胰高血糖素（通用7篇）
胰高血糖素 篇1
胰高血糖素瘤 (glucagonoma, GCGN) 是一种极为罕见的胰腺内分泌肿瘤, 约占神经内分泌肿瘤的1%, 国际上统计其发病率为二千万分之一[1]。该肿瘤主要起源于胰腺 α 细胞, 少数来自APUD细胞[2]。临床上以皮肤游走性坏死性红斑为特征性表现, 另外可有糖尿病、贫血、消瘦、低氨基酸血症等表现。可分为良性和恶性两种。以手术治疗为首选治疗方法。我科于2013 年12 月28日收治1 例该病患者, 经过积极手术治疗和精心护理, 患者痊愈出院, 现将护理体会报告如下。
1 临床资料
患者, 男, 30 岁, 患者因全身散在游走性红斑10 月余, 查体发现胰腺肿物8 天入院。患者10 月前无明显诱因出现足部斑片状红色皮疹, 伴瘙痒, 后波及全身, 以头面部、颈部及下肢为重, 于我院皮肤科就诊, 诊为多型红斑, 给予激素等药物治疗, 效果欠佳;后于北京大学第一医院就诊, 诊为多型红斑, 给予曲奈德等药物治疗, 效果不明显;随后于我院风湿免疫科就诊, 诊为血管炎, 给予2 次环磷酰胺药物治疗, 效果欠佳;8 d前患者再次于我院皮肤科就诊, 诊为游走性坏死性红斑, 行腹部CT检查示:胰尾区占位, 建议CT增强检查。既往史:患者糖尿病病史5 月, 口服二甲双胍治疗, 血糖控制可。入院查体:患者头面部、颈部、双手及下肢可见散在斑片状红色皮疹, 高出皮肤, 部分呈坏死样变, 皮损面积达全身皮肤总面积的50%以上, 双手及双足甲沟感染性渗出。上腹部增强CT检查示:胰尾部病灶, 考虑内分泌性肿瘤。入院后血清化学发光报告空腹胰岛素值为29.81 m IU/L, 空腹胰高血糖素为1001pg/ml, 入院后积极完善相关检查, 排除手术禁忌, 于2014 年1 月4 日在全麻下行保留脾脏的胰体尾切除术, 术前检验血清葡萄糖为5.07 mmol/L, 术中标本送快速病理报告示胰腺上皮性肿瘤, 倾向于神经内分泌肿瘤。切除肿瘤后复测血糖为6.4 mmol/L。术后第2 d血清化学发光报告空腹胰岛素7.04 m IU/L, 术后第7 d复测胰高血糖素为71 pg/ml, 恢复正常。患者住院21 d治愈出院, 出院时皮损愈合, 留有部分色素沉着, 甲沟炎明显好转, 干燥无渗出, 血糖正常。出院后随访患者, 皮肤色素沉着消失, 皮肤完全恢复正常, 甲沟炎痊愈, 血糖正常。
2 护理
2.1 术前护理
2.1.1 心理护理患者因皮肤长期皮损, 尤其头面部等暴露部位, 形象异于常人, 有严重的自卑心理, 入院时患者戴帽子、口罩, 把自己裹得严严实实, 不愿与人沟通。入院后热情向病人介绍病区环境, 消除病人的陌生感, 向其介绍其主管医生、主管护士, 做自我介绍, 拉近医患距离, 取得病人的信任, 向其尽量多的提供疾病相关知识, 让病人明白自己的皮肤问题其实源于胰腺的疾病, 使其对自身疾病有一个正确的认识, 告诉患者经过手术治疗皮肤会恢复正常的, 使其树立战胜疾病的信心, 积极配合治疗。并做好家属的思想工作, 取得家属的支持。
2.1.2 皮肤护理皮肤瘙痒时, 嘱病人避免搔抓, 以免加重皮肤损伤, 造成感染, 可用温水擦拭皮肤, 忌用热水及肥皂水。穿宽松纯棉内衣, 减少对皮肤的摩擦。床单及时更换, 应保持平整、柔软、干燥、无碎屑。皮疹结痂脱落时忌用手用力揭痂, 应待其自行脱落, 防止造成新的损伤。皮肤有大疱形成时可在严格无菌操作下用注射器抽出疱内液体。床边实行保护性隔离。病室每天通风30 min, 保持室内空气新鲜, 保持室温在18~22℃, 湿度在50~60%, 促进病人舒适。
2.1.3 监测血糖变化因肿瘤分泌大量的胰高血糖素同时抑制胰腺外分泌, 直接抑制胰酶的分泌和释放, 导致血糖升高[3]。因此要监测血糖变化, 使手术前血糖控制良好, 按时应用降糖药物。首先叮嘱患者继续严格执行糖尿病饮食, 继续服用二甲双胍控制血糖, 遵医嘱每天监测空腹及三餐后血糖变化, 如遇血糖控制不好, 遵医嘱临时皮下注射普通胰岛素, 使血糖控制在良好水平。
2.1.4 术前准备术前禁食8 h, 禁水4 h, 手术前一天给予聚乙二醇电解质散2 盒口服进行肠道准备, 术晨给予留置胃管、尿管, 给予术前针阿托品0.5 mg、苯巴比妥钠注射液0.1 g术前30 min肌肉注射。
2.2 术后护理
2.2.1 严密监测患者生命体征变化患者术后回病房, 与手术室护士做好交接工作, 了解患者术中情况, 给予心电监护, 持续低流量吸氧, 观察患者体温、心率、血压、血氧饱和度和呼吸, 如有异常及时通知医师。
2.2.2 皮肤护理继续严格执行术前皮肤护理措施并做好观察。该患者术后第1 d皮疹颜色变淡, 明显好转, 术后第2 d皮疹干燥, 部分痂皮脱落, 术后第3 d出现大量痂皮脱落, 告知患者不要自行揭除痂皮, 让其自然脱落, 以免造成新的创伤, 同时做好床单元护理, 保持床单位清洁干燥, 增加病人的舒适感, 术后5 d红斑明显消失, 术后2 周皮疹完全消失, 留有部分皮肤色素沉着。甲沟炎明显好转, 甲沟干燥无渗出。鼓励患者每日照镜子, 让病人自己看到皮肤好转的情况, 增加病人战胜疾病的信心。
2.2.3 活动指导术后第1 d遵医嘱停用心电监护、吸氧, 鼓励患者早期下床活动, 向其解释早活动的好处, 预防下肢深静脉血栓形成, 防止坠积性肺炎发生, 促进胃肠道功能的恢复。
2.2.4 引流管护理术后患者带有胃管一根, 腹腔引流管两根, 尿管一根, 要妥善固定引流管, 保持引流通畅, 密切观察引流液的颜色、性质和量, 并做好记录, 如有异常及时通知医师。患者的尿管于术后第1 d拔除, 胃管于术后第1 d引出墨绿色液体130 ml, 术后第2 d引出墨绿色液体200 ml, 术后第3 d排气后拔除, 胰腺上缘腹腔引流管于术后第1 d引出淡红色液体10 ml, 胰腺下缘腹腔引流管引出淡红色液体15 ml, 胰腺上缘腹腔引流管于术后第2 d引出淡红色液体10 ml, 胰腺下缘腹腔引流管引出淡红色液体10 ml, 两根腹腔引流管于术后2 周无手术并发症且引流量减少后拔除。
2.2.5 监测血糖变化胰高血糖素瘤切除后患者可出现高血糖和低血糖, 术后应密切观察患者血糖变化, 该患者术后3 d内未进饮食前遵医嘱每6 h监测末梢血糖变化, 开始进食后每天监测空腹及三餐后血糖变化, 如有异常应及时通知医师, 积极采取处理措施。该患者手术后血糖较平稳, 未出现高血糖及低血糖现象。
2.2.6 并发症观察及护理 ①出血:术后1~2 d和术后1~2 周时均可发生出血, 表现为伤口渗血或引流管引出血性液体, 病人可同时有脉速、血压下降等表现。②胰瘘:通常发生在术后1 周左右, 表现为突发剧烈腹痛、持续腹胀、发热、腹腔引流管或伤口流出清亮液体, 引流液测得淀粉酶。为了防止胰瘘的发生, 遵医嘱应用抑制胰腺分泌药物善宁0.1 mg入生理盐水50 ml中q8h微量泵持续泵入, 于术后第4 d停用;乌司他丁10 万单位入5%的葡萄糖250 ml中一天两次静脉输注, 于术后第5 d停用。应向病人解释用药的目的、药物的作用及不良反应, 及时准确应用药物并观察药物的副作用, 如有异常及时处理。③脾梗死:为保留脾脏的胰体尾切除术后少见而严重的并发症。主要表现为左上腹疼痛, 常伴有发热, 恶心、呕吐, 可伴肩背部放射痛[4]。以腹部CT为首选检查方法。因此术后应注意病人腹痛的部位、性质, 以及体温的变化, 异常时应及时报告医师, 积极采取处理措施。该患者术后未出现并发症, 恢复顺利。
