氨基酸衍生维生素（共4篇）
氨基酸衍生维生素 篇1
0 引言
以氨基酸为前体合成的维生素叫做氨基酸衍生维生素, 主要为维生素B和E家族成员, 在人体生理活动中有重要的功能[1], 还有一些氨基酸衍生维生素有多种代谢和生物化学作用, 如维生素B6可作抗氧化剂;维生素B2、B3、B5、B、E可在氧化还原反应中作辅因子或辅被用物;维生素B2是蓝光光感受器的发色团;维生素B2、B3、B5、B7、B9也参与酶、转录因子和组蛋白的翻译后修饰[2]。维生素B1和E可能会影响信号传递、细胞传递、膜泡运输等与膜相关的过程和相关蛋白质的活性, 因此会影响膜结构的形成[3]。维生素对人体至关重要, 而人体自身不能合成维生素, 只能从植物中获取或服用人工合成维生素制剂。目前可以人工合成的纯维生素B制剂只有七种, 它们一般作为药物制剂应用, 会产生一定的副作用, 必须在医生指导下服用, 而且还会造成环境污染, 因此最好采用植物或微生物生物合成的方法获得人体所需的维生素。植物利用氨基酸生产维生素的途径主要有两种:整合和转氨作用。本文主要对氨基酸衍生维生素中的维生素B家族的生物合成及功能进行研究, 概述氨基酸在B族维生素生物合成中的作用、不同物种中B族维生素的含量水平以及B族维生素的作用。
1 氨基酸在B族维生素生物合成中的作用
α-L-氨基酸可参与B族维生素的形成。甘氨酸可以整合到噻唑啉硫胺素或5-氨基咪唑核苷酸 (AIR) 中, AIR是维生素B1 (硫胺素) 的前体;天冬氨酸可参与整合到维生素B3 (烟酸) 中[4];丙氨酸可整合到维生素B7 (生物素) 中[5];谷氨酸可整合到维生素B9 (叶酸) 中[6];酪氨酸可整合到维生素E (生育酚) 中[7]。利用动物色氨酸, 植物天冬氨酸, 细菌色氨酸和天冬氨酸可从头合成维生素B3[8]。维生素B5 (泛酸) 等则由氨基酸代谢产生。氨基酸可整合到维生素中, 也可以从中除去。
氨基酸另一个主要作用是提供氨基。通过转氨酶的作用, 谷氨酸和谷氨酰胺可提供氨基, 从而利用从头合成嘌呤核苷酸途径合成很多维生素前体[9]。磷酸吡哆醛 (PLP) 合酶可使谷氨酰胺脱氨基转化成谷氨酸盐, 脱掉的氮则使PLP杂环关闭[10]。吡哆胺-丙酮酸氨基转移酶也可参与维生素代谢, 但需要丙氨酸和丙酮酸实现吡哆醛和吡哆胺的互换[11]。天冬氨酸/延胡索酸也可作氨基供体。
2 维生素含量的变化
不同物种或同一物种不同品种中维生素B1、B2、B3、B5、B7、B9和E的含量也不同, 主要有两种方法来提高其在生物体中的含量:植物育种和代谢工程策略[12]。代谢工程是对参与维生素生物合成、稳定性、回收、转运和分解代谢等过程相关的基因进行修饰或调控[13], 也可以通过增加所需氨基酸浓度来提高相应维生素含量[14]。利用自然变异筛选高含量维生素品种受遗传性限制, 必须依赖全面的分子定位和高通量表型方法来筛选[15]。除此之外, 还应该考虑温度、曝光度等农业操作环境因素, 食物和饲料加工、存储等因素对维生素含量的影响[16]。
利用植物生长调节剂和生物诱导因子可以提高蔬菜中维生素的含量和稳定性, 如茉莉酮酸甲酯、水杨酸等可使叶中叶酸含量增加一倍[17]。甜菜碱可提高δ-氨基乙酰丙酸合酶的酶活力, 促进维生素B12的合成[18]。
氮情况 (缺乏, 富足) 或不同氮源 (氨, 硝酸盐) 对氨基酸分布有影响。利用菌体发酵生产维生素B12 (核黄素) 时, 不同的无机氮源对其影响不同[19], 如 (NH4) HPO4作为无机氮源时, 由于磷是组成细胞核酸及ATP的重要元素, (NH4) HPO4自身含有的元素磷促进了菌体生长, 但是会对维生素B12的合成产生负作用, 而硝酸盐中的氮原子不能被菌体直接利用, 需要将其氮原子还原成-3价的NH4+才能利用, 这一过程需要消耗一定的能量, 因此菌体的生长受到了一定的限制, 所以使NaNO3或NH4NO3作为无机氮源时菌体生物量减少而降低了维生素B12的产量。某些无机氮源可以提高维生素B1的含量。在植物中维生素合成途径受最终或中间产物的反馈抑制。
3 氨基酸衍生维生素在植物代谢中的功能
