葡萄糖苷酶抑制剂（精选8篇）
葡萄糖苷酶抑制剂 篇1
糖尿病是一类由于内分泌异常而引起的代谢性疾病,在现代临床上较为常见[1,2]。目前临床上治疗糖尿病的药物主要有磺脲类、双胍类、格列奈类、噻唑烷二酮类和α-葡萄糖苷酶抑制剂类五种[3],其中,α-葡萄糖苷酶抑制剂类药物因其独特的优势而在临床上有着广泛的应用[4,5,6]。α-葡萄糖苷酶抑制剂类药品主要有阿卡波糖(Acarbose)、伏格列波糖(Voglibose)、米格列醇(Miglitol)等,这些药物不仅价格高,还存在副作用[7]。因此,开发新型α-葡萄糖苷酶抑制剂类药物成为当今治疗糖尿病药物研究的热点[8]。
本实验利用体外筛选模型[9]从土壤中筛选到一株产α-葡萄糖苷酶抑制剂的菌株UN-8[10],其代谢产物对α-葡萄糖苷酶有较强的抑制作用,经分离鉴定,活性物质的分子量在1 000 Da以上。目前未见有相关文献报道,为课题后续研究提供了拓展空间。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验材料:
菌株UN-8由作者实验室保藏。
1.1.2 试剂:
4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷,美国Sigma公司;α-葡萄糖苷酶,美国Sigma公司。
1.1.3 仪器:
J2-21高速冷冻离心机,美国Beckman公司;UV-1601紫外分光光度计,日本SHIMADIU公司;RE-52A型旋转蒸发器,上海亚荣生化仪器厂;中空纤维超滤系统,Pharmacia公司;Sephadex G25凝胶自装柱与Superdex Peptide 10/300GL预装柱,Bio-Rad公司;LC-10AVP型高效液相色谱仪,日本岛津公司。
1.1.4 培养基
①初始发酵培养基(g/L):
可溶性淀粉 20,酵母膏 10,K2HPO4 1,KNO3 0.5,NaCl 0.5,MgSO4·7H2O 0.5,FeSO4·7H2O 0.01,蒸馏水1 000mL,pH值7.2～7.4;
②优化后发酵培养基(g/L):
木薯淀粉 20,黄豆粕粉 10,K2HPO4 1,KNO3 0.5,NaCl 0.5,MgSO4·7H2O 0.5,FeSO4·7H2O 0.01,蒸馏水1 000mL,pH值8.0。
1.2 方法
1.2.1 种子培养方法
无菌条件下,刮取一环斜面孢子于50 mL种子培养基(250 mL锥形瓶)中,28 ℃、160 r/min培养24 h,得种子液。
1.2.2 发酵培养方法
无菌条件下,用移液枪移取2 mL种子液于装50 mL发酵培养基(250 mL锥形瓶)中,置于摇床中,28℃、160 r/min发酵培养3 d,得发酵液。
1.2.3 α-葡萄糖苷酶抑制剂活性测定
采用PNPG-紫外分光光度计法[11],即取100 μL待测样品(用去离子水稀释10倍)于玻璃试管中,依次加入400 μL磷酸缓冲液(pH 6.8),100 μL α-葡萄糖苷酶,混匀,置于37℃恒温水浴锅保温15 min,加入400 μL 5 mmol/L底物PNPG,混匀,于37℃恒温水浴锅中反应15 min,加入2 mL 0.5 mol/L Na2CO3溶液终止反应,对照组以蒸馏水代替样品,最后采用紫外分光光度计在405 nm波长处测定各管溶液的吸光值。
1.2.4 发酵液预处理
将发酵液置于4℃高速冷冻离心机,除去菌体及发酵液中其他大颗粒物质,收集上清液。上清液浓缩5倍,加入2倍体积冰乙醇,密封,于4℃冰箱中静置1～2 h,离心,收集上清液,除乙醇,经活性炭脱色,过滤,于4℃冰箱保藏,备用。
1.2.5 采用透析袋判断活性抑制剂的分子量范围
分别选取截留分子量为3 500 Da和1 000 Da两种透析袋对发酵液进行透析试验。将大约1/2透析袋体积的发酵液装入袋内,置于装有去离子水的烧杯中,于磁力搅拌器上边搅拌边透析,每隔4 h换一次水,透析完毕,将透析内液与透析外液浓缩至原体积,分别测定各溶液对α-葡萄糖苷酶的的抑制率。
1.2.6 中空纤维超滤
采用0.45 μm有机滤膜对脱色后发酵液进行过滤,去除颗粒性杂质,澄清液经截留量为3 000 Da的中空纤维超滤系统超滤,收集分子量小于3 000 Da的流出液,置于4℃冰箱中保存,备用。
1.2.7 采用Sephadex G25凝胶柱层析分离纯化活性抑制剂[12]
量取步骤1.2.6中滤液3 mL,上柱,超纯水洗脱,洗脱流速控制在0.5 mL/min,每管收集1.5 mL,共收集75管。分别测定各管溶液对α-葡萄糖苷酶的抑制活力。
1.2.8 采用Superdex Peptide 10/300GL进一步分离纯化活性抑制剂
将步骤1.2.7中抑制活力最高的一管样品浓缩,经0.2 μm微孔过滤膜过滤除去样品中气泡,采用Superdex Peptide 10/300GL凝胶柱进一步分离纯化。
1.2.9 紫外分光-可见光度分析
将活性抑制剂用超纯水稀释一定的倍数,以超纯水作对照,采用酶标仪在波长190～1 000 nm范围内进行紫外扫描,确定活性抑制剂的吸收峰。
1.2.10 高效液相色谱检验样品纯度
检验活性抑制剂的高效液相色谱条件为:所用分析柱为C18柱(规格4.6 mm×250 mm,5 μm),检测器为紫外检测器,检测波长为200 nm,以甲醇:水(V/V)=3:7的混合溶液作为流动相,进样量10 μL,控制流速为0.5 mL/min。
1.2.11 傅里叶变换红外光谱仪定性分析[13]
将样品溶液置于真空旋转蒸发仪浓缩干燥,得到固体样品,然后将样品与KBr压制成透明薄片(直径约13 mm,厚度约1 mm),在波数400～4 000 cm-1 范围内,扫描样品信号,经傅里叶变换干涉信号即得到样品的红外光谱图。
1.2.12 质谱检测
取样品0.5 μL,采用AB 4800 MALDI-TOF-TOF 质谱仪测定其分子量。
1.2.13 硅胶薄层色谱分析活性抑制剂
本实验所用展开剂系统为:乙酸乙酯:吡啶:无水乙醇:水(V/V/V/V) =8∶1∶2∶2,显色剂系统为:苯胺-二苯胺-磷酸显色剂系统,配方比例为:苯胺(2%,m/v):二苯胺(2%,V/V ):磷酸 (85%,V/V )=5∶5∶1。
2 结果与分析
2.1 分离纯化
2.1.1 发酵液预处理所得α-葡萄糖苷酶抑制率
2.1.2 Sephadex G25凝胶柱层析分离纯化结果
取经脱色处理的样品3 mL,沿柱壁缓缓加入已装好凝胶柱中,用超纯水洗脱,流速控制在0.5 mL/min,每管收集1.5 mL,共收集75管。测定每支管中的液体对α-葡萄糖苷酶的抑制能力,实验结果如图1所示。
由图1可知,经过Sephadex G-25凝胶柱分纯后,活性抑制剂主要分布在第40～61管之间,而活力最高管为第47号和48号管,因此将这两管样品合并浓缩,为后续实验做准备。
2.1.3 Superdex Peptide 10/300GL分离纯化结果
经过Superdex Peptide 10/300GL柱子分离后,共收集40管,图谱如图2所示。
测定每管溶液对α-葡萄糖苷酶的抑制率,活性抑制剂主要集中在第A4～A9管之间,而活力最高的为第A8管,因此将第A8管用于结构的初步分析。
2.2 初步鉴定
2.2.1 紫外可见光谱分析结果
由图3可知,样品溶液在200 nm处有最大紫外吸收峰,因此,选择200 nm作为样品的紫外检测波长。
2.2.2 高效液相色谱检测样品纯度结果
由图4 显示,样品经 HPLC分析呈现单一对称峰,可见其α-葡萄糖苷酶抑制剂活性物质是一种均一成分。
2.2.3 傅里叶变换红外光图谱