3 出院指导
定期复查:出院后6 月内每月复查一次, 6 月~12 月间每3个月复查一次, 12 月以后每6 个月复查一次。监测血糖及胰高血糖素变化, 复查腹部CT, 如有不适我科随诊。
4 讨论
胰高血糖素瘤为胰岛 α 细胞发生的肿瘤, 由位于第2 号染色体上的胰高糖素原前体基因编码的一种多肽, 使肿瘤产生过多的胰高血糖素, 进入血液后导致一系列代谢异常而致病。胰高血糖素促进肝糖原分解和糖异生, 抑制糖酵解和脂肪的生成, 血氨基酸水平减低, 蛋白分解增加, 脂肪合成减少。以上是导致胰高血糖素瘤临床表现的病理生理基础[5]。
皮肤游走性坏死性红斑为为其特征性表现:开始表现为皮肤红斑, 红斑不断扩大并形成水泡, 渗液, 然后结痂并愈合, 留下色素沉着, 伴痒痛, 然后以相同的模式反复发生, 皮疹新老交替, 红斑、水疱、结痂、色素沉着可并存。因此病人常常就诊于皮肤科, 而忽略了内在疾病。因此胰高血糖素瘤病人易误诊, 病情长期反复, 病人往往处于烦躁、不信任的状态, 护理人员应多与病人沟通, 取得病人的信任, 做好患者的心理护理尤其重要, 尽量多的向病人提供疾病相关知识, 让病人充分了解自己的疾病, 取得病人的配合。
手术切除肿瘤是治疗胰高血糖素瘤的最主要的方法, 也是唯一可能治愈此病的方法[6]。因此做好围手术期护理尤为重要。在该病中皮肤护理相当重要, 应在避免感染的前提下尽量保持其舒适干燥, 做好皮肤护理的健康教育, 取得病人主动配合。术前血糖水平一定控制好, 这样才能保证手术及术后患者顺利恢复, 减少术后并发症的产生。约2/3 以上的胰高血糖素瘤患者, 一般有轻度糖尿病或糖耐量异常表现, 多为非胰岛素依赖型糖尿病, 无并发症及酮症酸中毒[7]。通常饮食控制或口服降糖药即可控制症状, 因此在住院期间及出院宣教时均应对患者做好相应的解释工作, 使患者了解饮食控制的重要性, 促使患者积极配合。术后一定做好引流管的护理, 保持引流管引流通畅, 认真记录引流液的颜色、性质及量, 为医师治疗提供依据。做好并发症的观察工作, 对并发症做到早发现、早处理, 把并发症对病人的损害降到最低。
在护理过程中, 由于做了大量的心理护理, 使病人心情愉悦, 对治愈疾病充满信心, 从而积极配合治疗护理。目前该患者疾病治愈, 生活完全恢复正常, 这是医、护、患共同努力的结果。
参考文献
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[7]Kaplan EL, Michelassi F.Endocrine tumors of the pancreas and their clinical syndromes[J].surg Annu, 1986, 18:181-223.
胰高血糖素 篇2
表达人胰高血糖素样肽前药工程菌遗传稳定性
通过传代培养的方法,研究高表达重组人胰高血糖素样肽前药(Pro-rhGLPs)的工程菌E.coli BL21(DE3)/pET41a(+)-hGLPs的遗传稳定性,观察菌体和菌落形态,比较在有无选择压力下的质粒稳定性,酶切和测序鉴定重组基因片断的正确性,SDS-PAGE电泳证实重组蛋白质的`表达量的稳定性,在C57BL/6小鼠上进行葡萄糖耐量实验检测重组蛋白生物学活性.结果显示:此工程菌连续传代过程中,保持大肠杆菌的典型特征,各代质粒的酶切鉴定和测序正确,重组蛋白表达水平及生物活性也无显著差异.因此,工程菌E.coli BL21(DE3)/pET41a(+)-hGLPs具有良好的遗传稳定性.
作 者：周颖 马雪 侯征 薛小燕 陈瑛瑛 罗晓星 ZHOU Ying MA Xue HOU Zheng XUE Xiao-yan CHEN Ying-ying LUO Xiao-xing 作者单位：第四军医大学,药学系药理学教研室,西安,710032 刊 名：生物加工过程 ISTIC英文刊名：CHINESE JOURNAL OF BIOPROCESS ENGINEERING 年，卷(期)： 8(2) 分类号：Q78 关键词：人胰高血糖素样肽 遗传稳定性 前药 hGLP-1 genetic stability prodrug胰高血糖素瘤两例报道并文献复习 篇3
1 临床资料
病例1
患者女性, 57岁, 2007年因“口干1年余”入院。患者1年多前无明显诱因出现口干, 伴有舌痛, 进行性加重, 无明显缓解因素, 于当地医院内分泌科就诊查餐前血糖7.03 mmol·L-1、餐后7.74 mmol·L-1, 诊断为可疑糖尿病, 未治疗。因口干至鼓楼医院内科就诊。予角膜荧光染色及泪流量检测, 左 (+) , 泪流量左右2 mm· (5 min) -1, 腮腺造影正常。诊断为干燥综合征?老年性干燥症状?患者未予重视, 未服药控制。后因舌痛多次至南京口腔医院就诊, 查体见舌背乳头萎缩、舌苔消失、舌裂纹, 予维生素等治疗 (具体不详) 后症状无明显好转。两个月前患者双下肢屈侧及肛周等处皮肤反复红斑水泡, 至南京军区总医院皮肤科就诊, 考虑湿疹, 予百多邦等外用后稍好转。近日患者口干症状加重, 体重减轻约5 kg, 再次至鼓楼医院内分泌科就诊, 考虑患者既往有血糖增高史, 遂收住内分泌科进一步治疗。查体可见舌炎 (图1) , 双下肢可见多处红色斑疹, 部分结痂, 有褐色色素沉着 (图2) 。实验室检查:随机血糖7.46~17.1 mmol·L-1, OGTT (m IU·L-1) 0 min 10.95、30 min 50.68、60 min 169.17、120 min 200, 胰岛素水平正常, C肽及肿瘤标志物未见异常, 胰高血糖素 (GC) >1 000 pg·ml-1 (正常值<200 pg·ml-1) 。常规查B超示胰尾见一实质性低回声光团, 考虑为胰尾占位性病变 (图3) 。胰脾外科会诊后转入外科。CT示胰尾体积稍大、胰尾部囊性病变, 考虑囊肿可能性大 (图4) , 决定行手术治疗。术中见胰体尾部一囊性肿块 (图5) , 拟行保脾胰尾切除术。术中送快速病理检查示恶性肿瘤 (图6) , 遂加行脾切除术。术后病理示: (1) 胰腺恶性内分泌肿瘤, 结合免疫组化考虑GCGN, 肿块大小4 cm×2.5 cm×2 cm, 神经见癌组织侵犯, 脉管内未见明确癌栓, 癌组织浸润胰腺周围脂肪组织, 送检肿块切缘未见癌组织残留; (2) 胰尾单纯性囊肿。免疫组化:癌细胞表达Syn+++, Cg A++, GC>60% (+) , 胰岛素10% (+) , CD56- (图7~10) 。患者病理诊断明确, 术后血糖恢复正常, 术后1周GC为124.58 pg·ml-1, 下肢坏死松解性游走性红斑 (necrolytic migratory erythema, NME) 逐渐消褪, 随访至今。
病例2
