大鼠模型论文（共11篇）
大鼠模型论文 篇1
1990年Kitagawa等[1]在沙土鼠脑缺血的实验研究中发现缺血预处理有神经保护作用, Arboix等[2]发现, 发生过短暂性脑缺血发作 (TIA) 的脑梗死患者预后较好, 提出TIA可能增加脑缺血的耐受性;Yi-Wei Tsai等[3]的研究, 采用电凝局灶性脑梗死大鼠模型, 发现造模7 d后间断缺氧能明显减少梗死体积;使得预缺血缺氧的研究成为热点。低氧诱导因子-1 (HIF-1) 是一种氧敏感转录激活因子, 在哺乳动物的各种组织细胞中广泛表达, 有利于促进机体和细胞对低氧环境的适应。本研究拟对一种简单易行大鼠预缺氧模型进行探讨, 并进行大鼠脑组织HIF-1免疫组化和RT-PCR测定, 判断此模型的可靠性。
1 材料与方法
1.1 动物及分组
健康雄性SD大鼠12只, 体重280 g～300 g, 由山西医科大学实验动物中心提供。随机分为缺氧组和对照组。
1.2 主要试剂和设备
缺氧设备组成:密闭容器、氧气罐、氮气罐、测氧仪;兔抗大鼠HIF-1α单克隆抗体、ABC试剂盒购自博奥森, 引物由北京全式金生物技术有限公司合成。
1.3 预缺氧模型制备
在固定体积的容器中缓慢输入氧气、氮气, 使测氧仪监测到的O2浓度始终保持在12%, 然后放入大鼠。并保持温度、湿度恒定。在缺氧环境下的大鼠出现呼吸频率加快, 自发性活动减少。缺氧组大鼠每天缺氧4 h, 连续7 d。对照组大鼠在相同容器中通入空气, 每天4 h, 连续7 d。
1.4 免疫组化
用石蜡切片机自前囟后3 mm处开始向后行冠状位切片, 层厚1.5 μm, 梯度乙醇脱蜡至水, 3%H2O2室温孵育20 min, 高压锅热修复2 min, 加冰迅速冷却, 非相关蛋白封闭15 min, 分别滴加一抗 (兔抗大鼠HIF-1α抗体, 浓度为1∶200) , 4 ℃过夜, 生物素化二抗室温孵育15 min, 辣根过氧化物酶标记的亲和素工作液室温孵育15 min, DAB显色, 适时终止, 苏木素复染核, 脱水、透明、封片。光学显微镜下观察大鼠海马和大脑皮层的神经细胞, 以细胞内出现鲜艳的棕黄色颗粒为阳性细胞, 每张切片高倍镜 (10×40倍) 下随机选择5个不同的视野, 计数每个视野中阳性细胞数, 取其平均值, 检测皮层区HIF-1α的表达。
1.5 RT-PCR检测HIF-1αmRNA
取脑组织在1% DEPC水中稍作漂洗后立即放入细胞冻存管中, 并存放于-80 ℃冰箱。按TRIZOL法提取组织中HIF-1α总 mRNA, 所提总RNA经紫外分光光度计测样品RNA含量和纯度。HIF-1α引物, 上游:tcaagtcagcaacgtggaag, 下游:tatcgaggctgtgtcgactg, 扩增产物为198bp;Gapdh 引物, 上游:tgaacgggaagctcactgg, 下游:tccaccaccctgttgctgga, 扩增产物为307bp。反应条件:94 ℃ 5 min, 94 ℃ 30 s, 56 ℃30 s, 72 ℃1 min, 35 个循环, 反应结束后, 反应产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳, 电泳结果用凝胶成像仪观察电泳结果并拍照。用Bio-Rad 图像分析系统软件进行光密度分析。HIF-1α的相对表达量用HIF-1α扩增产物的光密度值/GAPDH 扩增产物的光密度值×100% 表示。
1.6 统计学处理
采用SPSS 12.0统计软件进行分析, 所有数据以均数±标准差
2 结 果
2.1 免疫组化
光学显微镜下观察大鼠海马和大脑皮层的神经细胞, 以细胞内出现鲜艳的棕黄色颗粒为阳性细胞。对照组大鼠有少量HIF -1α蛋白表达, 主要分布于皮层的锥体细胞, 胞浆、胞核均有明显着色。缺氧组HIF -1α阳性神经元的表达明显增多, 散在分布, 主要分布于皮层、海马、纹状体。缺氧组HIF -1α蛋白表达为22.88±2.09, 高于对照组的12.85±1.79 (P<0.01) 。
2.2 脑组织HIF-1αmRNA的水平
HIF-1α与内参照GAPDH mRNA比较得相对转录水平, 结果显示:对照组HIF-1αmRNA较弱, 为0.150 8±0.017 8, 缺氧组明显上升, 为0.607 9±0.040 1, 两组比较差异有统计学意义 (P<0.01) 。
3 讨 论
HIF-1是一种氧敏感转录激活因子, 由氧调节亚单位HIF-1α和结构亚单位HIF-1β组成的异二聚体, 在机体耐受缺氧、维持体内氧稳态方面发挥重要作用。在缺氧预处理过程中HIF-1α作为转录因子与胞核中HIF-1β相互作用, 启动低氧易感靶基因, 从而使HIF靶基因血管内皮生长因子、促红细胞生成素 (EPO) 、iNOS、葡萄糖转运体-1 (GLUT-1) 、血红素氧化酶等基因表达上调, 保护24 h后再缺血的损伤。正常氧分压时脑组织表达很少, 氧浓度降低时可诱导HIF-1快速、大量的表达。
现国内外[3]普遍采用混合灌装气体进行缺氧, 氧氮混合气体灌装技术有难度, 依靠实验室自身难以完成, 另外氧气的浓度不好把握。本研究采用氧气和氮气分装, 可以随实验条件自由调节氧的浓度, 且设施简单, 容易操作。
本研究在固定体积的容器中缓慢输入氧气、氮气, 使测氧仪监测到的O2 浓度始终保持在12%, 然后放入大鼠。并保持温度、湿度恒定。在缺氧环境下的大鼠出现呼吸频率加快, 自发性活动减少。缺氧组大鼠每天间断缺氧4 h后, 连续7 d。对照组大鼠在相同容器中逗留7 d (通入空气, 每天4 h) 。通过免疫组化和RT-PCR测定脑组织HIF-1α蛋白及mRNA表达。结果提示缺氧组脑组织中HIF-1α蛋白和mRNA表达增多。说明脑缺氧模型制作在分子水平检测是成功的。
总之, 本模型简单易行, 通过对脑组织中HIF-1α蛋白和mRNA表达的观察, 证实其达到预缺氧的要求。
参考文献
[1] Kitagawa K, Matsumoto M, Tagaya M, et al.“Ischemic tolerance”phenomenon found in the brain[J].Brain Res, 1990, 528 (1) :21-24.
[2]Arboix A, Cabeza N, García-Eroles L, et al.Relevance of transientischemic attack to early neurological recovery after nonlacunar is-chemic stroke[J].Cerebrovasc Dis, 2004, 18:304-311.
[3]Yi-Wei Tsai1, Yea-Ru Yang, Gun-Hao Chen, et al.The time win-dow of intermittent hypoxia intervention after middle cerebral ar-tery occlusion[J].Chinese Journal of Physiology, 2008, 51 (5) :324-328.
