蛋白芯片检测系统

蛋白芯片检测系统（通用7篇）

蛋白芯片检测系统 篇1

我国肝癌的病死率高,甲胎蛋白(AFP)目前仍是公认的早期诊断和筛查原发性肝癌的指标。Evdokimova等[1]研究发现,在10%~30%的原发性肝癌患者血清中AFP为阴性,Watanabe等[2]通过研究发现,用多项肿瘤标志物联合诊断肿瘤较单项指标诊断具有更高的准确性,邹雄[3]也提出了多肿瘤标志物联合检测的观点。我们通过综合国内外2001至2009年关于多肿瘤标志物蛋白芯片诊断肝癌的相关文献进行系统评价,以明确其对肝癌的诊断价值。

1 资料与方法

1.1 纳入/排除标准

1.1.1 研究类型

国内外已经发表的关于多肿瘤标志物蛋白芯片法对肝癌诊断价值的研究,语种限制为中文和英文。

1.1.2 研究对象

纳入标准:(1)经病理检查或影像学检查及临床追踪随访确诊肝癌为诊断金标准,研究对象为经金标准诊断的肝癌患者、良性肝病患者、健康体检人群;(2)良性肝病患者或健康人群为对照组;(3)以C12多肿瘤标志物蛋白芯片检测系统进行检测(标本均由HD-2001A型系列生物芯片检测仪检测,该仪器由上海数康生物科技有限公司研制)[12项肿瘤标志物包括糖类抗原199(CA199)、癌胚抗原(CEA)、糖类抗原242(CA242)、血清铁蛋白(ferritin)、糖类抗原125(CA125)、糖类抗原153(CA153)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、B-HCG、甲胎蛋白(AFP)、游离型前列腺特异性抗原(F-PSA)、前列腺特异性抗原(PSA)、生长激素(HGH)];(4)文章结果中含有或通过计算可得四格表数据。排除标准:(1)研究对象不完整(缺少良性肝病或健康体检人群为对照组);(2)数据不完整;(3)非原始研究文献。

1.1.3 测量指标

敏感度、特异度、阳性似然比(LR+)、阴性似然比(LR-)、诊断优势比(d OR)以及综合受试者特征(SROC)曲线下面积(AUC)和Q*指数。

1.2 检索策略

1.2.1 检索数据库

检索数据库包括Cochrane library、MEDLINE、Embase、中文科技期刊全文数据库(CNKI)、中国生物医学文献数据库(CBMdisc)、中国生物医学期刊文献数据库、维普中文科技期刊数据库(VIP)、中国学术会议论文库(CACP)以及人工检索等,时间限制在2001年1月至2009年10月。

1.2.2 检索词

中文检索词包括“肿瘤标志物”、“蛋白芯片”、“肿瘤”、“肝癌”等,英文检索词包括“tumor”、“marker”、“liver cancer”、“liver neoplasm”、“protein chip”、“chip”、文献检索语种限制为中文及英文。

1.2.3 文献检索策略

参考Cochrane协助网工作手册制定检索策略。

1.3 研究方法

1.3.1 文献筛选

严格按照纳入和排除标准筛选文献,两位研究者独立阅读所获文献题目和摘要,在排除明显不符合纳入标准的文献后,对可能符合纳入标准的文献阅读全文,以确定是否真正符合纳入标准,两位研究者交叉核对纳入试验的结果,有分歧而难以确定其是否纳入的试验,通过讨论由专家决定其是否纳人。

1.3.2 资料提取

由两名评价员独立选择试验、提取资料并交叉核对,确保文献提取和质量评价的结果具有一致性,如遇分歧,讨论并向专家咨询解决,缺乏的资料通过与作者联系予以补充。提取的主要资料包括:(1)实验的基本情况;(2)研究对象的基线情况;(3)各实验的结局指标。

1.3.3 文献质量评价

对纳入研究我们使用诊断性实验准确性质量评价评价工具QUADAS[4](quality assessment of diagnostic accuracy studies)进行评价,分别对14个条目以“是”、“否”、“不清楚”进行评价,参考Jadad[5]质量计分法,回答“是”的为2分,“不清楚”的为1分,“否”的为0分,16~28分为高质量,0~15分为低质量:量表从偏倚(条目3~7、10~12、14)、变异(条目1、2)、报告质量(条目8、9、13)三方面对文献进行评价,找出各种偏倚和变异产生的原因。

1.3.4 统计学分析

采用采用Cochrane协作网提供的Meta Disc 1.4软件做荟萃分析:首先进行异质性分析,采用Spearman相关分析检查有无阈值效应引起的异质性,对敏感度和特异度采用卡方检验,对LR+和LR-采用Cochran-Q检验,如存在异质性,则采用随机效应模型对准确性指标进行汇总处理,反之则采用固定效应模型,检验水准为α=0.05;其次,计算合并效应尺度各效应量均以95%CI表示。

2 结果

2.1 文献检索结果及纳入研究的基本特征

初筛出相关文献102篇,其中英文4篇,中文98篇。排除重复发表、非临床研究文献、并按照严格的纳入及排除标准,最终纳入16个研究[6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21]。纳入研究的基本特征见表1。16个实验发表时间为2001至2009年,共3753例患者。所有试验均以病理检查或影像学检查及临床追踪随访作为肝癌的诊断标准,良性肝病患者或健康体检人群为对照组。

a:真阳;b:假阳;c:假阴;d:真阴

2.2 质量评价

纳入文献的方法学质量评分见表1,评分波动22~24分,平均分23分,中位数23分,均为高质量文献(表2)。

2.2.1 文献偏倚的来源

有关偏倚的9个条目中,有8个条目“是”的符合率为100%,只有1个条目“否”的符合率100%,表明文献偏倚可能性小。

2.2.2 文献变异的来源

在有关变异的两个条目中,条目1“是”和“否”的符合率分别为50%和50%,表明对疾病谱的描述欠清或未描述。

2.2.3 报告质量

在报告质量的3个条目中,条目8和9“是”的符合率均为100%,表明对待评价试验实施和参考标准实施的报告好;而条目13“否”的符合率为100%,表明所有文献均未提示有无法解释的试验结果。

