16SrRNA（通用4篇）
16SrRNA 篇1
嗜盐微生物属于极端环境微生物,通常生长于盐湖、盐碱湖、盐场和海洋中, 近年来,从我国青海省大柴旦盐湖、新疆艾丁湖、塘沽盐场、青岛东风盐场等地不断分离出嗜盐菌新种。嗜盐菌是很重要的生物资源,有广泛的应用前景。耐盐红螺菌的代谢产物对水产养殖动物病害细菌分离株有抑制作用,鲍建国等分离出耐高盐菌作用于废水的降解[1]。郭建博从海底污泥中分离得到一株降解偶氮染料的耐盐新菌株同时该菌株对13种不同结构的染料具有脱色作用[2]。
舟山位于我国东南沿海,中国大陆海岸线的中心,地理坐标为东经121°30′～123°25′,北纬29°32′～31°04′,是长江、钱塘江和甬江的出海口,海洋资源相当丰富,是进行嗜盐菌研究的菌株理想来源地。我们从舟山深海取得海泥样品,获得一株只能在8%～20%NaCl培养基中生长的嗜盐菌,并对该菌的16SrRNA基因测序。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 供试菌株
菌株来源于舟山深海海泥,经无菌双蒸水稀释后,再过滤获得。
1.1.2 仪器和试剂
用于本试验的设备主要为低温冷冻离心机(HITACHI CR21R)、PCR扩增仪(Biometra PCR仪)。试验所用ExTaq DNA酶、pMD-18T载体购于TAKARA公司,DNA凝胶回收试剂盒购于上海博亚生物技术有限公司,其他试剂均为国产分析纯。
1.2 方法
1.2.1 菌株的筛选
筛选LB培养基:蛋白胨10g/L,酵母粉5g/L,盐浓度按照0.5%、0.9%、2.5%、3.5%、5%、8%、10%、20%、30%设置。用200μl土壤过滤液涂平皿,37℃摇床培养,挑取单菌落反复划线纯化,得到10%NaCl培养基中生长的5个单菌落。纯化好的菌株以甘油管用冻存管在-80℃保存,以便后面研究使用。
1.2.2 菌株基因组DNA的提取
将液体培养基中生长好的菌液,12 000r/min离心2min后倒去上清收集菌体,用无菌水清洗菌体,溶菌酶破壁,蛋白酶K处理,酚/氯仿/异戌醇按体积比25/24/1进行抽提,冷无水乙醇沉淀,70%冷乙醇洗净沉淀后减压干燥风干,最后溶于TE缓冲液中并放置在-20℃条件下保存。
1.2.3 菌株的抗性实验
用不同盐浓度的LB培养基在37℃摇床中摇菌,对菌株嗜盐性进行筛选,结果表明该菌株生长最适NaCl浓度为8%～20%,培养基低于8%和高于20%NaCl浓度该菌均不生长。
1.2.4 16SrRNA的PCR扩增及克隆
以提取的基因组DNA为模板,通过PCR反应扩增菌株的16S rRNA基因序列。PCR扩增采用一对引物,其正向引物为F(8-27):5'-AGA,GTT,TGA,TCA,TGG,CTC,AG-3'。反向引物为R(1525-1541):5'-T,AAG,GAG,GTG,ATC,CAA,C-3'。引物分别对应National center for Biotechnology Information(NCBI)J01859号Escherichia coli 16S rDNA核苷酸保守序列上的8-27位和1525-1541位。
PCR反应体系为50μl:其中10×PCR buffer(含有MgCl2 20mmol/L)5μl,2.5mmol/L dNTP 1μl,基因组DNA模板0.2μl,20μmol/L的引物分别2μl,Taq DNA聚合酶0.5μl,去离子水39.3μl。
PCR扩增条件为:94℃ 5min;94℃ 1min,55℃ 45s,72℃ 1.5min,一共运行30个循环;72℃ 10min。
扩增的PCR产物在1.0%的琼脂糖凝胶上进行电泳分离后,采用DNA凝胶回收试剂盒进行回收纯化,将纯化的PCR产物与载体pMD-18T连接后转化DH5α进行克隆。
1.2.5 阳性克隆的筛选
将转化后的菌落接种于含氨苄青霉素(100mg/L)、X-gal(40mg/L)和IPTG(24mg/L)的LB平板中。挑取白色菌落,将其扩大培养后用碱裂解法小量快速提取质粒DNA。将提取的质粒DNA为模板进行PCR扩增,1%琼脂糖凝胶电泳检测重组阳性质粒。同时将质粒DNA以BamHⅠ、HindⅢ酶切,进一步验证克隆结果。
1.2.6 16S rRNA的全序列测定
纯化后得到重组质粒DNA,由北京三博公司进行全序列测定。
2 结果与分析
2.1 经过多次传代驯化、反复平板涂布,分离纯化的嗜盐菌在固体培养基上呈圆形,菌落较大、边缘整齐,表面光滑,菌体呈白色,极易挑起。菌株细胞为杆状,无鞭毛,大小为(0.6～0.7)μm ×(1.7～2.4)μm。其生长特点是低于8%NaCl和高于20%盐浓度的培养基中不能生长,适合在8%～20%的 NaCl盐浓度的培养基中生长。
2.2 菌株基因组DNA提取
菌株的基因组DNA通过溶菌酶、蛋白酶K以及酚/氯仿/异戌醇抽提,而后用乙醇沉淀,得到了基因组DNA,如图1所示。
2.3 菌株16SrRNA 基因序列的PCR扩增
以提取的基因组DNA为模板,通过PCR反应扩增菌株的16S rRNA基因序列。扩增的PCR产物在1.0%的琼脂糖凝胶上进行电泳分离后,其电泳结果见图2,菌株16S rDNA基因序列经过PCR扩增后,有一条大约1 500bp左右的核苷酸片断被扩增出。
2.4 菌株的16SrRNA基因全序列测定