患者男性, 43岁, 2010年因“消瘦半年”入住鼓楼医院消化科。患者半年前无明显诱因出现消瘦, 体重下降约16 kg, 伴食欲下降、口渴、多饮, 门诊查餐后2 h血糖14.50 mmol·L-1, C肽值偏高, 诊断为2型糖尿病, 口服降糖药治疗血糖控制欠佳。查B超示脾门处一低回声不均匀肿块, 形态不规则, 境界欠清, 上腹部CT (图11) 示:胰尾部低密度肿块影, 边界不清, 肿块与脾门不能分界。病程中患者双下肢反复出现红色斑疹, 部分红斑中心有水泡, 不久水泡破溃坏死, 然后结痂、遗留色素沉着斑, 双下肢皮疹交替, 此起彼伏, 迁延不愈。查体:消瘦, 轻度贫血貌, 舌面见草莓状舌炎, 双下肢可见多处红色斑疹, 部分结痂, 有褐色色素沉着。实验室检查:Glu 6.44 mmol·L-1, 尿常规、粪常规、胰酶3项及肿瘤标志物CEA、CA199、CA125、AFP均正常。超声内镜示胰尾部一低回声肿块, 边界欠清, 侵犯脾脏。进一步查GC 920.27 pg·ml-1, 胃泌素正常, 考虑诊断为GCGN, 普外科会诊后有手术指征遂转入胰脾外科。术中见胰尾一大小约6.5 cm×5 cm肿块, 与脾脏粘连, 淋巴结无肿大, 遂行胰体尾加脾脏切除术 (图12) 。术后病理示肿瘤组织浸润脾实质 (图13) , 脉管内见瘤栓, 神经见肿瘤组织侵犯, 切缘未见肿瘤组织残留;免疫组化示肿瘤组织表达GC+, 胰岛素-, Syn+, Cg A+, 5-HT+, NSE+, α-AT-, α-ACT-, Ki67约10% (+) 。明确诊断为GCGN。术后监测血糖正常, 半个月后复查GC 32.67 pg·ml-1, 双下肢皮疹消褪。术后患者定期于门诊复查, 2013年6月查CT (图14) 示肝脏多发占位, 考虑转移可能。遂以“肝转移性GCGN”再次入院。查体左脚踝处可见大量红斑。CT检查示胰体尾及脾脏术后、肝脏多发占位, 考虑转移可能, 胆囊结石。空腹血清C肽458.50 pmol·L-1, 空腹血清胰岛素3.98μIU·ml-1, B超示肝脏多发占位部分伴液化。行肝脏右后叶切除、肝左叶肿瘤局部切除加胆囊切除术 (图15) 。术后病理示: (1) 肝脏右后叶和左叶局部切除标本:神经内分泌肿瘤, 2级 (核分裂像<2个10 HPF, Ki67增值指数约15%) 。结合临床症状、免疫组化考虑为肝脏内转移性胰腺GCGN。 (2) 胆囊:慢性胆囊炎、胆囊结石。免疫组化:GC+, 胰岛素受体-, Syn+++, Cg A+++, CD56++, CK+++, Ki67约15% (+) 。术后恢复良好并顺利出院。
2 讨论
GCGN主要起源于胰岛A细胞, 1966年Mc Gavran应用电子显微镜技术发现肿瘤细胞有A细胞颗粒特征, 并用放射免疫方法测定出切除的肿瘤组织中含有大量GC, 为该病的首次确定性诊断[2]。其主要表现为皮肤NME、糖尿病、贫血、舌炎及口角炎、外阴阴道炎、低蛋白血症、深静脉血栓等, 又称为GCGN综合征[3]。肿瘤直径一般为1.5~3 cm, 多为孤立肿瘤, 75%位于胰腺体尾部, 亦可多发, 有时整个胰腺均为肿瘤, 恶性占60%~82%, 50%以上患者诊断时已远处转移, 最常见的转移是肝脏及淋巴结, 也有转移至骨和肾上腺[4]。本病多见于40~70岁中老年人, 女性较男性多见, 绝大多数为绝经期的女性。
2.1 GCGN的发生机制
GCGN的病理生理基础是胰岛A细胞分泌过量的GC, 一般超过500~1 000 pg·ml-1 (正常范围25~200 pg·ml-1) , 其可促进葡萄糖异生、糖原分解、酮体生成和脂肪分解, 刺激胰岛素分泌, 抑制胃、胰腺外分泌, 松弛胃和小肠平滑肌, 从而引起NME、糖尿病、贫血、消瘦等一系列GCGN综合征。
2.2 GCGN的临床表现
根据GCGN的特点有学者将其分为3型[5]: (1) 有皮肤综合征的GCGN, 有典型的坏死性红斑; (2) 无皮肤综合征的GCGN, 仅有轻度糖尿病, 血浆GC浓度升高; (3) 有多种综合征的GCGN。本资料两例患者均具有皮肤综合征、糖尿病等相关症状, 属于多种综合征的GCGN。GCGN临床特点为: (1) 糖耐量受损:80%以上的GCGN患者有轻型糖尿病, 多为2型糖尿病, 此与肿瘤分泌过多的GC引起肝糖原分解增加有关。 (2) 特征性皮疹:Wilkinson[6]首次提出了NME的概念用来描述GCGN患者的皮损表现。NME是患者最具特征性的临床表现, 发生率为68%~90%[7], 好发于间擦和易受外伤部位, 初为淡红斑, 中心苍白, 随着红斑扩大和隆起, 中央发生水泡和脓疱, 易破裂形成糜烂、结痂, 其后脱屑和遗留色素沉着而愈, 历时7~14 d, 皮疹此起彼伏, 红斑、水泡、糜烂、结痂及色素沉着共存, 呈周期性发作。 (3) 消瘦:90%患者体重下降超过5 kg, 伴营养不良、低蛋白血症、血浆氨基酸含量严重减少, 其原因可能为肿瘤分泌GC及其代谢产物加强了机体分解代谢、恶性肿瘤的消耗及长期慢性腹泻。 (4) 其它:血栓栓塞性疾病、间歇性腹泻、胃炎、舌炎、贫血, 精神症状如抑郁、定向障碍、紧张、失眠等[8]。本资料1例患者先后具有口干、舌炎、糖尿病、皮疹等临床表现, 并反复多次就诊于不同科室, 另1例患者因消瘦、糖尿病、皮疹多次就诊于不同科室。总之GCGN患者有临床症状多、病情复杂的特点。
2.3 GCGN诊断与治疗
GCGN症状无特异性, 往往因皮疹就诊于皮肤科, 因消瘦、血糖升高至内分泌科诊治。早期诊断较困难, 往往需结合病史并借助于相关辅助检查。GCGN主要表现为GCGN综合征, 包括NME、糖尿病、舌炎、贫血、消瘦等, 具备这些症状者应考虑GCGN可能[9]。GC的正常参考范围是25~200 ng·L-1, GCGN一般超过500 ng·L-1。现在认为无肝病及门脉梗阻, 在非应激状态下GC值超过1 000 ng·L-1作为诊断本病的标准[10,11]。定位检查中B超、CT及MRI可作为首选, 能发现1 cm以上的病灶。约有92%的GCGN是高度血管化肿瘤, 故对B超和CT检查未能发现肿瘤灶的应行选择性或超选择性腹腔动脉造影, 诊断率可达80%。生长抑素受体闪烁成像 (somatostatin receptor scintigraphy, SRS) 对GCGN敏感性为60%~100%, 并有利于发现全身转移灶。诊断金标准是对手术切除标本用GC单抗免疫组化特殊染色结果为阳性[12]。本资料两例患者临床表现均有NME、糖尿病、舌炎、消瘦等一系列GCGN综合征的表现, B超、CT等影像学检查可见胰体尾部肿块, 根据GC水平及术后病理结果, 均可确诊为GCGN。
GCGN的主要治疗方法有手术、化疗和生长抑素治疗, 手术切除仍是治疗GCGN的最理想方法。虽然GCGN多为恶性, 而且确诊时多已有肝脏或其他部位转移, 但肿瘤生长缓慢, 对良性GCGN切除即可治愈, 恶性不能根治者, 切除原发肿瘤甚至是姑息性切除手术, 对患者术后症状和预后有一定的改善作用[13]。本资料两例患者均行手术治疗, 术后患者症状及病情均有一定的改善。相关辅助药物的治疗对GCGN患者也有一定的疗效。生长抑素类似物奥曲肽能明显降低血浆中GC水平, 缓解症状, 降低血栓栓塞性疾病的发生, 并对皮损有显著的治疗效果, 但对肿瘤的生长似乎无抑制作用[14,15]。对转移的患者, 目前常用的化疗药物有氟尿嘧啶、阿霉素、链佐星、达卡巴嗪等[16]。临床其他治疗还包括输注支链氨基酸3H注射液、补充锌剂及皮疹局部治疗。
胰高血糖素 篇4
1 胰高血糖素样肽-1及其类似物简介
1.1 胰高血糖素-1
胰高血糖素样肽-1 (GLP-1) 又称为肠促胰岛素, 胰升血糖素样肽-1, 类胰升血糖素-1。是一种主要由分布于结肠和直肠的肠道L细胞分泌的含30个氨基酸的多肽类物质[1,2], 通过与胰高血糖素样-1受体 (GLP-1R) 结合而发挥作用, 如促进胰岛素的合成和分泌、促进胰岛β细胞增殖和新生、抑制胰高血糖素分泌、减少食物摄取、能延缓胃排空、以及增强外周组织的葡萄糖利用和减少肝糖输出等[3]。临床上已用于成年人2型糖尿病 (DM-2) 的治疗。但是GLP-1在人体内半衰期短, 仅1~2 min即被二肽酶 (DPP-Ⅳ) 快速降解而失去活性[4,5], 使得其生物学效应受到很大限制。