大鼠模型论文 篇2
在药物对肝脏靶脏器作用的研究中，Lindell肝动脉插管法常用于一次性的给药实验，在打开动物腹腔导入药后又重新关闭，不能多次性的`重复给药。而在科研实验中，往往需要多次乃至长期给药，这就需要肝动脉导管长期体外留置备用，而目前这方面的模型建立报道较少。参照现有的相关文献进行模型构建，发现有不少不足之处：①肝固有动脉和胃、十二指肠动脉难以定位，寻找时，极容易造成肝包膜下瘀血及肝叶损伤;②导管插入成功后，回流的血液极易在狭窄的管道内凝固而阻塞管道;③手术意外、动物死亡常见，失败率高。
大鼠全脑暂时性脑缺血模型的复制 篇3
[关键词] 脑缺血；椎动脉结扎；静总动脉结扎；再灌注
脑血管疾病已成为世界上危害人类健康的第三大疾病，严重危害人类健康，发病率已达人群的104.53/10万[1]。缺血性脑血管疾病（ICVD）发病率有逐年增高的趋势，脑中风发病后，死亡率达56.6%～80%，而且即使不死亡也留下严重的后遗症，严重影响病人和家属的生活质量。所以人类脑血管疾病的研究已成为人们迫切的问题。生命科学是建立在实验动物基础上的真正科学，21世纪是鼠的世纪，在人类研究生命科学中，鼠是人们的代替者。该实验就是用大鼠全脑暂时性脑缺血模型来模拟人类的脑血管疾病并对之进行研究。大鼠的脑血管解剖结构和功能与人类相似以及品种品系相对标准，具有良好的种内纯合等特点，便于进行统计学处理，因此目前利用大鼠做脑缺血模型的有很多。大为人类对疾病的研究做出了不可估计的贡献，可以说：“我们的生命和它有缘”。
一、试验材料与方法
1.试验时间
2009年5月13日
2.试验地点
胶南市斯泰普高新医学动物实验研究中心。
3.动物与仪器
雄性Vst大鼠，体重50～300g。分四组，每组30只，分别为：2组清洁级分别由上海某单位（合格证号：沪动合格字152号）和北京某单位（许可证编号：sekkll_oo_ooo6）提供，普通级分别由江苏某单位（合格证号为苏动质字第020510）和长春高新医学动物实验研究中心（合格证号为吉动质字第020512）提供。
JGD—RF2射频双极电凝器、江湾1型C立体定位仪、微型动脉夹。
4.试验方法
（1）麻醉。Vst大鼠用20%的水合氯醛腹腔注射麻醉（300mg/100g体重），5min内大鼠痛觉消失，翻正反射消失，有角膜反射。
（2）分离颈总动脉。将已麻醉的大鼠平铺四肢仰卧用棉线固定在固定板上，消毒颈部，将颈部的毛剪去。在两前肢直线上方沿腹中线切1cm 长的皮肤切口，找出跳动的颈总动脉（CCA）和与之相伴行的神经。沿血管纵向钝性分离出颈总动脉（CCA）用棉线环颈总动脉（CCA）成1cm的线环，两侧相互交叉埋于皮下，缝合切口。
（3）电凝椎动脉。大鼠转移到立体定位仪上，俯卧。头向下倾斜30度[2-3]固定。剪去头颈部的毛，然后消毒。在枕骨下沿背正中切1cm长的切口，切开皮肤和斜方肌，分离肌肉，找到第一颈后弓上的横突孔，用电凝针插入2～3mm，灼断孔中椎动脉，使之永久性阻塞，如果横突过小，电凝针插不进去，也可用7号针头轻轻旋入2～3mm，并不拔出，再用电凝针电凝针尾，使椎动脉永久性阻断。电凝电毕后，将切口缝合。大鼠放回饲养笼中，让其自然苏醒，晚上不喂任何饲料，自由饮水[3]。
（4）缺血。以上手术后24h，大鼠在清醒的状态下仰卧固定，重新打开颈部切口，用显微动脉夹夹住双侧的颈总动脉，使大鼠脑部供血完全阻断，大鼠先挣扎数秒后于30～60s内昏迷，放开固定，可见大鼠四肢上举，翻正反射消失，痛觉反应消失，双侧瞳孔散大，眼球呈灰白色，身体可呈角弓反张，用脑电图（EEG）验证，脑电图几乎成直线，与对照组有明显的区别。实验过程中，室温保持20℃以上。缺血时间达到所需时间后，把动脉夹松开，让颈总动脉中的血液重新流动。整个手术过程以及动物能自主活动前，应用红外线加热器或电热毯保持动物的直肠温度为37℃左右[4]。
二、试验结果
1.测试项目与方法
（1）大鼠脑部供血完全阻断后，大鼠四肢上举，反正发射消失，痛觉反应消失，双侧瞳孔增大，眼球呈灰白色，身体呈角弓反张，用脑电图验证，脑电图几乎成一直线。
（2）试验证明，两种清洁级的大鼠全脑暂时性脑缺血模型复制的成功率明显高于普通级。
2.试验结果
大鼠具有脑部血管解剖结构和功能与人类相似，品种，品系相对标准，良好的种内纯合性的特点，该试验成功的做成了大鼠全脑暂时性的缺血模型，给人们对人类脑血管疾病的研究提供了条件。
三、讨论与结论
复制大鼠全脑暂时性脑缺血模型的主要目的是为了检测该模型中的基因、转录因子和蛋白质表达的变化或者某种药物的治疗效果，所以缺血再灌注模型的成功与否直接影响以后试验的进行。做该模型时要选择质量好，耐受性好的大鼠，因为脑缺血对大鼠的脑组织损伤严重，而再灌注，不仅没有使损伤的脑组织得以恢复，反而由于细胞内Ca离子超载、一氧化氮以及氧自由基等作用使损伤程度进一步加深。所以必须慎重选择，要选择30～60s内昏迷的大鼠，在缺血过程中，大鼠的直肠温度要保持在36.5～37.5℃，因为已证明低温（〈32℃）或亚低温（32～35℃）对缺血造成脑组织损伤具有一定的保护作用[5]。而且在复灌过程中，室温要保持22℃以上，直到大鼠清醒能自由活动。注意大鼠在缺血时若没有昏迷，或发生振颤、翻转以及复灌时发生癫痫、痉挛、不宜做模型，这种动物都得淘汰。
参考文献
[1] 周光绍.基础研究与国家目标，中国首届“科技活动周”上的科技形式报告，2001
[2] pulinelli WA，Brierly JB.A new model of bilateral hemispheric schemia in the unanesthetized rat（J），stroke；1979，10（3），267～272
[3] Pulinelli WA，Buchan，AM，The four—vessel occusion rat model：method for complete occlusion of vertebral arteries and control of collateral iroulation[J]stroke，1998，19（7）：913～914
[4] 刘红梅等。大鼠全脑缺血再灌流后脑组织P53及P21蛋白的表达[J]中国神经免疫学和神经病学杂志，1999，6（3）：140～146
大鼠心气虚模型制备方法 篇4
1 材料与方法
1.1 实验材料
近交系Wistar大鼠(中国科学院上海实验动物中心)26只,体重180~200g,雌雄各半,随机分为对照组(14只)和游泳模型组(12只);游泳缸(直径30cm、高50cm);MedLab生物信息采集处理系统(南京美易生物科技有限公司);0.48%心得安溶液。
1.2 方法
1.2.1 造模方法 (1)游泳组:造模全过程按大鼠静息状态下采食量进食,即喂饲精饲料5g/100g。每天强迫负重(按大鼠自身重量5%计)游泳至力竭(水温25~28℃,以头没入水下10秒不能上浮为力竭标准),力竭采用两次游泳法,前后相隔10分钟。实验第18天起,在每日游泳的基础上灌服心得安溶液2.4mg/100g,连续4天。实验第22天造模结束,进行指标测定。(2)对照组:实验过程自由进食。实验第18天起,每日灌服生理盐水0.5mL/100g体重,连续4天。于实验第22天测定相关指标。心气虚证按中国中西医结合学会心血管学会1990年修订的标准[3]判断。
1.2.2 心功能检测方法 戊巴比妥钠麻醉动物后,分离右侧颈总动脉,插入含0.1%肝素生理盐水的细塑料管直至左心室,并联接于MedLab生物信息采集处理系统,记录左室血流动力学的指标。
1.2.3 统计方法 计量资料数据均用均数±标准差(
2 结果
2.1 一般情况
游泳组大鼠实验的前7天觅食活动增强,频咬铁笼。7天后逐渐安静,14天后出现精神不振、活动减少、毛松、眼眶变小、鼠尾颜色淡白、拱肩缩背、行动迟缓。实验第18天起连续灌服心得安4天后,出现精神萎靡、倦怠,尤以强迫活动后为甚。对照组大鼠活动正常。
2.2 体重变化
造模前游泳组与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。造模第3天后体重逐渐减轻,至实验第21天游泳组较对照组体重明显降低(P<0.01),见图1。
*与正常组比较 P<0.05,**与正常组比较 P<0.013 讨论
根据《素问·刺志》“谷盛气盛,谷虚气虚”和《灵枢·五味篇》“谷不入半日则气衰,一日则气少矣”,实验中每日给予大鼠的基础进食量,只保证大鼠的每日基础需要量,同时增加消耗量以达到饥则损气和劳则耗气的目的。实验中,游泳组大鼠出现精神萎靡、少动、皮毛蓬松、无光泽、鼻尾色淡、缩肩拱背等现象,且体重明显下降,尤以强迫活动后为甚;实验结束时游泳组大鼠心脏收缩功能明显下降。上述结果提示游泳组大鼠体力下降,心功能减弱,符合临床心气虚的特点,说明心气虚大鼠模型制备成功。心得安具有抑制Ca2+和 Na+的内流作用,及抑制交感神经对心脏的刺激效应和兴奋迷走神经作用从而对心脏及传导系统具有负性效应。同时心得安为非选择性β受体阻断剂,长期或大剂量使用使支气管阻力增高,从而引起缺氧和二氧化碳潴留,影响心肌血供。因此,我们在大鼠力竭运动后使用大剂量心得安,一方面是将气虚定位于心,另一方面也是用来耗损心气,旨在加重心肌损伤,以保证造模成功。
摘要：目的:研究制备大鼠心气虚动物模型的方法。方法:成年近交系Wistar大鼠26只,雌雄各半,随机分为对照组和游泳模型组;游泳组每天采用两次游泳法,强迫大鼠负重游泳至力竭,实验第18天起,在每日游泳的基础上灌服心得安溶液2.4mg/100g,连续4天;实验第22天造模结束。结果:游泳组在造模第3天后体重逐渐减轻,至实验第21天较对照组体重明显降低(P<0.01),最大心室内压、心室峰压平均值、心率均下降,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。结论:游泳组大鼠体力下降,心功能减弱,符合临床心气虚的特点,心气虚大鼠模型制备成功。
关键词：大鼠,心气虚,动物模型
参考文献
[1]屈松柏.心脏病心阴虚证候特征探讨[J].湖北中医杂志,1995,17(3):24-26.
