胰高血糖样肽1（精选5篇）
胰高血糖样肽1 篇1
摘要：糖尿病患者的高糖、高脂状态可直接影响心血管系统, 引起心血管并发症, 且目前的治疗方法不能完全防止血管并发症的发生, 严重危害患者的生命健康。近年来, 随着对胰高血糖素样肽-1 (glucagon-like peptide 1, GLP-1) 越来越深入的研究, 部分药物应用于临床, 研究者们发现GLP-1不仅具有降糖作用, 还可以减轻体重、改善血脂, 达到直接或间接的心血管保护效应。目前GLP-1对心血管的效应愈来愈受到学者们的关注, 本文对GLP-1的心血管保护效应从直接作用, 间接作用, 及临床应用方面进行综述。
关键词：胰高血糖素样肽-1,血管内皮细胞,糖尿病,心血管系统
胰高血糖素样肽-1 (GLP-1) 是一种肠促胰素, 主要由远端小肠和结肠内的L细胞, 在食物的刺激下分泌。GLP-1与受体结合后, 信号通过腺苷酸环化酶和蛋白激酶A进行传递, 发挥多种生物学效应, 例如:促进胰岛素分泌、保护胰岛功能、减肥、改善血管内皮功能等。GLP-1受体不仅在胰岛的α和β细胞上表达, 还广泛表达于胃小凹、小肠黏膜、心、肺及中枢神经系统等[1]。
人们最早发现的GLP-1生物学效应是其促进胰腺的胰岛素分泌, 且呈葡萄糖浓度依赖性。正常人进食后, GLP-1分泌增加, 迅速刺激胰岛素分泌, 有效降低血糖, 当血糖恢复正常时, GLP-1就不再刺激胰岛素分泌。这种葡萄糖浓度依赖性是GLP-1类似物在治疗2型糖尿病方面, 不增加低血糖发生率的原因之一[2]。随着研究的深入, 研究者们发现GLP-1不仅可以促进胰岛素分泌, 同时还可以作用于胰岛α细胞, 在高血糖时抑制胰高血糖素分泌的作用[3], 这种抑制作用也呈葡萄糖浓度依赖性。当血糖浓度下降至正常水平时, GLP-1抑制胰高血糖素分泌的作用也减弱。近年还证实GLP-1可以通过激活蛋白激酶B (PKB) , 抑制糖毒性诱导的β细胞凋亡, 促进β细胞增殖分化[4]。
GLP-1在肝脏、骨骼肌和脂肪组织中的作用主要是合成代谢。大量研究证实, GLP-1可以抑制肝糖原的输出和促进外周组织对葡萄糖的利用, 而且不依赖胰岛素和胰高血糖素的分泌[5]。除了以上的降血糖作用外, GLP-1还对心血管有益处, 包括舒张血管、降压以及内皮细胞保护功能等。
1 GLP-1的心血管保护机制
糖尿病血管并发症是糖尿病致死的主要原因[6], 研究发现GLP-1对心血管的保护效应是通过间接和直接作用改善心血管功能的。
1.1 GLP-1对心血管的间接作用
1.1.1 减轻体重
超重和肥胖是2型糖尿病心血管事件的重要危险因素, GLP-1作为一种厌食信号肽, 可以通过对胃肠道和中枢神经系统的调节达到减少摄食, 减轻体重, 间接提供心血管益处。一方面, 食物进入肠腔后, 刺激肠道的L细胞, 引起GLP-1的释放, GLP-1参与所谓的“回肠制动”效应, 减慢胃蠕动和减缓食物向具有吸收功能的小肠节段运动。另一方面, GLP-1受体在下丘脑外侧核、背内侧核和腹内侧核都有表达, 而这些区域是人体的进食调节中枢, 因此, GLP-1与其受体结合, 可能发挥介导食欲下降的作用。一些研究人员将GLP-1直接注射入啮齿类动物的背内侧核和室旁核以及下丘脑两侧区域, 可以使空腹状态的动物进食量减少, 其减少的程度则与使用药物的剂量有关[7]。Zander等[8]研究显示, 2型糖尿病患者接受GLP-1治疗6周后, 除了可以明显改善血糖水平以外, 体重平均减轻约1.9 kg, 这可能是胃肠道和中枢神经双重调节的结果。一项对胃旁路术后患者的研究发现, 术后空腹或进食后血GLP-1的水平较术前显著升高, 患者的食欲明显下降, 因此推断这类患者食欲的下降可能与GLP-1有关。由于GLP-1对胃蠕动的抑制作用要依靠完整的迷走神经, 当支配胃的迷走神经被切断后, 这种抑制作用将显著减低[9]。因此, 胃旁路术患者中, 血GLP-1水平的升高不仅通过胃动力的变化而抑制食欲, 而且与GLP-1作用于中枢神经系统调节食欲有关, 也就是通过胃肠道和中枢神经双相调节食物的摄取。
1.1.2 降低血糖
现已证实, 高血糖可以诱导血管内皮细胞凋亡, 影响血管内皮功能[10]。长期的高血糖可以诱导线粒体产生过多的超氧阴离子, 从而促进或激活糖氧化、脂肪氧化、体内糖基化蛋白质的氧化等, 这些物质都可以导致机体氧自由基的生成增多, 而氧自由基可以与一氧化氮 (NO) 反应, 使NO灭活, 影响血管内皮舒张功能。同时, 高血糖可以使二脂酰甘油升高, 抑制NO合成酶的活性, 使NO的合成减少, 并能抑制由NO介导的环磷鸟苷生成, 而引起血管舒缩功能的改变。于是, 血糖控制是否良好, 可以直接影响血管内皮的舒张功能和分泌功能。一项人体模型体外实验证实[11], GLP-1类似物能抑制高血糖诱导的1型纤溶酶原激活物抑制物 (PAI-1) 和血管细胞黏附分子-1 (VCAM-1) 的表达。因此, GLP-1对血糖的直接调节作用可以改善血管内皮功能。