将扩增的PCR产物在1.0%的琼脂糖凝胶上进行电泳分离后,采用DNA凝胶回收试剂盒进行回收纯化,将纯化的PCR产物与载体pMD-18T连接后转化进行克隆,经过筛选后将有16S rRNA基因序列插入的质粒提取测序。Bankit1052782的16S rRNA的基因序列被测定后,将该数据提交给了国际核酸数据库GenBank,经确认,在国际核酸数据库GenBank中的注册号为EB382220.National center for Biotechnology Information于2008年02月05日将该数据公布。将测得的序列用BLAST软件在Gene bank数据库进行同源性检索。
该株嗜盐菌16SrRNA基因序列测序结果如图3所示。
2.5 构建进化树
构建的系统发育树如图4所示,获得19条相似16S rRNA基因序列,加上目标基因,一共20条序列,保存为16SrRNA.txt。用CLUSTAL X软件进行多序列比对,得到16SrRNA.aln。用MEGA4软件对多序列比对结果进行进化分析,用N-J法(连接近邻法)构建进化树。由图4可见, 系统树整体由2个分支构成,EU382220处于Chromohalobacter-salexigens属部分菌株的系统发育树的一个分支中,根据16S rRNA的系统发育树分析,EU382220菌属于Chromohalobacter-salexigens属。
3 讨论
我们从舟山深海海泥中筛选得到一株嗜盐菌,经形态特征、16SrRNA序列分析,将所得序列与已知的16S rRNA序列进行同源性比较,该菌与色盐杆菌属红海菌DSM 3043(NC 007963.1)有94%的相似性。通常情况下,16S rRNA序列同源性小于97%,可以认为属于不同种,同源性小于93%,认为属于不同属。因此,该菌株可归属为色盐杆菌属。有报道新疆中部地区伊吾湖嗜盐微生物和细菌视蛋白基因资源[3]被研究。该嗜盐菌只能在8%～20%盐浓度的培养基中生长,这与普通的嗜盐菌有很大不同,这对于丰富嗜盐微生物的基因库具有重大意义。周钰钢等人从北京科技大学校园的草坪中分离到一株芽孢杆菌[4],其也能在20%NaCl盐浓度的培养基中生长。但我们鉴定的一株色盐杆菌具有嗜盐性,在低于8% NaCl盐浓度的培养基中不能生长。
嗜盐微生物是极其宝贵的基因资源,同时也是研究生物进化和生物多样性的重要材料。海洋是世界上盐份储藏最高的地方,同时那里的高盐、低温、无光照的特殊环境造就了海洋生物的多样性远远大于陆地生物。适应海洋环境的生物,其机体组分和代谢产物也与陆生生物大不相同,其细胞内形成了多种具有特殊功能的酶,同时蕴含着大量的新型化合物,对人类的生产和生活都是十分有用的。例如,嗜盐古菌的紫膜(Purple membrane)能够通过构型的改变存储信息,并具有广泛的pH值和温度耐受范围,是未来制造生物计算机芯片的理想材料[5]。另外,中度嗜盐菌产生的酶可以在高盐、高pH值情况下发挥作用,因而可使一些特殊环境下的生物降解得以实现,一种纤维素磷酸合酶已经成功从生长在耐盐的水稻中分离[6]。
总之,这项研究丰富我国微生物资源库和基因库,促进我国微生物学的学科发展,我们下一步的实验目的是用抑制差减杂交从这株嗜盐菌中筛选到耐盐基因,并转到植物中,增加其耐盐抗性,提高作物产量。这株嗜盐菌的发现具有很好的理论意义和潜在的应用价值,并值得做进一步的研究工作。
参考文献
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16SrRNA 篇2
1 材料
14株NTM菌株(来自吉林省),由吉林农业大学预防兽医学实验室保存,分别命名为 FJ-1～14,其中FJ-1、FJ-6、FJ-11来自猪颌下淋巴结,FJ-4、FJ-12～14来自牛颌下淋巴结,其他菌株均来自牛肠系膜淋巴结。
2 方法
2.1 DNA的提取
采用酚-氯仿抽提法提取DNA,参照标准方法进行,将提取得到的DNA于-20 ℃保存,备用。
2.2 16S rDNA片段PCR扩增
根据16S rRNA基因高变区位置[4]设计合成 1对引物(由上海生工生物工程技术服务有限公司合成),即上游引物P1 5′-CACATGCAAGTCGAACGGAAAGG-3′(位于结核分枝杆菌16S rDNA 62～85位核苷酸处)和下游引物P2 5′-GCCCGTATCGCCCGCACGCT-3′(位于结核分枝杆菌16S rDNA 626～647位核苷酸处),以上、下游引物扩增16S rRNA基因5′端长为570 bp左右的片段。PCR反应体系(20 μL):10×Ex Taq Buffer(含Mg2+) 2 μL,dNTP Mixture (2.5 mmol/ L)1.5 μL,上、下游引物(10 μmol/ L ) 各0.5 μL,DNA模板1 μL,ExTaq(5 U/μL) 0.25 μL,H2O 14.25 μL。PCR扩增程序:95 ℃预变性5 min;94 ℃变性30 s,63 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,共30个循环;72 ℃延伸10 min。循环结束后取PCR产物3～5 μL用1.0% 琼脂糖凝胶电泳,观察扩增结果。
2.3 PCR 扩增产物纯化及序列测定
PCR扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳后,应用DNA 回收试剂盒[宝生物工程(大连)有限公司生产]从凝胶上回收、纯化目的片段,并送至宝生物工程(大连)有限公司测序。
2.4 16S rDNA序列分析