1.2 利拉鲁肽
利拉鲁肽 (Liraglutide) 是人工合成的GLP-1长效类似物, 是通过基因重组技术将GLP-1第34位的赖氨酸替换为缬氨酸, 第26位增加一条棕榈酰脂肪酸侧链而形成。经证实, 利拉鲁肽与人的GLP-1具有97%同源性[6], 具有GLP-1的各种生理作用, 且半衰期长达13 h[5]。在欧洲, 美国及我国已批准上市, 用于成年人DM-2的治疗。近年来, 研究表明利拉鲁肽不仅具有降糖作用, 还可通过血脑屏障[7,8,9], 与GLP-1R结合发挥脑保护作用。目前, 国内外已有利拉鲁肽脑保护作用的临床前期研究。
1.3 Exendin-4
Exendin-4是Eng和Raufman从一种美洲毒蜥蜴的唾液中分离得到GLP-1的类似物, 亲和力和生理活性都远大于GLP-1, 它的氨基酸残基与哺乳动物GLP-1序列有52%的同源性[10], 在于N端第2位的甘氨酸 (Gly) 可抵抗血液中二肽基肽酶 (DPP-Ⅳ) 的降解作用, 入血后的半衰期较长约2.4 h。研究表明, Exendin-4是一种强效GLP-1受体激动剂。临床上也已用于DM-2的治疗。
2 GLP-1及其类似物的神经保护特性
近年来, 研究发现除了肠道分泌GLP-1外, 大脑中也产生少量的GLP-1, 尤其是孤束核、后极区、脑干尾部[11,12,13,14,15,16]。且GLP-1R不仅存在于胰岛细胞中, 在肾脏、心脏、胃、肺和周围及中枢神经系统区域等都有表达[17]。在中枢神经系统, GLP-1 R表达于下丘脑, 海马, 皮层及小脑[16,18]。已有研究证实GLP-1及其类似物利拉鲁肽, Exendin-4都可以通过血脑屏障[9,19], 促进神经细胞生长、增值、修复及抑制凋亡、减轻炎症反应[20]。另外, GLP-1及其类似物可以改善记忆和大脑中的突触可塑性[21], 增加脑血流量和提高认知能力[22]。因此GLP-1及其类似物的神经保护作用是它们极有可能成为治疗中枢神经系统疾病的新型药物。
3 GLP-1及其类似物的抗炎作用
事实上, GLP-1及其类似物不仅具有神经保护作用, 还具有抗炎效应。研究表明, 活化的星形细胞和小胶质细胞参与免疫, 炎症反应, 诱导GLP-1受体的表达。GLP-1治疗可以预防内毒素诱导星形细胞和小胶质细胞释放细胞因子白介素-1 (IL-β) , 而IL-β能促进炎症反应, 增强凋亡相关信号及减慢神经元的传导[23]。Exendin-4在动脉粥样硬化的炎症反应中能减少大动脉血管内皮的单核细胞黏附, 而且能够预防由LPS诱导的细胞因子和趋化因子的释放[24], 增加微血管的通透性。另外, 有研究表明在大脑的慢性炎症中, 利拉鲁肽除了可以减少大脑皮层、海马齿状回活化的小胶质细胞、大脑皮层的星形胶质细胞外, 还可减少促炎因子IL-β、IL-12p70、IL-6, 以及亚硝酸盐的含量[20]。这就表明GLP-1及其类似物可以用于治疗神经系统疾病的炎症反应。
4 GLP-1及其类似物脑保护作用的应用
4.1 阿尔兹海默病
阿尔兹海默病 (Alzheimer disease, AD) 是最常见的痴呆类型, 又称为老年性痴呆, 是一种具有年龄相关性的以记忆力损害和进行性的认知障碍为主的中枢神经系统退行性病变的疾病[25,26]。严重威胁着老年人的健康, 也为社会经济带来巨大负担。目前认为DM-2是阿尔兹海默病的危险因素, AD患者也可能发展为DM-2, 这两者之间存在着一些相同的病理生理学特征, 比如在AD患者的大脑灰质中有淀粉样蛋白-β (Aβ) 过量集聚, 而在DM-2患者的胰腺中有淀粉样蛋白 (IAPP) 沉积, 过早的细胞变性被认为是这两种疾病的共同特征[22]。最近, 对胰岛素受体、胰岛素受体底物蛋白-1 (IRS-1) 的信号途径的研究表明, AD的一些病理的特征和认知缺陷可能是由于大脑的胰岛素抵抗所造成, 这种胰岛素抵抗可能是由于Aβ沉积引起小胶质细胞释放细胞因子抑制IRS-1的丝氨酸而形成[27]。因此, 降糖新药GLP-1及其类似物Liraglutide及Exendin-4等用于AD的治疗逐渐被人们所重视。最近的研究表明在阿尔茨海默病的APP/PS1的小鼠模型上, 利拉鲁肽可通过血脑屏障, 防止损害记忆的形成和突触可塑性, 增加轴突数量, 减少淀粉样蛋白斑块负荷, 提高齿状回的神经祖细胞的增殖和神经细胞的发生[28], 减少氧化应激和大脑的炎症反应[8], 利拉鲁肽不仅能在阿尔兹海默病发展的早期发挥预防作用。在阿尔兹海默病晚期也有恢复效应[29]。Exendin-4也被证实在AD的转基因小鼠模型上有一系列神经保护效应[30], 它能够减少小鼠大脑中的内源性Aβ的水平, 还能够剂量依赖性的保护Aβ诱导的细胞凋亡[31]。Exendin-4与GLP-1受体结合后, 还能激活腺苷酸环化酶 (AC) , 从而催化ATP生成c AMP, 提高胞内c AMP水平, 触发Ca2+内流, 增加神经递质的释放, 加快神经兴奋性传导, 增强学习、记忆和认知能力。总而言之GLP-1类似物促进突触形成, 神经发生, 细胞修复, 减轻炎症反应, 以及减少大脑中淀粉样斑块的作用使之能成为治疗AD的新型药物。
4.2 帕金森病
帕金森病 (idiopathic Parkinson’s disease, PD) 是一种以静止震颤、肌张力增高、动作迟缓及减少、姿势不稳为主要特征的锥体外系运动功能障碍性疾病。是中老年人常见的神经系统变性疾病, 也是中老年人最常见的锥体外系疾病。PD的主要病理特征为选择性黑质致密区多巴胺 (DA) 神经元丢失, 而经研究证实, 在PD的动物模型中, Exendin-4使合成多巴胺的相关酶类表达增加, 保护多巴胺能神经元和预防基底神经节的多巴胺丢失[32], 如:在6-羟基多巴胺 (6-OHDA) 和内毒素 (LPS) 构建的PD大鼠模型上, Exendin-4可以减少苯丙胺诱导的大鼠旋转行为, 增加基底神经节的多巴胺水平, 减少多巴胺能神经元的损伤[33];在1-甲基-4-苯基-1, 2, 3, 6-四氢吡啶 (MPTP) 诱导的PD小鼠模型上, Exendin-4可以通过抑制黑质纹状体小胶质细胞的过度活化, 基质蛋白酶-3 (MMP-3) 的表达来保护多巴胺能神经元[34]。另外, Exendin-4还能减少炎症因子如TNF-α、IL-1β的释放, 减少多巴胺能神经元的损伤。也有研究表明, Exendin-4促进PD小鼠大脑侧脑室室管膜下层的神经干细胞增生[35]。基于这些临床前期研究, GLP-1类似物极有可能为PD患者带来福音。
4.3 脑卒中、脑缺血