氨基酸衍生维生素能够调控植物代谢途径。维生素B1生物合成速率能调控维生素B1依赖型酶的活性、糖酵解、柠檬酸循环和氮同化、脂肪酸生物合成、支链氨基酸生物合成、戊糖磷酸途径和卡尔文循环[20]。黄素酶是很多酶的辅因子, 能催化主要代谢的氧化还原反应:三羧酸循环、光合作用、氨基酸的β-氧化和降解。除此之外, 还参与蛋白折叠、氮固定、萜类化合物合成、光传感和发射、染色质重塑、DNA修复和细胞凋亡等过程[21]。
维生素B1和B2可以诱导植物对抗真菌、细菌和病毒感染, 因此可以利用维生素来治疗和保护庄稼免受病原虫的侵害。维生素B3是NAD (P) +的前体, 同时也是信号化合物的前体, 它参与酶、转录因子和组蛋白的翻译后修饰。在植物中, 维生素B3是吡啶生物碱, 特别是葫芦巴碱的直接前体, 可作为渗透保护剂参与控制细胞循环。维生素B5参与柠檬酸循环, 还参与脂肪酸、萜类、聚酮、半胱氨酸等的生物合成。维生素B7在细胞代谢中主要有两个作用:在脱羧反应、转羧基反应中作为辅因子, 帮助转运CO2;通过组蛋白的生物素酰化实现细胞信号传递和基因监控[22]。生物素酰化是组蛋白的一个共价修饰, 通过有丝分裂和减数分裂的染色体缩合和DNA修复对核染色质结构进行重排, 此过程受生物素浓度影响[23]。维生素B7可作乙酰CoA羧化酶、3-巴豆酰CoA羧化酶、丙酮酸羧化酶等的共价绑定辅酶。维生素E通过淬火和清除单线态氧来保护膜, 并且能够阻碍脂质过氧化作用的蔓延, 从而维持膜的稳定, 由于对膜构象和与膜相关的蛋白有影响, 因此它能够调控信号传递和转录[24]。
4 氨基酸衍生维生素在人体中的作用
氨基酸衍生维生素广泛存在于饮食中, 并且人体对其需求很少, 因此很难出现严重的维生素缺乏疾病。这些维生素主要的来源是蔬菜, 谷类及其衍生产品。
维生素B1缺乏会引发脚气病和威尼克-柯萨可夫综合征等多神经炎和神经障碍。这些生理和发育紊乱与能量代谢受损有关, 也与硫胺素在膜中的作用有关[25]。维生素B2在人体内以黄素腺嘌呤二核苷酸 (FAD) 和黄素单核苷酸 (FMN) 两种形式参与氧化还原反应。FAD在脂肪酸β-氧化中是电子受体, 因此维生素B2缺乏会导致β-氧化变弱, 积累大量的脂肪酸, 从而引起尿酸。维生素B2与特定的蛋白质结合生成黄素酶, 参与很多辅因子和激素 (如辅酶A、辅酶Q、亚铁血红素、类固醇、甲状腺素等) 的合成。黄素缺乏会导致铁代谢紊乱、夜盲症、神经退化和周围神经病变[26]。大剂量维生素B3可用于降低血清脂质和胆固醇, 减少冠状动脉疾病发病率和死亡率, 主要有四种机制来调控血清脂质含量[27]:抑制脂肪组织脂解, 提高高密度脂蛋白 (HDL) 水平, 降低血清脂质, 抑制超低密度脂蛋白 (VLDL) 的合成和分泌。高剂量的烟酰胺可阻碍I型糖尿病和退行性疾病的发生, 但长期使用存在风险[28]。
缺乏维生素B5会引起抑郁、睡眠和神经障碍、心律不齐、皮炎等病症。维生素B6可能会减少心血管疾病的发生。PLP降血压的途径有以下几种[29]:降低血醛水平;通过PLP依赖多巴胺的合成, 降低血糖和脂质水平;阻碍糖化或脂氧化产物的形成。除此之外, 还参与合成血清素、多巴胺、γ-氨基丁酸等神经递质。低浓度的PLP会导致抑郁和大脑功能失调。
人体最容易缺乏维生素B9。一旦缺乏, 会降低细胞合成DNA的能力, 不利于嘌呤和胸腺嘧啶的合成。胸苷酸合成受损使得细胞中dUMP/dTMP比值过高, 由此导致dUTP更多地整合到DNA中, 造成DNA点突变和单双链断裂, 最终导致染色体断裂和细胞凋亡, 这些破坏很有可能引发癌症[30]。同型半胱氨酸的反硫化依赖维生素B6, 蛋氨酸的再甲基化依赖维生素B2、B9、B12, 因此缺乏这些维生素会使得它们的代谢受阻, 引发心血管和神经退行性疾病。
黄素、烟酸、泛酸、生物素和叶酸可能会通过组蛋白的翻译后修饰或其他机制影响核染色体的结构。不同饮食结构会影响转录调控、基因组稳定性、细胞分裂、分化、细胞凋亡、有丝分裂和减数分裂染色体缩合、DNA修复等。
5 结论
大部分维生素的生物合成与氨基酸代谢有关, 维生素研究的最终目的是减轻或消除缺陷及相关疾病。应该从分子生物工程、传统育种和农业实践三个方面对氨基酸衍生维生素的补救合成途径和调控机制进行研究。植物和哺乳动物生理学家与营养学家等协同工作可以更好地研究维生素在各种生物中的作用。
