革兰氏染色（精选5篇）
革兰氏染色 篇1
革兰氏染色法是细菌学中最基本, 最重要的鉴别染色技术。它是1884年由丹麦细菌学家Christain Gram建立的, 而后一些学者在此基础上作了某些改进[1]。革兰氏染色法的基本步骤是:将干燥固定好的涂片先用初染剂结晶紫进行染色, 再用碘液媒染, 然后用乙醇 (或丙酮) 脱色, 最后用复染剂 (如复红) 复染。经此方法染色后, 细胞保留初染剂蓝紫色的细菌为革兰氏阳性菌;如果细胞中初染剂被洗脱而使细菌染上复染剂的颜色 (红色) , 为革兰氏阴性菌[2]。革兰氏染色鉴定反应受多种因素影响, 如染色液的质量及脱色剂乙醇含量, 染色的PH环境, 脱色的时间, 另外对数期生长细菌反应典型而衰老或死亡G+菌结果呈G-反应[3], 染色可能出现革兰氏变性 (阳性与阴性不规则出现) , 此种情况过于复杂影响因素太多, 为了得到最高的准确率, 必须对诸多影响因素加以分析, 需要对该方法进行简化改进。
1 革兰氏染色的影响因素
1.1 培养菌的菌龄
革兰氏染色要求菌种被染色时处于对数增殖期, 此时菌体的细胞壁的成分和结构最为典型, 经革兰氏染液染色处理后, 能典型正确地反映染色的结果, 若菌体细胞未成熟或已老化, 染色结果可能会出现完全相反的情况, 造成假阳性或假阴性的产生。我们对不同培养时间的大肠埃希菌作了革兰氏染色试验分析。如表1。
我们对不同培养时间的肠球菌作了革兰氏染色试验分析如表2。
由表1表2可见, 培养时间对革兰氏染色结果影响巨大。其中, 大肠埃希菌培养时间24h左右为宜, 而肠球菌培养时间15h左右为宜。实验对比也从侧面反映出不同菌种对培养时间有不同的要求。
1.2 涂片的厚度
涂片时, 先在载玻片上滴加一滴生理盐水, 再用灼烧过且冷却的接种环取少量培养基上的细菌与玻片上的盐水相混合, 从中央逐步向外围涂开, 厚度以肉眼稍觉浑浊即可。若涂片太厚, 菌体在中央集中, 影响观察效果。若涂片太薄, 菌体过于稀少, 观察时难以找到视野。用直径2mm的接种环培养24h的大肠埃希菌满环, 半环, 更少量, 均匀涂片, 直径12—15cm, 革兰氏染色, 实验结果如表3。
表3结果表示, 涂片菌膜过厚时, 因大肠埃希菌密集成堆造成不易脱色或脱色不完全而常常呈G+反应;涂片薄而均匀能得到正确结果。
1.3 媒染时间对染色结果的影响
对于G-菌而言, 媒染时间过长容易造成假阳性。可能与媒染时间过长使结晶紫复合物和细胞结合过紧有关。
1.4 脱色时间对染色结果的影响。
革兰染色法是细菌学中最经典, 应用最广泛的染色法之一。脱色是影响革兰氏染色的关键步骤, 脱色时间长短直接关系到染色结果的准确性。规范的乙醇脱色使革兰氏阳性菌细胞壁脱水, 肽聚糖层网状结构孔径缩小, 通透性降低, 从而使结晶紫—碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内。但通透性降低不等于无通透性不易被洗脱不等于不被洗脱。因此, 若脱色时间过长, 革兰氏阳性菌也有可能被脱色, 成为假阴性菌。同样若脱色时间不足, 革兰氏阴性菌细胞壁的部分类脂质未被乙醇溶解, 使结晶紫—碘的复合物不能被洗脱出来成为假阳性菌, 初学者难以掌握。我们选择5s至90s的脱色时间范围, 分7个时间分别进行试验。革兰氏阳性菌的试验结果见表4, 革兰氏阴性菌的试验结果见表5。
