心肌梗死模型大鼠

2024-05-10

心肌梗死模型大鼠（精选12篇）

心肌梗死模型大鼠篇1

1 方法

Wistar大鼠101只, 10%水合氯醛腹腔注射麻醉, 以肢体导联 (Ⅱ导联) 进行心电图监测。气管切开插管接动物呼吸机, 在胸骨左缘心脏搏动处切口, 经第3肋与第4肋间分离开胸暴露心脏, 在左心耳下缘与肺动脉圆椎间距主动脉根部约3 mm处进针, 结扎左冠状动脉前降支, 以心电图出现ST段弓背向上抬高大于0.2 mV, 持续30 min以上作为模型成功的标志[1]。术后肌肉注射青霉素80×104 U, 连用7 d, 预防感染。3 周后观察大鼠存活情况, 复查心电图并开胸观察心肌组织的形态学变化。

2 结果

2.1 心电图变化

术中结扎左冠状动脉前降支后, 心电图出现ST段弓背向上抬高 (大于0.2 mV) , 其中, ST段在10 s内抬高的有57只, 10 s～30 s内抬高的有25只, 30 s以上抬高的有13只, 共有6只在结扎前降支后出现心室纤颤死亡;3周后复查心电图, 有18只出现Q波, ST段回到基线水平, 46只出现QS波。

2.2 心脏改变

术中结扎前降支后, 肉眼可见结扎远端心肌颜色变浅, 主要局限在左心室, 靠近心尖部最为明显, 正常和缺血交界处充血, 颜色发绀;3周后开胸, 梗死区心肌组织已由瘢痕组织替代而变薄、苍白, 非梗死区心肌肥厚, 左心室腔明显扩张。

2.3 死亡及存活情况

术中、术后72 h、术后1周～2周及术后2周～3周大鼠死亡率分别为11.00%、12.87%、7.92%、4.95%, 死亡多发生在术中及术后72 h内;存活3周以上为陈旧性心肌梗死大鼠, 存活率为63.37%。

3 讨论

心肌梗死是威胁人类生命的重大疾病, 稳定的心肌梗死动物模型的开发与应用, 是研究人类心肌梗死病理、诊断和治疗的基础。本次研究中采用结扎左冠状动脉前降支的方法制作陈旧性心肌梗死大鼠模型, 发现术后3周以上大鼠的存活率为63.37%, 术中及术后72 h内是大鼠死亡率较高的时期。

术中死亡的主要原因是心律失常, 有6只 (54.55%) , 其次是肺损伤、失血性休克。只有准确结扎左冠状动脉前降支, 才能保证稳定的心肌梗死模型制备成功;加强呼吸道管理及术后护理是提高大鼠成活率的重要措施。①快速、准确地结扎冠状动脉。心律失常多发生在术中结扎冠状动脉后, 故选择适当的结扎部位十分重要。一般选择以左冠状静脉主干为标志, 在左心耳根部下方2 mm处进针, 在肺动脉圆锥旁出针, 太高则室性纤颤的发生率增加;另外结扎动作要快, 时间太长会影响心脏的射血, 增加心律失常的发生机会[2]。②减少肺损伤的发生。肺损伤多发生在开胸和关胸时, 所以建议在开胸时先用小镊子破开胸膜, 然后用眼科开睑器纵向撑开第3肋、第4肋间, 这样可以避免剪断肋骨后残端扎伤肺, 也有利于保持大鼠胸部正常的解剖结构, 不影响其术后的呼吸功能, 利于大鼠长期存活;关胸时尽量上提胸廓, 在大鼠呼气末缝合避免针尖损伤肺组织。③术中及时止血, 避免大出血死亡;气管切开时要避开颈部血管, 防止出血、渗液进入气管切口引起气管堵塞。术后死亡则主要因为心力衰竭和肺部感染, 故在术后应保持良好的生存环境:①室温一般为22 ℃左右, 空气湿度60%～70%为宜。②每天更换大鼠饮用水, 保持饲料的充足, 勤换鼠笼下面的垫料, 保持其干燥, 两天换1次为宜, 这样可以避免因垫料潮湿导致伤口的感染。③术后预防性应用抗生素3 d～7 d, 发现伤口化脓的大鼠应立即隔离并及时行清创处理, 必要时可延长抗生素的使用时间[3]。实验中我们尝试在缝合前往伤口处撒消炎药粉后发现, 可刺激组织渗液而造成积液。3周后开胸观察, 梗死区由瘢痕组织替代而变薄、苍白, 非梗死区心肌肥厚, 左心室腔扩张, 说明心肌梗死后心肌组织出现了病理形态学的改变。研究表明, 心肌梗死后心室发生重塑改变, 其中胶原纤维增多, Ⅰ型、Ⅲ型胶原比例的改变严重影响了心肌功能, 继而出现心力衰竭, 是心肌梗死后死亡的主要原因之一[4]。心肌梗死发生后, 早期的修复过程主要是Ⅲ型胶原表达水平升高, 而心肌梗死后胶原蛋白的成分改变是心腔扩大的病理基础。