脑卒中 (Stroke) 又称脑中风, 是一种突然起病的脑血液循环障碍性疾病。又称为脑血管意外。是指在脑血管疾病的患者, 因各种诱发因素引起脑内动脉狭窄, 闭塞或破裂, 而造成急性脑血液循环障碍, 临床上表现为一过性或永久性脑功能障碍的症状和体征。GLP-1类似物的抗炎效应和神经保护效应使它们有望成为治疗脑卒中的新型药物。在Wistar大鼠的脑卒中模型, Wistar大鼠经过90 min的大脑中动脉血流阻断, 再经恢复血流1 h后, 随机分为利拉鲁肽治疗组, 生理盐水治疗组。治疗24 h后评估发现利拉鲁肽治疗组与生理盐水治疗组相比外周学血糖水平并无明显差异。利拉鲁肽治疗组大鼠的行为评分比生理盐水组大大提高, 脑梗死面积减少, 活性氧代谢产物的诱导水平降低, 大脑皮层的血管内皮生长因子 (VEGF) 增加。这表明了利拉鲁肽可以通过抗氧化应激和上调VEGF对脑卒中发挥神经保护效应[36]。在Stroke的大鼠模型中, Exendin-4也被证明能减少大脑的梗死面积、改善行为障碍[34], 减少脑缺血再灌注诱导的神经元死亡、氧化应激、小胶质细胞活化后的炎症反应[37]。此外, 在暂时性脑缺血 (transient cerebral ischemia) 的沙土鼠模型上, 可观察到Exendin-4治疗后, 海马CA1区GLP-1 R表达增加。这些临床前期研究表明, GLP-1类似物能有效的治疗脑卒中, 脑缺血。
5 展望
临床前实验表明, GLP-1类似物利拉鲁肽、艾塞那肽除具有降糖作用外, 还具有一系列神经保护特性和抗炎特性, 且因其降糖作用呈葡萄糖依赖性, 很少发生低血糖事件, 胃肠道反应也较轻微。因此, GLP1类似物很有可能为神经系统退行性疾病的治疗开辟新的道路, 目前其对于AD和PD的治疗已进入临床实验阶段。但是其作用机制未完全清楚, 还需要大量的临床研究和实验数据的支持。
摘要：胰高血糖样肽1是一种肠促胰岛素, 它通过促进胰岛素的释放, 抑制胰高血糖素分泌、胰岛β细胞增殖、延缓胃排空等多种途径发挥降糖作用。在临床上胰高血糖素样肽1及其类似物已用于2型糖尿病的治疗。近年来, 研究发现胰高血糖样肽1受体不仅分布于胰腺中, 在人和动物的脑中也有广泛分布, 胰高血糖样肽1及其类似物具有脑保护作用, 预示着他们有可能成为治疗中枢神经系统疾病的新型药物。
胰高血糖素 篇5
从天然资源中提取GLP-2成本高、得率低、工序繁琐, 而化学合成的价格又相当昂贵[3], 半衰期较短, 难以应用于临床, 因此利用基因工程技术生产GLP-2具有重要意义。研究选用巴斯德毕赤酵母 (P.pastoris) 系统表达GLP-2, 目的在于利用毕赤酵母表达系统的特点和方法获得高表达量的GLP-2, 为今后其在临床上的应用提供理论基础[4]。
1 材料
1.1 菌株和质粒
大肠杆菌 (E.coli) DH5α、P.pastoris受体菌 X-33 (His-/Mut+) 、表达载体PpICZaC, 均由华南农业大学兽医学院传染病教研室保存。
1.2 主要试剂
XhoⅠ、XbaⅠ、Sac Ⅰ、三羟甲基氨基甘氨酸 (Tricine) 、T4 DNA连接酶等, TaKaRa公司生产; Tryptone、Yeast Extract, Oxoid公司生产; ZeocinTM, Invitrogen公司生产; Tricin-SDS-PAGE超低分子质量Marker, 北京索莱宝公司生产, 其他产品均为进口或国产分析纯。
2 方法
2.1 GLP-2基因设计与合成
根据猪GLP-2氨基酸序列 (登录号为NP-999489) 分析其生物活性和人工定点突变位点, 选用毕赤酵母偏好密码子[5], 利用DNAStar、Primer Premier 5.0 软件设计合成GLP-2基因, 同时设计上游和下游引物, 引物由上海英俊生物技术有限公司合成。将合成的GLP-2基因序列菌株命名为pMD18-T-GLP-2, 序列为5′-CACGGTGACGGTTCCTTCTCCGACGAGATGAATACTGTTTTGGACAACTTGGCTACTAGAGACTTCATCAACTGGTTGTTGCACACTAAGATCACTGAC-3′ (斜体部分是丙氨酸变成甘氨酸) 。 GLP-2-P1 5′-CCCTCAGGAAGAGACACGGTGACGGTTCCTTCT-3′, GLP-2-P2 5′-GCTCTAGATCAGTCAGTGATCTTAGTGTGCAACAAC -3′ (斜体部分为识别序列及Kex2蛋白酶裂解位点) 。
2.2 GLP-2基因重组酵母载体的构建
反应体系 (50 μL) :10×PCR Buffer 5 μL, 10 mmol/L dNTPs 4 μL, rTaq 0.5 μL, GLP-2-P1、GLP-2-P2各1 μL, pMD18-T-GLP-2菌液3 μL, ddH2O 35.5 μL。
PCR反应条件:94 ℃预变性4 min; 94 ℃变性20 s, 56.5 ℃退火20 s, 72 ℃延伸30 s, 共30个循环;72 ℃延伸10 min。
取PCR产物8 μL, 经1.5%琼脂糖凝胶电泳, 凝胶成像系统可观察到1条长度约为124 bp的条带, 并记录拍照。PCR产物纯化之后与表达载体PpICZaC 均用XhoⅠ、XbaⅠ双酶切, T4 DNA连接酶连接, 连接产物转化E.coli DH5α, 重组表达质粒进行 PCR鉴定。阳性质粒送 Invitrogen 上海分公司测序, 以确定序列及阅读框的正确性, 将构建正确的重组表达质粒命名为PpICZaC-GLP-2 [6]。
2.3 重组载体转化P.pastoris受体菌X-33的鉴定和筛选
将80 μL感受态 P.pastoris受体菌X-33 (His-/Mut+) 与5 μg Sac Ⅰ线性化PpICZaC-GLP-2混合, 转移至预冷的 0.2 cm 电转杯 (Bio-Rad) 中, 置冰上 5 min, 1.5 kV、25 μF、200 Ω电击, 立即加入预冷的 1 mol/L 山梨醇1 mL, 轻轻混匀后转入5 mL的培养管中。 30 ℃ 静止培养1 h后加入1 mL YPD液体, 30 ℃振荡培养45 min, 离心收集菌体, 取150 μL 涂布于 YPDS 平板上, 30 ℃培养至单个菌落出现。详细步骤参照 Pichia Expression Kit。采用 PCR 方法分析P.pastoris转化子, 用煮—冻—煮法[7]制备 PCR 模板, 以 P1、P2为引物, 反应体系和PCR 反应条件同2.2, 以能扩增出长度为 124 bp 的克隆确定为阳性转化子。再经不同浓度的ZeocinTM筛选出高拷贝克隆用于蛋白表达。
2.4 重组P.pastoris诱导表达
用灭菌牙签挑取具有ZeocinTM抗性的单个菌落, 于40 mL的BMGY液体培养基中进行激活培养, 30 ℃、220 r/min振荡过夜。OD600值为2～6[8]时, 此时细胞处于对数生长期, 4 000 r/min离心4 min, 收集培养沉淀, 重悬于4 mL的BMMY液体培养基中继续培养, 培养期间每隔24 h左右加100%的甲醇至终浓度为1%时进行诱导表达。96 h后, 4 000 r/min离心4 min, 收集培养上清液。用100%TCA沉淀上清液, 冰浴0.5 h以上 (过夜效果更佳) , 12 000 r/min离心12 min, 收集沉淀, 溶解于100 μL的PBS液中。以Tricine-SDS-PAGE 分析表达产物。
2.5 重组表达GLP-2的 Tricine-SDS-PAGE鉴定
参照参考文献[9]进行。
2.6 重组表达GLP-2的蛋白测定
用DNA/RNA微量定量仪测定蛋白浓度。
3 结果与分析
3.1 GLP-2基因设计