将16S rDNA的测序结果与GenBank上标准序列比较,从中列出与该序列最相近的细菌,相似度达99%以上者为所得到的鉴定结果[7]。用DNAMan软件对14株NTM序列与GenBank上下载的标准16S rDNA序列进行同源性比对,以及构建系统发育树。试验所用的已知NTM菌株16S rDNA序列名称见表1。
3 结果
3.1 16S rDNA片段PCR扩增结果
14株NTM菌株均扩增得到长为570 bp左右目的片段(见图1) ,与预期片段大小相符。
1～4.分别为FJ-1～4菌株PCR扩增结果;5,13.DL- 2 000 Marker; 6～12.分别为FJ-5～11菌株PCR扩增 结果; 14～16.分别为FJ-12～14菌株PCR扩增结果。
3.2 NTM菌株16S rDNA 序列分析
试验所测定的NTM菌株16S rDNA片段5′端500 bp序列既含有属特异性的保守区域,又含有2个种特异性的高变区,分别是位于120～254,388～490位核苷酸的区域。14株NTM菌株中FJ-1与FJ-3,FJ-7、FJ-8与FJ-9,FJ-4与FJ-14 16S rDNA序列重合部分完全一致,其他菌株16S rDNA序列相似水平为94.8%～99.8 %(见表2) ,具有较好的同源性。各分离菌株序列与GenBank 序列库中相同或最相似序列的比较见表3。
3.3 系统发育树构建结果
以14株NTM菌株与从GenBank上下载的5株NTM标准菌株的16S rDNA 5′端570 bp左右序列构建系统发育树(见图2),结果菌株均得到良好区分。
3.4 NTM菌株的鉴定结果
14株NTM菌株16S rDNA的测序结果与GenBank上的标准序列比较结果显示:FJ-2、FJ-6为浅黄分枝杆菌;FJ-1、FJ-3、FJ-11为偶发分枝杆菌;FJ-4、FJ-14为母牛分枝杆菌;FJ-7、FJ-8、FJ-9、FJ-10为新金色分枝杆菌;FJ-5与Mycobacterium sp. Myc399的同源性达99.5%,提示二者可能为同一种型;FJ-12与新金色分枝杆菌,FJ-13与偶发分枝杆菌同源性分别为98.8%与98.6%,显示其亲缘关系非常相近,FJ-12、FJ-13是否为分枝杆菌新种或是这些已知分枝杆菌的亚种仍需进一步确认。
4 讨论
NTM对人的感染途径有3种说法,即环境感染、动物感染及人与人之间的传染,但至今这些观点均未得到证实 [8]。有日本学者报道,可从猪、牛等多种动物体内分离出NTM,因此认为动物作为传播媒介的可能性有探讨的必要。至今,我国关于动物NTM的研究相对较少,相关报道主要集中在人医临床分离与药敏试验方面。2005年,林世平等[9]报道,从广东地区174份牛鼻腔分泌物标本中分离出88株NTM,阳性率高达50.5% ,提示在广东地区NTM可能广泛存在于自然环境中。
目前,基因分析的细菌鉴定方法已成为快速检测和鉴定分枝杆菌的重要手段。rRNA进化速度十分缓慢,具有“分子进化钟”的特点,是目前细菌的系统发育分类与鉴定的最常用的靶基因,其中16S rDNA序列分析是细菌系统分类的“金标准”[10],16S rDNA在分枝杆菌的分类和鉴定中的作用已得到充分肯定[11,12]。
本试验选择的14株NTM中,有3株被证实为偶发分枝杆菌。偶发分枝杆菌是临床上常引起人肺部感染的NTM,其他一些菌株虽属条件致病菌,也有学者报道可引起人类的感染。在本研究中发现,部分菌株16S rDNA与GenBank序列库中的相似程度为98.6%～98.8%。用临床分离菌株的16S rDNA序列和与其最相似的已知NTM菌株的序列构建系统发育树,结果提示这些菌株可能是与新金色分枝杆菌、偶发分枝杆菌密切相关的新种,或是它们的亚种,但这些均需要进一步研究加以证实。本研究结果显示,吉林地区的NTM临床分离株的种类与国内外报道的临床分离的NTM种类有明显的不同,这可能与地域、气候的差异密切相关。本研究为寻找NTM疾病可能的传染源、了解其致病性及今后对家畜NTM的防制提供了科学依据。
摘要：为了对非结核分枝杆菌菌株进行分类与鉴定,试验采用PCR方法从14株非结核分枝杆菌中扩增16S rDNA基因5'端片段,并对所得DNA基因片段进行测序;同时用DNAMan软件对所获得的序列与GenBank中分枝杆菌序列进行比较,计算种间相似性,构建系统发育树。结果表明:14株非结核分枝杆菌中有浅黄分枝杆菌2株、偶发分枝杆菌3株、母牛分枝杆菌2株、新金色分枝杆菌4株,另有3株分别与Mycobacterium sp.Myc399、新金色分枝杆菌与偶发分枝杆菌有较好的亲缘关系。
关键词：非结核分枝杆菌,菌株鉴定,PCR,16SrRNA
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16SrRNA 篇3
1 氨基糖苷类抗生素的抗菌及耐药机制