氨基酸衍生维生素 篇2
1 材料与方法
1.1 供试材料
白茶样品为福鼎大白茶加工制成。
1.2 衍生化反应原理
一级氨基酸的衍生化反应邻苯二甲醛(OPA)与2-巯基乙醇(或巯基丙酸)联用,在常温下迅速同一级氨基酸发生定量反应,对每种氨基酸都生成唯一的有较强荧光和紫外吸收的异吲哚衍生物(不太稳定),反应方程式如下:
衍生化反应速度非常迅速,反应完全,且在室温下即可完成,容易实现自动化,自动化操作保证了衍生化的重复性,使用自动进样器便可完成衍生化反应的全部操作。OPA衍生化法提供了很好的重现性,衍生化反应不受水和盐类的影响。
1.3 分析方法
1.3.1 原料处理
准确称取磨碎好的白茶样品2g,放入样品瓶中,加入40ml 50%乙醇,水浴浸提30min后,冷却过滤,滤液用50%乙醇定容至50ml,作为进样样品备用。取1μl 0.4 mol/L硼酸缓冲溶液后洗针,吸入1μl样品(或标准品)后洗针,再吸入1μl OPA衍生试剂,空气混合15次后洗针、进样(均由自动进样器自动完成)。
1.3.2 色谱分析条件
安捷伦公司Agilent 1100 HPLC由四元泵,自动脱气装置,自动进样器,柱温控制器,二极管阵列检测器,色谱工作站等组成。氨基酸分析时OPA自动衍生。色谱柱:Hypersil ODS C18 4.6'250cm。起始流动相:A:93%;B:7%。梯度洗脱,并相应调整流速,如表1所示。流速:1～1.2 ml/min;检测波长:338 nm。
流动相的配制A相:称取结晶醋酸钠7.00 g,加纯水1000 ml;加入三乙胺110 ml,用5%冰醋酸调节pH=7.20±0.02;取出5 ml该溶液,加入5 ml四氢呋喃。混匀,用0.22 mm滤膜过滤。B相:称取结晶醋酸钠2.20 g,加HPLC甲醇400 ml;加入HPLC乙腈400 ml,用1～2%冰醋酸调节pH=7.20±0.02;混匀,用0.22 mm滤膜过滤。备用。
OPA (邻苯二甲醛)衍生试剂称取100 mg OPA,加入1 ml HPLC甲醇,加入100μg巯基丙酸,再加入9 ml 0.4mol硼酸缓冲溶液混匀。
氨基酸标准品配制取0.5 ml 2.5μmol/ml氨基酸标准品加入0.5 ml 2mg/ml茶氨酸标准品,于自动进样瓶中混匀。氨基酸标准品浓度为1.25μmol/ml,其中半胱氨酸浓度为0.625μmol/ml,茶氨酸浓度为1 mmg/ml。
1.3.3 定性和定量分析。
根据标样进行定性和定量分析
2 结果与分析
2.1 色谱图
图1是高效液相色谱检测游离氨基酸标准品的色谱图,图2是高效液相色谱检测白茶样品中游离氨基酸的色谱图,从图1、图2可以看出用OPA衍生HPLC测定白茶中的氨基酸组分可以得到很好的分离。
2.2 白茶样品中氨基酸分析
从色谱图看,该方法能够较好地分离氨基酸的组分,色谱图形较好。通过对检测结果与标准样品进行分析,鉴定出14种氨基酸(表2),出峰顺序为:天冬氨酸-谷氨酸-丝氨酸-组氨酸-甘氨酸-苏氨酸-丙氨酸-精氨酸-茶氨酸-酪氨酸-半胱氨酸-缬氨酸-蛋氨酸-苯丙氨酸-异亮氨酸-亮氨酸-赖氨酸,但未检测到标准样品中的谷氨酸、组氨酸、半胱氨酸。氨基酸总量占茶叶干重的1.37%。含量最高的是茶氨酸,占氨基酸总量的66.96%;其次是精氨酸,占氨基酸总量的12.45%;接着是苏氨酸、丝氨酸、天冬氨酸等,它们的含量分别占氨基酸总量的5.42%、4.98%、3.22%。在所鉴定出的14种氨基酸中,含有7种人体必需氨基酸(赖氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸),占氨基酸总物;因为该衍生化反应速度非常迅速,反应完全,且在室温下即可完成,容易实现自动化,自动化操作保证了衍生化的重复
3 讨论
OPA氨基酸分析方法,其核心在于邻苯二甲醛(OPA)与巯基丙酸联用,在常温下迅速同一级氨基酸发生定量反应,对每种氨基酸都生成唯一的有较强荧光和紫外吸收的异吲哚衍生性。OPA的衍生化法提供了很好的重现性,衍生化反应不受水和盐类的影响。