GLP-2-P1 5′-CCCTCAGG AAGAGACACGGTGACGGTTCCTTCT-3′ (下划线部分分别为XhoⅠ识别序列及Kex2蛋白酶裂解位点) , GLP-2-P2 5′-GCTCTAGA TCAGTCAGTGATCTTAGTGTGCAACAAC -3′ (下划线部分分别为XbaⅠ识别序列及终止密码子) , GLP-2氨基酸序列为HG (A) DGSFTSDINKVLDTIAAKEFLNWLISTKVTE。所合成的GLP-2基因长124 bp, 包括33个氨基酸的编码序列、1个终止密码子和保护性碱基。基因的5′端有XhoⅠ识别序列, 3′端有XbaⅠ识别序列, 并在基因的N端加了P.pastoris Kex2蛋白酶裂解位点。为了更好地延长GLP-2的半衰期, 将丙氨酸 (GCT) 变成甘氨酸 (GGT) [10]。
3.2 基因克隆
以pMD18-T-GLP-2质粒为模板, GLP-2-P1和 GLP-2-P2为引物进行PCR扩增, 扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳, 凝胶成像系统可观察到1条长度约为124 bp的条带 (见图1) 。
M.DL-2 000 Marker;1, 2.pMD18-T-GLP-2质粒的PCR扩增产物;3.阴性对照。
3.3 基因表达载体的构建和鉴定
将GLP-2基因定向插入酵母表达载体PpICZaC中, 酶切位点缺失鉴定 (用EcoRⅠ进行酶切鉴定, 正确插入酵母表达载体的重组质粒多克隆位点缺失) 。以GLP-2-P1和GLP-2-P2为引物进行PCR扩增, 扩增产物经 1.5%琼脂糖凝胶电泳, 凝胶成像系统下观察到1条长度约为124 bp的条带 (见图2) , 并送检测序。试验结果表明, GLP-2基因大小为124 bp, 与理论值一致, 并成功插入表达载体。
1.重组质粒的PCR扩增产物;M.DL-2 000 Marker。2.PpICZaC空载体的PCR扩增产物;3.阴性对照。
3.4 GLP-2蛋白的表达鉴定
重组GLP-2的相对分子质量为 3.9 ku。理论上, 分子质量低于 15 ku 的多肽在常规三羟甲基氨基甲烷 (Tris) -甘氨酸电泳系统中难以得到理想的电泳分辨率。因此, 使用Tricine代替甘氨酸作为终止离子, 提高了交联度和凝胶浓度, 并加入了适量的尿素, 使重组GLP-2 得到了较好的分辨率及带型。试验结果表明:分子质量为3.9 ku (见图3) 的GLP-2获得分泌表达, 而阴性对照的相应部分没有出现相应的条带, 说明该蛋白获得表达。
1.PpICZaC 空载体表达上清液;M.超低分子蛋白质量标准;2.PpICZaC-GLP-2载体表达上清液。
4 讨论
设计GLP-2时, 在N端引入Kex2裂解位点, 以保证其具有天然的N端;以解决翻译后不能酰胺化修饰的问题。在C端引入终止密码子, 以保证及时终止目的基因的翻译和使其具有天然的C端。同时在设计酶切位点时, 应注意阅读框, 以防目的基因错配导致乱码, 致使目的基因表达失败[11]。
P.pastoris作为较常见的外源基因真核表达系统具有较高的表达量, 酵母菌具有比大肠杆菌等其他表达系统更完备的基因表达调控机制和对表达产物的加工修饰及分泌能力。同时, 与原核生物相类似, 真核生物在密码子的选择上也具有偏爱性, 适合高密度发酵。P.pastoris中存在过氧化物酶, 表达的蛋白贮存其中, 可免受蛋白酶的降解, 而且可以减少对细胞的毒害作用。目前, 已经有240多种蛋白在P.pastoris中成功表达, 如人源抗菌肽、猪表皮生长因子等。PpICZaC作为一种诱导的分泌型载体, 可以将表达的蛋白分泌到培养基中。因此, 试验将GLP-2基因克隆到PpICZaC载体中, 通过合理的N 端设计及优化的毕赤酵母偏嗜密码子, 使其表达的GLP-2在忠实的设计情况下, 运用PpICZaC所携带的ZeocinTM抗性进行目的基因高拷贝筛选。但由于GLP-2的分子质量较小, 用Tricine-SDS-PAGE进行鉴定使得目的蛋白具有较好的分辨率。目前, 市场上还没有相应的GLP-2商品化的抗体, 体外的生物活性暂时无法检测, 还有待在以后的试验中进一步完善。
试验在改造GLP-2基因的基础上, 采用受体菌株X-33 (His-/Mut+) 和诱导表达载体PpICZaC, 成功地表达了GLP-2, 对动物试验和促生长机理[12]等研究具有较重要的意义, 也将为开发新型绿色饲料添加剂和工业化生产提供理论依据。
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胰高血糖素 篇6
关键词：糖尿病,2型,胰高血糖素,血清C反应蛋白
一般认为, 胰岛素抵抗与胰岛素分泌缺陷是2型糖尿病发病机制的两个要素, 而对胰高血糖素在糖尿病中的作用考虑的较少。近几年随着对胰高血糖素的研究逐渐增多, 发现胰岛α细胞的病理改变及胰高血糖素分泌紊乱在糖尿病发病中有很重要的作用, 但影响胰高血糖素分泌的因素尚不十分清楚。本研究通过分析2型糖尿病患者胰高血糖素与血清C反应蛋白 (SCRP) 及胰岛素抵抗相关指标的关系, 初步探讨影响胰高血糖素水平的因素。
1 资料与方法
1.1 一般资料
收集2012年10月-2013年4月于天津医科大学代谢病医院住院的2型糖尿病患者168例, 2型糖尿病诊断符合1999年世界卫生组织 (WHO) 标准。排除严重心、肝、肾功能不全、脑血管疾患、糖尿病急性并发症, 感染和感染相关性疾病, 所有患者均未使用二肽基肽酶4抑制剂、胰高血糖素样肽-1类似物及其受体激动剂。根据SCRP水平分为两组:A组 (0<SCRP≤3 mg/L) 82例 (男51例, 女31例) , 年龄 (52.89±10.63) 岁;B组 (3<SCRP≤17.2 mg/L) 86例 (男49例, 女37例) , 年龄 (56.08±11.08) 岁。将所有患者按SCRP水平的四分位数进行分层:1组:0<SCRP≤1.0 mg/L;2组:1.0<SCRP≤3.1 mg/L;3组:3.1<SCRP≤6.1 mg/L;4组:6.1<SCRP≤17.2 mg/L, 比较不同SCRP水平之间胰高血糖素的变化情况。
1.2 方法
收集所有患者的身高、体重, 计算体重指数 (BMI) ;口服75 g葡萄糖耐量试验空腹、120 min血糖[使用ROCHE MODULARP800全自动生化分析仪 (德国) 、己糖激酶法测定], 空腹胰岛素[采用ROCHE E170电化学发光仪 (德国) 、电化学发光法测定], 空腹、30 min、120 min胰高血糖素 (采用放射免疫非平衡法测定) ;SCRP、血脂[甘油三酯 (TG) 、总胆固醇 (TC) 、低密度脂蛋白胆固醇 (LDL-C) ]、肝功能、肾功能指标 (日立7600A-020全自动分析仪测定) ;用稳态模型评价胰岛素抵抗指数 (HOMA-IR) , HOMA-IR= (空腹血糖×空腹胰岛素) /22.5。
1.3 统计学处理
所有数据均采用SPSS 17.0医学统计软件进行分析处理。计量资料组间均数比较采用独立样本t检验或秩和检验, 计数资料进行字2检验。各变量间相关关系采用Pearson相关分析及多元逐步回归分析。以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 两组一般资料比较