氨基糖苷类(aminoglycosides)抗生素是由氨基环醇、氨基糖与糖组成的一类带正电荷的、水溶性的抗生素总称。自1944年首次发现链霉素以来,因此类抗生素抗菌谱广、疗效卓越,在医学临床和畜牧兽医业得到广泛使用[1]。氨基糖苷类抗生素的抗菌活性与其化学结构密切相关,其带正电荷的特性使其能与带负电荷细菌外膜和胞内的核酸结合。氨基糖苷类抗生素通过与细菌的16SrRNA结合抑制蛋白质的合成和破坏细胞膜的完整性而达到抗菌的目的[2]。其作用分为以下过程:①起始阶段,主要抑制70S核蛋白始动复合物的形成;②选择性与30S核蛋白亚基上靶蛋白结合,使mRNA上的密码错译,导致异常的无功能的蛋白质合成;③阻止终止因子(R)与核蛋白A位结合,使已合成的肽链不能释放并阻止70S核蛋白体的解离,最终造成菌体内核蛋白体的耗竭;④通过离子吸附作用附着于细菌体表面造成胞膜缺损使胞膜通透性增加、细胞内钾离子、腺嘌呤核苷酸、酶等重要物质外漏,从而导致细菌死亡[3,4,5]。但由于泛用和过度使用氨基糖苷类抗生素,耐药问题随之凸现,细菌对该类药物耐药的耐药机制比较复杂,主要可以概括为以下5个方面:①细菌产生一种或多种修饰酶,使进入细菌胞内的抗生素失去生物活性;②抗生素作用靶位的改变、核糖体碱基发生变化或与核糖体结合的核蛋白氨基酸发生突变,使抗菌药物无法发挥作用;③细菌细胞膜通透性改变,使进入胞内的抗菌药物减少;④细菌通过主动外排(active effiux)机制将已进入胞内的药物泵至胞外;⑤细菌产生16SrRNA甲基化酶[6,7]。其中最主要的机制是产生氨基糖苷类修饰酶,但近年来,由16SrRNA甲基化酶介导的耐药现象也日趋增加。
2 氨基糖苷类修饰酶
酶修饰是氨基糖苷类抗生素最常见的耐药机制,经酶修饰的抗生素与细菌16SrRNA上的A位点的结合力下降,从而导致药物抗菌活性的丧失[8]。依据其修饰功能的不同可分为3类,即氨基糖苷磷酸转移酶(aminoglycoside phosphotransferases,APH)、氨基糖苷乙酰转移酶(Aminoglycoside acetyltransferases, AAC)和氨基糖苷类核苷转移酶(aminoglycoside nucleotidyltransferases,ANT)[4,9]
2.1 APH
抗生素的磷酸化明显影响了其与核糖体A位点结合能力。编码这种酶的基因常见于多药耐药细菌的R质粒、转座子和整合子,因而尽管氨基糖苷类抗生素并没有广泛使用。但其耐药性基因也经常在细菌家族中出现。APH是一种利用ATP作为第二底物,且能磷酸化所有氨基糖苷类抗生素的羟基酶。目前,临床上分离到7种APH,即APH(3’)、APH(2”)、APH(3”)、 APH(4)、APH(7”)、 APH(6)和APH(9)[5]。临床上最为常见的为APH(3’).多数APH在3’修饰羟基,现已发现7种不同的APH(3’),即APH(3’)-I～ APH(3’)-VII。APH(3’)-I产生对卡那霉素、新霉素、核糖霉素等的抗药性。首先在大肠埃希菌的Tn903转座子上发现其编码基因aph(3’)-I,后来又在肺炎克雷伯菌、肠炎沙门菌、霍乱弧菌和空肠弯曲杆菌等革兰阴性细菌中发现。近来又在革兰阳性菌条件致病菌棒状杆菌中发现[6]。APH(3’)-Ⅱ与APH(3’)-I具有相似的耐药谱,临床上却少见。只是在铜绿假单胞菌的染色体上发现APH(3’)-IIb的编码基因。APH(3’)-Ⅲ磷酸转移酶首先从金黄色葡萄球菌和粪链球菌中找到,接着又在结肠弯曲杆菌中检出,其编码基因为aph(3’)-Ⅲ,该基因可在革兰阳性和革兰阴性菌间转移。APH(3’)-Ⅲ产生对卡那霉素、新霉素、核糖霉素和阿米卡星等的耐药[10,11],APH(3’)-Ⅳ和APH(3’)-Ⅴ仅在产抗生素的微生物中发现。APH(3’)-Ⅵ对阿米卡星、卡那霉素、新霉素、核糖霉素等耐药,其编码基因主要在不动杆菌中发现。APH(3’)-Ⅶ产生对卡那霉素和新霉素的耐药,其编码基因在空肠弯曲杆菌中找到。在革兰阳性菌中发现了4个编码APH(2”)的基因。位于aac(6’)-Ie下游的aph(2”)-Ia基因编码的双功能酶(ACC(6’)-Ie和APH(2”)-IaC末端部分。在肠球菌、链球菌、葡萄球菌中发现的乙酰转移酶和磷酸转移酶使它们对临床上除链霉素外的所有氨基糖苷类抗生素耐药。另3个酶APH(2”)-Ib,APH(2”)-Ie和APH(2”)-Id最近在肠球菌中发现。APH(3”)和APH(6)分别修饰链霉素的3”和6-羟基。编码APH(3”)-I有2个基因,aph(3”)-Ia见于链霉素的链霉菌,aph(3”)-Ib从革兰阴性菌的质粒RSF 1010中找到。尽管这2种酶在不同的细菌中发现,它们有50%的氨基酸相同,68%同源性,APH(4)和APH(7”)产生对潮霉素的耐药性,APH(9)产生对大观霉素的耐药性,这几种酶在临床上并不多见。
2.2 AAC
AAC有4种同工酶:AAC(1)、AAC(3)、AAC(2’)和AAC(6’),它们主要以乙酰辅酶A作为乙酰基的供体,分别作用于氨基糖苷类抗生素的2-脱氧链霉胺环的1位和3位、62氨基己糖环的2’和6’位。AAC(6’)为宽谱酶,它能修饰临床上多数氨基糖苷类抗生素。AAC(6’)-I对阿米卡星、妥布霉素、奈替米星、卡那霉素、异帕米星、地贝卡星和西索米星的耐药,已在细菌中发现该酶的24种亚型。已知的AAC(6’)中AAC(6’)-Ib是革兰阴性菌中最常见的,临床上约70%的革兰阴性菌有此活性,AAC(6’)-II只发现了2种,它们产生对庆大霉素、妥布霉素、奈替米星、西索米星的耐药,但不产生对阿米卡星的耐药。AAC(6’)-IIa和AAC(6’)-IIb首先在铜绿假单胞菌和荧光假单胞菌中发现,它们对庆大霉素、妥布霉素、奈替米星、地贝卡星和西索米星耐药。AAC(3)-I为窄谱酶,其修饰底物包括庆大霉素、西索米星和阿司米星。AAC(3)-Ia和AAC(3)-Ib的编码基因见于临床上30%的革兰阴性菌。aac(3)-Ia见于结合质粒、转座子和肠球菌、铜绿假单胞菌整合子的基因盒。近来又发现aae(3)-Ib与另一个位于铜绿假单胞菌整合子的耐药基因acc(6’)-Ib融合。