参考文献

[1]付鹏, 牛铁生, 姜春力.一种慢性心肌梗死大鼠动物模型的建立方法[J].中国比较医学杂志, 2006, 5 (16) :295-297.

[2]刘元生, 陈运贞.慢性心肌梗塞大鼠实验模型[J].重庆医科大学学报, 2002, 27 (2) :153-155.

[3]孙敬方.动物实验方法学[M].北京:人民卫生出版社, 2001:369.

[4]Sprinale FC, Coker ML, Bond BR, et al.Myocardial matrix degrada-tion and metalloproteinase activation in the failing heart:Apotential therapeutic target[J].Cardiovac Res, 2000, 46 (2) :225-238.

心肌梗死模型大鼠篇2

目前在以肝脏为靶脏器的药效研究仍不理想，除了药物本身的药理作用原因外，肝靶向性差可能是重要的原因之一[3]。药物必须在其作用部位达到足够的浓度方能产生其特征性效应[4]。药物经周围静脉进入血液循环后，经过药代动力学的改变，到达肝脏的浓度已相当低，从而影响了临床疗效。而大剂量药物使用又可能造成对其他脏器的严重毒副作用，或医疗成本的提高。经由导管置入肝固有动脉的开口，药物可以不经体循环，顺血流直接作用于肝脏，肝靶向性强。这项技术能有效的提高药效、减低用药剂量、降低治疗成本以及减少药物的毒副作用。如，肝癌血供的90%以上来自肝动脉，经肝动脉给药可有效提高肿瘤局部的药物浓度，从而提高药效，减少抗肝肿瘤药物对其它脏器的毒副作用。所以肝动脉插管并体外留置大鼠模型在抗肝肿瘤、肝衰竭等研究药物对肝脏作用是有重要意义。

大鼠脊髓损伤模型建立及评价篇3

[关键词] 脊髓损伤模型建立

引言

脊髓损伤是目前临床上多发且致残率较高疾病,给患者家庭、社会带来沉重负担。脊髓损伤患者生活质量明显低于正常人群[1]。脊髓作为人体低级反射中枢,其损伤直接影响到人体各器官、组织的正常生理功能。为此许多学者投入到了关于脊髓损伤的研究中,研究发现中枢神经损伤后仍具备一定的再生能力。为了找寻更好的治疗方法,标准的、可重复性高的动物模型建立尤为重要。近年来在脊髓损伤模型建立方面已有很大进展,在此回顾常用的脊髓损伤模型建立方法并进行相应评价。

Allen’s造模法

早在1911年,Allen应用重物下落敲击的方法制备出脊髓损伤动物模型[2]。实验过程中,可分别通过对重物重量、重物下落高度及损伤截断的调整而制作出不同程度、不同类型的损伤模型,由于该种方法具有最大限度的模拟现实损伤情况,不破坏硬脊膜以防止外源性物质进入脊髓内部形成干扰,避免手术过程中脊髓外露和脑脊液渗出等诸多优点[3],一直被沿用至今,但因该方法对于损伤程度、损伤位置等具有不定性,脊髓模型的严格标准性无法达到而存在着相应的不足。随着研究的推进,相继出现了一些Allen’s造模法的改良方法。

1 将打击头置于硬膜上,打击头与重物连接,并用重锤线调节引导玻管后进行敲击[4]。敲击过程中,由于引导玻管及重锤线的调节大大增加了中午落下时位置的准确度。但是也有其不足之处。首先打击头提前置于硬膜上,会造成脊髓实验预想之外的充血损伤;再者,打击头与重物相连接,之间的连接线会影响重物落于打击头的位置,从而出现偏差,易造成不同角度偏瘫;除此之外,此装置在敲击完成时不易做到迅速挪走重物,从而造成脊髓的进一步压迫性损伤。