由图5可知,样品在4 000 cm-1到400 cm-1之间的主要特征吸收峰有3 394.61 cm-1、2 946.15 cm-1、1 651.93 cm-1、1 402.71 cm-1、1 149.60 cm-1、1 035.82 cm-1、526.44 cm-1,其中3 600 cm-1～3 200 cm-1和1 665 cm-1～1 635 cm-1之间的两组峰,表明该活性抑制剂可能是糖类物质。在3 394.61 cm-1处有宽的强吸收峰, 证明是分子间氢键O-H的伸缩振动峰,2 946.15 cm-1处为C-H的伸缩振动峰,1 651.93 cm-1处为C=C、N-H或者C=O的伸缩振动峰,1 402.71 cm-1处为C-N伸缩或者C-H弯曲振动,1 149.60 cm-1和1 035.82 cm-1处为醚的伸缩振动峰。
2.2.4 质谱检测结果
由图6可知,质谱图中呈现一个明显的离子峰,[M+H+]=1 229.8,因此该活性抑制剂的分子量为1 228.8。
2.2.5 硅胶薄层层析结果
由图7可知,通过苯胺-二苯胺-磷酸显色后,活性抑制剂得到了一定程度的纯化,并且显示了糖的特性,因此,活性抑制剂应属于糖类物质,在硅胶板上具有与糖相同的性质。
3 讨论
目前有很多学者采用化学合成法来制备α-葡萄糖苷酶抑制剂[14],但步骤繁杂,副产物多。也有学者从中草药植物中筛选α-葡萄糖苷酶抑制剂[15],但由于原料有限,活性物质纯度低,至今未工业化生产。倪孟祥等人从海洋微生物的代谢产物中分离得到α-葡萄糖苷酶抑制剂[16],但没有给出明确的成份鉴定。
由于活性物质分子量为1 228.8,而每个葡萄糖分子量为180,若假设活性抑制剂是由若干个葡萄糖或(和)其他单糖连接而成的,则推测该物质应是一种由7～8个单糖组成的天然寡聚糖。寡聚糖具有很多独特功能,比如低聚异麦芽糖、低聚果糖、低聚半乳糖等,不仅能能显著增加人体肠道益生菌(比如双歧杆菌、乳酸杆菌)数量,还能抑制腐生菌生长,从而改善肠道微生态,有益于人体健康。此外,此类寡聚糖还具有抗龋齿、进食后不会出现血糖升高、不引起肥胖等优势。而阿卡波糖是一种假性四糖,虽然在结构上与寡糖非常相似,但不具备低聚寡糖的这些独特优势,而且在降血糖过程中患者还会出现腹胀、腹泻、腹部不适等不良症状。因此,该活性抑制剂具有很大的研究意义及探索价值。
4 结论
作者从土壤中筛选到产α-葡萄糖苷酶抑制剂菌株,首先通过层析等方法对发酵液中抑制剂进行分离提纯,然后通过质谱鉴定显示活性物质分子量为1228.8,最后结合紫外-可见光光谱扫描、傅里叶红外光谱扫描以及硅胶薄层层析对物质结构做了初步分析,结果表明活性物质应属于寡糖,其精确结构还有待进一步研究。
摘要：目的:分离纯化发酵液中的α-葡萄糖苷酶抑制剂,并对其结构进行初步鉴定。方法:通过预处理发酵液、活性炭脱色、中空纤维超滤、Sephadex G25葡聚糖凝胶层析以及Superdex Peptide 10/300GL预装柱层析等方法对发酵液中的活性抑制剂进行了分离纯化,通过质谱鉴定确定其分子量,结合紫外-可见光光谱扫描、傅里叶红外光谱扫描以及硅胶薄层层析对该物质的结构进行初步分析。结果:经分离纯化,该物质的高效液相色谱图呈单一对称峰,通过质谱确定其分子量为1 228.8,经初步鉴定该抑制剂应属于寡糖类物质。结论:提取了发酵液中的α-葡萄糖苷酶抑制剂,其分子量为1 228.8,目前未见有文献报道,为糖尿病新药研发奠定了基础。
关键词：α-葡萄糖苷酶抑制剂,层析,分离,纯化
葡萄糖苷酶抑制剂 篇2
氨基酸对锯缘青蟹N-乙酰氨基葡萄糖苷酶的效应
研究Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Met、Asn、Cys、Ser、Thr、Asp、Glu、His、Lys、Arg等17种氨基酸对锯缘青蟹(Scylla serrata)N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAGase)活力的影响.结果表明:非极性氨基酸中Gly、Ala、Leu、Phe对酶活力几乎没有作用,而Val、Ile对酶略有激活,20 mmol/L的`Val可以使酶活力提高7.5%,40 mmol/L的Ile可以使酶活力提高10.5%;Pro、Met对该酶略有抑制作用,当浓度为40 mmol/L时,分别可以使酶活力下降15.2%和9.8%;极性氨基酸Asn、Cys、Ser、Thr对酶的活力没有影响;带负电荷的酸性氨基酸Asp和Glu对酶有抑制作用;带正电荷的碱性氨基酸His对该酶略有抑制,Lys和Arg对该酶抑制作用较强.研究Lys和Arg对酶催化pNP-NAG水解反应的抑制机理,并测定其抑制常数,结果表明:Lys和Arg的抑制作用均表现为可逆效应,抑制类型均为反竞争性抑制,其K.分别为5.29mmol/L和3.76 mmol/L.
作 者：林建成 谢进金 张继平杨学敏 王勤 陈清西 LIN Jian-cheng XIE Jin-jin ZHANG Ji-ping YANG Xue-min WANG Qin CHEN Qing-xi 作者单位：林建成,LIN Jian-cheng(厦门市妇幼保健院)谢进金,张继平,杨学敏,王勤,陈清西,XIE Jin-jin,ZHANG Ji-ping,YANG Xue-min,WANG Qin,CHEN Qing-xi(厦门大学生命科学学院,细胞生物学与肿瘤细胞工程教育部重点实验室,福建,厦门,361005)
刊 名：厦门大学学报（自然科学版） ISTIC PKU英文刊名：JOURNAL OF XIAMEN UNIVERSITY (NATURAL SCIENCE) 年，卷(期)：2006 45(2) 分类号：Q356.1 关键词：锯缘青蟹 N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶 氨基酸 抑制作用机理苦苣菜α-葡萄糖苷酶的抑制活性 篇3
国内外对苦苣菜化学成分和药理活性的报道较多。文献报道,苦苣菜的水提液对动物耐缺氧和急性心肌缺血具有明显的保护作用[2];苦苣菜总黄酮对实验性肝损伤具有明显的保护作用[3];苦苣菜酸性提取物具有抗肿瘤作用[4];苦苣菜提取物具有明显的抗炎和抗凝血作用[5];苦苣菜水提液对亚硝基和羟基自由基均有很强的清除作用[6];苦苣菜提取物对小鼠具有明显的抗伤害性疼痛的作用[7];苦苣菜对老鼠的抗焦虑样作用[8]。
据报道,胡佩卓等[9]研究了苦苣菜的脂溶性化学成分。徐燕等[10]对中国安徽大别山区苦苣菜的化学成分进行了研究。白玉华[11～12]连续对日本产苦苣菜的化学成分进行了研究。周桂芬[13]通过不同提取方法,采用紫外-可见分光光度法测定苦苣菜总黄酮的含量。但国内外均未见对苦苣菜α-葡萄糖苷酶抑制活性研究的报道。
α-葡萄糖苷酶抑制剂可有效降低餐后高血糖,如今已作为治疗Ⅱ型糖尿病的有效药物类型[14]。本文利用体外α-葡萄糖苷酶抑制筛选模型对苦苣菜提取物进行了α-葡萄糖苷酶的抑制活性研究,以期为苦苣菜开发利用提供科学依据。
1 仪器与材料
Multiskan MK3酶标仪(美国Thermo Electron公司);LRH-150恒温培养箱(上海一恒科技有限公司);DELTA320型PH计(美国Mettler-Toledo公司);电子天平(美国Mettler-Toledo公司);旋转蒸发仪(德国Heidolph公司)。
α-葡萄糖苷酶(α-glucosidase,EC 3.2.1.20,美国Sigma公司);4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷(4-N-trophenyl-α-D-glucopyranoside,PNPG,026K1516,美国Sigma公司);阿卡波糖(Acarbose,Lot16869,德国SERVA公司);4-硝基苯酚(4-Nitrophenol,PNP,10116387,美国Alfa Aesar公司)和二甲亚砜(DMSO)。
苦苣菜样品于2008年7月采于内蒙古阿拉善盟额济纳旗进样,经河南大学天然药物研究所生药教研室李昌勤副教授鉴定为菊科植物Sonchus oleraceus Linn.,标本存放于河南大学天然药物研究所。
注:NT表示未测定。
2 实验方法