[2]中国中西医结合学会心血管学会.冠心病中医辨证标准[J].中国中西医结合杂志,1991,(5):257.
大鼠模型论文 篇5
[关键词] Aβ25-35；D-半乳糖；补肾活血方；Morris水迷宫；跳台试验；老年性痴呆
[中图分类号] R749.1 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2012）04-32-03
Therapeutic effect study of bushen huoxue formula on the experimental model of alzheimer’s disease
ZHAO Baosheng1 WANG Pu2 XU Tunhai2
1.Center of Scientific Experiment,Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100029,China;2.School of Chinese Materia Medica,Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100102,China
[Abstract] Objective To observe the therapeutic effect of Bushen huoxue formula to experimental animal model of Alzheimer's disease. Methods established AD animal model with Aβ25-35 encephalic injection once and D-galactose hypodermical injection for 5 weeks,then administrated the rats with drugs for 4 weeks, after that, check the cognitive behavior with Morris mater maze experiment,and survey the contents of SOD and MDA of the brains. Results After administrated the animal with Bushen huoxue formula,the searching time and distance in safety island quadrant were lengthened. The formula also diminished the content of MDA and elevated the activity of SOD. Conclusion Bushen huoxue formula obviously improved the learning and memonic capacity of AD rats,its mechanism may has certain relationship to its regulating lipid peroxidation reaction effect.
[Key words] Aβ25-35;D-galactose;Bushen huoxue formula;Morris water maze;Step down test; Alzheimer's disease
老年性癡呆（alzheimer’s disease，AD）是一种病因未明、以记忆认知功能障碍为首要临床表现并进行性加重的神经变性疾病。该病主要表现为颞叶、额叶、顶叶大脑皮质的弥漫性萎缩，尤其是双侧海马的萎缩表现较为突出[1]。β-淀粉样蛋白（β-amyloid protein，Aβ蛋白）是AD主要病理特征老年斑的主要成分，在AD发病机制中具有关键作用[2]。本实验以Aβ脑内注射联合D-半乳糖皮下注射方法诱导建立AD大鼠模型，并观察中药补肾活血方对该病理模型认知功能的影响。
1 材料与方法
1.1 药物与试剂
Aβ25-35（Sigma公司），D-半乳糖（Amresco公司），青霉素、链霉素粉针剂（华北制药集团），戊巴比妥钠（上海沃凯公司）；Biopanda人工脑脊液(英国博达生物试剂公司)；SOD试剂盒（批号20110816）、MDA试剂盒（批号201109423）均购自南京建成生物工程研究所；其他均为试剂分析纯。
熟地、山药、肉桂、黄芪、当归、川芎、桃仁、红花、赤芍、泽泻、
丹皮、炒谷芽、郁金、肉苁蓉购于购于北京卫仁中药饮片厂，北京中医药大学中药学院制成流浸膏，临用时用蒸馏水配成相应浓度的混悬液。
1.2 实验动物
SD大鼠，雌雄各半，体重180～200 g，由北京维通得华实验动物中心提供，合格证号：SCXK（京）2011-0011。所有大鼠饲养在符合国家标准的屏障环境内，常规饲养，昼夜时间比例为1∶1。
1.3 实验仪器
Morris水迷宫实验系统（Smart Junior，西班牙Panlab公司），单臂脑立体定位仪（美国Stoelting公司），Hamilton微量注射器（5μL，美国Hamilton公司），0.22μm过滤器（美国Millipore公司），精密电子天平（Sartorius SP211），电热恒温水浴箱（CD-25型，北京市医疗器械设备厂）。
1.4 实验方法
1.4.1 Aβ25-35老化 按丛伟红等[3]的方法，取1 mg Aβ溶解于200μL的ACSF中制成5 mmol/L的溶液，用0.22μm的滤器过滤除菌，密封后置于37℃细胞培养箱中经96 h后即成凝聚态，分装后4 ℃保存备用。
1.4.2 25% D-半乳糖溶液 取100 g D-半乳糖溶解于0.9%生理盐水中，定溶至400 mL。0.22μm微孔过滤器过滤除菌，分装，4 ℃保存，临用前37 ℃水浴加热后直接注射。
1.4.3 动物分组 SD大鼠随机分为假手术对照组、AD模型组、补肾活血方高、低剂量组和阳性对照药脑复康组，每组10只。
1.4.4 AD模型制备 大鼠头部脱毛，麻醉，俯卧位固定于脑立体定位仪。消毒术区，钝性分离肌肉至颅骨。脑立体定位仪固定大鼠，以前囟为基点，旁开2.5 mm，向后3.6 mm即为颅骨表面标志点。用牙科钻在左右标志点各钻一孔，微量注射器进针深度3.0 mm，海马内注射Aβ25-35 1μL，留针10 min。骨蜡封闭钻孔，缝合肌肉、皮肤，常规消毒。假手术组大鼠除海马内注射1μL的ACSF外，其余处理与AD模型组相同。除假手术组外，其余各组大鼠背部皮下注射25% D-半乳糖溶液200 mg/ （kg·d），连续注射5周。各给药组于脑内注射后第1周开始给药，其中，阳性药组灌胃给药脑复康0.5 g/kg，补肾活血方高、低剂量组分别灌胃给药补肾活血方20 g/kg和10 g/kg，假手术组与模型组只灌胃等量的生理盐水，连续4周。末次给药1 h后，进行以下实验。
nlc202309040136
1.4.5 Morris水迷宫实验[4] 水迷宫由圆形水池、安全岛和记录系统3部分组成，池壁标记4个人水点，将水池分为4个象限，选A限中点放置安全岛，记录系统为BI2000系统的行为学检测模块，痴呆模型大鼠给药治疗80 d后进行学习记忆能力测定。水迷宫实验第6天，拆除安全岛，从安全岛对面象限固定入水点将大鼠面向池壁放入水池，记录2 min内大鼠在安全岛所在象限搜索的时间和距离。
1.4.6 脑组织中SOD、MDA含量测定 所有大鼠均于跳台实验后断头处死，冰浴下快速匀浆，4 ℃，3 000 r/min离心15 min。取上清液备用。SOD和MDA的测定均严格按照试剂盒说明书操作进行。
1.5 统计学处理
所有数据用SPSS13.0 For Windows统计分析软件处理。计量资料以（）表示，组间比较采用方差分析或者t检验；自身前后比较用Wilcoxon秩和检验。
2 结果
2.1 Morris水迷宫实验
由表1可知，AD模型组大鼠在安全岛象限的搜索时间和搜索距离明显缩短（与假手术组比较，P＜0.01），表明学习记忆能力明显下降。脑复康及补肾活血方高、低剂量可使模型大鼠在安全岛象限的搜索时间和搜索距离明显延长（与模型组比较，P＜0.05或P＜0.01），表明两药对痴呆大鼠记忆储存能力及提取再现能力有明显的改善作用，其中补肾活血方高剂量组与阳性药组作用相似。
2.2 内SOD及MDA的含量