该方法与朱旗等采用Waters公司生产的AccQ.Tag衍生方法经HPLC检测分析茶叶的游离氨基酸[8,10],在出峰顺序上面存在差异,这可能与所采用的色谱柱和衍生方法不同有关。
茶氨酸是一种神经递质,具有降血压、抗疲劳、抗肿瘤等功效[5,6,7]。本研究发现在茶叶中茶氨酸占总游离氨基酸的比例最高,同时还发现白茶中茶氨酸所占的比例比绿茶及速溶茶的含量均高[8,9,10]。茶氨酸的含量可能与采摘茶叶的嫩度、加工工艺和茶树品种有很大的关系,白茶中的白毫银针主要采摘刚刚生长出来的幼芽;并且白茶的加工过程不炒不揉,只经过萎凋和干燥两道工序,对茶叶的成分破坏少,故茶氨酸含量较高。本研究样品的游离氨基酸中人体必需氨基酸含量较高,长期饮用对人体大有裨益。
摘要：氨基酸是茶叶中重要化学成分,对茶叶品质有重要的影响。本试验采用OPA柱前衍生高效液相色谱法检测分析白茶中游离氨基酸的含量。在白茶中游离氨基酸总量占茶叶干重的1.37%,在样品中共检测出14种游离氨基酸,其中茶氨酸的含量最高,占氨基酸总量的66.96%,其次是精氨酸、苏氨酸、丝氨酸等。结果表明,用OPA柱前衍生高效液相色谱法是一种快速、简便检测白茶中游离氨基酸含量的方法。
关键词：OPA,HPLC,白茶,氨基酸
参考文献
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氨基酸衍生维生素 篇3
1 材料与方法
1.1 仪器与试剂
(1) 仪器:高效液相色谱仪 (Waters e2695, UV-2489紫外检测器, 2475荧光检测器) , 色谱柱 (Shimpack VP-ODS, 250 mm×4.6 mm, 5μm, 日本, 岛津公司) , Empower 3色谱工作站;分析天平 (Sartorius, d=0.1 mg) ;氮吹仪 (天津恒奥科技, HSC-12A) ;快速混匀器 (金坛市医药仪器厂, SK-1) ;pH计 (Sartorius, PB-10) 、溶剂过滤装置、离心机 (Thermo型号:Multifuge X3R) , 水浴锅 (DK-S22型, 上海精宏实验有限公司) 。
(2) 氨基酸标准样品:天冬氨酸 (Asp) 、谷氨酸 (Glu) 、天冬酰胺 (Asp) 、丝氨酸 (Ser) 、组氨酸 (His) 、甘氨酸 (Gly) 、苏氨酸 (Thr) 、精氨酸 (Arg) 、丙氨酸 (Ala) 、脯氨酸 (Pro) 、酪氨酸 (Tyr) 、缬氨酸 (Val) 、蛋氨酸 (Met) 、胱氨酸 (Cys) 、亮氨酸 (Leu) 、苯丙氨酸 (Phe) 、色氨酸 (Trp) 、赖氨酸 (Lys) (国药集团, 纯度均大于98%) 。
(3) 其他化学试剂:乙酸钠 (天津市光复精细化工厂, 优级纯) ;正己烷、 (天津市富宇化工有限公司, 分析纯) ;异硫氰酸苯酯 (PITC) (上海金山亭新化工公司) ;AccQ·Fluor氨基酸衍生试剂盒 (美国Waters公司, 包括AQC粉末2A、2B和硼酸盐缓冲液及17种混合氨基酸标准品) ;乙腈和甲醇为色谱纯;milli-Q超低有机物超纯水机制备超纯水 (美国Millipore公司生产) 。
1.2 方法
1.2.1 色谱条件
(1) PITC法分离条件
流动相A:称取15.2g无水乙酸钠, 加水1 850mL, 溶解后用冰醋酸调pH为6.5, 然后加乙腈140mL, 混匀, 用0.45μm滤膜过滤。
流动相B:甲醇∶乙腈∶水=20∶60∶20, 柱温35℃, 检测波长254nm, 流速:1.0mL·min-1, 进样量10μL。
线性梯度洗脱:0min, 0%B;5min, 2%B;6min, 6%B;15min, 9%B;19min, 21%B;32min, 45%B;34min, 55%B, 38min, 100%B;45min, 0%B。
(2) AQC法分离条件
流动相同PITC法, 柱温37℃, 荧光检测, 激发波长235 nm, 发射波长395 nm。流速:1.0mL·min-1, 进样量5μL。进行线性梯度洗脱, 洗脱程序同“1.2.1中的 (1) ”。
1.2.2 衍生化试剂配制