2.1 提取
苦苣菜全草阴干,粉碎,石油醚浸泡12h后,于索氏提取器中连续回流提取,提取3次,每次1h,浓缩,得石油醚提取物。挥干溶剂后,依次用乙酸乙酯、甲醇浸泡12h,回流提取3次,每次1h,得乙酸乙酯提取物、甲醇提取物。
2.2 抗氧化活性筛选方法
2.2.1 α-葡萄糖苷酶抑制活性的筛选方法
2.2.2 α-葡萄糖苷酶活力的测定
酶活力单位定义:37℃,pH6.8系统条件下,每分钟水解底物产生1μmol对硝基苯酚的酶量,定义为一个酶活力单位(U)。
酶活力测定:1 1 2μL磷酸钾缓冲液(pH6.8),加入0.2U/mL的α-葡萄糖苷酶20μL,DMSO 8μL,37℃恒温15min后加入2.5 m m o l/L P N P G 2 0μL,3 7℃恒温反应15min。再加入0.2mol/L的Na2CO3溶液80μL,于405nm波长下测OD值。
2.2.3 标准曲线制作
根据采用的反应体系,用磷酸缓冲液(pH6.8)配置1000μmol/LPNP,稀释成400、300、200、150、100、50、25、5和0μmol/L。分别取7种不同浓度的PNP溶液各160μL,加入0.2mol/LNa2CO3溶液80μL,混匀,在405nm下测定OD值,测三组取算术平均值。以OD值为纵坐标,对硝基苯酚浓度为横坐标,做出标准曲线。
2.2.4 苦苣菜对α-葡萄糖苷酶抑制活性的检测
将苦苣菜各提取物以D M S O溶解,并存储于4℃冰箱中。以张丽等[15～17]建立的9 6微孔板筛选方法,4 0 5 n m处检测其O D值。同时做相同体系下的样品空白组,不加样品和酶与底物的空白对照组、不加样品的阴性对照组和以阿卡波糖为抑制剂的阳性对照组。并用Origin软件求出相应的IC50值。
3 结果与讨论
3.1 各提取物的抑制活性
表1显示,苦苣菜的石油醚、乙酸乙酯和甲醇提取物的α-葡萄糖苷酶的抑制活性。从表1可以看出该植物各提取物在质量浓度为1500μg·mL-1时,石油醚和乙酸乙酯提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制活性较,且均高于阳性对照药阿卡波糖(55.63%),表明苦苣菜具有较好的α-葡萄糖苷酶抑制活性。
为进一步研究抑制活性,对苦苣菜石油醚和乙酸乙酯提取物的初筛终浓度依次对半稀释进行IC50值计算。从表1可以看出,不同溶剂比较,苦苣菜的石油醚提取物的IC50值最小(IC50=33.25μg·mL-1),显示其抑制效果最好,其次为乙酸乙酯提取物(IC50=1909.14μg·mL-1)。说明苦苣菜石油醚和乙酸乙酯提取物具有很好的抑制活性。
3.2 提取物浓度对α-葡萄糖苷酶抑制活性的影响
图1显示,苦苣菜的不同极性提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制活性均呈剂量依赖性,其中石油醚提取物在质量浓度小于93.75μg·mL-1时,抑制率达到了最大值100%,此后,再增加提取物浓度抑率也不再变化,出现“平台期”。Acarbose在实验质量浓度范围内,抑制率随质量浓度的增加而增大,几乎呈线性增长。说明苦苣菜石油醚提取物具有很好的α-葡萄糖苷酶抑制活性。
4 结语
本实验利用课题组建立的一种简单的α-葡萄糖苷酶抑制作用的微量筛选模型,对苦苣菜的不同提取物进行酶抑制活性筛选。
葡萄糖苷酶抑制剂 篇4
关键词：藤黄,藤黄酸,新藤黄酸,α-葡萄糖苷酶,糖尿病,抑制剂,活性筛选
中药藤黄为藤黄科植物藤黄 ( Garcinia hamburgy Hook. f. ) 树干切伤后分泌的胶树脂[1], 性凉, 味酸、涩, 有毒, 具有消肿化毒、止血杀虫功效。化学成分研究表明, 藤黄主要含有以藤黄酸为代表的黄酮类化合物[2,3]。藤黄的主要药理作用是抗肿瘤[4], 临床上用于治疗乳腺癌、胃癌、肝癌、淋巴肉瘤、骨髓瘤、消化道肿瘤、呼吸系统肿瘤及前列腺肿瘤[5,6,7]等。黄酮类化合物是藤黄抗肿瘤的主要物质基础, 目前该类化合物的降血糖作用尚无报道。本试验首先从藤黄中分离鉴定出黄酮类化学成分, 然后以4 - 硝基苯- α - D -吡喃葡萄糖苷 ( P - Nitrophenyl - α - D - glucopyranoside, PNPG) 为底物, 考察它们体外对 α - 葡萄糖苷酶的抑制活性, 以期为藤黄的进一步开发利用提供科学依据。
1 材料
1. 1 药品与主要试剂
藤黄药材, 购自安国药材市场 ( 由吉林省中医药科学院助理研究员南敏伦鉴定) ; 藤黄酸标准品 ( 批号为130523) 、新藤黄酸标准品 ( 批号为20130304) , 宝鸡辰光生物科技有限公司生产; α - 葡萄糖苷酶、PNPG, Sigma公司生产; 阿卡波糖 ( 化学对照品) , 中国药品生物制品检定所生产。
1. 2 主要仪器
电子天平 ( 型号为SHIMADZU AUY220) , 上海精天电子仪器有限公司生产; 超声波清洗器 ( 型号为KQ - 250E) , 昆山市超声仪器有限公司生产; 自动收集器 ( 型号为BSZ - 100) , 上海沪西分析仪器厂有限公司生产; 数显恒温水浴锅 ( 型号为HH4) , 金坛市江南仪器厂生产; 酶标分析仪 ( 型号为DNM - 9602) , 北京普朗新技术有限公司生产; 布鲁克质谱仪 ( 型号为av400D) , 瑞士布鲁克公司生产。
2 方法与结果
2. 1 提取分离
取藤黄药材200 g, 粉碎至50 目以下, 精密测定, 乙酸乙酯回流提取3 次, 每次2 h; 回收溶剂, 干燥, 用p H值为10 水溶液溶解, 经AB - 8 大孔树脂柱吸附纯化; 用碱水洗至中性, 再水洗; 最后以p H为10 的60% 乙醇洗脱, 收集洗脱液, 调至中性, 回收溶剂蒸干, 得到藤黄总黄酮提取物32. 64 g。
2. 2 纯化
选择长约40 cm, 内径为4 cm的玻璃柱, 称取硅胶350 g, 湿法装柱。称量藤黄总黄酮提取物4 g, 少量甲醇溶解, 湿法上样, 用系统梯度二氯甲烷- 甲醇 ( 100∶1 ~ 0∶1) 洗脱, 自动收集器以10 m L/min的速度收集馏分, 每馏分100 m L, 回收溶剂, 采用薄层层析板法合并相同馏分, 重结晶, 得化合物1 和化合物2, 分别对其进行1H - NMR、13C - NMR分析。
2. 3 α-葡萄糖苷酶抑制活性检测
取化合物1 和化合物2, 分别用二甲基亚砜溶解, 再用p H值为6. 8 的磷酸盐缓冲液稀释浓度分别为0. 025, 0. 05, 0. 1, 0. 25, 0. 5, 1. 0, 2. 5 mg /m L, 二甲基亚砜在反应体系中的最终含量< 1% 。该体系为:67 mmol / L磷酸盐缓冲液150 μL, 1 mg / m L谷胱甘肽溶液50 μL, 0. 1 mg /m L α - 葡萄糖苷酶溶液100 μL, 37 ℃ 温育10 min; 20 mmol / L PNPG溶液100 μL, 37 ℃ 温育20 min; 再加入0. 2 mol / L Na2CO3溶液400 μL终止反应。期间将20 μL藤黄酸和新藤黄酸及缓冲液加到反应体系中, 每个样品在同一浓度下同时作3 个平行组, 取其平均值; 在409 nm波长处测定吸光度值。以阿卡波糖为阳性对照, 计算酶活性抑制率, 计算公式: 抑制率 ( % ) = ( A对照- A样品) /A对照 × 100% 。式中: A为酶与底物反应后的吸光度值。测得的吸光度值经Origin软件作图, 并求出IC50值。
2. 4 结构鉴定
2.4.1藤黄酸