2.3 异质性分析

首先考虑阈值效应所致,本研究中单一肿瘤标志物AFP和多肿瘤标志物的ROC平面散点图不是典型的“肩臂形”外观(图1),同时Spearman相关系数分别为0.009和0.230,P值分别为0.974和0.392,提示不存在阈值效应,然后对其他来源的异质性进行检验,结果提示各研究之间敏感度、特异度、LR+、LR-及dOR等存在异质性。

2.4 统计分析结果(单项肿瘤标志物AFP同多肿瘤标志物比较)

2.4.1 AFP和C12多肿瘤标志物检查的敏感度、特异度、LR+、LR-及dOR的比较

由于异质性检验提示各研究之间敏感性、特异度、LR+、LR-、dOR等存在异质性,且对照组纳入人群亦不统一,故荟萃分析合并效应量时采用随机效应模型。同时在荟萃分析中,我们得知SROC曲线均是非对称的,最终的SROC图形见图2。AFP和多肿瘤标志物诊断肝癌的敏感度、特异度、LR+、LR-及dOR等汇总值及95%CI见表3。

2.4.2 AFP和多肿瘤标志物C12的敏感度比较

通过对这16个研究的比较,在诊断肝癌中,发现多肿瘤标志物的敏感度远高于AFP,但AFP的特异度高于多肿瘤标志物。

2.4.3 SROC分析

AFP和多肿瘤标志物C12的SROC曲线下面积(AUC)分别为0.6957、0.8932,Q*指数分别为0.6782、0.8579。提示多肿瘤标志物C12在诊断肝癌方面的效能明显优于AFP。

3 讨论

3.1 C12多肿瘤标志物蛋白芯片检测的优势

3.1.1 技术优势

C12多肿瘤标志物蛋白质芯片是一种高通量、高敏感度、高特异性且微型化的蛋白质分析技术[22],此系统由2002年我国研发成功并应用于临床,它采用双抗体夹心法的化学发光检测方法,可以给临床工作者更多的信息,较单一的肿瘤标志物检测相比技术优势明显。

3.1.2 诊断优势

(1)C12多肿瘤标志物蛋白芯片检测系统同化学发光检测系统的检测结果符合率高[8],并同Roche Modular E170、Elecsys 2010、Abbot12000在检测肿瘤标志物中有较高的一致性[23],说明蛋白芯片检测系统有较高的稳定性和可靠性。(2)C12多肿瘤标志物蛋白芯片检测系统对肝癌的诊断同单项肿瘤标志物AFP做比较,SROC曲线下面积分别为0.8932、0.6957,Q*指数分别为0.8579、0.6782,提示多肿瘤标志物C12对肝癌的诊断效能及敏感度较AFP高。

3.2 本研究的局限性

3.2.1 通过本研究,我们发现AFP对肝癌的诊断敏感度只有59.3%,跟一些文献有些出入,其出现的原因可能是:(1)信息来源受限,C12多肿瘤标志物蛋白芯片检测主要在我国使用,而国外虽有多肿瘤标志物蛋白芯片检测系统,但所选肿瘤标志物不同,在收集文献资料时,国外文献经过筛查、挑选,1篇未收入;(2)不同的研究,所纳入的研究对象有异质性,如有些文献中有健康及良性肝病患者作为对照组,而有些仅有健康体检者作为对照组;(3)研究员的操作水平的差异。

3.2.2 文献质量

(1)文献变异:研究对象的疾病谱可能影响到检测方法的敏感性、特异性,也影响到试验结果的可推广性。对照组中所纳对象应包括一些易混淆的病例,而我们所做的研究中,所取的文献有50%包含了易混淆的病例,这就造成了一定程度上的文献变异,同时,鉴于其他恶性肿瘤对多肿瘤标志物的检测有一定的影响,文中未收入其他恶性肿瘤的患者作为对照组,此也许也对诊断试验有一定的影响。b报告质量评价:若对待评价试验实施、参考标准实施及纳入人群报告不充分都可能在一定程度上导致诊断性试验的准确性。我们所纳入文献关于检测方法和试剂报告不全面,直接影响到资料提取及结果的临床应用,改善诊断性试验的报告质量,使诊断性试验的结果更准确;同时有些文献[6,13,15,18,19,20,21]对Fer(铁蛋白)单独升高不计入阳性数,而有些文献对此没有提及,在这里我们将这两种文献一并算入研究中,这也对诊断试验有些影响。(2)文献的异质性:本研究ROC平面散点不是典型的“肩臂形”外观,提示不存在阈值效应,然后对其他来源的异质性进行检验,结果提示各研究之间敏感度、特异度、LR+、LR-及dOR等均存在异质性,提示纳入文献异质性较大。(3)发表偏倚,虽然有较广的检索范围,但仍有诸多如增刊、行政部门统计、会议等灰色文献无法获取,因而不能排除潜在的发表偏倚。(4)语种偏倚,检索文献的语种限于中文和英文,且本文亦未收入一篇英文文献,可能会漏检其他语种的相关研究。

综上所述,C12多肿瘤标志物蛋白芯片检测诊断肝癌与单项肿瘤标志物AFP相比,有良好的诊断效能,且具有高通量,快速的特点,有良好的稳定性和可靠性,我们应广泛推广并推向国外。