在大肠埃希菌中AAC(1)产生对安普霉素、利维霉素、巴龙霉素和核糖霉素耐药。AAC(2’)-Ia的基因分离自司徒普罗威登斯菌(Providencia stuartii),此酶或与其他酶一起成为司徒普罗威登斯菌对庆大霉素、妥布霉素、奈替米星、地贝卡星和新霉素耐药的主要机制,突变株aac(2’)-Ia的mRNA水平升高,产生高度的耐药。研究发现AAC(2’)-Ia的调节过程相当复杂,包括至少7个调节基因,通过2种途径进行。AAC(2’)-Ib、AAC(2’)-Ic、AAC(2’)-Id、AAC(2’)-Ie在分支杆菌中找到,对来自结核分支杆菌的AAc(2’)-Ic研究发现,它既可对抗生素进行N-乙酰化也可进行O-乙酰化[6,10,11]。2006年,美国学者Robicsek发现了能修饰灭活氨基糖苷类和喹诺酮类2类化学母体各异的药物,其编码基因为aac(6’)-Ib-Cr型,被称为双功能酶基因[12]。国内由李智山等于2007年在大肠埃希菌中检出,目前在各种革兰阴性菌都有报道。同年,我国学者徐卫东等[13,14]在国内外首次报道从肺炎克雷伯菌中检出aac(6’)-Ib-Suzhou型,次年黄伟支密等[14,15]在国内外首次报道从阴沟肠杆菌中检出。2009年,翁幸鐾等[16]从尿液中的大肠埃希菌中发现了aac(6’)-Ib-Ningbo型。
2.3 ANT
修饰氨基糖苷类抗生素,这些酶转移三磷酸核苷部分的单磷酸核苷到抗生素的羟基基团上。而所有在蛋白质水平上的研究均表明,O-核苷酸转移酶都有广泛地利用各种NTP的能力,与之相关在细菌细胞中有高浓度的ATP,很可能这些酶是细菌体内唯一的AMP转移酶。ANT已发现5种同工酶:ANT(2”), ANT(3”)、ANT(4’)、 ANT(6)、ANT(9)。其作用机制是利用ATP作为第2底物,通过将AMP分别转移到2”,3”,4’,6,9位的羟基上而修饰氨基糖苷类抗生素,ANT(2”)-Ia引起对庆大霉素、妥布霉素、西索米星、卡那霉素、达佐霉素的耐药。ant(2”)-Ia基因主要分布在小非结合质粒、结合质粒、转座子、整合子等上。ANT(3”)-I主要修饰链霉素的3”位羟基、壮观霉素的9位羟基而产生耐药性,已发现了至少8个相应编码基因,广泛见于革兰阴性菌及革兰阳性菌中的金黄色葡萄球菌和棒状杆菌。ANT(4’)主要有2个亚型。ANT(4’)-Ia引起对阿米卡星、妥布霉素、达佐霉素、卡那霉素、异帕米星耐药。已在金黄色葡萄球菌、嗜热杆菌和肠球菌中发现其相应编码基因。与ANT(4’)-I不同,ANT(4’)-IIa仅在包括肠杆菌和假单胞菌的革兰阴性菌中见到,它对阿米卡星、妥布霉素、卡那霉素、异帕米星耐药。ANT(6)-I引起对链霉素的耐药性,在欧洲,用DNA杂交法在80%肠杆菌和葡萄球菌中发现了其编码基因,同时它们大都还产生其他氨基糖苷类修饰酶,而使细菌对临床上可用的氨基糖苷类抗生素几乎都耐药。ANT(9)-I见于金黄色葡萄球菌,仅产生对壮观霉素的耐药[6,11]。
2.4 氨基糖苷类修饰酶基因来源与传播
氨基糖苷类修饰酶基因起源于抗生素产生菌,该类基因所表达的酶在抗生素产生菌中起到了自我保护作用。许多研究表明,抗生素产生菌所存在的自我保护机制与临床耐药菌的耐药机制相同。此类基因借助于整合子、转座子、质粒等可移动性遗传元件在同种或不同种细菌间传播。抗生素不规范使用是导致耐药相关基因传播的重要原因[1]。
3 16SrRNA甲基化酶(16SrRNA methylases)
16SrRNA甲基化酶是近年来发现的一种新的由质粒介导的耐药机制,与临床上常见的氨基糖苷类修饰酶不同,氨基糖苷类修饰酶具有底物特异性,因此,细菌同时对多种氨基糖苷类抗生素产生持续耐药比较少见,而甲基化酶修饰的是所有氨基糖苷类共同的作用位点,一旦修饰发生,目前使用的一切氨基糖苷类抗生素都将失去作用,并且耐药菌的MIC往往高达512～1024 mg/L。这种新的耐药机制的出现,打破了以往的认识,微生物学家们惊呼“前所未有的”危险的氨基糖苷类耐药菌株不久将在全球播散,必须引起临床高度关注。
3.1 16SrRNA甲基化酶的发现及其作用机制
16SrRNA甲基化酶最初是在产生氨基糖苷类抗生素的微生物中发现,如链霉菌属、单胞丝菌属。是该类抗生素产生菌为免于被自己产生的抗生素杀灭的一种自我防御的机制[17]。2002年,日本学者Yokoyama等对1株分离自1997年的铜绿假单胞菌的研究中,发现其对阿贝卡星高度耐药[18]。阿贝卡星是卡那霉素的衍生物,1990年开始在日本上市,对氨基糖苷类酶不敏感,仅甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌产生的功能酶[AAC(6’)/APH(2”)]对之有效,但一般只表现低水平耐药,说明存在其他耐药机制。进一步研究发现,介导铜绿假单胞菌对阿贝卡星高度耐药的是一种新的氨基糖苷类耐药机制——16SrRNA甲基化酶,(RmtA),并且该酶的编码基因和超广谱β-内酰胺酶CTX-M-3编码基因位于同一接合性质粒上。此后不断有新的16SrRNA甲基化酶的临床致病革兰阴性菌中被发现。2003年,法国学者在肺炎克雷伯菌上发现了一种16SrRNA甲基化酶ArmA。2004年,日本学者又从粘质沙雷菌中发现了另一种16SrRNA甲基化酶RmtB。RmtD由巴西人最先在铜绿假单胞菌中发现,携带rmtD菌株研究发现该基因通过质粒转移向肺炎链球菌蔓延。至今,已发现了6种16SrRNA甲基化酶,即RmtA、RmtB、RmtC、RmtD、ArmA、NpmA[7,18,19]。氨基糖苷类抗生素通过与细菌核糖体16SrRNA上的A位点结合引起核糖体功能的改变,导致细菌蛋白质合成中的转录错误和移位抑制。16SrRNA甲基化酶则通过甲基化16SrRNA上的A位点的碱基,使氨基糖苷类药物不能与其作用靶点相结合,从而导致细菌耐药。如ArmA通过甲基化16SrRNA核酸上的G1405的N7,主要是在16SrRNA装配成30S核糖体的过程中甲基化30S核糖体,而不是甲基化裸露的16SrRNA。G1405的N7被甲基化后,破坏了其与药物之间形成的氢键,在空间上破坏了其与药物之间结合。同时,甲基化后给药物引入正电荷,不利于氨基糖类药物与核酸的结合[8,9,20]。