两组患者的年龄、性别分布、病程、TC、LDL-C、空腹血糖 (FPG) 、丙氨酸氨基转移酶 (ALT) 、门冬氨酸氨基转移酶 (AST) 、血肌酐 (SCr) 、血尿素氮 (BUN) 比较差异均无统计学意义 (P>0.05) ;与A组相比, B组的HOMA-IR、BMI、糖负荷后2 h血糖 (PG2h) 、TG均明显升高, 两组比较差异有统计学意义 (P<0.05) , 见表1。
注:HOMA-IR:胰岛素抵抗指数;BMI:体重指数;SCr:血肌酐;BUN:血尿素氮;FPG:空腹血糖;ALT:丙氨酸氨基转移酶;AST:门冬氨酸氨基转移酶;PG2h:糖负荷后2 h血糖;TG:甘油三酯;TC:总胆固醇;LDL-C:低密度脂蛋白胆固醇;1:数据经自然对数转换
2.2 两组间空腹、30 min、120 min胰高血糖素比较
与A组相比, B组空腹、30 min、120 min胰高血糖素均升高, 两组比较差异均有统计学意义 (P<0.05) , 见表2。
pg/m L
按SCRP水平的四分位数进行分层后, 空腹、30 min、120 min胰高血糖素随着SCRP水平的升高从1组到4组依次升高, 差异均有统计学意义 (P<0.05) 。从1组到4组:空腹胰高血糖素依次为: (86.84±6.41) pg/m L、 (88.16±9.98) pg/m L、 (92.50±21.00) pg/m L、 (95.82±19.53) pg/m L;30 min胰高血糖素依次为: (124.55±20.02) pg/m L、 (127.57±20.93) pg/m L、 (133.30±33.46) pg/m L、 (141.27±36.44) pg/m L;120 min胰高血糖素依次为: (146.06±50.59) pg/m L、 (162.68±79.91) pg/m L、 (163.85±49.87) pg/m L、 (186.84±72.17) pg/m L。
2.3 Pearson相关分析
SCRP与空腹、30 min、120 min胰高血糖素、HOMA-IR及TG均呈正相关 (r分别为0.203、0.236、0.221、0.158、0.315, P<0.01或P<0.05) , 空腹胰高血糖素与HOMA-IR呈正相关 (r=0.212, P<0.01) 。
2.4 多元逐步回归分析
以病程、年龄、BMI、HOMA-IR、SCRP、TG为自变量, 分别以空腹、30 min、120 min胰高血糖素为因变量进行多元逐步回归分析, 结果显示HOMA-IR、SCRP是影响空腹胰高血糖素水平的独立相关因素 (标准化β分别为0.190、0.220, 均P<0.05) , SCRP是影响30 min、120 min胰高血糖素水平的独立相关因素 (标准化β分别为0.238、0.254, 均P<0.01) 。
3 讨论
以往普遍认为, 胰岛素抵抗与胰岛β细胞功能缺陷是2型糖尿病发病的重要病理生理机制, 而对胰高血糖素在糖尿病中的作用考虑的较少。近几年随着对肠促胰素的研究不断增多以及调节胰岛α细胞功能药物的出现, 愈来愈多的研究表明, 除β细胞外, α细胞的病理改变及胰高血糖素的分泌异常也参与了2型糖尿病的发生发展[1]。但引起胰高血糖素分泌异常的原因尚不完全清楚。
本研究发现, 与SCRP正常组相比, SCRP升高组的多时相胰高血糖素水平均升高, 随着SCRP水平的升高多时相胰高血糖素水平均升高, 且SCRP为多时相胰高血糖素水平的独立相关因素, 这强烈提示SCRP水平与2型糖尿病患者胰高血糖素有密切关系。
SCRP是一种由肝脏产生并分泌的蛋白质, 是全身炎症反应的敏感性标志物, 患慢性炎症疾病时体内SCRP浓度会持续升高。此外, 近几年有研究显示SCRP可作为对一些疾病, 如急性心肌梗死、急性脑梗死早期诊断和预测的一项敏感指标[2,3]。有关健康人群SCRP浓度日间及季节变异的研究显示, SCRP没有季节和周期变化。因此, SCRP作为慢性炎症疾病的预报因子很有价值。其表达受多种促炎因子的调控, 如IL-6、TNF-α等可刺激肝脏合成SCRP。目前普遍认为, 2型糖尿病是一种低度慢性炎症性疾病, 有研究显示炎症与胰岛素抵抗有密切关系[4]。Fagerberg等[5]发现SCRP引起胰岛素抵抗是由TNF-α等促炎因子所介导的。由于炎症因子可干扰胰岛素经胰岛素受体 (IR) /受体底物 (IRS) /磷脂酰肌醇-3-激酶 (PI3-K) 信号通路下传, 从而使胰岛素的正常生理作用减弱[6]。本研究Pearson相关分析也显示SCRP与HOMA-IR呈正相关, 证实了炎症与胰岛素抵抗有关。
胰岛素是影响胰高血糖素分泌的主要因素, 胰岛β细胞分泌胰岛素后通过旁分泌作用抑制胰岛α细胞胰高血糖素的分泌。目前有研究发现胰岛α细胞同样具有IR、IRS及PI3-K等下游信号分子的表达[7,8]。胰岛素通过作用于此途径抑制胰高血糖素的合成及释放[9,10]。由此推测, SCRP影响胰高血糖素水平的原因如下, 炎症因子可能通过干扰胰岛α细胞胰岛素信号转导通路使胰岛素抑制胰高血糖素合成及分泌的作用减弱, 即引起胰岛α细胞胰岛素抵抗, 从而引起胰高血糖素分泌增多[11,12]。其具体机制有待相关基础研究进一步证实。
本研究结果显示, 空腹胰高血糖素与HOMA-IR呈正相关, 即胰岛素敏感性与空腹胰高血糖素呈反比关系, 与既往文献报道相似[13]。此外, 多元线性逐步回归分析进一步发现, HOMA-IR是影响空腹胰高血糖素水平的独立相关因素, 推测胰岛素抵抗与空腹胰高血糖素水平有关。
胰高血糖素 篇7
1 材料与方法
1.1 实验动物和试剂
新西兰大白兔, 雄性, 体重约2.5~3.0 kg, 购于吴氏实验动物中心, GLP-1、GLP-1受体拮抗剂 (exendin9-39) 、Ⅰ型胶原酶、四甲基偶氮唑盐 (MTT) (Sigma公司) , BRDU增殖试剂盒、TUNEL凋亡试剂盒 (Roche公司) , M199细胞培养基、胎牛血清 (fetal bovine serum, FBS) 、0.25%胰酶-EDTA (Life公司) , 其他试剂均为国产分析纯试剂。
1.2 兔胸主动脉内皮细胞培养
无菌条件下取兔胸主动脉约5 cm, PBS冲洗2、3次;向血管内注入约1~2 ml 0.1%I型胶原酶, 37℃15~20 min, 用M199培养液冲洗3、4次, 300 g离心10 min;弃上清, 加入含20%FBS的M199培养基, 置37℃5%二氧化碳CO2培养箱24 h, 更换培养基;镜下观察, 待细胞长至70%~80%汇合时行1∶2传代, 取3~5代细胞进行实验。实验分为4组, 分别为对照组 (正常糖浓度) 、高糖组 (33 m M) 、GLP-1组 (GLP-1+高糖) 、exendin9-39组 (GLP-1+exendin9-39+高糖) 。其中, GLP-1组为GLP-1 (10-8M) 预处理内皮细胞60 min后, 再给予高糖 (33 m M) 干预24 h。exendin9-39组为exendin9-39 (10-7M) 预处理30min后加GLP-1 (10-8M) 60 min再给予高糖 (33 m M) 干预24 h。各组进行各项指标的检测。
1.3 TUNEL法测定胸主动脉内皮细胞凋亡