EI - MS m / z: 629 [M + H]+, m. p. = 77 ℃ , 化合物1 为黄色结晶粉末。1H - NMR ( CDCl3) : δ = 12. 75 ( 1H) , 7. 54 ( d, 1H) , 6. 57 ( d, 1H) , 6. 10 ( t, 1H) , 5. 34 ( d, 1H) , 5. 03 ( m, 2H) , 3. 47 ( m, 1H) , 3. 28 ( m, 2H) , 2. 98 ( d, 2H) , 2. 52 ( d, 1H) , 2. 07 ( m, 2H ) , 1. 96 ( br, 1H ) , 1. 75 ~ 1. 28 ( m, 28H) 。13C - NMR ( CDCl3) : δ = 203. 28, 178. 80, 171. 78, 161. 20, 157. 49, 157. 26, 137. 76, 134. 29, 133. 31, 133. 16, 131. 29, 127. 39, 123. 71, 123. 38, 123. 00, 115. 02, 107. 65, 102. 63, 100. 36, 90. 93, 83. 75, 83. 52, 81. 14, 48. 83, 47. 44, 41. 97, 29. 41, 29. 20, 28. 19, 27. 79, 26. 21, 25. 23, 24. 97, 22. 67, 21. 47, 19. 96, 18. 60, 18. 16。与参考文献[8]中的藤黄酸数据一致, 同时通过与藤黄酸标准品进行TLC对照 ( 展开剂为二氯甲烷∶甲醇∶三乙胺= 20∶1∶1) , 二者为同一物质, 故鉴定化合物1 为藤黄酸, 其结构式见图1。
2.4.2新藤黄酸
EI - MS m / z: 631[M + H]+, m. p. = 78 ℃ , 化合物2 为浅黄色粉末。1H - NMR ( CDCl3) : δ = 12. 79 ( s, 1H) , 7. 53 ( d, 1H) , 6. 48 ( s, 1H) , 5. 84 ( t, 1H ) , 5. 19 ( t, 1H ) , 5. 06 ( m, 2H ) , 3. 48 - 3. 21 ( m, 7H) , 1. 78, 1. 71, 1. 67, 1. 57, 1. 28 ( s, 3H) 。13C - NMR ( CDCl3) : δ = 203. 31, 179. 01, 171. 98, 163. 36, 160. 18, 155. 78, 138. 62, 138. 05, 134. 96, 133. 48, 133. 30, 131. 53, 127. 89, 123. 78, 121. 94, 121. 30, 107. 32, 106. 38, 100. 52, 90. 32, 83. 84, 83. 52, 48. 83, 46. 77, 39. 52, 29. 67, 29. 41, 28. 77, 26. 22, 25. 49, 25. 04, 21. 88, 20. 94, 20. 44, 17. 80, 17. 50, 15. 96, 与参考文献[8]中的新藤黄酸数据一致, 同时通过与新藤黄酸标准品进行TLC对照 ( 展开剂为二氯甲烷∶甲醇∶三乙胺=20∶1∶1) , 二者为同一物质, 故鉴定化合物2 为新藤黄酸, 其结构式见图2。
2. 5 藤黄酸和新藤黄酸对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用
在作用浓度为0. 025 ~ 2. 5 mg /m L的范围内, 藤黄酸和新藤黄酸对以PNPG为底物的 α - 葡萄糖苷酶活性的IC50值分别是0. 18 mg /m L和0. 24 mg /m L, 均明显小于阳性对照品阿卡波糖的IC50值0. 99 mg / m L, 见图3。
1.藤黄酸;2.新藤黄酸;3.阿卡波糖。
由图3 可知, 藤黄酸和新藤黄酸对以PNPG为底物的 α - 葡萄糖苷酶活性具有显著抑制作用, 且均优于阳性对照品阿卡波糖, 其中藤黄酸的抑制活性好于新藤黄酸。
3 讨论
α - 葡萄糖苷酶抑制剂是一种以延缓肠道内碳水化合物的吸收而达到治疗糖尿病的一种口服降糖类药物, 目前用于临床的 α - 葡萄糖苷酶抑制剂只有3 个: 阿卡波糖 ( acarbose) 、伏格列波糖 ( voglibose) 和米格列醇 ( migltol) [9], 都是生物合成或半合成药物, 种类少、价格贵、不良反应大, 因此从天然产物中筛选新的 α - 葡萄糖苷酶抑制剂成为研究的热点。藤黄为国家毒性中药管理品种, 临床上主要用于肿瘤的治疗, 藤黄及其化学成分对糖尿病是否有治疗作用尚未见到任何文献报道, 作者从藤黄中分离出藤黄酸、新藤黄酸两个黄酮类化合物, 首次发现它们对以PNPG为底物的 α - 葡萄糖苷酶活性具有显著抑制作用, 效果明显优于阿卡波糖, 具有广阔的开发前景, 然而藤黄酸和新藤黄酸是否有毒性, 其降血糖作用和作用机制是什么, 其在体内的药代动力学情况如何, 这些问题还需要深入研究和探讨。
参考文献
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合理使用α-糖苷酶抑制剂 篇5
1.α-糖苷酶抑制剂的药理作用:该类药物的结构类似葡萄糖, 在小肠上段上皮细胞刷状缘与各种α-葡糖苷酶结合, 抑制该酶的活性, 使淀粉类分解为麦芽糖进而分解为葡萄糖的速度和使蔗糖分解为葡萄糖的速度减慢。
食物中的碳水化合物和多糖必须经过消化转变为葡萄糖才能使小肠吸收, 而最后这一过程是在小肠刷状缘进行的, 由于此药对α-葡萄糖酶的可逆性、竞争性抑制作用, 使转变成葡萄糖的速度减缓, 因葡萄糖吸收减慢, 从而降低餐后血糖;同时也减轻餐后高胰岛素血症。长期使用该药, 可以显著降低餐后血糖, 也可以使空腹血糖有所降低。由于血糖降低及餐后高胰岛素的缓解, 使全身物质代谢进入良性循环, 减弱血管和神经的病理改变进程, 对糖尿病和全身各系统并发症的发生和发展起到减慢和减轻的作用。
α-糖苷酶抑制剂的作用针对的是食物中碳水化合物, 所以只有在进食碳水化合物时才起作用, 在就餐开始时嚼碎服用效果更好, 可见这种药物对以碳水化合物为主食的东方人 (主要是中国人) 最为适用。
2.α-糖苷酶抑制剂适应人群: (1) 2型糖尿病患者, 餐后血糖明显升高者最为合适。 (2) 胰岛素治疗的1型糖尿病患者, 餐后血糖控制不满意时, 可加用该药。 (3) 糖耐量低减或餐后血糖升高的糖尿病前期患者。 (4) 2型糖尿病患者服用其他口服降糖药者, 可联合使用该药。可达到减少所用药物剂量, 提高疗效, 减少每种药物的作用。
3.α-糖苷酶抑制剂的不良反应:最常见的不良反应是胃肠道反应, 由于该药使进入小肠和碳水化合物被延迟消化, 后者还会向肠道下段移动, 在肠道下段被发酵和消化吸收, 患者会出现腹部不适、排气、腹胀、少数人会有腹泻。一般不需特殊治疗。对反应严重者可加用胃动力药或其他对症治疗药物。
4.α-糖苷酶抑制剂的禁忌症: (1) 不能单独治疗1型糖尿病。 (2) 严重肝肾功能不全患者。 (3) 对该药过敏、糖尿病急性并发症、妊娠、哺乳期妇女。 (4) 消化道炎症和溃疡病。
5.α-糖苷酶抑制剂的注意事项: (1) 该药与胰岛素促泌剂和胰岛素联合应用时可能发生低血糖。届时应该给予葡萄糖, 严重者及时给予静脉葡萄糖治疗。 (2) 服药期间不宜给予碳吸附剂及辅助消化酶。不用胆醇螯合剂。 (3) α-葡萄糖苷酶抑制剂可影响地高辛和华法林的吸收, 合用时要注意监测后两种药的药理作用有无改变。 (4) 应用时从小剂量开始, 根据血糖水平及胃肠道反应及时调整药物。
葡萄糖苷酶抑制剂 篇6
茶叶已被发现有700多种芳香物。茶叶的芳香物质的转化对茶叶的质量和特色有着决定性的作用,已有很多研究表明植物很多香气成分是由键合态形式的糖苷类前提物质存在,再经过内源水解酶水解成游离态而呈现出具有芳香性。β- 葡萄糖苷酶是茶叶中重要的水解酶类,主要是催化水解芳香基或烃基与糖基原子团之间的糖苷键生成葡萄糖。其来源不同,底物特异性也不同[1]。该酶主要与萜烯类香气前驱体有密切关系。β- 葡萄糖苷酶首次是在苦杏仁汁中发现的,其广泛存在于各植物体、动物和微生物中,在植物中种子含量最多[2]。β- 葡萄糖苷酶作为茶叶重要的水解酶类之一,其活性随着工序和工艺的变化而变化,合理保证β- 葡萄糖苷酶的活性变化幅度对茶叶的质量有着重要的关系。
