶羟化酶HspA和HspB。NicA催化尼古丁经由PN的中间过渡生成SP:尼古丁首先在NicA的催化下被氧化成P,P又自发水解生成2-羟基尼古丁,然后自动开环生成PN,PN又在NicA的催化下生成SP。该酶大小为66.2 kDa,是FMN依赖型酶。Cu2+、Hg2+和Ag+会强烈抑制该酶的活性,Ca2+、Co2+、Mg2+对酶活有轻微的促进作用,而Mn2+对酶活没有显著影响[21]。HspA催化HSP直接生成DHP,分子量约为38 kDa,依赖NADH,其氨基酸序列与已知功能的蛋白没有相似性,是一个全新的酶[20]。HspB是HspA的同工酶,催化HSP生成DHP,是尼古丁降解过程中的关键酶。该酶在活性状态下以同源二聚体的形式存在,单个亚基大小为40 kDa,依赖NADH,与NADH的结合比率是1:1,0同时每个亚基各含有一个FAD结合域。该酶的最适催化pH和最适反应温度分别是pH 8和25 ℃,在最适条件下的酶活为4.8 μmol ·min-1mg-1;Km和kcat值分别为0.175 mM 和2.0 s-1。该酶并不需要金属辅因子,Cu2+和Zn2+能够完全破坏酶活力。研究其催化机制时,通过18O2标记的方法发现DHP 5位上的O原子来源于O2,而非来源于水。HspB与HspA的相似性只有10.9%,但活性是HspA的40倍,是P. putida S16降解尼古丁和HSP转化过程中的关键酶[22]。

对于Pseudomonas sp. HZN6中的尼古丁代谢相关酶,已报道的有假尼古丁氨基氧化酶(PNAO)和琥珀酰半醛吡啶脱氢酶(SAPD)。PNAO催化PN氧化生成SAP,分子量为54.101 kDa,活性状态下以同源二聚体形式存在,是非共价键结合的FAD结合蛋白。其最适pH为8.0,最适反应温度为35 ℃,Km和kcat值分别为(0.247±0.019) mM 和(151±14) s-1,其活性受到Ag+、Co2+、Cu2+和 Hg2+的抑制,而Ca2+、Mg2+、Mn2+、Ni2+和Zn2+则对酶活没有影响,PNAO 对尼古丁、γ-N-methylaminobutyrate、γ-aminobutyrate、spermidine、spermine、sarcosine、methylamine、imethylamine、dimethylglycine和3-(methylamino)proprylamine等均没有催化活性,对PN具有特异的催化活性,是HZN6中尼古丁代谢的关键蛋白。SAPD能够催化SAP氧化生成SP,分子量为51.246 kDa,活性状态下以同源四聚体形式存在,不是黄素蛋白,是NADP+依赖型的酶,因其还能催化甲醛和乙醛氧化生成甲酸和乙酸,故其底物并无SAP特异性[19]。

5 结论与展望

假单胞菌属是一类重要的尼古丁降解菌属,它们一般都能耐受高浓度的尼古丁。目前,越来越多的有尼古丁降解能力的假单胞菌被分离出来,但是目前已经确定到种的假单胞菌都属于Pseudomonas putida[15],因此获得新型尼古丁降解假单胞菌对丰富可降解尼古丁的微生物资源以及进一步研究假单胞菌的尼古丁降解机制是十分必要的。

假单胞菌的尼古丁代谢途径复杂而多样:比较完整的一条是P.putida S16代谢的吡咯途径,尼古丁首先生成P[17];其他几条途径中尼古丁分别被转化成可替宁、尼古提林、去甲基尼古丁、(2,3,4-三氢-5-吡咯基)-吡啶和1-methyl-5-(3-pyridyl) pyrrolidine-2-ol[8],然而这几条途径目前仍不完整,需要进一步进行中间产物的分离与鉴定以绘制完整的尼古丁代谢途径。

目前,烟草工业在合规经营方面主要面临两个重大挑战:如何控制并减少烟草产品中的尼古丁含量以及减少尼古丁对环境造成的不利影响[15]。在改善烟草品质上方面,假单胞菌属微生物在高效降解尼古丁的同时,并不会影响烟草产品的口味与成分,如Pseudomonas sp. Nic22的粗酶液已经被证明能够降解尼古丁而有效改善烟叶质量[11]。除此之外,假单胞菌降解尼古丁还可用于高附加值中间产物的积累,如2005年研究者利用P.putida S16的休止细胞体系成功转化尼古丁废弃物制备了HSP(化学方法无法合成的药物前体),这是一个通过生物转化变废为宝的典范 [26,28]。但是目前很少有关于假单胞菌大范围应用于烟草废弃物治理的报道,可见,对假单胞菌降解烟草废弃物的研究还局限在实验室范围内,其在实际生产中的应用还有待进一步测试与改良。