1.1.3 降血脂及改善胰岛素抵抗
2型糖尿病患者往往伴有脂代谢紊乱及胰岛素抵抗, 主要表现为三酯甘油 (TG) 和低密度脂蛋白 (LDL) 增高、高密度脂蛋白 (HDL) 降低以及高胰岛素血症。LDL可以抑制NO合成酶产生NO, 产生过氧化自由基, 导致NO失活, 使血管舒缩功能受损, 而HDL的降低对患者冠状动脉的保护作用下降。Viswanathan等[12]证实, 患者使用GLP-1类似物后, 三酯甘油可以降低达26%, C反应蛋白降低达34%[12], 即GLP-1可以改善脂代谢紊乱。在胰岛素抵抗的状态下, 高浓度胰岛素使脂肪细胞膜上受体敏感性下降, 游离脂肪酸增多, NO合成减少, 导致血管内皮功能障碍[13]。研究发现, 肌肉和脂肪组织存在GLP-1受体, 给2型糖尿病患者或切除胰腺的犬皮下注射GLP-1, 可以明显提高其胰岛素的敏感性。在肿瘤坏死因子α诱导的胰岛素抵抗3T3-L1脂肪细胞模型中, GLP-1可通过促进胰岛素介导的葡萄糖摄取来改善胰岛素抵抗, 磷酸化胰岛素受体β、胰岛素受体底物和糖原合酶激酶3β等因子可能参与其中[14]。因此, GLP-1可以通过改善脂代谢紊乱和胰岛素抵抗, 合成NO增加, 间接改善血管舒缩功能。
1.2 GLP-1对心血管的直接作用
1.2.1 改善内皮细胞功能
GLP-1不仅可以通过作用于心血管的相关危险因素间接改善内皮细胞功能, 还能直接作用于内皮细胞改善内皮细胞功能。血管内皮细胞损伤及功能异常是糖尿病大血管病变的重要因素之一, 并且与胰岛素抵抗和高血糖关系密切[15]。高血糖生成的糖基化终产物 (AGEs) 、高胰岛素血症、高脂血症、脂质过氧化等均可以导致内皮细胞损伤, 这种损伤会启动或加速血管病变。因此, 2型糖尿病患者, 在长期高血糖和 (或) 高胰岛素血症的环境下, 体内NO活性降低、糖基化终产物增多、血黏度增加, 引起血管内皮功能异常, 最终会导致血栓形成。GLP-1可以活化腺苷酸激酶脂肪酸活化酶 (AKT) [16], 通过AKT刺激内皮细胞的NO合成酶, 减少氧化应激, 直接改善异常的血管内皮功能。Nystrom等[17]已经证实, 冠状动脉的内皮细胞有GLP-1受体的表达, 在患有冠状动脉疾病的2型糖尿病患者中, 使用GLP-1可以使内皮功能障碍得到改善。
1.2.2 抗内皮细胞凋亡
磷酸肌醇激酶3 (phosphatidylinositol3-kinase, PI3K) 途径可以诱导抗细胞凋亡的信号途径。PI3K通路的激活可以引起细胞增殖、迁移、存活及血管生成。目前已经证实GLP-1可以通过PI3K信号途径抗细胞凋亡[18], 因此GLP-1对内皮细胞的凋亡可能有直接抑制作用。
2 GLP-1对心血管效应的临床研究
目前公认的GLP-1对心血管的直接效应主要包括:提高心肌正性肌力、促进心肌葡萄糖摄取、降低缺血再灌注损伤以及舒张血管等。在心肌缺血的动物模型中, GLP-1通过GLP-1受体通路对心肌起保护作用, 包括依赖c AMP信号通路, PI3K和MAPK诱导的抗细胞凋亡信号通路[19]。GLP-1可以通过PI3K和MAPK途径诱导抗细胞凋亡的信号途径。因此, 研究者们认为GLP-1对心肌梗死后和左心功能障碍有显著的改善。Sonne等[20]研究表明, GLP-1受体激动剂能有效减小梗死面积, 而这种作用能被GLP-1受体抑制剂消除, 相反, GLP-1 (9-36) 对减少梗死面积无益, 但和GLP-1受体激动剂一样, 对心肌细胞有相似的变力作用。
人们对10例心肌梗死后血管成形术患者应用GLP-1时发现, 术后使用GLP-1持续静脉输注72 h, 可提高左心室射血分数和局部室壁运动, 院内死亡率比对照组明显降低, 住院时间也较对照组减少[21]。Thrainsdottir等[22]实验证实, GLP-1可改善慢性充血性心力衰竭患者的心脏功能。Ban等[23]也证实, 在野生型大鼠中, GLP-1还可以与其受体结合诱导变力作用, 改善心肌细胞葡萄糖摄取和左室舒张压, 改善心肌细胞缺血再灌注损伤后的心脏功能和肌细胞活力。相反, GLP-1的代谢产物却没有变力作用, 只能通过GLP-1非受体依赖途径, 如NO/c GMP依赖途径, 诱导适当的葡萄糖摄取和一定的心脏功能和血管舒张功能的恢复。
在多项GLP-1类似物应用的观察中, 人们发现使用GLP-1类似物, 可以降低糖尿病个体的血压2.50~6.58 mm Hg不等[24,25], 于是有学说提出GLP-1有直接舒张血管的功能。Ozyazgan等[26]发现, 对糖尿病大鼠经腹腔分别注射GLP-1和exendin-4, 可以使损坏的血管张力得到改善。Thomas等[27]研究发现, GLP-1具有舒张大鼠股动脉环的作用, 这可能与GLP-1直接扩张血管的作用有关, 而与内皮细胞释放的NO等因子和内皮细胞无直接依赖作用。因此, GLP-1对血管的舒张作用是直接的扩血管作用, 还是通过内皮细胞的作用, 或是两者兼而有之, 现在还无法定论。