摘要：目的系统评价多肿瘤标志物蛋白芯片检测诊断肝癌的意义。方法综合国内外2002至2009年关于C12多肿瘤标志物蛋白芯片检测比较诊断肝癌的文献,采用QUADAS进行质量评价,用MetaDisc1.4软件进行荟萃分析。结果纳入符合标准的16篇文献进行荟萃分析。异质性检验提示无阈值效应,但存在其他原因导致的异质性。C12多肿瘤标志物检测诊断肝癌的敏感度分别为0.859(0.837,0.878),特异度为0.812(0.797,0.827),阳性似然比为6.630(3.615,12.159),阴性似然比为0.192(0.150,0.247),诊断优势比为36.788(18.960,71.379),SROC曲线下面积(AUC)分别为0.8932,Q*指数为0.8579。结论C12多肿瘤标志物对肝癌的敏感度及诊断准确度高,可广泛推广使用C12多肿瘤标志物蛋白芯片检测系统对肝癌的诊断。

关键词：肿瘤标志物,甲胎蛋白,肿瘤,肝癌,蛋白芯片

蛋白芯片检测系统 篇2

1 资料与方法

1.1 病例资料

本组273例患者, 男158例, 女115例, 年龄15岁～76岁。培养阳性肺外结核65例 (包括脑脊液结核菌培养阳性9例, 胸水结核菌培养阳性35例, 尿结核菌培养阳性7例, 骨结核脓肿结核菌培养阳性14例, 均不合并肺结核) , 痰结核菌培养阳性的肺结核123例、非结核患者85例 (包括确诊的肺癌或癌性胸水58例, 肺炎12例, 其他疾病10例, 健康者5例) 。所有病例均在住院期间进行了血清结核蛋白芯片的检测。

1.2 仪器及试剂

由南京大渊生物技术工程有限责任公司提供的结核分枝杆菌Ig G抗体检测试剂盒, 包括试剂和芯片。批准文号:国药准字s20050089。芯片结果分析由上述公司生产的PBT—X2型号生物识别仪进行。

1.3 方法

依照该蛋白芯片检测系统使用说明书的要求进行样本采集及试验操作, 阳性和阴性结果根据芯片识别仪器设置的参数自动进行判别。结果的判断:如果3种抗体中任一抗体检测为阳性, 结果判定为阳性;3种抗体检测都是阴性, 其结果判定为阴性。特异性=非结核组真阴性数/非结核组例数×100%;敏感性=肺外结核组真阳性数/肺外结核组例数×100%。

1.4 统计学方法

计数资料采用χ2检验, P<0.05为有显著性差异。

2 结果

2.1 肺外结核及肺结核、非结核中3种抗体检测结果, 见表1。

65例肺外结核中结核蛋白芯片检测阳性24例, 阳性率37%, 123例肺结核患者阳性75例, 阳性率为61%, 85例非结核病例10例阳性, 占11.8%。结核蛋白芯片检测肺外结核灵敏度为37% (24/65) , 特异度为88.2% (75/85) 。误诊率为11.8% (10/85) , 漏诊率为63% (41/65) 。

结核蛋白芯片肺外结核检测阳性率明显低于肺结核 (χ2=9.87, P<0.01) 。

2.2 肺外结核及肺结核中LAM、蛋白38 kDa和蛋白16 kDa3 种抗体的阳性检出情况见表2。

例 (%)

LAM、蛋白38 kDa和蛋白16 kDa单一指标, 联合LAM、蛋白38 kDa和蛋白16 kDa中2项阳性或3项阳性指标检测肺外结核病的阳性率较高的是LAM+38 kDa, 为24.6%, 其余指标阳性率均在10%以下。单一或联合检测肺外结核的阳性率除16kDa、16 kDa+38 kDa外, 阳性率较肺结核为低。

3 讨论

结核菌感染人体后, 由于结核菌的繁殖, 释放出大量的抗原, 可刺激机体产生相应的Ig G抗体[2]。肺外结核病同肺结核都是由于感染结核分枝杆菌引起, 患者也会产生相应的结核抗体, 血清中可以检测到。结核蛋白芯片技术是以微孔滤膜作为载体, 同时将结核分枝杆菌的LAM抗原、16 kDa和38 kDa 3种抗原固定在此载体上, 利用微孔滤膜的浓缩、渗滤以及凝集作用, 捕捉被检患者血清中的特异性抗体, 抗原抗体复合物与胶体金标记的兔抗人Ig G作用, 在微孔滤膜上形成紫红色斑点, 最后通过芯片识别系统进行结果判断。同步检测针对LAM的抗体、16 k Da抗体和38 kDa抗体, 对结核菌感染作出诊断, 目前广泛应用于肺结核和肺外结核病的诊断。

脂阿拉伯甘露糖 (LAM) 抗原是一种存在于分枝杆菌细胞壁的脂多糖成分, 结核分枝杆菌生长繁殖时能够大量产生, 其抗原性较强, 3/4的人群感染结核分枝杆菌后会产生针对LAM的特异性抗体[3], 本组肺外结核病例中LAM的检出率为30.8% (20/65) 。16 k Da蛋白仅仅发现于结核菌复合物中, 是结核分枝杆菌的特异性抗原, 针对16 kDa的抗体本组肺外结核病例中检出率低, 为12.3% (8/65) 。38 kDa抗原也是结核分枝杆菌中的一种特异性蛋白质抗原, 即便有预防接种过卡介苗的情况, 也不会影响到检查的结果。另外, 患者感染结核菌的程度与针对38 kDa的抗体有着良好的线性关系, 所以此抗体还可以用于疾病的动态观察和疗效的考核。本组65例肺外结核病例中, 38 kDa的抗体阳性者21例 (32.3%) 。16 kDa和38 kDa这两种抗原与其他类型的分枝杆菌不存在交叉反应, 有较好的特异性[4]。本组肺外结核病例中, 3种抗体联合检测灵敏度为37%, 特异度为88.2%。