2 在显微操作条件下,选用直径相同的重物与引导玻管对WD法进行改良,并采用标准型方丝弓槽作为打击垫片[5]。此种改良方法克服了许多不足之处,显微操作环境保证了整体操作过程的准确性,对于相同直径重物与引导玻管的选择,限制了重物在下落过程中偏离,标准型方丝弓槽打击垫片更是克服了敲击过后不能及时挪开重物而造成的损伤这一问题。此法的不足则在于引导玻管与大鼠脊髓暴露处的瞄准不够精细而易发生偏差。

3 除以上应用改良敲击装置造模外,还有许多学者根据Allen’s实验原理制作出精准度大大提高的仪器。Falconer等[6]将大鼠四肢固定于手术台上,应用立体定位仪固定大鼠头部,从而方便移动大鼠头部以调节脊髓位置。仪器包括重物、透明塑料管、铜包衣垫片以及控制重物与垫片并包绕铜线圈的三个电极,电子操纵单位、激光发生器与探测器、换能器等。首先应用电磁极将重物与垫片置于预期位置,将手术暴露脊髓的大鼠放于垫片下,点击开始按钮后,电磁极电磁消失重物沿管道迅速下落,下落过程中有两处激光透过管道小孔进行检测,探测重物下落方位,最后重物落于垫片上打击脊髓,在撞击力最大的一刹那激活第二、三电磁极和换能器,将重物与垫片迅速吸引开,防止进一步的压迫性损伤发生。该种方法可以说将Allen’s造模方法最大限度的完善。但也仅是对脊髓敲击做到了完美,人類的现实损伤情况下破坏的椎骨对脊髓造成的压迫性损伤难以模拟。

脊髓半横断造模法

脊髓损伤在临床高发,越来越多脊髓半横断的病例出现,但对于脊髓半横断动物模型的建立却并不多见,为此,许多学者开始了此类模型建立的研究。

成功动物模型的建立应具备准确性、可重复性高等特点,基于该点考虑脊髓半横断的模型建立更具难度。

1 打开大鼠选定节段处锥板,使用锐利的虹膜刀片半横断脊髓,并用玻璃针吸出损伤脊髓组织[7,8]。该种做法出血少操作方便,故大多研究人员选用此法,但是存在着脊髓去除不完全、易损伤另一半脊髓的不足之处。

2 选择合适器械从右侧椎板开始一次剔除右侧锥板、右侧关节突、棘突直至少量左侧脊髓暴露为止,由后正中沟向右垂直刺入并与脊髓垂直方向向右侧横行切断脊髓,最后自中线向外侧作一次横旋切,以确认半切完全。操作过程在显微环境下进行[9]。显微环境下可以相对准确的找准脊髓正中的位置,进行操作,并为了达到半切完全进行了最后一次横旋切,整体过程精细,该法制作调理清楚,但也存在一些细微的问题,纯手工操作进行椎骨剔除易出现周围组织损伤和不同手术个体的差异性。

3 针对椎骨的打开方法,有些研究者进行了改良。用组织剪划断两侧棘突与锥板交接处,用组织钳将选定棘突向右侧翻起[10]。运用该方法可使锥板剔除标准化,但其采用刀尖冠状面刺入脊髓腹侧,刀尖顺时针旋转左侧直接横断脊髓与上一方法比较又具有半切不完全的不足。

4 为了尽可能的保护硬脊膜的完整性,可以在脊髓半横断完全后对硬脊膜进行缝合处理[11]。这一操作减少了不必要的损伤,但由于伤口小,缝合难度大,使模型建立更加复杂。

5 脊髓半横断的损伤范围的准确把握是操作的难点,林斌珍[12]等运用自制的“脊髓半横断定量刀片”进行实验操作,将该刀片从后正中沟垂直插入,直抵对侧硬脊膜,之后以此为界进行限定脊髓组织切除。这一过程使操作更加标准化,值得学习,但对于对侧硬脊膜的损伤不易控制。