与正常对照组比较，模型组大鼠脑组织SOD降低（P＜0.01），MDA升高（P＜0.01）。与模型组比较，补肾活血方大鼠脑组织MDA降低（P＜0.05或P＜0.01），SOD升高（P＜0.05或P＜0.01）。见表2。
表1 补肾活血方对AD大鼠安全象限搜索时间和搜索距离的影响（，n=10）
组别剂量（g/kg）搜索时间（s）搜索距离（m）
假手术组-53.6±6.51.52±0.01
模型组- 34.7±3.4** 1.06±0.02**
补肾活血方组20 42.5±2.8# 1.27±0.01#
10 48.6±3.1# 1.39±0.02#
腦复康组0.5 51.6±4.9## 1.53±0.03##
注：与假手术组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01
表2 补肾活血方对AD大鼠脑组织SOD、MDA含量的影响（，n=10）
组别剂量（g/kg）SOD（NU/mg）MDA（nmol/mg）
假手术组-525.84±22.1652.35±11.37
模型组- 386.49±31.51** 102.29±35.91**
补肾活血方组20 414.58±27.89# 88.57±23.84#
10 475.43±33.21## 71.22±31.08##
脑复康组0.5 489.58±42.33## 79.37±22.34##
注：与假手术组比较，*P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01
3 讨论
老年性痴呆是一种严重危害老年人身心健康的慢性神经性退行性疾病。随着全球人口老龄化，该病的患病率呈现上升趋势。据国内外有关调查显示，西方发达国家60岁以上老年人的痴呆患病率达9%左右，我国在北京、上海、西安和成都等4个中心城市对年龄在55岁以上人口进行的调查表明，AD患病率高达8%[5]。
研究表明，AD的发生与多种因素导致脑内学习记忆相关神经元损伤有关[6]，其中氧化胁迫反应是主要病理改变之一。氧化胁迫可引起痴呆模型动物脑组织胆碱能神经和多巴胺能神经功能受损，胆碱乙酰化酶活性降低，单胺氧化酶活性升高，造成脑内与学习记忆和认知功能相关的神经递质乙酰胆碱（ACh）及多巴胺等的水平降低，还可导致衰老神经元胞浆中脂质过氧化产物丙二醛（MDA）的含量明显增高[7]。
现代医学对AD发病机制的认识以β-淀粉样多肽（Aβ）学说占主导地位。脑中淀粉样斑块积聚是引发AD系列病理改变的触酶[8]，而脑内出现大量Aβ为主要成分的老化斑块（SP）是AD的神经病理标志[9]。
本研究以Aβ25-35脑内注射联合D-半乳糖皮下注射方法建立AD动物模型，观察补肾活血方对AD模型认知及其脑内SOD、MDA含量的影响。结果表明，补肾活血方可以改善AD大鼠学习记忆，提高其脑内超氧化物歧化酶（SOD）活力，减少MDA含量，对脑神经具有较好的保护作用，其抗自由基损伤作用可能参与了其改善AD大鼠学习记忆功能的机制。补肾活血方治疗AD的其他机制有待于进一步探讨。
[参考文献]
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（收稿日期：2012-02-07）
大鼠慢性脊髓损伤模型的建立 篇6
1 材料与方法
1. 1 材料2013 年取56 只260~280 g成年wistar雌性大鼠 ( 由中国医科大学动物部提供) , 随机分为实验组和对照组, 每组28 只。
1. 2 动物模型的制作方法采用异戊巴比妥10 g/L (40 mg/kg) 腹腔麻醉, 备皮、消毒、常规消毒铺巾, 后正中切口, 暴露T6~9椎板, 咬除T7、8椎板, 见硬脊膜, 将粘于钢片下的压迫物置于已暴露硬脊膜的脊髓节段上, 并用穿过双侧肋骨的手术线将压迫物牢固的固定在脊柱上, 后逐层缝合伤口, 每组取4 个时间点:2、3、4、6 周, 每个时间点7 只;对照组将膨胀物粘于钢片的背侧后, 固定于T7、8节段, 即不对脊髓有任何压迫。术后抗炎1 周。
1. 3 压迫物的制作10 只wistar大鼠进行解剖, 根据大鼠T7、8脊髓节段脊椎的平均宽度、双侧椎板的角度制作压迫物的几何形状, 压迫物由两部分组成, 分别为7.0 mm×7.2 mm×0.8 mm的不锈钢钢片和5.0 mm×1.5 mm×1.0 mm的膨胀物 ( 主要成分为缓慢膨胀型橡胶) 组成, 其中钢片是由线切割机 ( 由东北大学实习工厂提供) 切割而成, 每个均为误差在0.2 mm内的标准几何形状, 将其中线处折弯, 折弯角度为100°, 误差范围在1°;膨胀物主要成分是橡胶的复合材料, 经流化为要求的标准尺寸后, 将膨胀物粘于钢片内侧, 形成一牢固的压迫物。
1. 4 行为学评分术后分别对2、3、4、6 周进行大鼠的行为学观察, 参照BBB评分标准[2], 采取双盲、双人独立观察记录, 记录后的结果取均值。
1. 5 病理观察将处于时间点的动物腹腔麻醉后, 分别用磷酸盐缓冲液 (PBS) 、4% 的多聚甲醛心脏灌注, 待灌流液为无色为止, 小心取出完整压迫段脊髓, 再用多聚甲醛侵泡24 h后, 常规脱水, 透明, 侵蜡, 石蜡包埋, 切片, 普通苏木精-伊红染色法 (HE) 染色, 置于光镜下观察脊髓组织结构。
1. 6 统计学方法采用SPSS19.0 统计学软件进行统计分析。计量资料以均数 ± 标准差 (±s) 表示, 采用t检验。P<0.05表示差异具有统计学意义。
2 结果
2. 1 两组大鼠行为学评分比较大鼠在术后6 h后完全苏醒, 所有的术后大鼠都活动自如, 无跖肌步态, 前后肢协调运动, 可以支持体重, 约术后第4 天时大部分动物逐渐出现走路协调性差, 跖肌步态, 后肢不能完全支撑体重, 尾巴下垂, 后爪前进时不与身体方向一致, 即内旋或外旋表现, 至7~10 d时, 动物均出现后肢的完全性瘫, 动物肌张力减退、轻度活动甚至无运动、不能支撑体重, 尿便均正常, 随着时间延长 (2~4 周) 动物的症状会有自我恢复的现象, 即出现近端肌肉肌力部分恢复, 由全瘫转为不全瘫, 4 周后动物行为学症状趋于稳定。结果显示, 实验组与对照组BBB评分比较, 差异有统计学意义 (P<0.05) 。见表1。
注:两组比较, P<0.05
2. 2 两组大鼠组织病理学检查大体观察, 大鼠脊髓组织均有不同程度的压痕, 硬脊膜完整, 无明显颜色改变, 切开硬膜后, 可见脊髓在矢状径上, 有不同程度的变扁, 组织结构无明显紊乱, 灰质、白质境界仍可分辨, HE染色光镜下观察, 脊髓形态不完整, 神经组织残缺; 灰质神经元细胞数量明显减少; 灰质神经元细胞内尼氏小体崩解、减少至完全消失, 细胞核裂解甚至消失、细胞肿胀;细胞膜溶解破损、边界不清;神经胶质细胞增生, 泡沫细胞形成;呈卫星状围绕变性的神经细胞, 并变性为格子细胞; 胶质细胞增生围绕坏死的神经细胞呈噬节现象;室管膜细胞增生, 向内侵入中央管并成团阻塞管腔, 向外侵入灰质; 白质纤维分布不均匀, 纤维减少, 髓鞘排列紊乱, 髓鞘间隙扩大, 脱髓鞘, 形态不完整。见图1~4。
3 讨论
3. 1 本模型的评价一直以来, 许多学者用不同的方法探寻、制作慢性脊髓损伤动物模型, 但每种方法都有缺点, 仍需要寻找一种能准确复制慢性脊髓损伤的动物模型。1989年Arbit等[3]将直径为0.25 mm的甲基纤维素- 聚丙烯晴块植入硬膜外, 依赖其的膨胀特性产生对脊髓的机械压迫作用。该方法对脊髓的压迫作用较缓慢, 与人慢性脊髓损伤的疾病过程比较相似。本实验亦采用该试验原理, 对不足之处加以完善, ①本实验压迫物并不是放在椎板下, 而是将椎板咬除后, 将压迫物复合体固定于背部, 这样可以避免手术操作时对动物造成急性损伤的可能;②采用相对坚硬的膨胀材料, 这样对脊髓的压迫作用更确实;③由于钢板的几何形状是可以调节的, 这样压迫物的形状大小就不受椎管内狭小的空间限制, 可采用最符合试验要求的尺寸压迫, 对膨胀物有更大的选择范围。本实验采取T7、8节段压迫, 一方面与BBB造模节段相一致, 另一方面T7、8节段损伤对动物的呼吸、循环及术后的二便功能损伤较小, 易于长期饲养, 以适合造慢性模型的需要。
3. 2 慢性压迫模型的行为学、病理学评价本实验成功的复制了慢性脊髓损伤动物模型, 并对其进行了行为学、病理学方面的评价。