(1) PITC法
1mol·L-1三乙胺乙腈溶液:取三乙胺1.4mL, 加乙腈稀释至10mL, 混匀备用。
0.1 mol·L-1 PITC乙腈溶液:取PITC 0.3mL, 加乙腈稀释至25mL, 混匀备用。
(2) AQC法
衍生试剂制备:精密量取1 mL AccQ·Fluor2B试剂加入装有AccQ·Fluor衍生剂粉末的2A瓶中, 加盖密封, 旋涡震荡10s, 55℃加热10min, 直至AccQ·Fluor衍生剂粉末全部溶解, 即得浓度为10mmol·L-1衍生化试剂, 置干燥器中避光保存备用。
1.2.3 氨基酸标准溶液的配制
(1) Waters公司氨基酸标样
此标样中含17种氨基酸均为2.5μmol·mL-1 (含胱氨酸1.25μmol·mL-1) 。
(2) 自制氨基酸标样
准确称取19种氨基酸各约10mg, 置于25mL容量瓶中, 用0.1mol·L-1 HCl稀释至刻度, 摇匀, 作为氨基酸贮备溶液, 4℃冰箱放置。
1.2.4 衍生化反应
(1) PITC法
精密吸取自制氨基酸标准液200μL, 加入三乙胺乙腈溶液100μL, 0.1mmol·L-1异硫氰酸苯酯乙腈溶液100μL, 混匀, 室温放置20min, 加入正己烷400μL, 振荡, 1000 0r·min-1离心5min, 取下层溶液 (正己烷萃取2次) , 经0.22μm滤膜过滤后, 进样10μL进行色谱分析。氨基酸标准液与PITC的衍生反应如图1。
(2) AQC法
精密量取waters公司提供的氨基酸标样10μL, 置于进样衬管中, 加入硼酸缓冲液70μL和配制好的AQC试剂20μL, 在涡旋振荡器上混匀, 室温放置1 min转入进样瓶, 水浴 (55℃) 加热10min, 直接进行色谱分析。图2所示为氨基酸标样与AQC的衍生化反应。
1.2.5 生物样品前处理
(1) 血清样品:室温下, 200μL血清样品中加400μL乙腈, 涡旋30s, 后静置10 min, 12 000r·min-1离心10min, 取上清液至EP管, 40℃氮气吹干, 用200μL水复溶后过滤至EP管, 分别按照“1.2.4”项下操作进行衍生反应。
(2) 尿液样品:尿液室温下溶解, 12 000r·min-1离心10 min, 取上清液过滤至EP管, 分别按照“1.2.4”项下操作进行衍生反应。
2 结果和讨论
2.1 两种衍生方法测定氨基酸标准样品及生物样品的HPLC图谱
分离谱如图3和图4所示, 由图中可知, 40min内, 各氨基酸均得到完全、有效的分离。
2.2 线性范围和检测限
吸取一定量的氨基酸标准溶液制备系列浓度溶液, 分别按照“1.2.4”操作, 以氨基酸峰面积为纵坐标, 浓度为横坐标进行线性回归, 结果见表1。各氨基酸峰面积和浓度之间的线性相关系数r为0.991 8~0.999 7, 按S/N=3计算各氨基酸的检测限。
1.天冬氨酸 (Asp) , 2.谷氨酸 (Glu) , 3.丝氨酸 (Ser) , 4.甘氨酸 (Gly) , 5.组氨酸 (His) , 6.精氨酸 (Arg) , 7.苏氨酸 (Thr) , 8.丙氨酸 (Ala) , 9.脯氨酸 (Pro) , 10.NH3, 11.胱氨酸 (Cys) , 12.酪氨酸 (Tyr) , 13.缬氨酸 (Val) , 14.蛋氨酸 (Met) , 15.赖氨酸 (Lys) , 16.异亮氨酸 (Ile) , 17.亮氨酸 (Leu) , 18.苯丙氨酸 (Phe) .
1.天冬氨酸 (Asp) , 2.谷氨酸 (Glu) , 3.天冬酰胺 (Aspa) , 4.丝氨酸 (Ser) , 5.甘氨酸 (Gly) , 6.组氨酸 (His) , 7.牛磺酸 (Tau) , 8.精氨酸 (Arg) , 9.苏氨酸 (Thr) , 10.丙氨酸 (Ala) , 11.脯氨酸 (Pro) , 12.酪氨酸 (Tyr) , 13.缬氨酸 (Val) , 14.蛋氨酸 (Met) , 15.胱氨酸 (Cys) , 16.亮氨酸 (Leu) , 17.苯丙氨酸 (Phe) , 18.色氨酸 (Trp) , 19.赖氨酸 (Lys) .