文献报道, 结核蛋白芯片检测在肺结核阳性率大多集中在60%～65%, 肺外结核阳性率为60%～80%[5,6]。在本研究中, 肺外结核阳性率为37%, 明显较肺结核阳性率低, 与文献报道不一致。这种情况可能与肺结核患者较肺外结核患者菌量大, 产生的抗原多, 从而刺激机体产生了较多的抗体有关。也可能与本研究选择的肺外结核病例均没有同时合并肺结核有关。另外, 检测的结果也受患者病情轻重、免疫状态等多种因素的影响。LAM、蛋白38 kDa和蛋白16 kDa 3种抗体单项或联合检测肺外结核病, 阳性率略高的是LAM+38 kDa, 为24.6%, 其余指标阳性率在10%以下。肺外结核16 kDa、16 kDa+38 kDa抗体阳性率检出率似较肺结核略高, 是否在肺外结核病由于病史长或其他原因更容易产生抗16 kDa的抗体, 需要进一步研究。

结核蛋白芯片检测速度快, 当天可以出结果, 方便了患者, 结果判读采用芯片识别系统, 避免了人为操作及主观判断的误差。3种抗体联合检测较单个抗体检测阳性率有所提高, 对结核病有一定的辅助诊断作用, 但是在不合并肺结核的肺外结核病, 如结核性脑膜炎、泌尿系结核、骨结核等, 结核蛋白芯片检测阳性率低, 价值有限。

参考文献

[1]World Health Organization.Global tuberculosis control2011[Z].Geneva:WHO, 2011.

[2]彭卫生, 王英年, 肖成志.新编结核病学[M].北京:中国医药科技出版社, 1995:66.

[3]张敦熔.现代结核病学[M].北京:人民军医出版社, 2000:167-170.

[4]张小刚, 庄玉辉, 何秀云, 等.重组结核分枝杆菌38KDa和16KDa蛋白用于结核病血清学诊断的价值[J].中国防痨杂志, 2001, 23 (5) :281-283.

[5]杨新军, 樊宇.结核杆菌蛋白芯片检测在肺结核诊断中的价值[J].临床肺科杂志, 2010, 15 (2) :255-256.

蛋白芯片技术监测肿瘤 篇3

C12A多肿瘤标志物蛋白芯片是国际上第一代用于临床检测的蛋白芯片,也是我国拥有完全自主独立知识产权的医用生物芯片技术。借助C12A芯片监测数据,医疗机构可及早了解患者的术后治疗情况、术后复发及转移时间等,可监测病情、判断疗效,以及肿瘤复发和转移防治等。

在此项临床研究中,铭源医疗将出资500万元,用于在上海筛选1500例患者进行1年4次的持续跟踪研究,以判断C12A芯片在预测消化道及肺癌复发转移方面的临床价值。同时开展此项技术进入“肿瘤临床诊疗指南(中国版)”的临床验证工作。上海10多家知名三甲医院的肿瘤科、呼吸科等相关科室将参与该项研究。

根据相关统计数据可知,我国肿瘤发病率约为200/10万,每年新发病例超过220万人,而且发病率呈现逐年上升及年轻化趋势。对于广大存活病患而言,便捷有效、无创、低成本地监测其预后疗效和复发转移具有十分重要的意义。

如果该临床研究取得成功,将顺利推动C12A芯片检测技术进入“肿瘤临床诊疗指南(中国版)”,从而使得占罹患肿瘤总数70%的消化道及肺部肿瘤患者从中获益。

蛋白芯片检测系统 篇4

1 资料与方法

1.1 一般材料

1.1.1 标本选取

选取临床上怀疑骨肉瘤且未经化疗的病例, 行穿刺活检术。分别取瘤体组织和癌旁组织。取出标本一部分放入冻存管立即置于液氮中保存, 一部分送中南大学湘雅二医院病理科行病理检查。选用病理结果诊断为骨肉瘤的标本4例进行实验。

1.1.2 主要试剂及仪器

Protease inhibitor (上海世仪生物科技有限公司) , Proteome ProfilerTM ANTIBODY AR-RAYS kit (美国R&D Systems公司) , 摇床 (WD-9405A型, 北京市六一仪器厂, 沃德生物医学仪器公司) , 离心机 (Thermo BR4i, 美国) , 蛋白质浓度测定仪 (DUR800, BECKMAN COULTER, 美国) , Aprotinin (Sigma, Catalog#A6279) Leupeptin (Sigma, Catalog#L8511) , Pepstatin (Sigma, Catalog#P4265) , X-ray film (Kodak BioMax ML, Catalog#1788207) , ImageJ1.42图像处理软件, Photoshop图像处理软件。

1.2 方法

1.2.1 提取蛋白

a) 配制核蛋白-40裂解缓冲液 (10mm Hepes, pH7.5;142.5mM KCl;5mM MgCl2;1mM EDTA;1%NP-40) , 加入蛋白酶抑制剂 (1mg/mL Aprotinin;1mg/mL Pepstatin;1mg/mL Leupeptin;1mm PMSF) 和磷酸酶抑制剂 (2mm sodium orthovanadate;5mm sodium fluoride) 置冰上备用。b) 分别取未经化疗的病理组织活检确定的骨肉瘤组织及癌旁组织约80mg, 放到预冷的研钵中加入液氮研磨。研磨成微细均匀的粉末即可。加入上述混合液, 充分溶解后移入EP管中。4℃, 重悬、轻柔旋转30 min。14 000g, 离心5min, 取上清液移入EP管中。c) 蛋白质浓度测定。取400μg总蛋白上样。

1.2.2 人类细胞凋亡芯片检测

人类细胞凋亡芯片是一种快速、灵敏、经济的工具, 可以同时筛选35种凋亡相关蛋白的相对表达水平, 而不用进行大量的免疫沉淀反应和Western Blots操作。每个捕获抗体用已知靶蛋白的细胞株的细胞提取物进行精心的筛选。