3 总结
目前研究者们普遍认为, GLP-1的心血管保护效应是综合作用的结果, 它不仅可以通过改善心血管系统的相关危险因素, 如降糖、调脂、减重、抑制食欲等, 还能直接作用于内皮细胞, 发挥保护效应。虽然GLP-1类似物已经开始临床应用, 但是其对心血管系统发挥保护效应的具体机制现在还未完全明确, 学者们也正积极致力于这方面的研究, 只有在了解了GLP-1对心血管系统发挥保护效应的机制, 才能更好地指导合理应用GLP-1相关药物, 使糖尿病患者的心血管获得全面益处, 为减少糖尿病血管并发症提供可能。
胰高血糖样肽1 篇2
表达人胰高血糖素样肽前药工程菌遗传稳定性
通过传代培养的方法,研究高表达重组人胰高血糖素样肽前药(Pro-rhGLPs)的工程菌E.coli BL21(DE3)/pET41a(+)-hGLPs的遗传稳定性,观察菌体和菌落形态,比较在有无选择压力下的质粒稳定性,酶切和测序鉴定重组基因片断的正确性,SDS-PAGE电泳证实重组蛋白质的`表达量的稳定性,在C57BL/6小鼠上进行葡萄糖耐量实验检测重组蛋白生物学活性.结果显示:此工程菌连续传代过程中,保持大肠杆菌的典型特征,各代质粒的酶切鉴定和测序正确,重组蛋白表达水平及生物活性也无显著差异.因此,工程菌E.coli BL21(DE3)/pET41a(+)-hGLPs具有良好的遗传稳定性.
作 者：周颖 马雪 侯征 薛小燕 陈瑛瑛 罗晓星 ZHOU Ying MA Xue HOU Zheng XUE Xiao-yan CHEN Ying-ying LUO Xiao-xing 作者单位：第四军医大学,药学系药理学教研室,西安,710032 刊 名：生物加工过程 ISTIC英文刊名：CHINESE JOURNAL OF BIOPROCESS ENGINEERING 年，卷(期)： 8(2) 分类号：Q78 关键词：人胰高血糖素样肽 遗传稳定性 前药 hGLP-1 genetic stability prodrug胰高血糖样肽1 篇3
1 胰高血糖素样肽-1及其类似物简介
1.1 胰高血糖素-1
胰高血糖素样肽-1 (GLP-1) 又称为肠促胰岛素, 胰升血糖素样肽-1, 类胰升血糖素-1。是一种主要由分布于结肠和直肠的肠道L细胞分泌的含30个氨基酸的多肽类物质[1,2], 通过与胰高血糖素样-1受体 (GLP-1R) 结合而发挥作用, 如促进胰岛素的合成和分泌、促进胰岛β细胞增殖和新生、抑制胰高血糖素分泌、减少食物摄取、能延缓胃排空、以及增强外周组织的葡萄糖利用和减少肝糖输出等[3]。临床上已用于成年人2型糖尿病 (DM-2) 的治疗。但是GLP-1在人体内半衰期短, 仅1~2 min即被二肽酶 (DPP-Ⅳ) 快速降解而失去活性[4,5], 使得其生物学效应受到很大限制。
1.2 利拉鲁肽
利拉鲁肽 (Liraglutide) 是人工合成的GLP-1长效类似物, 是通过基因重组技术将GLP-1第34位的赖氨酸替换为缬氨酸, 第26位增加一条棕榈酰脂肪酸侧链而形成。经证实, 利拉鲁肽与人的GLP-1具有97%同源性[6], 具有GLP-1的各种生理作用, 且半衰期长达13 h[5]。在欧洲, 美国及我国已批准上市, 用于成年人DM-2的治疗。近年来, 研究表明利拉鲁肽不仅具有降糖作用, 还可通过血脑屏障[7,8,9], 与GLP-1R结合发挥脑保护作用。目前, 国内外已有利拉鲁肽脑保护作用的临床前期研究。
1.3 Exendin-4
Exendin-4是Eng和Raufman从一种美洲毒蜥蜴的唾液中分离得到GLP-1的类似物, 亲和力和生理活性都远大于GLP-1, 它的氨基酸残基与哺乳动物GLP-1序列有52%的同源性[10], 在于N端第2位的甘氨酸 (Gly) 可抵抗血液中二肽基肽酶 (DPP-Ⅳ) 的降解作用, 入血后的半衰期较长约2.4 h。研究表明, Exendin-4是一种强效GLP-1受体激动剂。临床上也已用于DM-2的治疗。
2 GLP-1及其类似物的神经保护特性
近年来, 研究发现除了肠道分泌GLP-1外, 大脑中也产生少量的GLP-1, 尤其是孤束核、后极区、脑干尾部[11,12,13,14,15,16]。且GLP-1R不仅存在于胰岛细胞中, 在肾脏、心脏、胃、肺和周围及中枢神经系统区域等都有表达[17]。在中枢神经系统, GLP-1 R表达于下丘脑, 海马, 皮层及小脑[16,18]。已有研究证实GLP-1及其类似物利拉鲁肽, Exendin-4都可以通过血脑屏障[9,19], 促进神经细胞生长、增值、修复及抑制凋亡、减轻炎症反应[20]。另外, GLP-1及其类似物可以改善记忆和大脑中的突触可塑性[21], 增加脑血流量和提高认知能力[22]。因此GLP-1及其类似物的神经保护作用是它们极有可能成为治疗中枢神经系统疾病的新型药物。
3 GLP-1及其类似物的抗炎作用