2.3 精密度、稳定性和加标回收率实验
取一定浓度的氨基酸混合标准品, 经“1.2.4”处理后进行分析。在色谱条件下用已确立的方法连续进样5次, 结果表明, AQC法中各氨基酸峰面积的相对标准偏差RSD在0.32%~3.42%之间, PITC法中RSD为1.04%~3.82%, 重现性良好。
取低、中、高三个浓度的混合氨基酸标准品, 按照“1.2.4”分别衍生化后, 于第0、2、4、6、8、10、12h时进样分析, 测得两种衍生方法下, 各氨基酸衍生物色谱峰峰面积的RSD在0.61%~4.34%, 表明两种方法衍生化后的血样和尿样至少在12h内稳定。
取混合血清和尿液作为质控样品, 分别加入一定量浓度已知的氨基酸标准溶液, 经“1.2.4”处理后, 按照“1.2.1”色谱条件进样分析, 计算两种衍生化方法的回收率, 结果表明, 两种方法中各氨基酸的加标回收率在74%~145%之间, RSD均小于5%。
2.4 样品分析
分别用建立的氨基酸衍生方法对血清及尿样进行测定, 用标准曲线法分别计算血清及尿样中各氨基酸的含量, 结果见表2。
从表2可看出, 两种方法测试结果的准确度高, 一致性较好。但是对尿液测定结果发现, AQC法与PITC法差别较大, 利用AQC法测定的结果表明, 尿液中多种氨基酸 (组氨酸、苏氨酸、脯氨酸) 含量均超出AQC线性范围, 可能与尿液基质干扰了衍生试剂与氨基酸的反应有关, 需要进一步深入研究。而异硫氰酸苯酯法则显示了良好的测试准确性, 各氨基酸含量与文献报道范围接近。
3 讨论
AQC法与PITC法同属于柱前衍生方法, 本实验中两种方法所使用的色谱柱、流动相以及样品前处理方法均相同。本试验没有使用AQC法配套的色谱柱和流动相, 而是选用实验室常规色谱柱对生物样品进行分析, 结果证明同样可以达到很好的分离效果。但是, AQC衍生剂价格昂贵, AQC法衍生操作需要在水浴下完成, 条件较苛刻, PITC法在室温下即可完成, 成本低。
从以上对血样和尿样的比对结果可以看出AQC法和PITC法对血样的测定结果非常吻合, 且二者都有很好的准确度和精密度。但对于尿样的氨基酸测定显示尿液中多种氨基酸超出了AQC的检测范围, 因此对尿样的前处理方法需要进一步深入探讨。PITC法则显示了良好的测试准确性。
本文建立了PITC法同时测定血清及尿液中19种游离氨基酸的柱前衍生高效液相色谱方法, 对于尿液中氨基酸分析的应用未见报道。本方法采用乙睛-乙酸钠缓冲液作流动相进行梯度洗脱, 在45min内实现良好的基线分离, 方法简便、快速、灵敏准确。己被成功地应用于维吾尔族糖尿病患者血清和尿液样品氨基酸的含量测定, 获得较为满意的结果。
摘要：建立以PITC法和AQC法为柱前衍生试剂测定血液和尿液中游离氨基酸含量的测定方法。采用Waters-e2695操作系统, 色谱柱为Shim-vp, ODS (250mm×4.6mm, 5μm) (日本, 岛津公司) , 以甲醇/乙腈/水和醋酸钠溶液 (pH 6.5) 为流动相, 梯度洗脱。分别采用紫外和荧光检测器对血液和尿液中游离氨基酸进行含量测定。结果显示, 两种衍生化方法灵敏度好、分离度高, 具有良好的线性范围 (r>0.990 0) , 准确度高 (平均回收率为75.1%～127.0%) , 进样精密度好 (RSD为0.12%～3.42%) 。PITC法在尿液中游离氨基酸含量测定中显示了良好的测试准确性;而AQC法测定尿液中组氨酸、苏氨酸、脯氨酸超出线性范围, 需要对尿样的前处理进行深入研究。
关键词：柱前衍生,高效液相色谱法,异硫氢酸苯酯,6-氨基喹啉-N-羟基琥珀酰亚胺基氨基甲酸酯 (AQC) ,血液,尿液,游离氨基酸
参考文献
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氨基酸衍生维生素 篇4
伊马替尼(Gleevec,见图1)是由Novartis公司研发的首个上市的小分子酪氨酸激酶抑制剂,它是一种2-芳氨基嘧啶衍生物,能与多种激酶的保守ATP结合位点发生双重氢键相互作用, 从而成为竞争性的激酶抑制剂[6](见图1～图3)。