取3~5代兔胸主动脉内皮细胞消化接种于预先放置有盖玻片6孔培养板中, 105细胞/孔, 观察待细胞生长至约60%~70%汇合时更换0.2%FBS的M199培养基24 h, 加入33 m M葡萄糖及其他试剂干预, 继续培养24 h, 弃培养基, PBS洗涤1次, 4%甲醛固定液15 min, 弃固定液, PBS漂洗5 min×3, 加0.1%Triton于25℃条件10 min, 加5μg/ml蛋白酶K37℃20 min, PBS漂洗5 min×3, 加TUNEL反应液50μl/片, 37℃60 min, PBS漂洗5 min×3, 加converter-POD混合液50μl/片, 37℃30 min, DAB显色, 苏木素复染, 中性树脂封片。
1.4 BRDU法测定胸主动脉内皮细胞增殖
取3~5代兔胸主动脉内皮细胞消化接种96孔培养板, 2×103细胞/孔, 观察待细胞生长至约60%~70%汇合时更换0.2%FBS的M199培养基24 h, 加入33 m M葡萄糖及其他试剂干预, 继续培养24 h, 弃培养基, PBS洗涤1次, 4%甲醛固定液15 min, 弃固定液, PBS漂洗5 min×3, 加HRP-Anti-BRDU抗体 (1∶100) 于25℃条件2 h, PBS漂洗5 min×3, 加BRDU试剂盒中D反应液100μl/孔, 37℃10~20 min, 加25μl/孔1M H2SO4终止, 酶标仪450 nm检测, 以OD值大小表示细胞增殖水平。
1.5 MTT法测定胸主动脉内皮细胞代谢与增殖活性
取3~5代兔胸主动脉内皮细胞消化接种96孔培养板, 2×103细胞/孔, 观察待细胞生长至约60%~70%汇合时更换0.2%FBS的M199培养基24 h, 加入33 m M葡萄糖及其他试剂干预, 继续培养24 h, 加10×MTT 10μl, 37℃继续培养4 h, 弃培养液, 加100μl DMSO, 小心振荡1~2 min, 酶标仪450 nm波长检测, 以OD值大小表示细胞代谢增殖活性水平。
1.6 统计学方法
所有计量资料以均数±标准差 (±s) , 采用统计软件SPSS 13.0进行数据分析, 多组间计量资料比较采用单因素方差分析 (One-Way ANOVA) , 多组间两两比较使用最小显著性差异 (least significant difference, LSD) 法检验, P<0.05定义为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 GLP-1对高糖诱导内皮细胞凋亡的影响
对照组兔内皮细胞形态规则, 多呈卵圆状, 只见少量细胞核呈棕黄色;高糖组内皮细胞形态呈多形性, 并有大量内皮细胞细胞核呈棕黄色;GLP-1组呈星形, 卵圆状只见少量棕黄色细胞细胞核;exendin9-39组内皮细胞形态多呈卵圆, 可见大量量细胞核有棕黄色颗粒 (见图1D) 。每张切片在高倍视野下 (×200) 取5个视野, 计数5个视野中每100个细胞中染色阳性的细胞数 (%) , 取其平均数作为各组凋亡率。与对照组相比, 高糖组细胞凋亡明显增加 (P<0.01) ;与高糖组相比, GLP-1组可显著降低高糖诱导细胞凋亡 (P<0.05) , 而exendin9-39组细胞凋亡率与高糖组差异无统计学意义。见图1。
TUNNEL测定兔胸主动脉内皮细胞凋亡:A:对照组只见少量细胞核棕黄色颗粒沉着;B:高糖组可见大量细胞细胞核呈棕黄色;C:GLP-1组棕黄色细胞核减少;D:exendin9-39组可见大量呈棕黄色细胞核, (均×200) ;E:内皮细胞凋亡细胞数占总细胞数相对比分析。1:对照组;2:高糖组;3:GLP-1组;4:exendin9-39组;1) 与对照组比较, P<0.01;2) 与高糖组比较, P<0.01
2.2 BRDU法测GLP-1对高糖下内皮细胞增殖的影响
高糖明显地抑制内皮细胞增殖活性, 与对照组相比, 高糖组内皮细胞增殖水平显著降低 (P<0.01) 。与高糖组相比, GLP-1组内皮细胞增殖水平显著升高;exendin9-39组内皮细胞增殖水平与高糖组相比无明显差别 (P>0.05) 。见图2。
2.3 MTT法检测GLP-1对高糖诱导内皮细胞代谢的影响
高糖抑制内皮细胞代谢活性, 与对照组相比, 高糖组内皮细胞代谢水平显著降低 (P<0.01) 。与高糖组相比, GLP-1组内皮细胞代谢活性显著升高 (P<0.05) , 而exendin9-39组内皮细胞代谢活性与高糖组相比无明显差别 (P>0.05) 。见图3。
1:对照组;2:高糖组;3:GLP-1组;4:exendin9-39组;1) 与对照组比较, P<0.05;2) 与对照组比较, P<0.01;3) 与高糖组比较, P<0.05;4) 与GLP-1组比较, P<0.05
1:对照组;2:高糖组;3:GLP-1组;4:exendin9-39组;1) 与对照组比较, P<0.01;2) 与高糖组比较, P<0.05;3) 与GLP-1组比较, P<0.05
3 讨论
糖尿病所引起的高血糖、脂代谢紊乱、胰岛素拮抗等因素引起的内皮细胞损伤是糖尿病血管病变的始动环节。研究表明持续性的高血糖可引起内皮细胞缺失、血管收缩、局部组织缺血缺氧、血管平滑肌细胞增生, 从而导致糖尿病血管病变的发生[2]。从本实验可以看出, 高糖可以导致血管内皮细胞的凋亡增多, 而增殖减少, 细胞的活性下降。高糖引起的内皮细胞损伤与其引起胞内的氧自由基产物生成增多密切相关[3]。
GLP-1是一种肠道分泌的肽类激素, 有促进胰岛素合成与分泌, 以及增加β细胞的增殖分化与抑制其凋亡的作用, 在维持机体糖代谢稳态中发挥重要作用。近年来, 许多研究发现, 它对心血管也有保护作用。HALBIRK等[4]发现, GLP-1可以改善心力衰竭动物及急性心肌梗死患者的射血分数和左心室功能。它具有提高心肌正性肌力, 促进心肌摄取葡萄糖, 抑制心肌细胞凋亡, 降低缺血/再灌注损伤的作用。而ERDOGDU等[5]发现, GLP-1类似物可以促进心脏的冠状动脉的内皮细胞增殖。但它对糖尿病外周血管的病变是否有保护作用, 尚未有进一步的研究。本研究通过分离兔胸主动脉的内皮细胞进行原代培养发现, GLP-1可以明显地减少高糖引起的血管内皮细胞凋亡, 并改善高糖对血管内皮细胞增殖的抑制作用, 而加入GLP-1的受体拮抗剂, 此作用明显减轻。这说明GLP-1对高糖引起的血管内皮细胞损伤具有保护作用, 而这作用是由其受体介导的。
GLP-1具体的作用机制还不甚明了。虽然GLP-1受体是一种G蛋白耦联受体, 在体内包括心脏、血管、神经等组织均有存在。但现阶段的研究认为, GLP-1的作用有依赖与不依赖GLP-1受体途径两种方式, GLP-1促进血管内皮依赖性扩张与其经非受体方式有关[6]。一些离体的细胞培养实验表明, 单纯的GLP-1受体激动剂对血管内皮细胞的缺血再灌注损伤等并没有保护作用, 存在着另一种非受体介导方式[7]。但GLP-1通过其受体介导, 抑制PKC-α和NADPH等信号转导通路, 减少了TNF-α引起的内皮细胞损伤[8]。本实验表明GLP-1对高糖引起的血管内皮细胞损伤的保护作用与其受体介导有关。当GLP-1与内皮细胞表面的GLP-1受体结合后, 影响了细胞内的PKA和PI3K/Akt等信号传导通路, 可导致细胞的增殖与凋亡发生变化[9,10]。
本实验只是作为研究GLP-1对糖尿病血管病变作用的基础, 具体的GLP-1作用机制, 包括GLP-1受体在此间的作用方式等还有待进一步的研究阐明。
参考文献
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