表4表5结果表示, 革兰氏染色的最佳脱色时间是25s。
1.5 干燥的温度
细菌涂片一般让它自然干燥, 有时为了干燥快些, 可以把涂片很小心地在酒精灯火焰上轻轻摆动, 温度以不超过手背的耐受为限。若温度太高, 细菌会发生菌体变形, 影响结果观察。
1.6 固定的操作
固定的目的是为了杀死细菌, 使涂抹在玻片上的菌体很好地附着其上, 防止被水冲掉, 因为死的蛋白质比活的蛋白质着色力更强。因此固定时, 玻片慢慢地在火焰上通过2-3次, 使菌体受热附着在玻片上。当固定温度不够, 菌体固着不够牢, 则很易被洗脱。
2 革兰氏染色辅助鉴别
长期实践表明, 革兰氏染色常因各种因素造成误差, 引起结果不稳定, 如菌龄不同, 操作方法不当等。为了提高结果的准确性, 可采用氢氧化钠拉丝反应作为辅助鉴别实验。本方法是:在干净的载玻片上滴1滴3g/dl Na OH, 再从固体培养基上挑取一较大的菌落, 把菌落放在Na OH液滴上, 用接种环在液滴上研磨10-15s, 然后将接种环提起, 在黑色背景下观察;60s内出现细丝为拉丝反应阳性, 不出现细丝为拉丝反应阴性, 同时与革兰氏染色结果作对照比较。氢氧化钠拉丝阴性的细菌符合革兰氏阳性, 氢氧化钠拉丝阳性的细菌符合革兰氏阴性。
3 革兰氏染色改良方法。
3.1 快速法
具体步骤是: (1) 在固定好的涂片上, 滴加结晶紫液2滴, 再加入0.5mol/LNa HCO3缓冲液2滴, 摇动3~5s后冲洗。 (2) 滴加碱性碘溶液几滴, 摇动3~5s后冲洗。 (3) 滴加脱色剂液几滴, 摇动3~5s后冲洗。 (4) 滴加碱性复红液几滴, 摇动3~5s后冲洗, 待干镜检。
3.2 三步法
具体步骤是: (1) 取少量菌种均匀涂片, 干燥, 固定 (2) 结晶紫1min, 水洗 (3) 碘液1min, 水洗 (4) 0.4%复红酒精30s, 水洗; (5) 干后镜检。对几种革兰氏染色法进行了实验对比如表6。
4 总结与讨论
革兰氏染色法, 是广大微生物工作者在微生物基础实验中最常用的方法之一, 也会在未来的细菌学研究中扮演着重要角色;因此, 熟练掌握, 并且大胆创新革氏染色法有着非常重要的意义。进行革兰氏染色时, 除操作正确适当外, 更重要的是:对不同菌种选择适合菌龄, 准确把握脱色时间, 采用先进的三步法, 并且必要时对结果辅助鉴别。
参考文献
[1]俞树荣.微生物学和微生物学检验 (第二版) [M.]北京:人民卫生出版社, 2001:9~104.
[2]周德庆.微生物学教程[M.]北京:高等教育出版社, 1993, 18~401.
[3]俞树荣.微生物学和微生物学检验 (第二版) [M.]北京:人民卫生出版社, 2001, 9~104.