我们在研究激酶抑制剂的过程中设计了一系列新型的2-芳氨基均三嗪衍生物,此类化合物是在伊马替尼结构骨架的基础上将嘧啶环等排为三嗪环得到的,它保留了抑制剂产生活性的关键因素,能够与激酶的保守ATP结合位点发生双重氢键相互作用(见图4)。本文以三聚氯氰为原料,分别通过亲核取代反应、Suzuki偶联反应、格氏反应等方法合成了2个新型的2-芳氨基均三嗪衍生物(化合物7、14),并对格氏试剂合成方法进行了优化,为合成此类化合物提供了有效的途径(见图5合成路线1)。目前此类新型2-芳氨基均三嗪抑制剂的生物活性在测试中。
1 实验部分
1.1 试剂与仪器
三聚氯氰,河北诚信有限责任公司;苯酚,上海艺雷公贸有限公司;间硝基苯甲醛,南京沐客化学试剂公司;4-溴-1-丁烯,阿拉丁;4-氨基苯甲酸乙酯,上海吉康生化技术有限公司;2-氨基噻唑-4-甲酸乙酯,西亚试剂;所有试剂均为分析纯。
1H NMR(Bruker ARX -300型核磁共振仪),Bruker公司;ESI-MS(Finnigan LCQ-Advant-age MAX 质谱仪)Bruker公司。
1.2 合成
1.2.1 3的合成
在圆底烧瓶中加入三聚氯氰10.0 g (54.3 mmol),碳酸钾70.4 g (40.3 mmol)和四氢呋喃(80 mL),在冰浴条件下搅拌,将苯酚4.25 g (45.1 mmol)的四氢呋喃溶液用恒压滴液漏斗缓慢滴入反应瓶中,滴毕,室温条件下反应2 h。将混合物抽滤,滤渣用二氯甲烷(3×80 mL)洗涤三次,将滤液浓缩,得到白色固体,以乙酸乙酯重结晶后得产物3质量为5.21 g,收率为47.8%, 1H NMR δ7.46～7.42 (m, 2H), 7.35 (d, J=7.0 Hz, 1H), 7.17 (dd, J=0.72, 6.20 Hz, 2H); MS m/z 241.82[M+1]+。
1.2.2 5的合成
在圆底烧瓶中依次加入碳酸钠2.2 g (20.4 mmol),四氢呋喃(80 mL)和4.93 g (20.4 mmol)化合物3,在冰浴条件下搅拌5 min,将5.34 g (20.4 mmol)化合物4的四氢呋喃溶液用恒压滴液漏斗缓慢滴入烧瓶中,滴毕,室温条件下反应1.5 h。将混合物抽滤,滤渣用乙酸乙酯(3×60 mL)洗涤三次,将滤液室温条件下旋干,得到白色固体,用硅胶柱层析(V石油醚:V乙酸乙酯=8:1),得产物5质量为6.7 g,收率为70.1%; 1H NMR δ7.44～7.42 (m, 3H), 7.26 (s, 1H), 7.20 (dd, J=7.64, 0.96 Hz, 3H), 7.13 (s, 1H), 5.14 (d, J=9.3 Hz, 2H), 4.42 (s, 1H), 4.24 (s, 1H), 3.68 (s, 2H), 1.59 (s, 1H), 1.47 (s, 9H); MS m/z: 466.20,化合物4的合成方法见文献[7]。
1.2.3 7的合成
在三口烧瓶中依次加入二水合氟化钾2.1 g (1.9 mmol),二氧六环(20 mL),水(4 mL),1.7 g(3.66 mmol)化合物5和间硝基苯硼酸0.5 g(3.66 mmol),迅速加入四三苯基磷钯1.2 g(1.0 mmol),充氮气保护,80 ℃条件下反应3 h。将混合物抽滤,滤渣用乙酸乙酯(3×20 mL)洗涤三次,浓缩滤液,硅胶柱层析 (V石油醚:V乙酸乙酯=8:1 ),得产物7质量为0.8 g,收率为41.6%, 1H NMR δ7.47 (m, 2H), 7.28 (m, 6H), 7.10 (d, J=6.2 Hz, 1H), 6.80 (dd, J=12.3, 15.0 Hz, 2H), 5.71 (d, J=0.84 Hz, 1H), 5.15 (d, J=10.5 Hz, 2H), 4.59 (s, 1H), 4.46 (s, 1H), 3.96 (s, 1H), 3.73 (s, 1H), 1.55 (s, 4H), 1.36 (t, J=41.2, 26.0 Hz,9H); MS m/z 526.26[M+1]+。
1.2.4 10的合成
在圆底烧瓶中依次加4-溴-1-丁烯10.1 g(75.1 mmol),乙腈(100 mL),氢氧化钾4.9 g(86.7 mmol) 和间溴苯酚10.0 g(57.8 mmol),回流反应8 h。抽滤,二氯甲烷(3×50 mL)洗涤,浓缩滤液,硅胶柱层析[石油醚],得无色油状物10质量为10.0 g,产率为76.2%;1H NMR δ7.23(t, J=8.0Hz, 1H), 7.14～7.10(m, 2H), 6.96～6.93(m, 1H), 5.93～5.83(m, 2H), 5.19～5.07(m, 1H), 4.03(t, J=6.6Hz, 2H), 2.48(q, J=6.6Hz, 2H);MS m/z(离子源为电喷雾时,无信号响应);13C NMR δ159.98, 135.10, 131.55, 123.84, 122.56, 117.82, 117.47, 114.38, 67.53, 33.38。