事实上, GLP-1及其类似物不仅具有神经保护作用, 还具有抗炎效应。研究表明, 活化的星形细胞和小胶质细胞参与免疫, 炎症反应, 诱导GLP-1受体的表达。GLP-1治疗可以预防内毒素诱导星形细胞和小胶质细胞释放细胞因子白介素-1 (IL-β) , 而IL-β能促进炎症反应, 增强凋亡相关信号及减慢神经元的传导[23]。Exendin-4在动脉粥样硬化的炎症反应中能减少大动脉血管内皮的单核细胞黏附, 而且能够预防由LPS诱导的细胞因子和趋化因子的释放[24], 增加微血管的通透性。另外, 有研究表明在大脑的慢性炎症中, 利拉鲁肽除了可以减少大脑皮层、海马齿状回活化的小胶质细胞、大脑皮层的星形胶质细胞外, 还可减少促炎因子IL-β、IL-12p70、IL-6, 以及亚硝酸盐的含量[20]。这就表明GLP-1及其类似物可以用于治疗神经系统疾病的炎症反应。
4 GLP-1及其类似物脑保护作用的应用
4.1 阿尔兹海默病
阿尔兹海默病 (Alzheimer disease, AD) 是最常见的痴呆类型, 又称为老年性痴呆, 是一种具有年龄相关性的以记忆力损害和进行性的认知障碍为主的中枢神经系统退行性病变的疾病[25,26]。严重威胁着老年人的健康, 也为社会经济带来巨大负担。目前认为DM-2是阿尔兹海默病的危险因素, AD患者也可能发展为DM-2, 这两者之间存在着一些相同的病理生理学特征, 比如在AD患者的大脑灰质中有淀粉样蛋白-β (Aβ) 过量集聚, 而在DM-2患者的胰腺中有淀粉样蛋白 (IAPP) 沉积, 过早的细胞变性被认为是这两种疾病的共同特征[22]。最近, 对胰岛素受体、胰岛素受体底物蛋白-1 (IRS-1) 的信号途径的研究表明, AD的一些病理的特征和认知缺陷可能是由于大脑的胰岛素抵抗所造成, 这种胰岛素抵抗可能是由于Aβ沉积引起小胶质细胞释放细胞因子抑制IRS-1的丝氨酸而形成[27]。因此, 降糖新药GLP-1及其类似物Liraglutide及Exendin-4等用于AD的治疗逐渐被人们所重视。最近的研究表明在阿尔茨海默病的APP/PS1的小鼠模型上, 利拉鲁肽可通过血脑屏障, 防止损害记忆的形成和突触可塑性, 增加轴突数量, 减少淀粉样蛋白斑块负荷, 提高齿状回的神经祖细胞的增殖和神经细胞的发生[28], 减少氧化应激和大脑的炎症反应[8], 利拉鲁肽不仅能在阿尔兹海默病发展的早期发挥预防作用。在阿尔兹海默病晚期也有恢复效应[29]。Exendin-4也被证实在AD的转基因小鼠模型上有一系列神经保护效应[30], 它能够减少小鼠大脑中的内源性Aβ的水平, 还能够剂量依赖性的保护Aβ诱导的细胞凋亡[31]。Exendin-4与GLP-1受体结合后, 还能激活腺苷酸环化酶 (AC) , 从而催化ATP生成c AMP, 提高胞内c AMP水平, 触发Ca2+内流, 增加神经递质的释放, 加快神经兴奋性传导, 增强学习、记忆和认知能力。总而言之GLP-1类似物促进突触形成, 神经发生, 细胞修复, 减轻炎症反应, 以及减少大脑中淀粉样斑块的作用使之能成为治疗AD的新型药物。
4.2 帕金森病
帕金森病 (idiopathic Parkinson’s disease, PD) 是一种以静止震颤、肌张力增高、动作迟缓及减少、姿势不稳为主要特征的锥体外系运动功能障碍性疾病。是中老年人常见的神经系统变性疾病, 也是中老年人最常见的锥体外系疾病。PD的主要病理特征为选择性黑质致密区多巴胺 (DA) 神经元丢失, 而经研究证实, 在PD的动物模型中, Exendin-4使合成多巴胺的相关酶类表达增加, 保护多巴胺能神经元和预防基底神经节的多巴胺丢失[32], 如:在6-羟基多巴胺 (6-OHDA) 和内毒素 (LPS) 构建的PD大鼠模型上, Exendin-4可以减少苯丙胺诱导的大鼠旋转行为, 增加基底神经节的多巴胺水平, 减少多巴胺能神经元的损伤[33];在1-甲基-4-苯基-1, 2, 3, 6-四氢吡啶 (MPTP) 诱导的PD小鼠模型上, Exendin-4可以通过抑制黑质纹状体小胶质细胞的过度活化, 基质蛋白酶-3 (MMP-3) 的表达来保护多巴胺能神经元[34]。另外, Exendin-4还能减少炎症因子如TNF-α、IL-1β的释放, 减少多巴胺能神经元的损伤。也有研究表明, Exendin-4促进PD小鼠大脑侧脑室室管膜下层的神经干细胞增生[35]。基于这些临床前期研究, GLP-1类似物极有可能为PD患者带来福音。
4.3 脑卒中、脑缺血