革兰氏染色 篇2
使用梅里埃ATB微生物鉴定系统，原理见鉴定系统操作规程。3 标本要求
（1）标本类型：血液，骨髓，脑脊液，胸水，腹水，尿液，等体液；痰液，前列腺液，脓液，组织分泌物或穿刺液等。
（2）标本采集：见标本采集手册
（3）标本储存和运输：室温放置，室温运输并立即送检。
（4）标本拒收状态：非无菌方式采集的标本或未按要求部位采取的标本。容器和添加剂类型
均使用灭菌器皿盛放标本试剂
（1）试剂名称：革兰氏染液、氧化酶试剂、3%触酶、血平板、中国蓝平板、SS平板、柯玛嘉平板、相关生化试剂等。6仪器设备：
（1）接种针、接种环、酒精灯
（2）梅里埃ATB药敏鉴定仪
（3）显微镜、SPX-150B型生化培养箱、超净工作台、台式离心机、天平校准程序
(送市计量质量检测研究所校准)
8操作步骤
革兰氏阳性球菌
9质量控制：
参加我科质量管理小组组织的各项质量控制活动 10患者检验结果的可报告区间
细菌鉴定到种或属，同时报告药物敏感试验结果。11 临床意义：
革兰氏染色 篇3
1 材料与方法
1.1 材料
慢性胃溃疡胃黏膜组织标本、载玻片、盖玻片、中性树胶。仪器与试剂:切片机、碘化钾、碘片、碱性品红、冰醋酸、甲醛、蒸馏水、二甲苯。
1.2 试验方法
1.2.1 染色液配制方法。
革兰氏碘液:称取2g碘化钾先用10ml的蒸馏水彻底溶解, 再称1g的碘片加入, 加蒸馏水至100ml使其溶解, 过滤后备用。0.25%的碱性品红液:称取250mg碱性品红加蒸馏水至100 ml溶解, 过滤后备用。Gallego’s分化液:2份的甲醛加1份的冰醋酸。
1.2.2 染色。
(1) 切片按常规脱蜡至水。 (2) 染于革兰氏碘液中1 min, 蒸馏水洗。 (3) 在0.25%的碱性品红中染色1min, 蒸馏水洗。 (4) Gallego’s分化液中分化数秒钟, 立即水洗。 (5) 二甲苯透明, 中性树胶封片。学生显微镜观察。
2 结果
镜下幽门螺旋杆菌呈紫红至红色, 细胞核红色, 背景清晰。
3 讨论
改良的革兰氏染色法简单, 细菌形态明显, 可以判断细菌的形态、染色性。其中要注意碱性品红的染色时间随室温增高, 应相应的缩短染色时间, 原则是要过染后分化。分化时间不宜过长, 数秒钟内完成即可, 否则不仅使背景褪色, 而且所染上的幽门螺旋杆菌、细胞核也会一并褪色。
革兰氏染色 篇4
关键词：外科感染,病原菌,耐药性
外科感染是医院感染最常见的原因之一,其感染原因复杂,多与手术创面的微环境、患者自身免疫状态、住院时间的长短、医院环境卫生条件和护理质量密切相关[1]。通过外科感染性标本的微生物学分析,了解外科感染的病原菌和耐药性现状,为指导临床合理使用抗生素,控制感染具有重要的临床意义。为此,对我院外科患者感染送检的标本,培养分离病原菌及其对抗菌药物耐药性进行回顾性分析,报道如下。
1材料与方法
1.1 标本来源
2007年1月至2009年6月广州地区医院外科患者感染后送检的标本,检出革兰氏阴性杆菌共909例,其中胆汁(180例)、脓(127例)、尿(118例)、血(106例)、分泌物(103例)、排泄物(62例)、痰(49例)、腹水(44例)、其他标本(120例),同一患者同一部位的相同细菌不作重复统计。
1.2 菌株鉴定
分离培养和鉴定严格按照《全国临床检验操作规程》,用常规方法进行菌株分离培养,挑取可疑菌落经革兰氏染色、氧化酶试验初筛出氧化酶试验阴性的革兰氏阴性杆菌和氧化酶试验阳性的革兰氏阴性杆菌,纯分离后采用VITEK-32全自动微生物分析仪进行菌株鉴定。质控菌株大肠埃希菌ATCC25922和铜绿假单胞菌ATCC27853购于广东省临床检验中心。革兰氏阴性细菌鉴定卡及药敏板购于法国梅里埃生物有限公司。
1.3 药敏试验
采用GN-10 药敏卡或GN-13药敏卡进行药敏试验,实验严格按操作说明书进行。药敏结果按照美国临床实验室标准化委员会(NCCLS) 推荐标准解释。
1.4 统计学方法
采用WHONET 5.3软件分析。
2结果
2.1 病原菌分布
909例外科感染常见革兰氏阴性病原菌分布构成比中,大肠埃希菌和铜绿假单胞菌占据主要地位,分别为52.70%和18.15%,肺炎克雷伯菌占16.61%,排第三位;阴沟肠杆菌6.38%,排第四位;最后是鲍曼不动杆菌6.16%。
2.2 细菌药敏测试结果