3.2 16SrRNA甲基化酶的种系关系
抗生素产生菌产生的16SrRNA甲基化酶主要包括以下几种:GrmA、Grm、GrmO、Sgm、KgmB、Srm1、Kan、NbrB、NebM和FmrO。从系统发育上来看,16SrRNA甲基化酶分为几个簇,Sgm、GrmA、Srm1、Kan和Grm为一簇,NbrB、NebM和KgmB组成第二簇[18]。在进化树上,临床分离菌产生的RmtA、RmtB、RmtC、RmtD、ArmA、NpmA和抗生菌产生的16SrRNA甲基化酶位于进化树的两级,经比较发现,二者之间的氨基酸同源性比较低(<33%)。因此,难以确定分离菌和抗生素产生菌之间的进化关系[21]。rmtA 756个碱基,与抗生素产生菌的同源性约30%,但是基因序列中G+C含量达55%,提示该基因可能来源于包括放线菌在内的G+C含量丰富的微生物。rmtB基因编码251个氨基酸序列的RmtB,它与RmtA的同源性高达82%,与抗生素产生菌的氨基酸同源性仅为27%～33%。rmtD基因编码的247个氨基酸序列与rmtA和rmtB同源性分别为40%和42%,armA基因的开放读码框大小约为774个碱基,编码257个氨基酸残基的armA与RmtA,RmtB等临床分离的16SrRNA甲基化酶和抗生素产生菌的16SrRNA甲基化酶的同源性均较低,为30%～35%[22]。
3.3 16SrRNA甲基化酶的分布和基因环境及传播机制
目前,编码16SrRNA甲基化酶的基因先后从日本、法国、中国台湾、西班牙、波兰、保加利亚、美国、巴西、中国大陆和韩国等国家和地区检测到。在日本RmtA、RmtB、RmtC、ArmA、NpmA 16SrRNA甲基化酶都存在,在欧洲一些国家,主要流行ArmA,在中国的大陆和台湾地区主要检测到RmtB和ArmA。2004年,在中国台湾地区首次报道了rmtB和armA基因在大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌中的流行,rmtB基因在阿米卡星耐药大肠埃希菌中的检出率为7.1%,肺炎克雷伯菌中的检出率为9.4%;armA基因在阿米卡星耐药大肠埃希菌中的检出率为42.9%,在肺炎克雷伯菌中的检出率为30.2%[7]。2006年,陈琳等在我国大陆首次检测到rmtB基因,是从某猪肠采集的粪便、环境土壤样品中分离出rmtB阳性菌株,检出率高达29%[17]。2007年,潘韵峰等调查国内6个省市(北京、上海、重庆、沈阳、广州、浙江)25家医院鲍曼不动杆菌菌株中,23家检测到armA基因,阳性率达47.7%。朱健铭等报道armA在浙江地区的流行,阳性率达30.0%。16SrRNA甲基化酶基因位于可移动基元如转座子、质粒上,能通过接合或转化进行传播和扩散。通过分析基因周围遗传环境,rmtA位于介导铜绿假单胞菌对汞耐药的转座子Tn5041上,rmtB基因在Tn3转座子的侧翼上,armA位于携有1类整合子的质粒pMUR050上,质粒pMUR050上携带着介导抗生素多重耐药基因[18],rmtC与编码转座子的基因tnp基因相连,这些遗传环境表明16SrRNA甲基化酶基因通常由质粒介导,且与可移动基因元件(插入序列、转座子)相关,质粒的交换和转座子的转座作用都有利于耐药基因在细菌间的播散[19]。
4 结语
氨基糖苷类药物是临床上常用的治疗革兰阴性杆菌和革兰阳性球菌感染的药物,但因使用频度和广度的增加,其耐药性问题日趋严重,定要引起足够的重视。当前,由氨基糖苷类修饰酶导致的耐药机制仍是此类药物耐药的主要机制,但由16SrRNA甲基化酶导致的耐药现象亦变得日益增多并呈现全球性蔓延的趋势。因二者的耐药机制不同,对修饰酶导致的耐药,药学家常利用其底物特异性的特点通过改造老的氨基糖苷类药物的结构改善对产氨基糖苷类修饰酶细菌的抗菌效能,16SrRNA甲基化酶的出现使药物作用靶位甲基化将堵住通过改造老的氨基糖苷类药物的结构以拮抗修饰酶和提高抗菌作用开发新药的路子。因此,加强耐药机制及其传播机制的研究和对临床上耐药菌株的流行情况的调查和监控已是迫在眉睫的任务。并在此基础上根据细菌耐药机制,进行合理用药;加强院内感染控制,及时加强隔离措施,避免克隆株的播散。积极探索防治策略,控制耐药的过快上升,并为新抗生素开发作指导。否则,必将给人民的生命健康、医疗卫生事业、国民经济发展造成重大的伤害。
16SrRNA 篇4