按照说明书操作, 简要介绍如下:a) 用2.0mL的缓冲液1 (在Proteome ProfilerTM ANTIBODY ARRAYS kit中) 在摇床上孵育1h, 在250μg稀释的裂解缓冲液中摇床上2~8℃孵育过夜。b) 加入Detection Antibody Cocktail (在Proteome ProfilerTM ANTIBODY ARRAYS kit中) 在摇床上孵育1h, 蒸馏水反复冲洗3遍, 每一遍10min。c) 加入稀释的Streptavidin-HRP (在Proteome ProfilerTM ANTIBODY ARRAYS kit中) 在摇床上孵育30 min, 蒸馏水反复冲洗3遍, 每一遍10min。X-ray胶片显影, 扫描胶片。

1.2.3 图像处理

应用Photoshop图像处理软件进行图片剪切, 应用ImageJ1.42图像处理软件计算每个点的灰度值。

1.3 统计学分析

应用SPSS 13.0统计软件, 同种蛋白在癌组织和癌旁组织中表达差异采用两个独立样本t检验, α=0.05作为检验标准。

2 结果

2.1 病理组织结果临床怀疑骨肉瘤的患者行穿刺手术取活体组织标本, 送中南大学湘雅二医院病理科诊断 (见图1) 。

2.2 蛋白芯片分析结果, 见图2~6。

2.3 不同蛋白表达数据分析结果, 见图7。

3 讨论

蛋白质芯片技术是一种新型的用于样本蛋白分析的生物芯片技术。因具有高通量、髙灵敏度、高特异性、应用广泛等特点[3], 备受医学领域关注。目前用于肿瘤标记物的筛选, 包括消化系统、呼吸系统、生殖系统, 但是在骨肉瘤中应用较少。从细胞凋亡的角度来看, 恶性肿瘤的发生是凋亡机制受到抑制, 肿瘤细胞减少受阻所致[4]。骨肉瘤属于恶性程度极高的肿瘤。本研究证实抑制凋亡蛋白Bcl-2、cIAP、Clusterin、HSP27、Survivin在骨肉瘤组织中表达上调。目前研究抑制细胞凋亡通过两个途径:a) 与肿瘤坏死因子 (TNF) 受体结合抑制核转录因子NF-κB;b) 与各种参与凋亡的因子 (生长因子、细胞因子等) 结合。

图7癌旁组织和骨肉瘤组织Bcl-2、cIAP-2、Clusterin、HSP27、Survivin蛋白的表达 (P<0.05)

Bcl-2是Bcl家族中主要的抑制凋亡基因之一。线粒体在细胞的凋亡过程中发挥了核心的作用, Bcl-2蛋白位于线粒体膜上、核膜和粗面内质网, 不促进细胞增殖, 而是延长细胞寿命, 是一个明确的生存信号, 但当有其他癌基因如C-myc被激活, 细胞就会不断增殖[5]。主要的机制如下:a) Bcl-2能改变线粒体巯基的氧化还原状态来控制其膜电位, 从而调控细胞凋亡。b) 在细胞凋亡过程中, caspase可使线粒体PT (permeability transition pore) 通道打开, 导致线粒体内的细胞色素C释放到胞质中, Bcl-2蛋白可能是线粒体PT孔道的组成成分, 它在较高PH条件下能形成离子通道, 一般情况下它能封闭孔道的活性, 使一些小分子不能自由通透, 从而保护细胞免于凋亡。c) Bcl-2能将凋亡蛋白前体Apaf-1等定位至线粒体膜上, 使其不能发挥凋亡作用[6]。Zhao等[7]通过慢病毒诱导Bcl-2的表达下调, 提高阿霉素对骨肉瘤细胞的敏感性, 证实Bcl-2抑制骨肉瘤细胞的凋亡作用。Liu等[8]证实在骨肉瘤细胞中, 紫杉醇和吡柔比星可以在G2/M或G0/G1期阻滞细胞周期和诱导细胞凋亡, 而这个过程依赖Bcl-2/Bax。王大平等[9]发现Bcl-2蛋白在骨肉瘤的表达水平明显高于骨良性肿瘤, 认为Bcl-2蛋白高度表达与骨肉瘤的发生有关。本研究发现Bcl-2蛋白在骨肉瘤组织中的表达水平明显高于癌旁组织。刘金洋等证实Bcl-2可能通过抑制Fas蛋白的表达来引起骨肉瘤的发生[10]。高天等[11]证实Bcl-2、凋亡指数 (AI) 可能成为评估骨肉瘤预后的一项重要指标。

cIAP-2和Survivin属于凋亡抑制蛋白家族。一方面它们可以抑制Caspase的作用来抑制凋亡, cIAP-2可以直接抑制Caspase的作用, 而有研究报道survivin并不能直接抑制caspase, 而是通过与凋亡抑制剂 (Smac) 相互作用抑制其发挥促进凋亡功能[12]。另一方面cIAP-2、Survivin和Clusterin可以通过TNF受体激活核转录因子NF-kB, 导致细胞增殖分化, 发挥抗凋亡作用[13]。劳克诚等[14]研究证实Survivin基因可能在骨肉瘤的发生发展中起重要作用, 可能为骨肉瘤的基因治疗提供了新的靶点。刘国辉等[15]研究证实Survivin mRNA在骨肉瘤组织中特异性表达, 可能在骨肉瘤的发生发展中起重要作用, 阻断Survivin mRNA的表达可为骨肉瘤的治疗提供新的途径。高嵩等[16]研究证实survivin蛋白表达与骨肉瘤发生发展密切相关, survivin蛋白可作为判断骨肉瘤发生发展的良好指标, 并为以survivin基因为靶点进行基因治疗提供理论依据。有研究表明Survivin mRNA高表达骨肉瘤患者的预后不良[17]。Survivin蛋白被阻断后明显抑制了骨肉瘤细胞系MG-63的分化和入侵[18]。在骨肉瘤细胞中, 通过小干扰RNA使clusterin基因沉默表达从而诱导自然凋亡、降低生长能力、降低细胞对遗传毒性和氧化应激的敏感性, 说明clusterin蛋白抑制骨肉瘤细胞凋亡的作用[19]。