脑卒中 (Stroke) 又称脑中风, 是一种突然起病的脑血液循环障碍性疾病。又称为脑血管意外。是指在脑血管疾病的患者, 因各种诱发因素引起脑内动脉狭窄, 闭塞或破裂, 而造成急性脑血液循环障碍, 临床上表现为一过性或永久性脑功能障碍的症状和体征。GLP-1类似物的抗炎效应和神经保护效应使它们有望成为治疗脑卒中的新型药物。在Wistar大鼠的脑卒中模型, Wistar大鼠经过90 min的大脑中动脉血流阻断, 再经恢复血流1 h后, 随机分为利拉鲁肽治疗组, 生理盐水治疗组。治疗24 h后评估发现利拉鲁肽治疗组与生理盐水治疗组相比外周学血糖水平并无明显差异。利拉鲁肽治疗组大鼠的行为评分比生理盐水组大大提高, 脑梗死面积减少, 活性氧代谢产物的诱导水平降低, 大脑皮层的血管内皮生长因子 (VEGF) 增加。这表明了利拉鲁肽可以通过抗氧化应激和上调VEGF对脑卒中发挥神经保护效应[36]。在Stroke的大鼠模型中, Exendin-4也被证明能减少大脑的梗死面积、改善行为障碍[34], 减少脑缺血再灌注诱导的神经元死亡、氧化应激、小胶质细胞活化后的炎症反应[37]。此外, 在暂时性脑缺血 (transient cerebral ischemia) 的沙土鼠模型上, 可观察到Exendin-4治疗后, 海马CA1区GLP-1 R表达增加。这些临床前期研究表明, GLP-1类似物能有效的治疗脑卒中, 脑缺血。
5 展望
临床前实验表明, GLP-1类似物利拉鲁肽、艾塞那肽除具有降糖作用外, 还具有一系列神经保护特性和抗炎特性, 且因其降糖作用呈葡萄糖依赖性, 很少发生低血糖事件, 胃肠道反应也较轻微。因此, GLP1类似物很有可能为神经系统退行性疾病的治疗开辟新的道路, 目前其对于AD和PD的治疗已进入临床实验阶段。但是其作用机制未完全清楚, 还需要大量的临床研究和实验数据的支持。
摘要：胰高血糖样肽1是一种肠促胰岛素, 它通过促进胰岛素的释放, 抑制胰高血糖素分泌、胰岛β细胞增殖、延缓胃排空等多种途径发挥降糖作用。在临床上胰高血糖素样肽1及其类似物已用于2型糖尿病的治疗。近年来, 研究发现胰高血糖样肽1受体不仅分布于胰腺中, 在人和动物的脑中也有广泛分布, 胰高血糖样肽1及其类似物具有脑保护作用, 预示着他们有可能成为治疗中枢神经系统疾病的新型药物。
胰高血糖样肽1 篇4
从天然资源中提取GLP-2成本高、得率低、工序繁琐, 而化学合成的价格又相当昂贵[3], 半衰期较短, 难以应用于临床, 因此利用基因工程技术生产GLP-2具有重要意义。研究选用巴斯德毕赤酵母 (P.pastoris) 系统表达GLP-2, 目的在于利用毕赤酵母表达系统的特点和方法获得高表达量的GLP-2, 为今后其在临床上的应用提供理论基础[4]。
1 材料
1.1 菌株和质粒
大肠杆菌 (E.coli) DH5α、P.pastoris受体菌 X-33 (His-/Mut+) 、表达载体PpICZaC, 均由华南农业大学兽医学院传染病教研室保存。
1.2 主要试剂
XhoⅠ、XbaⅠ、Sac Ⅰ、三羟甲基氨基甘氨酸 (Tricine) 、T4 DNA连接酶等, TaKaRa公司生产; Tryptone、Yeast Extract, Oxoid公司生产; ZeocinTM, Invitrogen公司生产; Tricin-SDS-PAGE超低分子质量Marker, 北京索莱宝公司生产, 其他产品均为进口或国产分析纯。
2 方法
2.1 GLP-2基因设计与合成
根据猪GLP-2氨基酸序列 (登录号为NP-999489) 分析其生物活性和人工定点突变位点, 选用毕赤酵母偏好密码子[5], 利用DNAStar、Primer Premier 5.0 软件设计合成GLP-2基因, 同时设计上游和下游引物, 引物由上海英俊生物技术有限公司合成。将合成的GLP-2基因序列菌株命名为pMD18-T-GLP-2, 序列为5′-CACGGTGACGGTTCCTTCTCCGACGAGATGAATACTGTTTTGGACAACTTGGCTACTAGAGACTTCATCAACTGGTTGTTGCACACTAAGATCACTGAC-3′ (斜体部分是丙氨酸变成甘氨酸) 。 GLP-2-P1 5′-CCCTCAGGAAGAGACACGGTGACGGTTCCTTCT-3′, GLP-2-P2 5′-GCTCTAGATCAGTCAGTGATCTTAGTGTGCAACAAC -3′ (斜体部分为识别序列及Kex2蛋白酶裂解位点) 。
2.2 GLP-2基因重组酵母载体的构建
反应体系 (50 μL) :10×PCR Buffer 5 μL, 10 mmol/L dNTPs 4 μL, rTaq 0.5 μL, GLP-2-P1、GLP-2-P2各1 μL, pMD18-T-GLP-2菌液3 μL, ddH2O 35.5 μL。
PCR反应条件:94 ℃预变性4 min; 94 ℃变性20 s, 56.5 ℃退火20 s, 72 ℃延伸30 s, 共30个循环;72 ℃延伸10 min。
取PCR产物8 μL, 经1.5%琼脂糖凝胶电泳, 凝胶成像系统可观察到1条长度约为124 bp的条带, 并记录拍照。PCR产物纯化之后与表达载体PpICZaC 均用XhoⅠ、XbaⅠ双酶切, T4 DNA连接酶连接, 连接产物转化E.coli DH5α, 重组表达质粒进行 PCR鉴定。阳性质粒送 Invitrogen 上海分公司测序, 以确定序列及阅读框的正确性, 将构建正确的重组表达质粒命名为PpICZaC-GLP-2 [6]。