2 茶叶中的 β- 葡萄糖苷酶
2.1 茶树中 β- 葡萄糖苷酶特性
赵芹等[1]系统地对茶树中的β- 葡萄糖苷酶进行研究,表明了β- 葡萄糖苷酶的分子质量为650KD,最适稳定温度为50℃,最适p H为6.0。李叶云[3]等对茶树中β- 葡萄糖苷酶的分子量为41k D和34k D, 可能为单体酶。张正竹[4]等从数百种茶叶中分离的2种β- 葡萄糖苷酶的分子量分别为63k D和75k D。可见β- 葡萄糖苷酶不仅在不同生物体之间存在差异,在种属之间也会存在差别。大部分β- 葡萄糖苷酶p H都在酸性范围,并且变化不大,一般在p H3.5~5.5之间,但较适p H可以超过7.0,而且酸碱耐受性强。β -葡萄糖苷酶在40℃~ 110℃之间都具有活性[5]。β- 葡萄糖苷酶的底物专一性是“基团专一性”的相对专一性 , 能水解许多具有β型糖苷键的糖苷,对糖苷非糖部分的专一性不强[3]。葡萄糖是β- 葡萄糖苷酶的典型抑制剂,其中β- 葡萄糖酸内脂、对氯高汞苯甲酸、异丙基 -β-D- 硫代葡萄糖苷也表现出抑制作用 ,Sn2+、Fe3+、EDTA、SDS和脲对该酶也有一定的抑制作用,Mn+、Co2+和K+对该酶有明显的激活作用。其余金属离子则无明显影响[6]。
2.2 β- 葡萄糖苷酶在茶叶加工中香气转化的研究进展
茶叶的香气形成来源于五个部分:1脂肪酸的过氧化和降解等生成的醇、醛类芳香物质化合物 ; 2由儿茶素氧化引起的β-紫罗酮及相关结构的化合物 ; 3氨基酸的脱羧和氧化脱氨产生相应的醛;4氨基酸与糖类、儿茶素等在热作用下产生香气 ; 5糖苷的水解[6]。这些途径可以解释茶叶中一部分香气的形成机理是各种内含物质的转化。研究发现在β- 葡萄糖苷酶存在下 , 以葡萄糖苷形式存在的单萜烯醇前提物能产生具有花果香的芳樟醇、橙花叔醇、苯甲醇(前体物为苯甲醇 -β-D- 毗喃葡萄糖苷)香叶醇(前提物是香叶基β- 葡糖苷)。随着酶活性的升高 , 以糖苷形式存在于茶叶中的萜烯类化合物均有所增加,如橙花醇、香叶醇、芳香醇氧化物等化合物 ; 脂肪族 , 萜烯类或芳香族香气也明显比酶解前要高[7]。所以对β- 葡萄糖苷酶活性的控制调节,可以直接或间接地控制或影响着茶叶香气的形成,尤其是在以酶促反应为主的红茶萎凋发酵和乌龙茶做青工艺中,从中采取各种措施,创造各种适宜条件,从而提高β- 葡萄糖苷酶的活性,促进香气前提物质的释放就显得尤为重要。近年来对绿茶杀青前进行摊放,可以提高香气质量,表明也有β- 葡萄糖苷酶的作用。
3 β- 葡萄糖苷酶在不同茶类中的研究进展
3.1 β- 葡萄糖苷酶在乌龙茶的研究进展
乌龙茶的基本制茶工序为萎凋 - 摇青 - 晾青 - 杀青 - 揉捻 -烘干。杀青前细胞内的酶都有参与反应,杀青后高温使酶失活,确定了茶叶的基本品质。所以β- 葡萄糖苷酶主要在乌龙茶的萎凋和做青期间进行反应。乌龙茶鲜叶在鲜叶到摇青叶的香气发生剧烈的变化,很大原因是因为β- 葡萄糖苷酶将结合态糖苷类物质水解成游离态的挥发性芳香化合物。加工过程中鲜叶萎凋完成是β- 葡萄糖苷酶的活性达到最高,而后静置活性降低,第一次摇青开始又升高到摇青结束,静置后又降落,如此随着做青过程出现M型的变化规律,但总体有所回落[8]。所以萎凋和摇青对β- 葡萄糖苷酶的活性有积极的作用,主要是因为日光作用提高了温度、鲜叶失水提高了细胞的渗透浓度和摇青的机械力作用破坏细胞使其细胞液中的糖苷与糖苷水解酶充分接触而造成。做青临近结束时 , 由于茶鲜叶失水较多 , 细胞膜透性增大,多酚类物质的酶促氧化作用增强,对β- 葡萄糖苷酶活性有一定的抑制作用 , 因此做青结束时β- 葡萄糖苷酶活性呈下降的趋势。
3.2 β- 葡萄糖苷酶在红茶的研究进展
红茶的基本工艺技术是萎凋 - 揉捻 - 发酵 - 干燥。干燥之前酶类都有进行活动,干燥之后酶活性急剧下降甚至失活。夏涛[9]研究表明 : 在茶叶鲜叶萎凋过程中 ,β- 葡萄糖苷酶活性含水率低于67% 时酶活性幵始出现下降 , 而高于67% 时其酶活性逐渐上升。宛晓春对不同工艺红茶香气品质研究表明,工夫红茶加工过程中β- 葡萄糖苷酶活性在萎凋与揉捻阶段持续上升 , 揉捻结束达最大值 , 而红碎茶β- 葡萄糖苷酶在萎凋阶段活性上升至萎凋结束,揉切开始下降。因为揉切时细胞被大量破坏,细胞膜透性增大 , 多酚类物质的酶促氧化作用及其它酶活性增强,抑制了β- 葡萄糖苷酶的活性。发酵阶段由于鲜叶含水量进一步下降 , 酶底物含量减少,导致酶活性持续下降。因为工夫红茶茶叶鲜叶保持得比红碎茶完整,细胞破损较少,其β- 葡萄糖苷酶的活性比红碎茶的β- 葡萄糖苷酶的活性表现得更久,所以传统红茶香气物质芳樟醇及其氧化物、香叶醇、水杨酸甲酯等重要香气含量比红碎茶高[10]。其中,利用延长β- 葡萄糖苷酶的活性来增强红茶的香气,潘一斌[11]对花果香型的新工艺工夫红茶进行探究,在红茶萎凋之后加入摇青工艺来促进β- 葡萄糖苷酶的活性,研究表明在一芽三叶金牡丹中 , 轻摇青对其酶活性的提高有利 , 重摇青不利于酶活性水平的保持。在香气成分含量上 , 大多数的香气物质表现为摇青工艺高于传统工艺。
3.3 β- 葡萄糖苷酶在绿茶的研究进展
绿茶的加工基本工序为杀青 - 揉捻 - 干燥。然而如今绿茶杀青前都适当进行摊放,这样不仅可以使部分蛋白质水解成氨基酸并部分转换成香气物质,还可以在β- 葡萄糖苷酶的作用下使芳香物质大幅增加,显露出清香花香[12],对绿茶香气的形成具有重要的作用。在绿茶加工的摊放中,屠幼英[13]等研究绿茶加工摊放过程中酶活性在摊放6h后 , 其酶活性大幅度增加 , 可能是因为鲜叶离体后为满足呼吸作用 ,β- 葡萄糖苷酶降解为纤维二糖碳水化合物的需求有关系,而使β- 葡萄糖苷酶的活性增强。鲜茶叶摊放过程中 , 随着摊放时间的延长 , 叶组织水分逐渐蒸发散失 ,β-葡萄糖苷酶活性明显升高 , 特别是在摊放初期。摊放10 h后急剧下降到与鲜茶叶相当的水平。摊放4 h鲜叶中游离态香气含量急剧升至最高,摊放4 h后开始下降,4 ~ 8 h是绿茶加工中较为理想的摊放时间,其中低温高湿的摊放环境更有利于酶活性的保持[14],使酶处在一个相对活性较高的环境下。
4 茶叶中 β- 葡萄糖苷酶活性差异的研究
4.1不同品种β- 葡萄糖苷酶活性差异研究
杨锐[15]研究表明 : 不同品种间其酶活性水平存在差异。其酶活性水平大小依次为 : 毛蟹 > 铁观音 > 肉桂 > 黄旦。张秀云[16]研究得到槠叶群体种的酶活性水平明显高于福鼎大白茶,并且两种茶叶在制作过程中的酶活性的变化趋势和变化幅度也有所不同,槠叶群体种的变化幅度比福鼎大白茶大。骆耀平[17]从生化的角度对7个茶树品种新梢生育过程中β- 葡萄糖苷酶活性变化进行研究。发现各品种间酶活性高低之差达3 ~ 4倍,并且不同品种在相同加工工艺中的β- 葡萄糖苷酶的活性表现形式也不尽相同。和红州[18]研究表明 , 在红茶制作过程中传统品种福云6号和高香品种金观音、梅占在萎凋过程中其酶活性变化趋势相反 , 金观音和梅占在萎凋前期缓慢上升 , 萎调中后期缓慢降低 , 而福云6号在萎凋前期酶活性趋于下降 , 在萎凋中后期趋于平稳或稍有上升。
4.2 不同嫩度鲜叶 β- 葡萄糖苷酶差异研究
植物的不同部位对植物的生理有着不同的作用,各部位酶的种类与活性也不同。茶叶的不同老嫩程度中β葡萄糖苷酶的活性也存在差异。赵丽萍等[19]通过PCR分析龙井43新梢不同部位叶片中β- 葡萄糖苷酶基因的表达情况。结果表明 ,β- 葡萄糖苷酶的表达量为第4叶>第3叶>第5叶>第2叶>第1叶,其中1芽5叶新梢中 , 第4叶表达活性最高。随叶龄的增加,酶活性趋向上升 , 在叶片接近成熟时活性较强,而在即将衰老的叶位酶活性开始下降。而骆耀平[17]认为新梢不同部位的酶活性是 : 芽>第1叶>第2叶>第3叶>茎梗 , 随叶龄的增加该酶活性趋于减弱,但有的品种呈先降后升的变化。在不同的茶树品种中,随着叶位的变化酶活性的变化没有统一的规律,但相对于个株则有其自己的规律。所以茶叶制作要根据工艺选择品种和老嫩的适制性。