国内外学者对梅童鱼的研究主要集中在摄食、生长、鱼卵和仔、稚鱼等渔业生物学方面的报道[4,5,6,7]。遗传学研究方面,田兰香等[8]基于Cyt b序列对国内7种石首鱼科鱼类系统发育进行了研究,发现大黄鱼(Pseudosciaena crocea)和棘头梅童鱼亲缘关系较近;蒙子宁等[9]研究了中国近海8种石首鱼科鱼类系统发育关系,结果表明,2种梅童鱼16S rRNA基因片段序列完全相同,但未对其进行深入探讨;陈泉梅[10]对中国石首鱼科鱼类的分子系统学研究结果显示,■鱼属、梅童鱼属和黄鱼属位于系统树的相邻位置,支持3属组成黄鱼亚科的传统分类学结论。迄今尚未见棘头梅童鱼与黑鳃梅童鱼的遗传分化研究的其他报道。线粒体DNA(mitochondrial DNA)具有分子结构简单、母系遗传、几乎不发生重组、进化速度快以及不同区域的进化速度存在差异等优点,已被广泛应用于系统发育和种群遗传学研究[11,12,13]。该研究对2种梅童鱼的16S rRNA和Cyt b基因片段进行了PCR扩增和序列测定,探讨了2种梅童鱼的遗传分化程度及分化年代,分析了不同基因片段核苷酸替代速率,旨在阐明2种梅童鱼的分类地位,为梅童鱼种质资源保护及其渔业管理提供理论依据,并为石首鱼科鱼类系统发育研究提供新的遗传学依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
选用2种梅童鱼样品各3尾。棘头梅童鱼样品于2005年10月采自海州湾121.0~121.5°E,34.5~35.0°N;黑鳃梅童鱼样品于2004年10月采自海州湾123.5~124.0°E,34.5~35.0°N。酒精固定的梅童鱼肌肉组织保存于中国海洋大学渔业生态研究室样品库,入库编号、GenBank下载的梅童鱼属鱼类16S rRNA序列以及用于外群的白姑鱼(Argyrosomus argentatus)序列等信息见表1。
1.2 试验方法
1.2.1 基因组DNA的提取 取约100 mg的梅童鱼肌肉组织,采用标准的酚-氯仿方法提取基因组DNA[14],将乙醇沉淀后的基因组DNA溶解于100 μL TE溶液中,4 ℃保存备用。
1.2.2 PCR扩增 扩增16S rRNA的引物为:L2510(5′-CGCCTGTTTAACAAAAACAT-3′)和H3059 (5′-CCGGTCTGAACTCAGATCATGT-3′)[15];在TaKaRa扩增仪上进行PCR反应:95 ℃变性3 min;94 ℃ 45 s,50 ℃ 45 s,72 ℃ 45 s,40个循环;72 ℃延伸10 min;PCR反应体积为25 μL,其中10×缓冲液2.5 μL,MgCl2 1.5 mmol·L-1,各种dNTP 200 μmol·L-1,Ex Taq酶1.25 U,每个引物各0.2 mmol·L-1,模板DNA 1 μL,加灭菌蒸馏水至25 μL。扩增Cyt b基因片段的引物为:L14734(5′-AACCACCGTTGTTATTCAACT-3′)和Cyt b(5′-CTCAGAATGACATTTGTCCTCA-3′)[15];PCR反应条件为:95 ℃变性5 min;95 ℃ 1 min,50 ℃ 1 min,72 ℃ 1 min,35个循环;72 ℃延伸10 min。PCR反应体积为25 μL,其中10×缓冲液2.5 μL,MgCl2 1.5 mmol·L-1,各种dNTP 200 μmol·L-1,Ex Taq酶1.25 U,每个引物各0.2 mmol·L-1,模板DNA1 μL,加灭菌蒸馏水至25 μL。以上反应均采用阴性对照来检查是否存在DNA污染。
1.2.3 DNA序列测定 PCR产物电泳检测后,于紫外灯下切割目的条带,用UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒(上海华舜出品)纯化回收,取适量回收产物做测序反应。用美国ABI公司3700型全自动序列分析仪进行双向测序。
1.2.4 数据分析 所有序列均由Dnastar软件包(DNASTAR, Inc., Madison, USA)进行编辑、校对和排序,并对排序结果进行分析和手工校正,然后用Modeltest 3.7[16]进行模型选择,得到2个目的基因片段的最佳核苷酸替代模型,并计算相关参数。根据核苷酸最适模型,应用MEGA 2.0[17]软件将Cyt b蛋白质编码基因核苷酸序列的密码子转化为氨基酸序列,分析核苷酸组成并计算种间遗传距离。应用ARLEQUIN Ver 2.000[18]软件计算分析棘头梅童鱼和黑鳃梅童鱼的DNA多态性。基于邻接法、最大简约法、最大似然法[19]和贝叶斯法[20]重建16S rRNA和Cyt b基因片段的系统树。
2 结果
2.1 替代模型选择和参数估计
Modeltest 3.7分析结果显示,2种梅童鱼16S rRNA和Cyt b基因片段最适核苷酸替代模型分别为GTR和HKY+I,并得到5个模型相关参数(表2),包括模型的似然值自然对数的负数(-ln L)、不变位点比率(I)和Gamma分布的形状参数(G)。
2.2 核苷酸组成分析
对棘头梅童鱼与黑鳃梅童鱼线粒体DNA 2个基因片段序列进行比对分析,得到长度分别为526 bp(16S rRNA)(图1)和379 bp(Cyt b)(图2)的目的片段。2种间在16S rRNA基因片段上共检测到了6个多态位点;在Cyt b基因片段上检测到了38个多态位点(表3)。核苷酸组成分析结果表明,2种梅童鱼在这2个目的基因片段上的鸟嘌呤(G)含量均比较低,其中最低的为黑鳃梅童鱼的Cyt b基因片段(15.8%);G含量在Cyt b蛋白质编码基因的第三密码子位点上呈现明显的反G偏倚(<5%)(图3)。棘头梅童鱼与黑鳃梅童鱼Cyt b基因片段中的G+C含量分别为48.1%和48.5%;16S rRNA基因片段G+C含量分别为47.34%和47.72%。
2.3 遗传分化分析