2.3 重组载体转化P.pastoris受体菌X-33的鉴定和筛选
将80 μL感受态 P.pastoris受体菌X-33 (His-/Mut+) 与5 μg Sac Ⅰ线性化PpICZaC-GLP-2混合, 转移至预冷的 0.2 cm 电转杯 (Bio-Rad) 中, 置冰上 5 min, 1.5 kV、25 μF、200 Ω电击, 立即加入预冷的 1 mol/L 山梨醇1 mL, 轻轻混匀后转入5 mL的培养管中。 30 ℃ 静止培养1 h后加入1 mL YPD液体, 30 ℃振荡培养45 min, 离心收集菌体, 取150 μL 涂布于 YPDS 平板上, 30 ℃培养至单个菌落出现。详细步骤参照 Pichia Expression Kit。采用 PCR 方法分析P.pastoris转化子, 用煮—冻—煮法[7]制备 PCR 模板, 以 P1、P2为引物, 反应体系和PCR 反应条件同2.2, 以能扩增出长度为 124 bp 的克隆确定为阳性转化子。再经不同浓度的ZeocinTM筛选出高拷贝克隆用于蛋白表达。
2.4 重组P.pastoris诱导表达
用灭菌牙签挑取具有ZeocinTM抗性的单个菌落, 于40 mL的BMGY液体培养基中进行激活培养, 30 ℃、220 r/min振荡过夜。OD600值为2～6[8]时, 此时细胞处于对数生长期, 4 000 r/min离心4 min, 收集培养沉淀, 重悬于4 mL的BMMY液体培养基中继续培养, 培养期间每隔24 h左右加100%的甲醇至终浓度为1%时进行诱导表达。96 h后, 4 000 r/min离心4 min, 收集培养上清液。用100%TCA沉淀上清液, 冰浴0.5 h以上 (过夜效果更佳) , 12 000 r/min离心12 min, 收集沉淀, 溶解于100 μL的PBS液中。以Tricine-SDS-PAGE 分析表达产物。
2.5 重组表达GLP-2的 Tricine-SDS-PAGE鉴定
参照参考文献[9]进行。
2.6 重组表达GLP-2的蛋白测定
用DNA/RNA微量定量仪测定蛋白浓度。
3 结果与分析
3.1 GLP-2基因设计
GLP-2-P1 5′-CCCTCAGG AAGAGACACGGTGACGGTTCCTTCT-3′ (下划线部分分别为XhoⅠ识别序列及Kex2蛋白酶裂解位点) , GLP-2-P2 5′-GCTCTAGA TCAGTCAGTGATCTTAGTGTGCAACAAC -3′ (下划线部分分别为XbaⅠ识别序列及终止密码子) , GLP-2氨基酸序列为HG (A) DGSFTSDINKVLDTIAAKEFLNWLISTKVTE。所合成的GLP-2基因长124 bp, 包括33个氨基酸的编码序列、1个终止密码子和保护性碱基。基因的5′端有XhoⅠ识别序列, 3′端有XbaⅠ识别序列, 并在基因的N端加了P.pastoris Kex2蛋白酶裂解位点。为了更好地延长GLP-2的半衰期, 将丙氨酸 (GCT) 变成甘氨酸 (GGT) [10]。
3.2 基因克隆
以pMD18-T-GLP-2质粒为模板, GLP-2-P1和 GLP-2-P2为引物进行PCR扩增, 扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳, 凝胶成像系统可观察到1条长度约为124 bp的条带 (见图1) 。
M.DL-2 000 Marker;1, 2.pMD18-T-GLP-2质粒的PCR扩增产物;3.阴性对照。
3.3 基因表达载体的构建和鉴定
将GLP-2基因定向插入酵母表达载体PpICZaC中, 酶切位点缺失鉴定 (用EcoRⅠ进行酶切鉴定, 正确插入酵母表达载体的重组质粒多克隆位点缺失) 。以GLP-2-P1和GLP-2-P2为引物进行PCR扩增, 扩增产物经 1.5%琼脂糖凝胶电泳, 凝胶成像系统下观察到1条长度约为124 bp的条带 (见图2) , 并送检测序。试验结果表明, GLP-2基因大小为124 bp, 与理论值一致, 并成功插入表达载体。
1.重组质粒的PCR扩增产物;M.DL-2 000 Marker。2.PpICZaC空载体的PCR扩增产物;3.阴性对照。
3.4 GLP-2蛋白的表达鉴定
重组GLP-2的相对分子质量为 3.9 ku。理论上, 分子质量低于 15 ku 的多肽在常规三羟甲基氨基甲烷 (Tris) -甘氨酸电泳系统中难以得到理想的电泳分辨率。因此, 使用Tricine代替甘氨酸作为终止离子, 提高了交联度和凝胶浓度, 并加入了适量的尿素, 使重组GLP-2 得到了较好的分辨率及带型。试验结果表明:分子质量为3.9 ku (见图3) 的GLP-2获得分泌表达, 而阴性对照的相应部分没有出现相应的条带, 说明该蛋白获得表达。
1.PpICZaC 空载体表达上清液;M.超低分子蛋白质量标准;2.PpICZaC-GLP-2载体表达上清液。