3. 2. 1 行为学评价BBB评分是观察动物的臀、膝、踝关节、行走、躯干运动及起协调情况[5], 该方法对动物的行为学症状观察的比较详细、全面, 与脊髓损伤的程度高度相符[6]。鉴于此, 该方法被广泛应用于脊髓损伤动物模型的评价。本实验, 动物在术后活动正常, 随着时间的延长动物会逐渐出现在BBB评分中提及的跖肌步态 (plantar step) 、后爪在运动时的旋转运动、脚趾间隙的扩大、髋膝踝的过度运动 (extentive movement) 、不稳定躯干运动 (trunk instability) 、前后肢不协调运动 (FL-HL incoordination) 不能支持体重 (no weight support) 等行为学症状。动物出现的症状有连续性, 较好的模拟了脊髓慢性损伤行为变化的全过程, 是一种重复性好慢性脊髓损伤模型, 适用于进一步探寻病因及治疗的动物模型。
3. 2. 2 病理学评价脊髓损伤后, 除机械性性损伤外, 在数小时及数天内出现复杂的继发性损伤, 神经细胞坏死、调亡是脊髓损伤的病理变化重要组成部分, 最终导致脊髓灰质神经元数量的减少, 另一个很明显的变化是神经纤维脱髓鞘, 有实验表明, 在灰质坏死部分的边缘与剩余脱髓鞘轴索之间存在一个长纤维束的不完整的轴突区域, 在这个区域有节段性的脱髓鞘现象[9,10], 本实验亦发现在每组都有不同程度的神经细胞的坏死, 以及随之而来的神经元的减少及白质的脱髓鞘现象, 说明在慢性脊髓损伤过程中, 神经细胞的坏死是一个渐进连续的过程, 究竟神经细胞的密度下降到什么程度时脊髓的功能无法恢复, 仍需进一步研究。实验中还发现大部分动物行为学评分与病理学检测是相符合的, 但亦有少部分动物病理变化与行为学评分不相符合的情况发生。
综上所述, 用该种方法可以很好的复制慢性脊髓损伤病理发展过程, 而且操作简便, 对材料要求较低, 易于制作成功, 该方法制作的模型适合于进一步应用于脊髓型颈椎病的病因及治疗的研究中。
摘要：目的 探寻简便易行的慢性脊髓损伤模型建立方法 , 为探索脊髓型颈椎病的损伤机制、病理及进一步为治疗奠定基础。方法 56只成年wistar雌性大鼠, 随机分为实验组和对照组, 各28只。根据大鼠脊柱解剖结构特点自行设计一种大鼠脊髓压迫复合体, 用以制作大鼠慢性压迫模型。运用行为学、病理组织观察等方法评价模型的可靠性。结果 脊髓压迫后两组大鼠行为学评分 (BBB) 比较差异有统计学意义 (P<0.05) ;观察两组病理切片, 可见实验组明显出现尼氏体减少, 细胞核崩解, 神经元坏死、减少, 泡沫细胞形成, 神经纤维脱髓鞘。结论 本方法提供了一种理想的制作鼠慢性脊髓压迫损伤方法。
关键词：脊髓损伤,动物模型,大鼠,病理
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雌性甲亢大鼠模型的建立 篇7
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物
Wistar雌性大鼠44只(购于内蒙古大学实验动物中心),体重210~270 g,鼠龄60 d;饲养室温18~25 ℃,相对湿度50 %~70 %,保持清洁通风。
1.1.2 实验药品及试剂
甲状腺片剂(山东中泰药业股份有限公司)为40 mg/片,FT3、FT4、TSH放射免疫试剂盒及质控血清购于山东潍坊市三维诊断技术有限公司。
1.2 方法
实验动物随机分为甲亢模型组和对照组,其中对照组20只,灌服生理盐水1 mL/100 g;甲亢模型组24只,随机分为3组,将甲状腺片用蒸馏水洗去表面有色糖衣,用研钵和杵子将其研末,用生理盐水分别配成5 mg/mL、10 mg/mL、20 mg/mL混悬液。每天1次连续经口灌胃给药,给药量分别为每日5 mg/100 g、10 mg/100 g、20 mg/100 g。每天记录饮食、饮水量,行为指征;每隔3 d称量体重,调整给药量。发现大鼠出现易怒好斗、体重减轻、饮食量增加等典型的甲亢症状时,进行眶静脉采血2~3 mL,使用KDC-2044低速冷冻离心机离心后取血清,使用全自动γ免疫计数器采用放射免疫法检测游离三碘甲腺原氨酸(FT3)、游离四碘甲腺原氨酸(FT4)及促甲状腺激素(TSH)水平。
使用SPSS 11.5进行数据分析,先进行方差齐性检验,方差齐采用单因素方差分析。实验数据采用均数±标准差(
2 结果
2.1 外观行为
对照组大鼠精神状况、活动情况、毛色光泽均未见异常。模型高剂量组大鼠第15 d出现易怒、好斗、饮食饮水量增多,中低剂量组大鼠分别于造模第22 d和第25 d出现上述症状。实验第33 d全部出现上述症状,并且部分大鼠毛色枯犒及明显脱毛。
2.2 体重变化
实验前各组大鼠体重比较差异无统计学意义,实验后的造模低剂量组体重与对照组比较差异无统计学意义,中、高剂量组与对照组体重比较差异有统计学意义;造模各组实验前后的体重变化(差值)分别为低剂量组体重增加6.50 g、中剂量组体重减少5.25 g、高剂量组体重减少16.50 g,对照组体重增加24.10 g,与对照组比较差异均有统计学意义。体重变化显示随给药剂量增加,体重增长缓慢甚至体重减轻。见表1。
*与对照比较P<0.05,**与对照比较P<0.01
2.3 血清FT3、FT4、TSH检测结果
经灌胃甲状腺素,模型各组与对照组间FT3、FT4及TSH平均值均高于对照组,差异均有统计学意义;造模各组FT3、FT4随着给药量剂量的增加而随之增高,TSH随给药剂量增加呈反向变化。见表2。
*与对照比较P<0.05,**与对照比较P<0.01
3 讨论
本研究成功建立了低、中、高雌性大鼠甲亢模型。对于甲亢模型国内外均有报道,而雌性大鼠甲亢模型报道较少,缺乏确凿的实验依据。国外在建立大鼠甲亢模型时一般都采用腹腔注射T3或者T4的方法[2,3],国内一些研究人员采用优甲乐片灌胃法和甲状腺素片灌胃法[4,5]。T3、T4注射液价格高,优甲乐片价格也较国产的甲状腺素片高,优乐甲片灌胃法[5,6]一般需20~30 d。本研究显示甲状腺素片灌胃法需30 d左右。甲状腺素片灌胃法的给药剂量各文献报道并不相同,如安平[6]用甲状腺片每日5 mg/100 g连续灌胃雌、雄Wistar大鼠,给药14 d制备甲亢模型;林兰等[7]用每日60 mg/100 g甲状腺素片混悬液给Wistar雌雄大鼠灌胃14 d制备出大鼠甲亢模型。本研究结果显示每日5 mg/100 g剂量组连续给药33 d后尚不能确定出现甲亢,可能与统计样本数量较少及大鼠的个体耐受性不同所致,也可能与使用药物、试剂盒厂家不同有关;中、高剂量模型组的大鼠外观、行为变化与安平、林兰、刘婷[8]等的研究结果一致;本研究推荐甲亢造模剂量为每日10~20 mg/100 g,时间约30 d。本模型是通过单纯灌胃甲状腺素实现的,满足了实验条件控制单一的目的,具有方法简单、成功率高、死亡率低、稳定性强等优点。值得指出的是本模型并非Graves甲亢。
摘要：目的:建立雌性甲亢大鼠模型。方法:为低、中、高三个剂量组灌胃给药甲状腺素片混悬液造成大鼠甲亢,对照组灌胃生理盐水,观察行为变化及体重变化,经放免法检测FT3、FT4及TSH值。结果:成功建立雌性甲亢大鼠模型,甲亢各组大鼠的血清FT3、FT4水平较对照组明显升高,TSH值下降。结论:使用甲状腺素片制备雌性大鼠甲亢模型推荐采用每日1020 mg/100 g剂量组,时间约30 d。
关键词：甲亢,雌性大鼠,模型
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皮肤创伤愈合大鼠模型的应用进展 篇8
1模型的类型
以Davidson等[1]描述的各种动物创伤愈合模型为框架, 结果显示, 55个研究中有10例所用模型属慢性创伤模型。为了复制缺血条件, 9例研究应用皮瓣手术, 1例研究应用阿霉素溢出法制备皮肤坏死模型。有些研究属几种类型, 如某研究中部分应用了36个月龄的大鼠, 应归为衰老和创伤愈合的复合型模型。据Gottrup等[2]的报道, 没有可与人的慢性不愈性创伤相比的大鼠慢性创伤模型, 大部分应用急性外科创伤模型, 可分为切口和切除模型。其他模型有死亡空间、创伤腔室、烧伤及功能减弱。
2复合模型的应用
在应用烧伤模型的研究中, 使用部分层创伤。如应用有毛动物, 像典型的SD大鼠和Wistar大鼠, 采用皮刀等装置制作部分皮层创伤在研究中存在固有问题:高密度的被毛可夸大啮齿动物模型的上皮再生率。对被毛大鼠使用脱毛剂, 结合刮或不刮的优缺点及各实验来考虑。
Davidson等[1]的研究还发现伤口大小有所不同, 当4项研究采用相同创伤技术、在相同部位制作相同面积的伤口, 即在大鼠背部制作4cm切口。因采用相同技术进行研究的数量很小, 无法从数据中得到一致证据。在应用圆形伤口所做研究中, 创面大小不同, 有直径6mm、15mm创面, 直径1.5cm圆形切口及直径>2cm创面, 切口长度5mm～8cm不等。烧伤创面包括直径6mm的圆形液氮灼伤、在脱毛背部制作占体表面积15%～20%的烫伤及用直径1.5cm金属棒制备的烫伤模型。皮瓣大小有:2cm×4cm、4cm×10cm、3cm×6cm、7cm×1.2cm、7cm×5cm。