脊髓半横断整体上创伤小,出血较少,继发反应轻,适用于放置移植物或观察药物对脊髓再生作用的实验研究,国内许多学者均采用此种造模方法,但目前脊髓半横断方法局限,更加理想的方法仍有待研究。

脊髓完全横断造模法

为了避免脊髓半切模型建立的复杂性和应用脊髓损伤模型研究治疗药物症状的典型性,许多研究者也选择脊髓的安全横断造模法。

1 用小尖刀将脊髓在节段完全横断,反复切割3～4次并抬起断端确定脊髓完全横断[13]。此方法注重脊髓的离断完全,但是由于反复切割并提起断端会对动物造成很大损伤,不利于实验动物的存活。

2 用自制的银针钩从脊髓腹侧穿过, 挑起脊髓,用显微剪剪断脊髓, 银针自然脱出即可, 然后横断处尾端切除2mm[14]。使用银针操作避免了大范围不必要的损伤,但针对横断处尾端切除2mm,虽确保了离断完全,但是在操作过程中对于不必要损伤的避免给实验增加了难度。

3 李云等[15]手术去除棘突锥板,使选定节段处脊髓暴露,划开硬脊膜,提起硬脊膜并在硬脊膜下方穿过10-0丝线,显微剪横断脊髓后,将丝线提起,以确保横断完全。这种方法在离断脊髓过程中保证离断彻底的前提下尽量避免了损伤,但对于划开硬脊膜及硬脊膜下穿线过程的创伤避免仍需改进。

脊髓完全离断这一模型建立方法的重点在于避免实验预期以外的损伤条件下做到选定节段脊髓的离断彻底。

参考文献:

[1] 金宇,管力,郭世绂.大鼠脊髓损伤动物模型的建立[J].中国组织工程研究与临床康复,2007,11(21):4144-4146.

[2] 张红,刘维钢,黄瑾,等.大鼠脊髓完全性损伤模型的建立[J].中国组织工程研究与临床康复,2009,13(33):6540—6543.

[3] 虞琴,徐娟.大鼠脊髓半横断损伤对脊神经节P物质表达的影响[J].解剖学研究,2008,30(1):8-14.

心肌梗死模型大鼠篇4

关键词：心肌梗死,心律失常,基因芯片,缝隙连接

心肌梗死(MI)是威胁人类健康的主要疾病之一[1],在我国发病率呈现逐年升高趋势[2]。虽然随着MI后再灌注治疗的普及,患者早期死亡率大幅降低[3],但是幸存的MI患者仍具有发生致死性心律失常的潜在风险[4]。这与基因的改变和调控密不可分。因此,有必要从基因水平研究MI后心律失常的发生机制,以进一步降低MI患者的猝死率。本研究制作MI大鼠模型,进行了左心室心肌组织的全基因组表达谱芯片检测和分析,并采用实时荧光定量聚合酶链反应(Real-time PCR)方法验证了心肌细胞间缝隙连接通路相关的3条基因,旨在为进一步从基因水平认识MI后心律失常发生的分子机制提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

雄性SD大鼠,平均体重220g~250g,由北京维通利华实验动物技术有限公司提供,许可证编号:SCXK(京)2002-0003。

1.2 主要仪器

RSP1002型呼吸机(美国Kent公司),心电示波仪(上海医学电子仪器厂),杂交炉(美国Agilent公司),扫描仪(美国Agilent公司),分光光度计(美国Nanodrop公司),Realtime PCR仪(美国Stratagene公司)。

1.3 主要试剂

RNA提取试剂盒(美国Promega公司),RT试剂盒(美国Promega公司),SYBER Green染料(美国ABI公司)。Agilent大鼠全基因组表达谱芯片(生物芯片上海国家工程研究中心)。

1.4 动物模型制备与分组方法

大鼠随机分为模型组和假手术组,参照文献[5]制作MI大鼠模型,用戊巴比妥钠(50mg/kg)麻醉,固定备皮,气管插管,连呼吸机和心电图仪。在左胸第三、四肋间开胸约1.5cm,用眼科弯镊轻提左心耳,在动脉圆锥与左心耳之间下约1mm处用5/0手术线结扎左冠状动脉前降支,迅速关胸缝合。心电图Ⅱ导联显示ST段显著抬高表示结扎成功。假手术组只穿线,不结扎。术后常规饲养1个月取材。