HSP27为小分子热休克蛋白家族的主要成员, 在多种肿瘤表达增高, 与肿瘤的预后密切相关, 但在不同肿瘤, 其意义有所不同。可能的机制如下:a) 抑制热休克过程中蛋白的合成, 使真核细胞中未折叠的蛋白的量减少, 从而减弱对细胞的破坏作用。b) HSP 27可以防止热休克后肌动蛋白 (Actin) 的破坏, 维护细胞骨架的稳定, 增加对热的耐受性[20]。c) 在热休克后刺激RNA及蛋白质的合成, 协助细胞在死亡之前修复热休克造成的损伤, 使细胞尽快恢复正常生理功能[21]。d) 维持谷胱甘肽水平, 可以减少细胞间的活性氧 (ROS) , 维持线粒体膜电势稳定, 阻止细胞色素c的释放, 从而阻止细胞色素c依赖的细胞凋亡途径[22]。HSP-27可以和与Caspase-3结合, 抑制其活性, 从而抑制细胞凋亡的发生[23]。

本实验选取的标本是未经化疗的骨肉瘤组织和癌旁组织, 与处理过的组织相比更能说明疾病的发生状态。结果显示抑制凋亡蛋白Bcl-2、cIAP-2、Clusterin、HSP27、Survivin在骨肉瘤组织中表达上调, 并且具有相同或相似的调节通路, 说明它们可能在骨肉瘤发病机制中同时发挥作用。本实验存在的不足:a) 样本例数较少;b) 人类细胞凋亡芯片虽然具有髙灵敏度、高特异性特点, 但同时也是高通量的, 需要相关的实验方法如免疫组化、PCR、细胞培养等进行证实。在接下来的研究中我们会对其它的凋亡相关蛋白表达进行分析、探讨。

摘要：目的 通过人类细胞凋亡芯片筛选骨肉瘤中表达异常的凋亡相关蛋白, 为近一步深入功能机制研究奠定基础。方法 应用人类细胞凋亡芯片, 筛选骨肉瘤组织及癌旁组织中表达有差异的凋亡相关蛋白。应用ImageJ1.42图片处理软件求出每个孔的灰度值, 进行统计分析。结果 凋亡相关蛋白Bcl-2、cIAP-2、Clusterin、HSP27、Survivin在骨肉瘤组织中和癌旁组织中都有表达, 且其在骨肉瘤组织中的表达水平大于癌旁组织 (P<0.05) 。结论 凋亡蛋白Bcl-2、cIAP-2、Clusterin、HSP27、Survivin在骨肉瘤组织中表达上调, 可能参与骨肉瘤的发病机制。

蛋白芯片检测系统 篇5

1 蛋白质芯片的临床应用

蛋白质芯片在临床方面的应用已广受关注, 国内、外的研究员都对此做了大量的研究, 尤其在疾病诊断与监测方面。

1.1 癌症的诊断

目前, 蛋白质芯片技术已成为癌症研究与临床诊断的重要手段之一。有人将它与质谱技术 (SEL-DI-TOF-MS) 联合应用, 通过比较病变组织与非病变组织的蛋白质表达谱, 寻找肿瘤标志物。迄今为止, 人们已经利用此技术对肺癌、胃癌、肠癌、前列腺癌、胰腺癌等常见肿瘤的蛋白质标志物进行了筛选研究。

刘辉琦将16个经过表达纯化的食管癌前相关抗原点样于醛基化玻璃片基上, 以此片对241例食管癌血清进行检测, 结果显示, 其检测符合率均可达到95%以上。Zhao等用蛋白质芯片鉴别胰腺病变性质, 通过对8例慢性胰腺炎、6例胰腺癌和10例正常对照的血清检测, 发现胰腺癌组的部分蛋白或者部分相关蛋白含量比胰腺炎组及正常对照组有所升高。

1.2 病毒性疾病的诊断

由于目前尚无杀灭病毒的特效药, 各病毒性疾病多以预防为主, 而已感染个体的早期确诊具有重要意义。李禾等将血清中艾滋病毒、丙型肝炎病毒、梅毒螺旋体的重组抗原和乙型肝炎病毒的单克隆抗体固定在醛基化玻片上, 检测相应的特异性抗体和表面抗原, 其检出的阳性符合率均达到97%以上。Zhu H等将急性呼吸系统综合症病毒 (SARS) 表达出全基因组, 再将其表达出的产物制成蛋白芯片, 对SARS进行诊断, 发现了具有高反应性的诊断抗原部位;其检测的特异性高于ELISA实验, 重复性达98%。葛海鹏等将人血清中弓形虫、风疹病毒、巨细胞病毒、单纯疱疹I型、Ⅱ型等五种病毒的抗原喷印到活化的醛基化玻片表面, 制成蛋白质微列阵, 检测相应的特异性抗体, 认为其特异性、灵敏度、准确度及精密度好于其他方法, 具有良好的应用和推广价值。