创面大小是创伤研究中需要考虑的主要问题之一。在实验性研究中, 无论最初设计的形状如何, 最终的大小和形状均受保留皮肤的弹力影响。据Montandon等观点, 在圆形溃疡观察到的收缩减低常是因缺乏延展性或与周围皮肤黏附所致的一种继发现象。对创伤愈合的研究, Montandon等推荐应用≥4cm的方形创面, 有利于研究收缩和上皮化对伤口愈合的作用。另一方面, Cross等[3]认为相对于总体表面积而言的大创面所致的代谢和物理胁迫可单独影响创伤愈合的研究结果。为减小胁迫作用, Cross等选用15cm×15mm而非20cm×20mm创面, 应用于200～350g成年雌性Hooded Lister大鼠。
3麻醉剂和止痛剂
注射用麻醉剂 (如戊巴比妥或克他命/甲苯噻嗪混合制剂) 比吸入性麻醉剂更常用。在选择麻醉剂时, 必须考虑其造价、可用性及与其他药物配伍等内容。
4分析方法
创伤愈合的研究人员应用大体和组织学联合观察、生物化学和生物机械学测量、创伤愈合标志物的分析、常将细胞学反应和免疫学反应结合来分析评价创伤修复的进程。组织学评价中新生上皮、炎症和血管反应的进程、皮层的厚度、伤处胶原的形成等常被测量。
创伤愈合目的是恢复组织的完整性并抵抗来自外部的压力。在动物模型中, 愈合过程可通过测定创面机械强度的形成来评价。大部分研究使用张力计测定创面的张力, 使用撕断力评价皮肤模型。皮肤收缩和上皮再生的区域可应用示踪和面积GRID技术结合计算机分析来评价。电镜、血管VASCULATURE PATENCY测定、免疫组化测定和遗传学水平的调查也是评价结果所用到的其他一些方法的代表。在报告结果中使用不同的方法只是增加了各研究结果间的直接相互比较。实验条件和创伤技术的变化较大, 使相互间的比较不可能完全科学公正。应进行一个单独的研究, 观察不同品系大鼠的创伤愈合能力, 与此同时, 尽可能减小其变量, 如动物的体积大小、性别、年龄、环境条件、动物的操作、创伤模型的制作技术、记忆对愈合分析的所有参数。
综上所述, 模型必须具有能被检测的可能, 需研制技术和重现性标准化的实验模型, 这样可通过科学的方法对来自不同治疗方式的结果进行比较。对各研究最终治疗效果的准确比较需以创伤愈合知识为基础。
关键词：创伤愈合,大鼠模型
参考文献
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大鼠模型论文 篇9
1 材料
1.1 仪器
岛津SPD-10A高效液相色谱仪 (日本岛津公司) ;MilliQ超纯水处理装置 (美国Millipore公司) ;HC-2517型高速离心机 (科大创新股份有限公司) ;XW-80涡旋混合器 (江苏海门市麒麟医用仪器厂) ;QF-3800氮气吹干仪 (泉州市恒德集团有限公司) ;HS6150型超声波清洗器 (天津恒奥科技发展有限公司) ;SHZ-DⅢ型循环水式真空泵 (巩义市予华仪器有限责任公司) 。
1.2 材料与试剂
Open-field自制敞箱 (80cm×80cm×50cm) ;甲醇 (色谱纯) (天津市科密欧化学试剂有限公司) 。
1.3 实验动物
SPF级SD雄性大鼠, 体重 (240±20) g, 辽宁长生生物技术有限公司提供, 生产许可证号:SCXK (辽) 2010-0001, 合格证号:211002300002168。
2 方法
2.1 动物分组
采用敞箱实验进行行为学评分, 选择得分相近的大鼠80只, 取其中12只作为空白对照组, 其余均为模型组。按“2.2”项下造模方法造模, 记录大鼠死亡数量, 于造模后第14天处死12只大鼠, 记为模型1组;于造模后第21天处死12只大鼠, 记为模型2组;于造模后第35天处死12只大鼠, 记为模型3组。
2.2 造模方法
除空白对照组外, 动物每只单笼饲养, 将其禁水24h, 禁食24h, 夹尾1min, 2 200V直流电电击足底10次 (早、中、晚) , 水平震荡5min (160Hz) , 明暗颠倒24h, 0℃冰水游泳, 40℃环境5min, 8种刺激随机安排在35天内, 每日2种, 使动物不能预料刺激的发生, 空白对照组不予任何刺激。分别在第14天、第21天、第35天末次处理1h后, 断头处死, 取血清, 对模型1组、模型2组、模型3组、空白对照组进行生化指标皮质酮检验。
2.2.1 体重测定
每日9时每只大鼠加食物10g, 模型组在接受禁食刺激时除外, 于造模第1、7、14、21、35天, 即每隔1周测量1次体重, 记录体重变化情况。实验结果见表1。
2.2.2悬尾次数
将大鼠成倒挂状态, 其头部离台面约10cm, 用板隔开相邻动物的视线, 悬挂5min, 于造模第1、7、14、21、35天记录悬尾次数。实验结果见表1。
2.2.3 糖水消耗
参照文献[8], 训练动物适应含糖饮水, 每笼同时放置2个水瓶, 第一个24h, 2个瓶内均装有1%蔗糖水, 24h后, 同时给予每只大鼠500mL两瓶水, 1个瓶装1%蔗糖水, 1个瓶装纯水, 24h后, 取走糖水瓶并称重, 计算大鼠的总液体消耗、糖水消耗、纯水消耗、糖水偏爱 (糖水偏爱=糖水消耗/总液体消耗×100%) , 记录造模第1、7、14、21、35天大鼠糖水偏爱值。为避免体重差异对实验结果的影响, 故1%蔗糖水饮用量按每100g体重消耗的糖水偏爱值表示。实验结果见表1。
2.2.4 强迫游泳
按照Porsolt[4]的行为绝望法, 将大鼠置于冰水中游泳, 记录大鼠在冰水中挣扎时间、漂浮时间。实验结果见表1。
2.2.5 敞箱实验
敞箱为80cm×80cm×50cm的自制无盖箱, 内壁为黑色, 底为白色, 在底部用黑色笔划分25个等格, 在造模后第7、14、21、35天进行观察, 将一只大鼠放入敞箱正中央, 每有三爪以上跨入邻格记1分;后肢直立1次 (两前爪腾空或攀附墙壁) 记1分;沿线行走, 以每10cm记1分, 记录5min内所得分数。实验结果见表1。
2.2.6 血清皮质酮含量检测
分别于造模第14天、21天、35天末次刺激后1h, 摘眼球取血, 断头处死。采用高效液相色谱法, Agilent TC-C18 (4.6mm×150mm, 5μm) 色谱柱, 以甲醇∶水=60∶40为流动相, 1.0mL·min-1的流速, 30℃的柱温, 242nm的波长下测定大鼠血清皮质酮含量。实验结果见表2。
2.3 统计学分析
用统计软件SPSS19.0进行单因素方差分析, 计量资料以均数加减标准差 (±s) 表示。P<0.05为有统计学差异, P<0.01为有显著统计学差异。
3 结果
慢性中度不可预见性应激对大鼠行为的影响如表1所示。模型组与空白组比较体重、悬尾次数、糖水消耗、强迫游泳、敞箱实验、血清皮质酮含量等指标均有显著性差异, 且模型2组、模型3组血清皮质酮含量较模型1组有明显下降, 而模型3组与2组相比血内皮质酮的含量变化不大, 综合以上指标认为此法21天可造模成功。
注:与空白组比较, *P<0.05, **P<0.01。
(±s)
注:与空白组比较, *P<0.05, **P<0.01。
4 讨论
本实验在CUMS法的基础上, 整合了获得性无助、行为绝望、隔离法、慢性应激等抑郁模型造模方法, 并对其进行了改进, 采用体重、悬尾、糖水消耗、强迫游泳、敞箱实验、血清皮质酮含量等多个行为及生理指标综合评价, 对最佳造模时间进行考察, 建立了一个改进的抑郁症造模方法。结果发现大鼠造模7天体重出现下降趋势, 悬尾次数、敞箱实验得分、糖水消耗等指标均明显下降, 游泳挣扎时间也出现了一定程度的下降, 然而由于对环境及造模方式的不适应, 出现了部分大鼠死亡的情况;造模14天时体重、悬尾次数、敞箱实验、游泳挣扎时间、糖水消耗等指标进一步下降, 且悬尾次数与空白组比较差异显著, 同时血清皮质酮含量较空白组也有明显下降, 由于抑郁模型成模条件复杂, 极有可能出现假阳性的情况, 因此需继续造模以待观察;造模21天时, 体重、糖水消耗、血清皮质酮含量与空白组比较差异均非常显著, 其他指标较空白组相比也均有明显下降;造模35天时各项指标与造模21天相比差别不大, 但死亡率明显增加。故综合以上实验结果, 将最佳造模时间确定为21天。此方法弥补了CUMS法工作量大, 持续时间过长等不足, 且实验结果科学合理, 可为今后抗抑郁药物的新药研发、病理研究等提供参考。