4.3 不同摇青的程度 β- 葡萄糖苷酶差异研究
不同的摇青次数和程度都对β- 葡萄糖苷酶的活性有不同的作用,张秀云[16]研究表明在褚叶种和福鼎大白茶在轻重两种做青强度下 ,β- 葡萄糖苷酶活性的变化趋势相似,重做青中活性变化幅度比较轻做青大,然而褚叶种重做青的品质较轻做青好,福鼎大白茶轻做青的品质好于重做青。杨锐[15]对铁观音不同程度的摇青对β- 葡萄糖苷酶活性的影响中研究表明 , 对酶活性影响较大的为摇青强度 , 而摇青次数和晾青时间的改变对酶活性的影响并不显著 , 在摇青过程和晾青过程中 , 轻摇处理的酶活性水平高于重摇处理 , 且在酶活性下降幅度 , 重摇处理大于轻摇处理。在保证铁观音做青叶顺利“走水”的前提下 , 适当的减轻摇青强度有利于β- 葡萄糖苷酶酶活性的提高和保持。根据以上不同品种的摇青程度表现不同,对乌龙茶摇青应根据不同茶区、不同品种、不同叶位采用合适的做青方式 , 才能充分发挥不同品种乌龙茶的香气特征。
4.4 不同季节 β- 葡萄糖苷酶差异研究
杨锐[15]对闽南四大品种暑秋两季中的β- 葡萄糖昔酶活性均达极显著差异水平。以秋季高于暑季且秋季在制品在做青的不同阶段酶活性水平都高于同阶段的暑季在制品。张娴静[20]研究认为β- 葡萄糖苷酶活性在不同嫩度鲜叶中其酶活性差异与季节相关 ,在春季中不同嫩度鲜叶其高低差异不明显 , 而秋季则表现为成熟叶>老叶>嫩叶。其可能原因是不同季节茶树的生长,表现在春秋季的内含物和各方面特性都会高于夏季,从而表现出β- 葡萄糖苷酶的活性差异。
4.5 不同萎凋方式 β- 葡萄糖苷酶差异研究
对冷冻萎凋、萎凋与不萎凋、正常萎凋与重萎凋等不同萎凋过程中的芳香物质变化,研究表明冷冻萎凋不利于香气的形成。这与冷冻作用下香气形成关键酶β- 葡萄糖苷酶活性受抑制有关[11]。范仕胜等人[21]研究表明萎凋处理方式能显著增强萎凋叶的β- 葡萄糖苷酶活性,随萎凋时间增加,人工光照处理萎凋叶和室内自然萎凋叶的β- 葡萄糖苷酶活性均先增加后降低,而且人工光照萎凋处理的β- 葡萄糖苷酶活性高于室内自然萎凋处理,结果与香气得分部分有些对应,在β- 葡萄糖苷酶活性最高时,香气评分较高。
5 对 β- 葡萄糖苷酶的研究展望
对不同品种、叶位、工艺、季节等的β- 葡萄糖苷酶的活性程度进行系统的测定,以利于不同品种制作茶类的选择和对工艺程度的探究可提高茶叶品质,形成专家数据系统。
已有研究表明 ,β- 葡萄糖苷酶可以酶解果汁、酒类中的风味前体物质 , 能够起到自然增香的作用 , 酶解可以明显增加绿茶茶汤中糖苷类香气组分 , 体现明显的增香效果[22]。所以对于提取β- 葡萄糖苷酶是否能应用于茶叶深加工技术,对加工产品的提升和新产品研究需进一步探究。
葡萄糖苷酶抑制剂 篇7
应用于生产中的α-葡萄糖苷酶主要来源于真菌, 真菌的发酵周期较长, 酶的产量和特性也不易控制。因此, 构建和利用基因工程菌作为大规模生产该酶制剂的宿主, 成为研究该酶的一种新途径。A Martino[4]等从Sulfolobus solfataricus MT-4菌株总DNA中通过PCR将α-葡萄糖转苷酶基因克隆到E.coli中。Akira N[5]等利用合成探针从Aspergillus niger GN-3中克隆出α-葡萄糖转苷酶基因 (胞外酶) , 将该基因引入到Aspergillus nidulans。Amaud Galichet[6]等从Thermococcus hydrothermalis AL662菌株中, 通过建立基因文库, 克隆了α-葡萄糖转苷酶基因, 将该基因克隆到S.cerevisiae突变株TCY70中。Aspergillus niger (CU-1) 是作者实验室自主筛选得到的一株优秀菌株[7], 其所产的胞内α-葡萄糖苷酶具有很高的转苷活性, 其作用于淀粉糖化液生成的低聚异麦芽糖的产率高达88%以上, 远高于目前国内同类报道。本文对该菌株的α-葡萄糖苷酶基因进行克隆和序列分析, 以及α-葡萄糖苷酶真核表达载体的构建, 为其分子水平的研究提供重要依据和该酶在真核宿主中的高效表达研究奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌种与质粒
Aspergillus niger (CU-1) 菌株和大肠杆菌DH5α为作者实验室保存。真核表达载体pGAPZαA由湖南农业大学生科院张学文教授惠赠, pMD-18T simple vector购自大连宝生物公司。
1.1.2 酶和化学试剂
pfu酶购自捷瑞生物工程有限公司;rTaq酶、T4 DNA连接酶、XhoⅠ酶和NotⅠ酶购自MBI公司;Marker λDNA/HindⅢDNA购自大连宝生物公司;抗生素Zeocin购自Sigma公司、氨苄青霉素、IPTG、X-gal、DEPC均购自上海生工公司;AMV逆转录酶购自Promega公司;RNA提取试剂盒为购自华美生物工程公司;PCR产物纯化试剂盒、凝胶回收试剂盒购自上海华舜生物工程有限公司, 其他试剂均为国产分析纯。
1.1.3 培养基
PDA培养基 (马铃薯200g/L、葡萄糖18g/L) 用于黑曲霉A.niger (CU-1) 的活化;麸皮培养基 (麸皮30g/L, 淀粉20g/L, 麸皮煮沸40min, 然后用4层纱布过滤, 冷却后加入淀粉, 溶解后加水补足至1L) 用于黑曲霉A.niger (CU-1) 诱导表达α-葡萄糖苷酶;LB培养基 (酪蛋白胨10g/L, 酵母抽提物5g/L, NaCl 10g/L, pH7.0) 用于大肠杆菌的培养, 培养基中加氨卞青霉素终浓度为100μg/mL;低盐LB培养基 (酪蛋白胨10g/L, 酵母抽提物5g/L, NaCl 5g/L, pH 7.5) 用于大肠杆菌的培养, 培养基中加抗生素Zeocin终浓度分别为50μg/mL。
1.2 实验方法
1.2.1 Aspergillus niger (CU-1) 菌株的诱导培养及样品处理
将保存的Aspergillus niger (CU-1) 菌株在PDA斜面培养基上活化, 30℃培养4d, 用10mL无菌水洗涤孢子, 接种于100mL麸皮培养基中, 30℃、140r/min 摇床培养3.0d。将培养基内液体小心倒掉, 留下白色的菌体, 用PBS缓冲液和无菌水反复冲洗。冲洗完后室温抽滤10min左右, 至水分完全抽干。然后分装0.1g/份, 装入离心管中, 立即投入液氮中速冻, 移入-80℃超低温冰箱中保存备用。
1.2.2 Aspergillus niger (CU-1) 菌株总DNA和总RNA的提取
将超低温冰箱中保存的菌体取出, 在液氮中研磨后, 采用CTAB法[13]提取菌株的总DNA, 按照RNA提取试剂盒推荐方法提取总RNA。
1.2.3 RT-PCR合成目的基因
在Oligo (dT) 18引物引导下通过逆转录合成cDNA第一链, 冰上取4μl总RNA, 加入Oligo (dT) 18引物2μl, DEPC-H2O 4μl, 70℃加热5min, 于冰上加4μl 5×RT buffer, 1μl RNase抑制剂, 2μl dNTP (2.5mmol/L) , lμl M.MLV逆转录酶 (200U/μl) , 42℃反应60min后, 再70℃加热10min停止反应。
以GenBank中编号为D451796的α-葡萄糖苷酶基因为模板设计合成一对PCR引物[8]:SP1: 5′-CCGCTCGAGATGGCCGGTCTAAAAAGCTTCCTTGCCAGTTCT-3′, SP2:5′-ATTTGCGGCCGCTCACCATTTCAGTACCCAGTCCTTCGCCCA-3′, 引物由上海生工公司合成。