1.2.5 12的合成
(1)在三口烧瓶中依次加入镁条0.8
g(31.7 mmol)和碘粒(1粒),氮气保护的条件下,将化合物7 6.0 g(26.4 mmol)的四氢呋喃溶液(40 mL)用恒压滴液漏斗缓慢滴入烧瓶中,滴加至1/5溶液(8 mL)时,停止滴加,用吹风机为反应瓶加热引发格氏反应,将剩余液体缓慢滴加至反应瓶中,滴毕,放入70 ℃油浴中保温反应2 h,得格氏试剂11。将反应瓶室温冷却,直接用于下一步反应。
(2)在三口烧瓶中依次加入三聚氯氰4.4
g(23.8 mmol)和四氢呋喃(100 mL),冰浴及氮气保护条件下,将上述制备的格氏试剂用恒压滴液漏斗缓慢滴入烧瓶中,滴加完毕后20 ℃继续反应2 h。浓缩反应液,硅胶柱层析( V石油醚:V乙酸乙酯=30:1),得白色固体12质量为4.1 g,产率为58.2%;1H NMR δ7.95～7.18(m, 4H), 5.95～5.85(m, 1H), 5.19～5.08(m, 2H), 4.09(t, J=6.1Hz, 2H), 2.51～2.49(m, 2H); MS m/z 319.26 [M+Na]+;13C NMR δ 162.47, 158.51, 153.43, 134.68, 131.75, 129.77, 120.76, 120.08, 116.97, 113.51, 67.06, 32.94。
1.2.6 14的合成
在圆底烧瓶中依次加入300.0 mg(1.01 mmol)化合物12,醋酸钠110.6 mg (1.35 mmol) ,4-氨基苯甲酸乙酯111.5 mg(0.68 mmol)和四氢呋喃(10 mL),室温搅拌0.5 h,放入40 ℃油浴中继续搅拌2 h。抽滤并以四氢呋喃(3×5 mL)洗涤,浓缩滤液,硅胶柱层析(V二氯甲烷:V甲醇=100:1),得白色固体14质量
为202.8 mg,产率为72.2%;1H NMR δ10.96 (s, 1H), 7.93 ～7.75 (m, 5H), 7.41 (t, J=7.8 Hz, 1H), 7.16 (d, J=6.8 Hz, 1H), 5.96 ～5.86 (m, 1H), 5.22 ～5.11 (m, 2H), 4.30 (q, J=7.0 Hz, 2H), 4.03 (s, 2H), 2.51(m, 1H), 1.34 (t, J=7.1 Hz, 2H); MS m/z: 425.17 (M+1)+;13C NMR δ 165.65, 164.43, 159.04, 142.93, 135.86, 134.98, 130.34, 124.95, 121.44, 120.23, 117.52, 68.68, 67.21, 60.87, 33.45, 27.85, 22.19, 14.60。
2 结果与讨论
化合物10经格氏反应、亲核取代反应“一锅法”合成关键中间体12。格氏反应溶液中原料的浓度对反应影响较大。当原料浓度过低时,格氏反应难以引发且容易被盖灭;当原料浓度过高时,产生严重副反应,生成的格氏试剂在室温冷却时容易析出,难以进行下一步反应。反应液中原料浓度是合成格氏试剂的成败的关键影响因素,也决定了终产物(化合物12)的收率。我们对格氏反应原料10浓度进行了实验探索,得到了反应收率较高的实验条件(见表1)。
3 结 论
我们采用两条不同的合成路线成功地合成了2个结构新颖的2-芳氨基均三嗪衍生物,为合成此类均三嗪衍生物提供了有效的途经。
摘要：以三聚氯氰为起始原料,经由烃化反应、Suzuki偶联反应、格氏反应等组成的两条不同的合成路线合成了2个结构新颖的2-芳氨基均三嗪衍生物,其结构经1H NMR,MS等确证。同时对格氏反应条件进行了实验探索,得到了反应收率较高的实验条件。
关键词：均三嗪衍生物,Suzuki偶联反应,格氏反应
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