参考文献
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大鼠模型论文 篇10
【摘要】目的：研究吗啡成瘾性和戒断大鼠在虎门合剂给药后GABA阳性神经元数量的变化。方法：通过提升传统建模方法建立大鼠成瘾模型和模型评估系统，同时利用免疫组化法观察虎门合剂给药后吗啡成瘾和戒断大鼠阳性细胞元的变化。结果：吗啡依赖大鼠海马CA1区和齿状回GABA阳性神经元数目明显减少，虎门合剂治疗组海马GABA阳性神经元数量和光密度均显著升高。结论：虎门合剂对吗啡损伤一般记忆的效应具有拮抗作用。
【关键词】物质依赖；γ-氨基丁酸（GABA）；海马；神经元；虎门合剂
【中图分类号】R965【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517（2016）21-0015-04
Influences from Traditional Chinese HuMen Composition on GABA Immune Positive Neurons of Morphine-Dependence and Withdrawal Rats
DING YoufangLIN HanLI Shuchun*
Institute of Chinese Minority Traditional Medicine， Minzu University of China， Beijing 100081， China
Abstract：Objective To discuss the changes occurring in GABA positive neurons of morphine-dependence and withdrawal Rats after given HuMen Composition. Methods Rats addiction models and model evaluation system were established in the study through improving the traditional methods of building models. At the same time， immunohistochemical method was used to observe the changes occurring in positive neurons of morphine-dependence and withdrawal Rats after given HuMen Composition. Results the number of positive neurons is obviously decreased in hippocampus CA1 and Dentate Gyrus areas of morphine-dependent rats. In the treatment group of HuMen Composition， the number of hippocampus GABA and optical density are all increased respectively. Conclusion HuMen Composition may have certain antagonistic effect in curing damaged memory induced by morphine.
Keywords：Addiction；GABA；Hippocampus；Neurons；HuMen Composition
虎门合剂为名医验方，在甘肃、河南等地进行的中药戒毒的临床研究中取得了满意的疗效。尤其是1996年底，该药在云南思茅等地的戒毒所进行临床研究时，快速、高效和无副作用的优点得到了当地有关部门的重视[1]。本方依据阿片类物质戒断综合征的病因病机特点，以中医气血脏象理论为指导，以阴阳双补、去瘀化痰、安神止痛，扶正固本等为治法，对改善成瘾患者稽延性戒断症状，对抗复吸具有明显疗效。
学习记忆在药物依赖中的作用已越来越引起人们的重视，甚至有人提出药物依赖是一种异常形式的记忆[2]。而老年性学习记忆能力减退的研究显示，与学习记忆有密切关系的隔海马投射系统除了有乙酰胆碱以外还有GABA，并且隔核内的胆碱能神经元接受伏核GABA能神经元的支配，GABA能神经元的活动可调节胆碱能神经元的功能[3]。但在阿片类物质依赖所致学习记忆功能改变中GABA的变化及意义未见报道。本研究用免疫组化方法对各组大鼠海马GABA进行研究，试图找出GABA在阿片类物质依赖中的变化规律及其与学习记忆减退间的关系，以及虎门合剂对此的调节作用。
1实验材料
11实验动物：SPF级SD健康雄性大鼠，体重200～400g。数目：60只（北京维通利华实验动物技术有限公司），合格证号：SCXK（京）2006-0008。动物常规饲养，适应环境一周后，随机分为6组，每组10只。模型组按造模方法皮下注射（sc）吗啡，正常组sc生理盐水。中药组在造模同时以虎门合剂灌胃（ig），对照组在造模同时ig生理盐水。模后组在造模完成后以虎门合剂灌胃（ig），模后对照组在造模后ig生理盐水。
12试剂和仪器盐酸吗啡 （mor-phinehy-drochloride，MH）（沈阳市第一制药厂），L-精氨酸（L-Arg）、DAB、花生油，内源性生物素封闭液（ABB）、3%正常羊血清，GABA抗血清，生物素结合IgG（Co1∶200），ABC复合物 （武汉博士德生物工程有限公司），虎门合剂免煎剂（北京中医药大学制剂室）。CM1900横冷式冰冻切片机（德国LAICA公司），Observor行为学研究装置（荷兰NODULES公司）。
2实验方法
21大鼠成瘾模型的建立大鼠称重，采用盐酸吗啡背部皮下注射，对照组将吗啡换成生理盐水，其他处理与模型组相同。给药时间及剂量见表1。
22免疫组织化学取实验大鼠，快速开胸，经左心室主动脉插管，生理盐水快速冲洗后，灌入预冷的4%缓冲多聚甲醛500mL，含025%戊二醛，取脑后固定2～4h，再转入20%蔗糖中，于-70℃冰冻保存。作厚5μm冠状冰冻切片，对含背侧海马的组织切片隔五取一，依次加入含3%正常羊血清中30min（37℃），001mol/L、PH74 PBS接片，03%（体积分数）甲醇过氧化氢封闭内源性过氧化物酶，03%（体积分数）TritonX100 37℃处理30min，ABB封闭内源性生物素。切片上加入GABA一抗（1∶100）及正常血清，4℃下孵育48～72h，加入二抗室温3h，SABC室温反应2h，DAB/H2O2呈色，明胶贴片，脱水透明，中性树胶封固。PBS代替一抗作为阴性对照。
3数据处理
数据均以（x±s）表示，采用SPSS115 统计软件进行方差分析及两两比较进行统计学处理，对3组大鼠各脑区的NA进行单因素方差分析。P<005为差异具有统计学意义。
4结果
41大鼠成瘾模型的评定各组在末次注射后12小时将大鼠放入行为学观察记录箱中，1min后开始用Observor观察戒断体征，历时20min，戒断体征分为可数和不可数体征，可数体征包括：齿颤，咀嚼，直立，湿狗样抖动，跳跃。直接记录20min内的次数得分。不可数体征包括：上睑下垂、流泪、流涎、眨眼、腹泻等，按评分标准评定（表2）。凡有接触惊叫大鼠均增加2分。全部体征得分之和为戒断总评分[3]。
吗啡成瘾大鼠和对照组大鼠戒断后，经过20min观察，两组动物戒断症状出现频次情况见表3。可见，吗啡成瘾大鼠模型的建立是成功的。模型组自然戒断诱发戒断症状结果是（3482±053）次，对照组的结果是（101±064）次，差异具有统计学意义（P<001）。
42海马不同亚区GABA阳性神经元的分布海马结构内GABA免疫组化染色可见阳性胞体和突起，细胞分布于海马各区，其中CA1区较多，并可见有较长突起的Golgi样染色细胞（图1A）。齿状回分子层的细胞相对稀疏（图1B）。
与正常组相比，GABA免疫染色阳性细胞在模型动物海马内的密度较低，定量结果显示，海马结构内CA1区的GABA阳性细胞与模型组对比明显减少，差异具有统计学意义（P<001）（图1C），齿状回分子层内的GABA阳性细胞（图1D）在模型组表达与正常组比较差异无统计学意义（P<005）。见表4。