4 讨论
设计GLP-2时, 在N端引入Kex2裂解位点, 以保证其具有天然的N端;以解决翻译后不能酰胺化修饰的问题。在C端引入终止密码子, 以保证及时终止目的基因的翻译和使其具有天然的C端。同时在设计酶切位点时, 应注意阅读框, 以防目的基因错配导致乱码, 致使目的基因表达失败[11]。
P.pastoris作为较常见的外源基因真核表达系统具有较高的表达量, 酵母菌具有比大肠杆菌等其他表达系统更完备的基因表达调控机制和对表达产物的加工修饰及分泌能力。同时, 与原核生物相类似, 真核生物在密码子的选择上也具有偏爱性, 适合高密度发酵。P.pastoris中存在过氧化物酶, 表达的蛋白贮存其中, 可免受蛋白酶的降解, 而且可以减少对细胞的毒害作用。目前, 已经有240多种蛋白在P.pastoris中成功表达, 如人源抗菌肽、猪表皮生长因子等。PpICZaC作为一种诱导的分泌型载体, 可以将表达的蛋白分泌到培养基中。因此, 试验将GLP-2基因克隆到PpICZaC载体中, 通过合理的N 端设计及优化的毕赤酵母偏嗜密码子, 使其表达的GLP-2在忠实的设计情况下, 运用PpICZaC所携带的ZeocinTM抗性进行目的基因高拷贝筛选。但由于GLP-2的分子质量较小, 用Tricine-SDS-PAGE进行鉴定使得目的蛋白具有较好的分辨率。目前, 市场上还没有相应的GLP-2商品化的抗体, 体外的生物活性暂时无法检测, 还有待在以后的试验中进一步完善。
试验在改造GLP-2基因的基础上, 采用受体菌株X-33 (His-/Mut+) 和诱导表达载体PpICZaC, 成功地表达了GLP-2, 对动物试验和促生长机理[12]等研究具有较重要的意义, 也将为开发新型绿色饲料添加剂和工业化生产提供理论依据。
参考文献
[1]HEER J D, PEDERSEN J.The alpha cell expresses glucagon-likepeptide-2 receptors and glucagon-like peptide-2 stimulates glu-cagon secretion from the rat pancreas[J].Diabetologia, 2007, 50:2135-2142.
[2]王丽娜, 陈杰, 赵茹茜, 等.胰高血糖素样肽-2及其受体与胃肠道的发育[J].畜牧与兽医, 2006, 38 (1) :55-57.
[3]蒋荣川, 贾刚, 王康宁, 等.胰高血糖素样肽-2对体外培养的断奶仔猪小肠黏膜-上皮细胞形态、增殖及其酶活力的影响[J].动物营养学报, 2008, 20 (6) :699-704.
[4]TIANRU J.Mechanisms underlying proglucagon gene expression[J].Endocrinology, 2008, 15 (9) :17-28.
[5]赵翔, 霍克克, 李育阳, 等.毕赤酵母的密码子的用法分析[J].生物工程学报, 2000, 16 (3) :308-310.
[6]萨姆布鲁克J, 弗里奇E F.分子克隆实验指南[M].金冬燕, 黎盂枫, 译.2版.北京:科学出版社, 1987.
[7]剧海, 梁东春, 郭刚, 等.用于PCR实验的毕赤酵母基因组DNA制备方法的比较[J].天津医药, 2003 (23) :270-272.
[8]KIEN C L, RUTH B.Cecal infusion of butyrate increases intestinalcell proliferation in piglets[J].J Nutr, 2007, 137:916-922.
[9]SCHAGGER H, VonJAGOW G.Tricine-sodium dodecylsulfatepoly—acrylamide gelelectrophorsis for the separation of proteins in therange from l to 100 ku[J].Anal Biochem, 1987, 166 (2) :368-379.
[10]BURRIN D G, PETERSEN Y, STOLL B, et al.Glucagon-like pep-tide 2:a nutrient-responsive gut growth factor[J].Nutr Sci, 2001, 131 (3) :709-712.
[11]ALISON H, ROBERT A.Increased expression of specific intestinalamino acid and peptide transporter mRNA in rats fed by TPN is re-versed by GLP-21[J].Nutrient-Gene Interactions, 2006, 134 (8) :2957-2964.