以cDNA第一链为模板进行PCR扩增, PCR反应程序:先94℃ 4min预变性, 94℃ 1min, 63℃ 1min, 72℃ 5min进行30个循环后, 72℃延伸10min。PCR产物 (D2) 采用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测, 并用DNA产物纯化试剂盒对PCR产物进行纯化。
1.2.4 以总DNA为摸板PCR扩增目的基因
以总DNA为模板, 引物 (SP1/SP2) 进行PCR扩增, PCR反应程序:先95℃ 5min预变性, 94℃ 1min, 61℃ 1min, 72℃5min进行30个循环后, 72℃延伸10min。PCR产物 (D1) 采用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测, 并用DNA产物纯化试剂盒对PCR产物进行纯化。
1.2.5 基因测序分析[9]
将纯化的PCR产物D1、D2与pMD-18T simple vector连接, 转化E.coli DH5α感受态细胞, 用含X-gal、IPTG和氨苄青霉素的LB平板于37℃培养12～16h, 通过重组质粒双酶切筛选阳性重组子pMD-D1和pMD-D2。基因测序由上海生工公司, 测序后登录NCBI网站进行BLAST比对分析。
1.2.6 agdA的扩增
重新设计引物:
SP3:5′-CCGCTCGAGGCCGGTCTAAAAAGCTTCCTTGCCA-GTTCT-3′, SP4:5′-ATTTGCGGCCGCCCATTTCAGTACCCAGT-CCTTCGCCCA-3′, 不含起始密码子ATG 和终止密码子TCA。其余的操作与1.2.3 中的操作相同, 结果见图8。
1.2.7 真核重组表达载体pGAPZαA-agdA的构建[9]
用XhoⅠ和NotⅠ分别双酶切方法1.2.6中纯化的基因agdA和载体pGAPZαA, 然后回收目的片段和载体片段, 用T4连接酶连接进行定向克隆, 构建真核重组表达载体pGAPZαA-agdA, 并用双酶切鉴定阳性重组子。
2 结果与分析
2.1 Aspergillus niger (CU-1) 菌株总DNA和总RNA的提取
经过电泳检测 (见图1) , 可以看到完整的总DNA条带, DNA降解少, 质量好, 可用作PCR模板。经过电泳检测 (见图2) , 可以看到rRNA清晰的三条带:28S、18S和5.8S。RNA样品的OD260/OD280均值为1.8, 总RNA质量较好, 可满足RT-PCR实验要求。
2.2 Aspergillus niger (CU-1) 菌株基因agdA扩增和克隆
经0.8%琼脂糖凝胶电泳 (见图3、图4) , Aspergillus niger (CU-1) 菌株的总RNA为模板RT-PCR产物 (D2) 大小约为3.0kb, 以Aspergillus niger (CU-1) 菌株总DNA为模板的PCR产物 (D1) 大小约为3.2kb, 两者都与预期结果相符。将重组质粒pMD-D1和pMD-D2用XhoⅠ和NotⅠ分别双酶切 (见图5、图6) , 双酶切重组质粒pMD-D1得到3.2kb和2.7kb两个片段, 双酶切重组质粒pMD-D2得到3.0kb和2.7kb两个片段, 表明目的片段已克隆到了T载体上。
1-2:the total DNA;M:λDNA HindⅢMarker.
M:λDNA HindⅢMarker;1:PCR production (D2) .
M:λDNA HindⅢMarker;1:PCR production (D2) .
2.3 Aspergillus niger (CU-1) 菌株的agdA序列分析
经测序, Aspergillus niger (CU-1) 菌株的agdA大小为3 127bp, 含有3个外显子和4个内含子。该基因的cDNA序列 (见图7) 共有2 958bp, 包含完整的编码框, 编码985个氨基酸。序列在NCBI上经BLAST比对分析, 表明该cDNA序列与GeneBank中登记号为XM00182023的基因序列的同源性达到了99%, 证明所获得的cDNA序列确实为α-葡萄糖苷酶基因, 可以继续进行下面的研究。该cDNA序列与XM-00182023的基因序列比对有6个位置的碱基发生了变化, 第286位的碱基 (A→G) , 第495位的碱基 (T→C) , 第557位的碱基 (A→G) , 第840位的碱基 (C→T) , 第1249位的碱基 (T→C) , 第1834位的碱基 (T→C) 。
1:pMD-D1 XhoⅠ+NotⅠ;M:λDNA HindⅢMarker.
1, 2:pMD-D2 XhoⅠ+NotⅠ;M:λDNA HindⅢMarker.
2.4 真核表达载体pGAPZαA-agdA的构建及鉴定
基因agdA的cDNA与载体pGAPZαA连接后构成真核表达载体pGAPZαA-agdA, 通过抗生素Zeocin筛选阳性重组子, 重组子经XhoⅠ和NotⅠ双酶切和EcoRⅠ单酶切, 电泳结果 (见图9) , 表明成功构建了含有基因agdA的真核表达载体pGAPZαA-agdA。
M:λDNA HindⅢ;1:RT-PCR production.
1-3:pGAPZαA-agdA XhoⅠ+NotⅠ;4-6:pGAPZαA-agdA EcoRⅠ;M:λDNA HindⅢ.
3 讨论
α-葡萄糖转苷酶是生产低聚异麦芽糖的关键酶, 在医学研究、临床诊断等领域具有重要的价值。国外研究者已经将研究方向转向基因工程方面, 国内相关报道较少。于岚[10]等克隆及表达黑曲霉α-葡萄糖苷酶基因;樊少华[11]等从中华蜜蜂克隆α-葡萄糖苷酶基因并对其序列分析;杨捷琳[12]等从阪崎肠杆菌中克隆α-葡萄糖苷酶基因, 重组到pET22b (+) 质粒在大肠杆菌中进行表达及活性研究。
Aspergillus niger (CU-1) 菌株其所产的胞内α-葡萄糖苷酶具有很高的转苷活性, 其作用于淀粉糖化液生成的低聚异麦芽糖的产率高达88%以上, 远高于目前国内同类报道。该菌株的α-葡萄糖苷酶基因是一个具有研究开发价值的特殊基因资源, 因此开展该菌的α-葡萄糖转苷酶基因方面的的克隆和表达的研究具有重要意义。本文对该α-葡萄糖苷酶基因序列进行分析为构建高产具有高转苷活性的α-葡萄糖苷酶的基因工程菌株奠定重要的理论基础。考虑到真核基因在原核系统中表达不能得到正确的修饰, 采用真核宿主系统进行表达可能会大大提高该外源蛋白的活性, 尝试通过构建真核表达载体pGAPZαA-agdA, 来实现α-葡萄糖苷酶在毕赤酵母中高效表达酶的工作还在进行中。
摘要：目的:Aspergillus niger (CU-1) 菌株α-葡萄糖苷酶基因 (agdA) 克隆并对其序列进行分析, 构建该基因的真核表达载体。方法:设计合成的一对特异性引物, 采用PCR以总DNA为模板, 扩增得到DNA片段 (D1) ;采用RT-PCR方法扩增得到DNA片段 (D2) 。将DNA片段D1和D2转入大肠杆菌中并进行了序列测定, 序列进行BLAST比对分析。将α-葡萄糖苷酶基因的cDNA片段与表达载体pGAPZαA连接, 构建重组表达载体。结果:基因agdA大小为3 127bp, 含有3个外显子和4个内含子。该基因的cDNA序列大小为2 958bp, 包含完整的编码框, 编码985个氨基酸。agdA基因序列与已发表的α-葡萄糖苷基因序列同源性达99%, 其中有6个位置的碱基发生了变化。已成功构建重组表达载体pGAPZαA-agdA。结论:Aspergillus niger (CU-1) 菌株α-葡萄糖苷酶基因序列分析及重组表达载体pGAPZαA-agdA的构建为在毕赤酵母中表达Aspergillus niger (CU-1) 菌株的α-葡萄糖苷酶奠定基础。
葡萄糖苷酶抑制剂 篇8
本实验工作主要涉及黔产鱼眼草植物生物活性研究,以期发现其活性部位及有效活性成分,为有效开发和利用提供科学的依据。
1 材 料
1.1 药材