棘头梅童鱼与黑鳃梅童鱼在16S rRNA和Cyt b基因片段的核苷酸序列以及Cyt b基因片段相对应的氨基酸序列上存在着不同程度的遗传分化。在526 bp的16S rRNA基因片段上,2种间检测到6个多态位点(包括6个信息简约位点),6个核苷酸替代(nucleotide substitution)中出现1个转换(transition)、5个颠换(transversion),转换颠换比(Ts/Tv)为0.2,基于Tamura-Nei模型得到2种间的遗传距离为0.012,棘头梅童鱼与黑鳃梅童鱼的种内遗传距离皆为0,种内个体间无差异,2种梅童鱼与白姑鱼的遗传距离分别为0.085和0.078;在379 bp的Cyt b基因片段上,检测到38个多态位点(包括38个信息简约位点),38个核苷酸替代包含了35个转换和3个颠换,转换颠换比(Ts/Tv)为11.67,2种梅童鱼的种内遗传距离分别为0和0.002,种间遗传距离为0.111,而与白姑鱼的遗传距离分别为0.153和0.155。
在蛋白质编码基因片段中,大部分的突变是同义突变(synonymous substitution),最普遍的核苷酸替代是发生在密码子第三位点上的转换,其次是密码子第三位点上的颠换和密码子第一位点上的无义转换[21]。Cyt b基因片段上的38处突变中,35处核苷酸替代发生在密码子第三位点上(2处为颠换),3处位于密码子第一位点上(1处为颠换)。氨基酸水平上,在Cyt b基因片段编码的126个氨基酸序列上,2种间共检测到2处氨基酸替代(amino acid substitution),是由第一密码子非同义替代造成的(转换、颠换各1处)(图4)。
根据分子钟假说,某一特定的大分子(蛋白质或DNA分子)在所有的世系(Lineage)中,核苷酸替代速率在时间上是稳定的。BROWN等[13]将2%/百万年的核苷酸分歧速率应用于Cyt b基因片段来推算硬骨鱼的分化时间(divergence time),此核苷酸分歧速率被广泛应用于鱼类分化年代的计算。该研究将此分歧速率应用于棘头梅童鱼与黑鳃梅童鱼Cyt b基因片段,基于Tamura-Nei模型计算的净遗传距离为0.110,推测棘头梅童鱼与黑鳃梅童鱼的分歧时间约为550万年,推算2种间的分化事件发生于上新世(Pliocene)早期。
2.4 系统发育分析
以石首鱼科的白姑鱼作为外群,基于邻接法、最大简约法、最大似然法和贝叶斯法构建的16S rRNA系统发育树基本一致(图5)。该研究得到的黑鳃梅童鱼序列同GenBank中的棘头梅童鱼序列(AY336721)和黑鳃梅童鱼序列(AY336722)完全相同,三者聚为一支,形成一个单系类群。基于邻接法、最大简约法、最大似然法和贝叶斯法构建的Cyt b系统发育树也基本一致(图5)。棘头梅童鱼与黑鳃梅童鱼明显分为2支,节点支持率均为100%。
3 讨论
3.1 2种梅童鱼的分类地位
蒙子宁等[9]对中国近海8种石首鱼科鱼类16S rRNA基因片段序列的研究结果显示,2种梅童鱼的16S rRNA序列相同。而该研究得到的黑鳃梅童鱼序列与棘头梅童鱼序列(AY336721)和黑鳃梅童鱼序列(AY336722)完全相同,共享一个单倍型。基于邻接法、最大简约法、最大似然法和贝叶斯法构建的16S rRNA系统发育树显示,该研究得到的黑鳃梅童鱼序列与蒙子宁等得到的序列(AY336721和AY336722)聚为一支,形成一个单系群,且棘头梅童鱼与黑鳃梅童鱼明显分为2个单系群,节点支持率均为100%。根据16S rRNA基因高度保守性的特点,推测蒙子宁等研究中所用的“棘头梅童鱼”应为黑鳃梅童鱼。基于Cyt b基因片段序列构建的系统树与16S rRNA系统树的结果一致,也支持棘头梅童鱼与黑鳃梅童鱼为2种不同的梅童鱼。
16S rRNA比Cyt b基因进化速率要慢,2个基因片段的序列分析结果都显示棘头梅童鱼与黑鳃梅童鱼存在显著的遗传分化,2种间遗传距离分别为0.012和0.111,属于属内种间差异[22],与笔者对棘头梅童鱼与黑鳃梅童鱼在鳃腔、头部小棘数目、臀鳍第一鳍棘等部位存在显著形态学差异的研究结果(未发表)相一致。
3.2 2种梅童鱼序列分析
4种核苷酸在线粒体基因组中分布不均是动物线粒体基因组的共性[13]。该研究得到的16S rRNA和Cyt b基因片段核苷酸组成中的鸟嘌呤(G)含量普遍较低。棘头梅童鱼和黑鳃梅童鱼的Cyt b蛋白质编码基因第三密码子位点的核苷酸组成存在较大偏倚(Bias),C占46.8%和50%,而G仅占4.2%和4%。在其他鱼类中,Cyt b基因片段核苷酸组成分析的结果也显示G含量普遍较低,这一点在密码子第三位点上尤为明显[23,24,25]。对于编码重要功能蛋白质的Cyt b基因来说,由于在DNA水平上受自然选择压力的影响,密码子第三位点的突变率高于第一和第二位点,而且密码子第三位点的突变绝大多数是同义突变,受自然选择压力较小,突变后易固定,所以密码子第三位点能够更清晰地表明线粒体基因组核苷酸组成的不均一性[26],而第一、第二位点则相反。
密码子第三位点上的突变很少导致氨基酸替代(同义替代),所以比导致氨基酸替代的突变(非同义替代)积累要快得多,最常见的突变是密码子第三位点上的转换,其次是第一密码子位点上的无义转换和密码子第三位点上的颠换[26]。该研究中Cyt b作为编码重要蛋白质的基因片段,在编码的126个氨基酸序列上,由于第一密码子的非同义替代造成2处氨基酸替代,与先前的研究结果一致[26]。
3.3 2种梅童鱼遗传分化