胰高血糖样肽1 篇5
1 生理作用特点
GLP-1主要由肠道L细胞合成其分泌30个氨基酸多肽, 生理作用相当广泛。
1.1 GLP-1的胰腺内作用
① GLP-1促进胰腺的胰岛素分泌, 该作用呈葡萄糖依赖性。当周围葡萄糖水平降低时, 其促胰岛素分泌作用也变弱。GLP-1的这种特性使其在联合使用其他降糖药物时并不增加低血糖的发生率[1]。其促胰岛素分泌的机制是结合胰岛B细胞G蛋白偶联受体, 使B细胞内cAMP浓度升高, 增加细胞内钙内流, 从而增强胰岛素的出胞作用[2]。②GLP-1促进胰岛素原基因表达和胰岛素的生物合成并抑制胰高血糖素的产生。③GLP-1可以刺激胰腺导管上皮细胞来源的B细胞增殖和新生[3]。④GLP-1可以抑制B细胞凋亡[4]。
1.2 GLP-1的胰腺外作用
除了胰腺, GLP-1受体广泛分布于各种组织和器官如肺、脑、下丘脑、心血管系统、肾脏、胃和小肠等。尽管许多研究表明肝脏、肌肉、和脂肪组织中的GLP-1受体不同于其他组织中GLP-1受体, 但人们也证实了这些组织中GLP-1与受体结合并发挥作用。GLP-1受体在全身广泛分布决定了其具有多种生物学作用。
1.2.1 GLP-1的胰腺外降糖作用
大量研究证实GLP-1可以促进肝糖原合成[5], 抑制肝糖输出和促进外周组织葡萄糖利用, 并且该作用不依赖于胰岛素和胰高血糖素的分泌[6]。关于GLP-1对脂肪细胞的作用存在一定分歧。有学者认为GLP-1可以直接促进葡萄糖的摄取并增加脂肪合成和分解[7]。虽然体内外实验均证实了GLP-1对胰腺外组织葡萄糖代谢的影响, 但也有很多研究得到了不一致的结果。这些实验提示, GLP-1在外周的降糖作用可能通过其促进胰岛素分泌和抑制胰高糖素释放来实现[8]。因此, 目前关于GLP-1在周围组织中是否直接影响葡萄糖利用从而降低机体血糖水平还存在争议, 需要进一步研究。
1.2.2 GLP-1对心血管系统的作用
在用大鼠进行的实验时发现GLP-1可以舒张血管、降低血压、改善内皮功能并保护其心肾功能[9]。对局部缺血心肌的在体和离体试验证实GLP-1可以增强缺血心肌的左室功能恢复, 增加心肌葡萄糖摄取。
1.2.3 GLP-1对其他胰腺外组织的作用
GLP-1具有抑制胃酸和胃排空、降低食欲及神经保护功能外, 几项研究表明GLP-1可以激活垂体前叶激素分泌, 刺激促甲状腺 (TSH) 释放, 促进黄体生成素、释放激素 (LHRH) 分泌。GLP-1对血浆促肾上皮质腺素 (ACTH) 水平和降钙素释放也起促进作用。研究发现体外注射GLP-1可以抑制黏液分泌, 舒张肺动脉并促进Ⅱ型肺泡细胞上表面活性物质的释放[10]。
2 GLP-1相关新药
2.1 GLP-1受体竞争物
基于GLP-1的上述生物活性, GLP-1在糖尿病治疗领域应该具有广阔的应用前景。但是, 人体天然的GLP-1很不稳定, 可被二肽基肽酶Ⅳ (DPP-Ⅳ) 降解, 半衰期仅为一二分钟。目前已经设计研发出长效抗降解的人GLP-1的类似物。exenatide-4与人类天然GLP-1在序列上有50%的同源性, 通过激活GLP-1受体 (GLP-1R) 发挥作用。对T2DM动物模型的研究表明, exenatide-4通过促进β细胞增殖和新生, 抑制B细胞凋亡, 可提升B细胞质量, 使血糖浓度恢复正常水平[11]。研究还表明exenatide-4可提升T2DM患者的代谢调控能力[12], 降低空腹和餐后血糖, 减少HbA1c和FFA, 引起饱感和减轻体重。Liraglutide是在GLP-1的赖氨酸残基上加上16碳的酰基链, 34位赖氨酸由精氨酸取代, 从而在血浆中与白蛋白结合, 缓慢释放。研究显示Liraglutide明显降低HbAlc水平, 有效控制T2DM患者血糖水平, 减轻体重, 而且没有低血糖风险[13]。Liraglutide治疗可诱导心脏保护性基因的表达, 保护心肌梗死模型鼠的心肌细胞, 提高其存活率以及改善心功能。这些GLP-1类似物不被DPP-Ⅳ降解, 在保留生理活性的同时延长作用时间, 但也面临着不少问题需要解决:GLP-1类似物是注射用的药物, 容易造成患者使用不便;分泌GLP-1的L细胞主要分布在空肠末端、回肠和结肠, 而糖、脂肪、蛋白质的消化产物大部分在十二指肠和空肠被吸收, 当到达回肠时通常已吸收完毕;由于抑制胃肠道蠕动, 会有胃肠道的不良反应;通过下丘脑来抑制食欲, 也会产生一些不良反应;此外, 在上市之初可能会价格偏高, 也限制了它的应用。
2.2 DPP-Ⅳ抑制剂
由于DPP-Ⅳ是降解GLP-1的主要酶, 所以应用DPP-Ⅳ特异抑制剂可显著降低循环DPP-Ⅳ的活性, 延长GLP-1的作用时间并伴随餐后完整GLP-1的增加[14]。DPP-Ⅳ抑制剂的许多生物活性与GLP-1R竞争剂类似, 包括增加胰岛素分泌, 减少胰升血糖素分泌, 通过增加B细胞增殖和抑制B细胞凋亡而提升β细胞质量。临床试验显示, 磷酸西他列汀对控制空腹和餐后高血糖作用明显, 并且HbA1c的降低具有显著的临床意义[14]。Vildaglaptin (商品名Galvus) 目前正处于常规审查中。
2.3 GLP-1融合蛋白
GLP-1融合蛋白是由GLP-1和其他蛋白组成的共价结合物, 目前已有多种用于临床前和临床研究。Albugon是将人清蛋白基因和GLP-1基因共价结合后的产物, 模拟激活GLP-1R途径发挥作用, 调节饱感、胃肠蠕动和糖平衡[15]。
2.4 GLP-1/IgG-Fc融合蛋白
由人活性GLP-1 (或exenatide-4) 和人IgG2恒定区重链 (IgG-Fc) 共价结合而成, 具有克服GLP-1半衰期短的缺点、增强了多肽效能、易于纯化等优点。目前正在研制中[16,17]。
综上所述, GLP-1不但从多途径改善糖代谢, 保护B细胞, 在降低血糖的同时还能减轻体重, 并对多项心血管危险因素有保护作用。目前与GLP-1相关的新药已进入临床实验阶段, 为T2DM的治疗带来了新的希望。