6种常见革兰氏阴性菌的药物敏感性试验结果见表1。其中碳青霉烯类(亚胺培南、美洛培南)对革兰氏阴性杆菌作用最强。除此之外,大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌对哌拉西林/他唑巴坦、头孢替坦、阿米卡星和妥布霉素<20.3%;大肠埃希菌对呋喃妥因耐药率是4.1%;肺炎克雷伯菌对左旋氧氟沙星耐药率是20.2%,其他抗菌药物耐药率均>30. 0%;阴沟肠杆菌对哌拉西林、替卡西林、替卡西林/克拉维酸和头孢噻肟敏感率高达100%。铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌多重耐药较为严重,只有阿米卡星和亚胺培南较为敏感。大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌ESBLs检测中,大肠埃希菌ESBLs阳性率58.7%(269/479);肺炎克雷伯菌ESBLs阳性率42.5%(87/151)。
注:“-”为未测试
3讨论
随着外科技术不断发展,手术的难度越来越大,并发症也相对增多,导致医院感染的发生率不断增加,其中以感染最为常见[2]。目前,术后切口感染是外科遇到的棘手问题,被列为医院感染监测的重要内容之一[3]。各种外科手术均为切入性操作,在治疗疾病的同时,也打破了人体免疫屏障,造成创面暴露、失液、失血,且术前、术中、术后接受大剂量抗菌药物治疗,更易引起病原体入侵导致切口感染。
通过对外科手术后感染的病例进行统计分析,发现909株病原菌中,大肠埃希菌的检出率最高(52.70%),其次是铜绿假单胞菌(18.15%)、肺炎克雷伯菌(16.61%)、阴沟肠杆菌(6.38%),最后是鲍曼不动杆菌(6.16%)。近年由于β-内酰胺类抗菌药物的大量使用,导致产ESBLs株明显增加,分别是大肠埃希菌58.7%,肺炎克雷伯菌42.5%,与文献报道接近[4]。本组数据显示:大肠埃希菌对亚胺培南、美洛培南最为敏感分别在99.3%～100%居首位,头孢替坦的敏感性居第二位98.9%,哌拉西林/他唑巴坦的敏感性96.9%居第三位。呋喃妥因对其敏感性为95.9%高于肺炎克雷伯菌。肺炎克雷伯菌也是对亚胺培南、美洛培南最为敏感分别在96.6%～100%,居首位,但环丙沙星和左旋氧氟沙星对其敏感性为71.3%和79.8%,远高于大肠埃希菌。对其他抗菌素的敏感性与大肠埃希菌基本一致。ESBL是质粒介导的一种水解酶,它的基因可以被整合、携带、播散,是造成致病菌多重耐药和爆发流行的原因。目前治疗产酶菌株感染,可选用碳青霉烯类、酶抑制剂/复合剂类抗菌药物。
阴沟肠杆菌对亚胺培南、美洛培南最为敏感分别在84%～100%,居首位,敏感性占第二的是头孢吡肟80.8%。阴沟肠杆菌属肠杆菌科的细菌,易产染色体头孢菌素酶(AmpC),对三代头孢菌素有很高的水解活性[5]。所以,四代头孢菌素能更有效治疗肠杆菌科的细菌引起的感染。
铜绿假单胞菌对阿米卡星,美洛培南,妥布霉素和头孢吡肟,哌拉西林/他唑巴坦,亚胺培南和庆大霉素,左旋氧氟沙星的敏感性分别为94.4%,90.9%,90%,88.8%,87.8%,83.3%。而氨苄西林,氨苄西林/舒巴坦,头孢唑啉,头孢替坦,呋喃妥因,四环素的耐药率均在90%以上。铜绿假单胞菌多药耐药情况较为严重,这可能是由于其多种耐药机制(膜通透性改变、泵出机制、孔蛋白缺失以及生物膜的形成)有关,而且常常多种药物敏感性检测体外敏感而体内效果不佳[6]。
鲍曼不动杆菌对阿米卡星100%敏感,亚胺培南、美洛培南耐药率在63.2%～76.3%之间,属较为敏感;其他抗菌药物的耐药率在31.6%～100%。其耐药机制可能与外排泵系统的存在和高表达的TEM型、AmpC等β-内酰胺酶有关。
革兰阴性杆菌在外科手术感染中占重要地位,其对抗生素的耐药性逐年上升。临床在抗感染治疗前,应及时采集标本,作病原学检测及药敏试验,并根据药敏试验结果选择抗菌药物,最大限度地避免更多耐药菌株的产生。同时密切监测手术后感染病原菌的变化,对抗生素的使用应遵循轮换原则,是对预防治疗外科感染的治疗手段之一。
参考文献
[1]姚正国,范秋莲,姚月球,等.外科手术切口感染的病原菌耐药性调查.中华医院感染学杂志,2004,14(5):593-594.