鱼眼草植物采自贵州省贵阳市,经贵阳医学院陈德媛教授鉴定为菊科(Compositae)鱼眼草属(Dichrocephala)鱼眼草(Dichrocephala integrifolia (L.) O.Kuntze)全草,标本存于贵州大学化学与化工学院化学系。
1.2 药品
1,1-二苯基苦基苯肼(DPPH),日本东京化成工业株式会社;α-糖苷酶(EC)和对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG),Sigma公司;二甲基亚砜,天津基准化学试剂有限公司;阿卡波糖(Acarbose, Lot 16869),德国Serva 公司;4-硝基苯酚(4-Nitrophenol, PNP),美国Alfa Aesar公司;黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌、铜绿假单胞菌,上海天呈生物信息有限公司;其余试剂均为国产分析纯。
1.3 仪器
紫外可见分光光度计(UV-2000型),上海尤尼克仪器有限公司;万分之一分析天平,美国Mettler-Toledo公司;混合器(CS-H1型),北京博励阳科技公司;酶标仪,美国Thermo Electron公司;生化培养箱(LRH-150),上海一恒科学仪器有限公司;立式压力蒸汽灭菌器(LDZX-30KB),上海申安医疗器械厂;洁净工作台(JJ-CJ-2FD),吴江市净化设备总厂。
2 实验方法
2.1 提取分离
干燥鱼眼草全草10 kg 粉碎,用95% 乙醇冷浸提取4 次(每次10 d)。减压回收乙醇,得浸膏(1200 g) ,加水分散,分别用石油醚,乙酸乙酯,正丁醇萃取,减压回收溶剂得到石油醚部分(170 g) ,乙酸乙酯部分(420 g) ,正丁醇部分(550 g)。
利用多种层析手段对鱼眼草乙醇提取物各部分进行分离和纯化,得到15个单体化合物,通过理化数据和波谱分析方法鉴定了13个单体化合物结构,分别是:正十八烷酸(1)、豆甾-7,22-二烯-3-醇(2)、α-香树脂醇(3)、表木栓醇(4)、十八酸甲酯(5)、正四十三烷(6)[2]、正二十二烷(7) 、正二十八烷酸(8)、正二十酸甲酯(9)、十六烷酸三十烷醇酯(10)、脱镁叶绿素甲酯(11)、柳穿鱼素(12) 、柳穿鱼素-7-葡萄糖甙(13)[3]。所有化合物均为首次从该种植物中分离得到。
2.2 抗氧化活性
DPPH 方法:按照文献[4],将样品用甲醇配制成一系列浓度,取0.1 mL样品加入3.5 mL DPPH甲醇溶液(0.06 mmol·L-1),混合30 min 后测定515 nm 波长处吸光度。每份样品平行操作 3 次,取平均值,计算出清除率,并计算出半数抑制率(IC50)。
利用体外DPPH微量抗氧化模型进行抗氧化活性筛选,结果表明:所得化合物和4个部位的抗氧化活性都不理想。
2.3 α-糖苷酶抑制活性
α-葡萄糖苷酶活力的测定参照文献方法,根据所采用的反应体系: 112 μL磷酸钾缓冲液(pH 6～8) ,加入20 μL 0.2 U·mL-1 α-葡萄糖苷酶, 8 μL DMSO, 37 ℃恒温, 15 min后加入215 mmol·L-1 PNPG 20 μL,摇匀, 37 ℃恒温反应15 min。再加入80 μL 0.2 mol·L-1 的Na2CO3 溶液,于405 nm波长下测OD值[5]。
初筛浓度为50 μg/mL,并对初筛抑制率大于50%的化合物进行复筛。其筛选结果如下表2。
采用α-葡萄糖苷酶抑制模型进行α-糖苷酶抑制活性测试,结果表明:脱镁叶绿素甲酯(IC50=19.23 mg·L-1)和柳穿鱼素-7-葡萄糖甙(IC50=30.27 mg·L-1)的体外抑制α-糖苷酶抑制活性远高于对照acarbose(IC50=1081.27 mg·L-1)。
2.4 抑菌活性
2.4.1 KB纸片法
纸片扩散法按照文献的方法[6],用微量加样器分别取5 μL 样品加到直径6 mm 的圆形滤纸片上,挥干试剂后,置于含菌平板,37 ℃恒温培养24 h,记录下抑菌圈的大小。每份样品平行操作3 次,用DMSO 作空白对照。
注: “-”表示无抑菌作用。
初筛结果表明:所有筛选样品中,化合物柳穿鱼素-7-葡萄糖甙和正丁醇部位对小麦赤霉病菌的抑制活性最好(抑菌圈直径d分别为2.4 cm, 2.5 cm),醇提物和石油醚部位对小麦赤霉病菌也有明显抑制效果(抑菌圈直径d分别为1.6 cm, 1.2 cm);醇提物部位、石油醚部位、乙酸乙酯部位脱镁叶绿素甲酯、柳穿鱼素-7-葡萄糖甙对玉米大斑病菌有明显的抑制效果(抑菌圈直径d分别为1.7 cm, 1.3 cm, 1.2 cm, 1.5 cm, 1.1 cm);所有筛选样品中,醇提部位、石油醚部位和化合物脱镁叶绿素甲酯、柳穿鱼素-7-葡萄糖甙对番茄灰霉病菌的抑制效果最好(抑菌圈直径d分别为2.3 cm, 2.1 cm, 2.7 cm, 2.0 cm),乙酸乙酯部位、正丁醇部位对番茄灰霉病菌也有明显抑制效果(抑菌圈直径d分别为1.8 cm, 1.9 cm)。
2.4.2 肉汤稀释法
最低抑菌浓度(MIC) 的测定将出现抑菌圈的样品进行对半梯度稀释,按文献方法操作进行,每个浓度梯度平行3 次,取平均值。用DMSO 作空白对照出现抑菌圈的最低样品浓度即为MIC 值[7]。
运用肉汤稀释法进行抑菌活性实验,实验结果表明:石油醚部位和乙酸乙酯部位对金黄色葡萄球菌,肺炎克雷伯氏菌,铜绿假单胞菌都具有抑制作用,乙酸乙酯部位的抑菌活性较好。
3 结 论
前期对新鲜鱼眼草的花和茎叶采用固相微萃取技术提取挥发油成分,用气相色谱-质谱联用技术对挥发油进行分析测定,发现β-蒎烯成分在鱼眼草花和茎叶挥发油中都有且含量较大[8],根据文献记载,此成分具有较强的抗炎作用[9]。
本实验通过提取分离化合物,并对各萃取部分和所得单体化合物进行抗氧化(DPPH)、α-糖苷酶、抑菌活性筛选,发现了鱼眼草的活性部位及其有效活性成分,为开发和利用这种药用植物资源提供了科学的依据。
摘要：通过对DPPH自由基的清除能力对鱼眼草的抗氧化活性进行评价;考察了鱼眼草的抗氧化、α-葡萄糖苷酶抑制活性和抑菌活性。应用体外α-葡萄糖苷酶筛选模型进行鱼眼草酶抑制活力的测定;采用KB纸片法和肉汤稀释法测定鱼眼草的抑菌活性。结果:鱼眼草的化学成分及各部位提取物的抗氧化活性并不理想;化合物脱镁叶绿素甲酯(IC50=19.23 mg.L-1)和柳穿鱼素-7-葡萄糖甙(IC50=30.27 mg.L-1)的体外抑制α-糖苷酶抑制活性远高于对照acarbose(IC50=1081.27 mg.L-1);KB纸片法表明部分化合物和提取物具有较好的抑菌活性,肉汤稀释法表明乙酸乙酯部位的抑菌活性较好(金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌、铜绿假单胞菌的MIC分别为32、64、128μg.mL-1)。
关键词：鱼眼草,DPPH,α-糖苷酶抑制,抑菌活性
参考文献
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[2]朱少晖,张前军,陈青等.鱼眼草化学成分研究[J].中药材,2010(1):53.
[3]朱少晖,张前军,陈青等.鱼眼草化学成分研究[J].中国实验方剂学杂志,2010,16(12):34-36.
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[5]康文艺,张丽,宋艳丽.滇丁香中抑制α-葡萄糖苷酶活性成分研究[J].中国中药杂志,2009,34(4):406.
[6]洪英,黄雁,魏良宇.浅谈纸片扩散法药敏试验[J].福建畜牧兽医,2004,26(5):56.
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[8]陈青,张前军,朱少晖,等.SPME-GC-MS分析鱼眼草花、茎叶挥发油成分[J].中国实验方剂学杂志,2011(8):92-95.