1.3 对淋巴细胞功能的评价

吴颖亚等采用蛋白质芯片及酶联免疫吸附方法对急性淋巴细胞白血病 (AML) 患者的IL-2、IL-4、IL-12、IL-13、TNF-α、IFN-γ6种与免疫相关的细胞因子进行测定, 结果发现AML患者IL-2、IFN-γ表达水平高于正常组。同时他们的另一项研究也是采用蛋白质芯片对急性髓细胞白血病 (AML) 患者IL-2、IL-4、IL-12、IL-13、TNF-α、IFN-γ、MIP-1α7种免疫相关细胞因子进行测定, 目的是为了评价患者体内细胞因子对肿瘤发生的应答情况。

2.4 其它疾病的研究

陈旭红等用蛋白质芯片检测了45例阿尔茨海默病 (俗称老年性痴呆症) 患者和60例健康老人的血清蛋白质, 从中筛选出11个有明显表达差异的蛋白质, 而其中选用的三个蛋白质建立的诊断模型对阿尔茨海默病检测的灵敏度达88.9%, 特异性为85.0%, 而总准确率为86.67%, 进而建立了指纹图谱和确诊模型。

2.5 蛋白质芯片在动物性疾病上的研究

目前, 国内、外用蛋白芯片诊断疾病的研究与应用主要见于人医临床, 而在动物疾病的研究上则仅限少数烈性传染病。2009年, 石霖等将蛋白质芯片技术、免疫胶体金技术和银显影技术结合, 用纯化的全病毒蛋白来作为捕获抗原, 建立了能同时检测禽流感 (AI) 、鸡新城疫 (ND) 血清抗体的可视化蛋白质芯片。他们的另一项研究是建立了能同时检测禽流感、鸡新城疫、鸡传染性支气管炎和鸡传染性法氏囊病四种病的抗体蛋白质检测芯片。

3 问题与展望

尽管人们在蛋白质芯片研究方面取得了许多进展, 但是仍有许多关键技术并不成熟, 尤其是普及应用时有许多问题亟待解决和突破。蛋白质芯片的制作需要的仪器太过昂贵, 且有些仪器还要求专业人员操作;另外, 在蛋白质芯片的制作与应用过程中, 任何微小的变化都可能导致差异性结果, 因此要求我们对实验条件的控制非常严格。

虽然蛋白质芯片还存在着很多不足, 但是它依旧吸引着越来越多的学者从事这项技术的研究, 相信在不久的将来, 它的发展速度将会赶上基因芯片技术, 成为生物芯片技术中同样成熟的一部分, 得以广泛应用于生物科学相关的各个方面, 为科技进步和人类发展贡献一份力量。

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[9]陈旭红, 等.应用蛋白质芯片技术筛选阿尔茨海默病血清标志物.临床和实验医学杂志[J].2010, 79 (14) :1045-1047.

蛋白芯片检测系统 篇6

1 实验材料和方法

1.1 磷脂囊泡的制备

采用水浴超声结合挤压过膜的方法制备尺寸均一的小单壁磷脂囊泡 (SUVs) , 具体步骤如下:将DMPC溶于氯仿中, 掺入不同摩尔比例的1, 2-二硬脂酰-甘油-3-磷脂酰乙醇胺-N-羧基 (聚乙二醇2000) (1, 2-Distearoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine-N-[Carb-oxy (Polyethylene Glycol) 2000], DSPE-PEG-COOH) , 用氮气将氯仿挥发殆尽后在真空下干燥至少2h, 以在管壁形成磷脂薄膜。然后加入一定体积的PBS溶液 (pH 7.5) , 使DMPC浓度为1 mM, 漩涡振荡5min后, 水浴超声至清。采用MiniExtruder (AvantiPolar Lipid Co.) 挤压溶液过聚碳酸酯膜 (孔径50nm) 至少11次, 将制备好的囊泡溶液保存于4℃备用, 并采用激光粒度仪 (Sympatec, GmbH) 分析囊泡粒径大小及分布。

1.2 硅片表面的磷脂膜修饰

将硅片 (表面为自然氧化的二氧化硅层) 切割成1cm×1.5cm后, 采用Piranha溶液 (H2SO4∶H2O2=3∶1) 清洗、氧化, 使其表面呈亲水性 (接触角约为5°) 。将硅片表面用磷脂囊泡溶液室温下处理30～60min, 即可在硅片表面形成磷脂膜层。由于磷脂分子具有亲水头基和烷基尾链, 在亲水表面形成脂质双层结构, 如图1 所示。

1.3 磷脂膜对蛋白非特异性吸附的抑制及蛋白在膜层表面的固定

将不同摩尔含量PEG的的磷脂囊泡, 在亲水性二氧化硅表面自组织形成磷脂双层膜结构。对磷脂膜表面的羧基采用N-羟基琥珀酰亚胺 (NHS) 和1-乙基-3- (3-二甲氨丙基) 碳二亚胺 (EDC) 活化处理 (NHS和EDC的终浓度分别为50mM和200mM) , 然后将人血清白蛋白 (HSA, 0.1mg/mL) 作为配基分子共价固定在膜层表面, 再与HSA的抗体 (30μg/mL) 反应, 研究蛋白在该膜层表面的固定情况。同时做膜层未经NHS/EDC处理的对照, 与同样的蛋白溶液反应, 以考察磷脂膜修饰表面对蛋白非特异性吸附的抑制情况。结果采用椭偏光学成像系统观察。

1.4 椭偏光学成像系统及微流道反应系统

椭偏光学成像系统[8], 将传统的光学椭偏术、CCD 摄像、计算机取样和图像处理技术相结合, 通过测量样品的反射光强变化实现对样品分析。测量结果以灰度图的形式保存下来, 其灰度值的变化反映了表面组装配基分子的面密度变化。

脂膜的组装、溶液的输运、蛋白分子的反应以及清洗等操作均在微流道反应系统[9]中完成。该系统包含一个8×6阵列排列的凹槽, 每个凹槽两端开通孔, 分别作为液体进口和出口。将该阵列凹槽与硅片表面接触, 就会形成一个个空腔, 即形成了有一进一出的微流道。该方法可实现多种不同样品的同时检测, 且所需样品量较少, 每个阵列单元仅需数微升样品。