[2]余利君.新加坡医院手术部位感染的控制.中国实用护理杂志,2006,22(3):72.
[3]常家聪,胡凯峰,朱广玉.外科手术后医院感染常见病原菌的耐药性分析.中华医院感染学杂志,2008,18(8):1450-1452.
[4]王辉,陈民钧,倪语星,等.2003-2004年中国十家教学医院革兰阴性杆菌的耐药分析.中华检验医学杂志,2005,28(12):1295-1303.
[5]徐英春,王贺,孙宏莉,等.细菌耐药监测让我们走进临床.中华检验医学杂志,2007,30(5):485-488.
革兰氏染色 篇5
1 材料与方法
1.1 菌株来源
2004～2008年福清地区住院和门诊患者送检的标本, 包括血液、痰液、中段尿、伤口分泌物、脑脊液、胸水、腹水等, 共培养出1193例革兰氏阴性杆菌。
1.2 试剂
药敏纸片丁胺卡那 (AN) 、哌拉西林 (PIP) 、氨苄西林 (AM) 、头孢唑啉 (CZ) 、头孢噻肟 (CTX) 、环丙沙星 (CIP) 、头孢他啶 (CAZ) 、哌拉西林/他唑巴坦 (TZP) 、头孢哌酮/舒巴坦 (CFS) 、庆大霉素 (GEN) 、左氧氟沙星 (LEV) 、复方新诺明 (SXT) 等全部购自杭州市天和微生物有限公司, M-H琼脂粉亦购自杭州市天和微生物有限公司。
1.3 实验方法
细菌鉴定使用法国生物梅里埃公司的VITEK 60鉴定系统, 药敏试验采用纸片扩散法 (K-B) 或采用法国生物梅里埃公司的VITEK 60药敏试验系统, 药敏试验结果判断根据美国临床实验室标准化委员会 (NCCLS) 2002年判断标准。双向药物敏感纸片 (即头孢他啶与头孢他啶/棒酸、头孢噻肟与头孢噻肟/棒酸) 扩散法或梅里埃药敏卡法检测超广谱β-内酰胺酶。细菌质控株采用购自卫生部质控中心的大肠埃希菌ATCC 25922、铜绿假单胞菌ATCC 27853标准株。
2 结果
2.1 菌株变迁
2004～2005年共培养出406例革兰氏阴性杆菌, 其中大肠埃希菌占37.3%, 克雷伯菌属占28.5%, 铜绿假单胞菌占13.2%, 阴沟肠杆菌占11.7%, 变形杆菌占4.8%, 其他占4.5%;产超广谱β-内酰胺酶细菌检出率为7.6%, 多重耐药鲍曼不动杆菌检出率占2.3%。2006～2008年共培养出787例革兰氏阴性杆菌, 其中变化为:大肠埃希菌占34.3%、克雷伯菌属占24.5%, 不动杆菌占22.2%, 铜绿假单胞菌占10.2%, 阴沟肠杆菌占4.7%, 其他占4.1%;产超广谱β-内酰胺酶细菌检出率为24.6%, 多重耐药鲍曼不动杆菌检出率占5.3%。与前两年相比, 不动杆菌感染率上升最为明显, 产超广谱β-内酰胺酶细菌和多重耐药鲍曼不动杆菌也有不同程度上升。
2.2 2006～2008年787株革兰氏阴性杆菌对12常用抗生素的药敏结果
见附表。
3 讨论
革兰氏阴性杆菌是引起细菌感染的主要病原菌之一, 对其进行耐药性研究, 对指导本地区细菌感染有一定现实意义。本次检测结果显示, 在细菌所致的感染中革兰氏阴性杆菌仍占大多数, 并随着新的抗菌药物的出现和不断应用, 多数菌株的耐药性呈逐年增加趋势[1]。5年来革兰氏阴性杆菌中非发酵菌的感染率呈上升趋势, 从13.7%增至23.6%, 比陈爱地等[2]统计的结果略低一些。2006年前本地区的治疗手段与大城市比较还存在一定差距, 但近几年, 本院呼吸机、导管等侵入性治疗以及免疫抑制剂的使用, 使院内感染机率增加, 其中非发酵菌感染也随之增加。所以, 应该加强医护人员的消毒意识, 对所有使用的医疗器械及时按要求严格消毒、更换, 以防止医院内感染的发生。