中药组海马内GABA阳性神经元在CA1区数目与模型组相比有统计学意义（P<001）（图1E、F）。中药对照组海马结构内GABA阳性神经元见于CA1、CA3区和齿状回，各区的细胞形态和分布模式与对照组和模型组比差异无统计学意义（P>005）。但在CA1区GABA阳性神经元数目与中药组比较显著降低，差异具有统计学之义（P<001）（表4），染色的强度也极度变淡（图1G、H），说明中药具有治疗作用。
5讨论
GABA是哺乳类中枢神经系统中的主要抑制性神经递质，广泛分布于与学习记忆有密切关系的隔海马投射系统。与学习记忆有密切关系的隔海马投射系统除了有乙酰胆碱以外还有GABA，并且隔核内的胆碱能神经元接受伏核GABA能神经元的支配，GABA能神经元的活动可调节胆碱能神经元的功能[5]。GABA在老年学习记忆能力损害的过程中起着非常重要的作用[6]。有研究显示行为学训练前隔区内注射GABA受体激动剂可损害动物的空间学习记忆能力，若训练后给药则可易化学习过程；训练后纹状体内注射GABA受体拮抗剂荷包牡丹碱可引起严重的逆行性遗忘症[7]。此外，GABA代谢酶抑制剂可通过提高脑内GABA水平而加重基底核损伤所致的空间定向能力障碍[8]。因此，可以认为GABA是参与学习记忆过程的另一重要的神经递质系统。
在海马GABA存在于非锥体神经元，按其与其它递质的共存情况可分为多种亚型：①含钙结合蛋白的GABA能中间神经元，主要是含小白蛋白和钙结合素D28K。②含神经肽的GABA能神经元，目前已发现的GABA能神经元内的神经肽有生长抑素，胆囊收缩素，血管活性肠多肽和神经肽-Y。③含一氧化氮合酶的GABA能神经元。④不含上述物质的GABA能神经元。这些亚群间的神经元有很多相互重叠，即GABA能神经元可与多种神经活性物质共存。如大鼠海马CA1区GABA阳性神经元中约有30%含有PV，而PV阳性神经元中有96%含CaBP，14%PV阳性神经元含有SOM。可见GABA神经元是一类非常复杂的神经元[9]。
本交实验结果显示，模型组海马本部各区的GABA能神经元均明显减少（P<001）；在齿状回分子层，GABA阳性神经元的光密度在模型组明显少于对照和中药组；而成瘾组与用药对照组之间没有明显差异（P>005）。因此，可以认为海马CA1区和CH区的GABA能神经元在戒断时明显减少，但学习记忆能力的改变究竟是GABA的直接作用还是GABA通过影响其他神经递质而间接作用，还有待进一步的研究。
众所周知，海马结构内的GABA能神经元是一类中间神经元。它接受基底前脑GABA能传入纤维的支配，而不接受胆碱能传入纤维和谷氨酸能传入纤维的支配。它发出的轴突支配海马的锥体细胞。损伤研究显示，致癫痫药物可引起海马内GABA免疫反应终扣的丢失，并有不同程度的GABA能神经元结构损伤，表现为线粒体肿胀，细胞器崩解和神经末梢变性[10]。也有研究显示[11]，GABA可通过控制其靶细胞BDNF的表达水平而调节海马中间神经元的表型，表现在发育早期GABA可促进神经元以旁分泌的形式产生大量BDNF，从而使GABA能中间神经元体积增大，表达NPY增加，发育晚期，GABA抑制BDNF合成，GABA受体激动剂蝇蕈醇可引起中间神经元体积缩小，NPY表达减少。NPY是与GABA共存的一种神经肽，可抑制CA1区和CA3区锥体细胞的兴奋性传递。可见GABA有可能是成瘾过程中GABA能神经元环路变性的一种使动因子。
本实验发现虎门合剂治疗组海马GABA均有所升高，说明虎门合剂对吗啡的损伤一般记忆效应具有拮抗作用。这种改善作用可能是中药促进学习记忆的一般机制之一。同时按着中医对脑病的研究成果来看，完全可以将依赖疾病定义为脑络之病，至少是一种脑病。
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局灶性脑缺血大鼠模型的建立 篇11
1术前准备
1.1 大鼠选择
一般选择SD大鼠, 其大脑动脉环 (Willis环) 解剖结构相对稳定, 变异较少。体质量一般为250～300g, 级别为清洁级以上的精壮大鼠, 购买回来后严格按照规则适应性饲养1周。
1.2 动物麻醉
根据文献的报道及实验室的实际操作对比, 用10%水合氯醛4ml/kg腹腔注射可达到较满意的麻醉效果。实践证明麻醉前不必禁食, 因大鼠无呕吐反应, 不用担心胃内容物反流阻塞气管而窒息死亡。
2模型的建立
2.1 历史沿革
Koizumi等[1]于1986年首次采用颈总动脉插入尼龙线栓建立大脑中动脉闭塞模型并获得成功。Longa等[2]于1989年将其方法改进, 即每只大鼠按400mg/kg体质量腹腔注射三氯乙醛进行麻醉, 将30mm的4-0尼龙线栓的一端用酒精灯烧灼至钝圆, 从颈总动脉分叉处远端插入至颈内动脉管腔约17～18mm, 至有阻力感为止, 缺血诱导120min后抽出线栓进行再灌注, 最后将其放回鼠笼并密切监视其麻醉苏醒清况。后来学者多按其方法造模。
2.2 个人方法
本实验室采用Liu等[3]改进的大脑中动脉线栓法建立局灶性脑缺血大鼠模型, 10%水合氯醛4ml/kg腹腔注射麻醉, 固定后颈部正中消毒, 然后做一长约2.5～3.0cm的切口, 钝性分离出右侧颈总动脉, 在其远心端分叉处分离出颈内动脉和颈外动脉。结扎颈总动脉和靠近气管的颈外动脉, 然后在颈总动脉分叉处近心端作一小切口, 将一段一端钝圆的4～0尼龙线由颈总动脉插入至颈内动脉, 感觉到有轻微阻力为止, 大约进入 (17.0±0.5) mm, 然后结扎固定, 缝合切口。手术过程中室温保持在20～30℃并使用加热垫或灯光照射, 术后将动物放入清洁的饲养盒中, 自由饮食活动。
2.3 其他方法
Katsunori等[4]用原创的“四血管闭塞法”建立大鼠脑缺血模型, 戊巴比妥钠50mg/kg腹腔注射麻醉, 用双极电凝器电烙双侧椎动脉, 暴露双侧颈总动脉, 用液压血管封堵器将其闭塞, 使脑血液循环中断10min, 麻醉苏醒后出现右侧肢体扶正反射。Oh等[5]建立短暂局灶性脑缺血模型, 用含2.5%乙醚的N2O和O2 (70∶30) 的混合气体将大鼠麻醉, 颈部正中切口, 暴露右侧颈总动脉, 将一段钝头涂有硅的4～0尼龙线从分叉处插入右侧大脑中动脉, 大脑中动脉阻断 (MCAO) 2h后抽出线栓进行再灌注, 以严重左侧偏瘫和右侧Horner征作为模型标准。另外还有光化学诱导法、栓塞法等。
3模型的评定
3.1 Longa分级评分法
Longa等[2]用五级评分标准在大鼠MCAO造模苏醒后24h进行神经系统指征评定, 0级:行为无明显变化, 0分;1级:左前肢屈曲, 左后肢伸展, 1分;2级:有左侧追尾现象, 2分;3级:行走困难, 摇摆不定, 3分;4级:无自发性活动, 有意识障碍, 4分。将第1、2、3级大鼠确定为成功模型, 分值越高, 说明动物行为障碍越严重。
3.2 红四氮唑 (TTC) 染色法
TTC是脂溶性光敏感复合物, 用来染色检测哺乳动物组织的缺血梗塞。将大鼠断头取脑后放入-20℃冰箱速冻25～30min, 取出后切片, 一般切成5～6片, 每隔2mm一片。切片部位在与后叶尾极之间。将切片置于2%TTC中, 放入37℃水浴箱中20～30min。MCAO模型成功的标志之一是大脑中动脉供血区的梗死, 即TTC上皮质及纹状体和部分海马梗死。
3.3 其他
动物苏醒后表现为提尾时左前肢内收屈曲;同侧Horner征;爬行时向左划圈;站立时向患侧倾倒。凡具有上述4项体征者即可评定为研究对象。
4问题与展望
大鼠局灶性脑缺血模型已经应用到多项实验研究当中, 如干细胞的研究、缺血性脑卒中的治疗等, 较熟练的掌握造模技术, 不但可节省实验时间, 而且还可降低大鼠的死亡率、节约科研经费等。在造模操作中会遇到种种问题与困难, 如线栓插不进去、死亡率高等, 插线的深度一定要掌握好, 一般线栓进入颅内的深度为6～11mm, 插入太浅大鼠无反应, 造模不典型、不成功;插入太深, 则会插破大脑血管, 导致大鼠蛛网膜下腔出血 (SAH) , 容易引起死亡, 同样也是造模不成功。造模后70%的大鼠都会有症状, 如无症状则应考虑线栓的粗细是否合适, 插入的深度是否合乎要求。偶而也有线栓插不进去的时候, 多由动脉未分离好或操作不熟练引起, 应继续分离颈内动脉后将线栓重新插入并多加练习反复操作。经过多次对比实验, 将线栓用蜡涂一层会明显降低模型的死亡率, 这样可避免划破血管。这就需要实验研究人员不断的去改进和创新实验方法。总之, 要熟练掌握并运用造模技术, 造出符合标准的局灶性脑缺血大鼠模型, 为下一步实验研究打下基础。
关键词：大鼠,脑缺血, 局灶性,实验模型
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