2 实验结果与分析

2.1 磷脂囊泡的制备

在硅片表面修饰磷脂膜, 可采用磷脂囊泡在硅片表面发生吸附与融合的方法实现[10], 但需要制备尺寸均匀的SUVs。SUVs的直径一般不超过100nm, 通过将水浴超声至清后的囊泡溶液再挤压过50nm孔径的聚碳酸酯膜来控制囊泡的尺寸。通过比较发现, 将水浴超声处理和挤压法结合起来制备磷脂囊泡, 可以更为快捷方便地得到尺寸均一的SUVs。经激光粒度仪分析, 挤压过膜后的囊泡比聚碳酸酯膜的孔径略大, 可能是PEG分子增加了囊泡的柔性, 使其在溶液中伸展有关。另外, PEG还有促使囊泡形成和稳定囊泡的作用, 在4℃下保存数月后, 溶液仍能保持澄清, 分析其粒径为101.4nm± 2.5nm。

2.2 磷脂膜对蛋白非特异性吸附的抑制及蛋白在膜层表面的固定

利用微流道系统, 在亲水性二氧化硅表面形成磷脂双层膜, 考察其对蛋白非特异性吸附的抑制情况, 以及对膜层功能化后共价固定蛋白的效果, 结果如图2所示。图中A1为囊泡空白对照 (含5% (摩尔分数) DSPE-PEG-COOH) , B1和B4分别为HSA配基及其抗体在基底上吸附的空白阳性对照和基底的空白阴性对照, 而A2, A4和B2分别为含0.5%, 1.5%和5% (摩尔分数, 下同) , DSPE-PEG-COOH的磷脂囊泡处理后的表面对蛋白的非特异性吸附。

从图中可以看出, 经过PEG化磷脂膜修饰后的二氧化硅表面, 同原亲水性表面相比, 蛋白吸附的灰度值降低, 并且随着PEG含量的增加, 蛋白膜层灰度值逐渐减小。当PEG含量达到1.5%时, 膜层与蛋白作用后的灰度值即无明显增加。这些结果表明, PEG化的磷脂膜层可以抑制蛋白分子的非特异性吸附, 并且抑制效果与PEG含量相关。

膜层表面的羧基基团通过NHS/EDC功能化, 可与蛋白分子的氨基形成酰胺键, 从而将蛋白分子固定在膜层表面, 图2中A3, A5和B3分别为硅片表面经含0.5%, 1.5%和5%DSPE-PEG-COOH的磷脂囊泡处理, 羧基进行NHS/EDC活化后, 固定配基及其抗体后的结果。

从图2中可以看出, 膜层经过NHS/EDC功能化后, 可以将蛋白分子固定到膜层表面并结合其抗体分子, 但膜层中DSPE-PEG-COOH的含量与固定蛋白量不成正比。随DSPE-PEG-COOH含量的增加, 膜层固定蛋白后的灰度反而有所下降, 说明增加膜层中可功能化羧基的含量, 并未提高固定的蛋白量。这很可能是由于在增加可功能化羧基含量的同时, 膜层表面的PEG分子也同时在增加, PEG为电中性分子, 具有较强的亲水性, 其在磷脂膜表面形成的水化层一方面阻碍蛋白分子的靠近, 同时又掩蔽了PEG末端功能化的羧基, 从而影响功能化羧基与蛋白的共价结合。此外, 在亲水硅片表面形成的磷脂双层膜, 随着膜层中PEG含量的增加, PEG分子将从“蘑菇相”转变为“刷相”, 此时磷脂膜层结构相对更为稳定。对于PEG2000, 理论的相变摩尔浓度为1.4%[11]。以上实验结果表明, 在PEG处于相变浓度时, 膜层既能保持对蛋白非特异性吸附的抑制, 同时又能较好地固定蛋白分子。因此, 在用PEG化的磷脂膜进行芯片表面修饰时, PEG的含量可选择在其相变摩尔浓度附近。由于通过功能化羧基固定蛋白分子, 其影响因素除表面的功能化羧基密度外, 还与蛋白的浓度、分子量以及溶液的pH值, 离子强度等有关, 在将来的实际应用过程中, 结合需要固定的蛋白分子, 还应进行具体条件的选择和优化。

3 结论

(1) 通过椭偏光学成像系统检测, 在亲水性二氧化硅表面修饰PEG化的磷脂膜, 随着膜层中PEG含量的增加, 可以逐渐增强表面对蛋白非特异性吸附的抑制。

(2) 对磷脂膜表面的活性基团进行功能化后, 可实现配基的固定及其抗体的结合。

(3) PEG化的磷脂膜, 既能在其表面固定生物活性分子, 同时能抑制其他生物分子的非特异性吸附, 有望应用于蛋白芯片的表面修饰。

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耳聋基因检测芯片研制成功成功 篇7

基因检测芯片, 是在一块指甲大小的玻片或硅片上植入已知基因序列的核酸片段作为生物探针, 通过与样品反应发出信号, 由计算机技术收集信号数据, 分析样品的基因突变情况来诊断遗传性疾病。

该基因检测芯片技术具有高效率、高通量、低成本等特点, 可以提供从孕前、产前到出生的基因检测, 有助于父母及时获知新生命的遗传信息并采取措施, 降低新生儿患遗传性耳聋的概率。我国每年有近3万新生儿先天性耳聋, 其中60%是遗传造成的。

该基因检测芯片上涵盖了常见的四种耳聋基因的9个突变位点, 一次检测只需5小时, 而以往依靠传统测序方式需要3天。该芯片可检出90%的药物性耳聋基因突变位点, 因此可以大大避免药物导致基因突变而引起的药物性耳聋。