从787株革兰氏阴性杆菌对12种常用抗菌药物结果来看, 细菌耐药性逐年增加, 并出现多重耐药菌株。本地区监测结果与全国大城市的细菌耐药相比较有明显差异[1]。2006年以后, 耐药率逐年增加, 头孢哌酮/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦、喹诺酮类对革兰氏阴性杆菌有较好的抗菌活性, 但青霉素类、头孢菌素类等抗生素耐药性增强。头孢哌酮/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦和头孢噻肟对不动杆菌和铜绿假单胞等非发酵菌抗药活性已呈下降之势。青霉素类、一代、三代的头孢菌素和磺胺类等抗生素对不动杆菌和假单胞菌的耐药性呈增强之势。产超广谱β-内酰胺酶细菌从2004～2005年的7.6%升至2006～2008年的24.5%, 升幅较快。2004～2005年多重耐药鲍曼不动杆菌检出率为2.3%, 2006～2008年则为5.3%, 升幅较大, 与全国其它地区相比有差异[1], 这与本地区近几年大量使用新药有关。
总之, 革兰氏阴杆菌分离率有逐年上升的趋势, 多重耐药现象也越来越严重。临床医生应尽早进行病原学检查及药物敏感试验, 临床经验用药必须要以本地区细菌耐药连续监测报告为科学依据, 不能总追随大城市医院用药原则, 更不能滥用抗生素。根据细菌耐药的变迁, 有计划地将抗菌药物分期分批交替使用, 对本地区防止或减少细菌耐药性有一定的作用。
摘要：将5年间本院临床标本分离的1193株革兰氏阴性杆菌用纸片扩散法 (K-B) 或生物梅里埃仪器法进行12种抗菌药物的体外药敏感试验。双向药物敏感纸片 (即头孢他啶与头孢他啶/棒酸、头孢噻肟与头孢噻肟/棒酸) 扩散法或梅里埃药敏卡法检测超广谱β-内酰胺酶。收集分离病原菌及其药敏资料, 并进行统计分析。结果2006年以前分离的革兰氏阴性杆菌中, 大肠埃希菌、克雷伯菌、铜绿假单胞菌、阴沟肠杆菌、变形杆菌占前5位。20062008年, 占前5位的主要致病菌分别为大肠埃希菌、克雷伯菌、不动杆菌、铜绿假单胞菌、阴沟肠杆菌。20062008年耐药率比前两年显著增加, 头孢哌酮/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦、喹诺酮类对革兰阴性杆菌有很好的抗菌活性, 但青霉素类、其他头孢菌素类等抗生素耐药性增强。不动杆菌感染率增速较快, 头孢哌酮/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦对不动杆菌、铜绿假单胞菌等非发酵菌抗菌作用较好, 但青霉素类、其他头孢菌素类、磺胺类作用较差。本地区革兰氏阴性杆菌的耐药监测结果与全国其他地区差异较大。
关键词：革兰氏阴性杆菌,耐药性监测,细菌耐药
参考文献
[1]王辉, 陈民均, 倪语星, 等.2003~2004年中国10家教学医院革兰氏阴性杆菌的耐药分析[J].中华检验医学杂志, 2005, 10:1295-1301.