1.5 心肌组织的基因芯片检测和生物学信息分析方法

由生物芯片上海国家工程研究中心完成。首先提取心肌组织样本的总RNA,质检合格后进行总RNA纯化,cDNA合成,cRNA合成,cRNA纯化,cRNA单荧光染料(Cy3)标记,芯片杂交、洗涤、扫描,归一化处理等一系列步骤,得到基因芯片检测结果。然后对模型组和假手术组的芯片数据进行差异基因分析,根据基因在两个分组中几何平均数的比值倍数决定差异基因的变化方向,比值大于1的基因为上调基因,小于1的是下调基因。用Fold Change值表示两组数据均一化以后的信号值的差异倍数。差异基因筛选标准为Fold Change值≥2或≤0.5。在此基础上利用京都基因与基因组百科全书(The Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)细胞通路(pathway)数据库进行差异基因的pathway注释,对差异基因富集的pathway进行归类,初步分析MI后pathway的变化。

1.6 心肌组织缝隙连接蛋白43(Cx43)、蛋白激酶C(PKC)、酪蛋白激酶1(CK1)的mRNA检测方法

登陆GenBank检索基因序列,用Primer Premier 5软件进行引物设计。Cx43上游引物:5′-TTCATGCTGGTGGTGTCC-3′;下游引物:5′-AGTG-GTGGCGTGGTAAGG-3′。CK1上游引物:5′-TACCGC-CAACCGACTCCGAAGT-3′;下游引物:5′-GCGCACCTCT-GTGGAGTCTCAT-3′。PKC上游引物:5′-GCTTCAA-CATCGACATGCCTCACC-3′;下游引物:5′-ACATTCATGC-CGCAGTCTTCACACT-3′。内参基因β-Actin上游引物:5′-AGATCCTGACCGAGCGTGGC-3′;下游引物:5′-CCAGG-GAGGAAGAGGATGCG-3′。提取左心室梗死边缘区心肌组织总RNA,M-MLV逆转录酶反转成cDNA,加入SYBR Green PCR Master Mix组成251反应体系,每个样本做3个平行管,进行Real-time PCR检测。扩增条件均为:95℃10 min变性后;95℃30s,55℃30s,72℃20s,共40个循环。以β-Actin作为内参,将所得Ct值按照2(-ΔΔct)的方法计算mRNA的相对表达量,以差异倍数进行统计分析。

1.7 统计学处理

实验数据以均数±标准差表示,采用SPSS 13.0统计软件进行处理,先进行正态性检验和方差齐性检验,符合正态性分布时,采用独立样本的t检验;不符合正态性分布时,采用非参数检验。相关分析采用Pearson相关分析,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 RNA纯度和完整性检测结果(见表1)

总RNA经分光光度计检测,OD260nm/OD280nm,比值介于1.8~2.1;经琼脂糖凝胶电泳鉴定,28S、18S两条带清晰可见,且无拖尾现象,提示完整性良好,可以进行基因表达谱芯片检测。

2.2 基因芯片检测和生物学信息分析结果

Agilent大鼠全基因组表达谱芯片采用Cy3单色荧光标记,芯片涵盖了41 012个大鼠基因。按照差异表达基因筛选标准,与假手术组比较,模型组共筛选出上调表达的基因3 136条,下调表达的基因2 222条。pathway富集度分析显示,这些差异基因共涉及了130个pathway。对检索到的pathway进行初步归类,主要涉及了糖、脂、核酸、氨基酸、能量等新陈代谢pathway;基因转录、蛋白水解、修饰等遗传信息处理pathway;膜转运、信号转导、信号分子等环境信息处理pathway;还有运输分解、细胞的运动、生长、死亡以及细胞间通讯等细胞过程pathway。其中与MI后心律失常发生关系比较密切的是细胞通信pathway,并且其重要分支缝隙连接pathway中的关键蛋白Cx43及其上游激酶CK1和PKC的基因表达出现了显著的下调和上调。

2.3 MI大鼠心肌组织Cx43、PKC、CK1mRNA检测结果

采用Real-time PCR检测相关基因表达,与假手术组比较,模型组Cx43和CK1 mRNA表达显著降低(P<0.05或P<0.01),PKC mRNA表达显著增加(P<0.05)。详见表2。

2.4 MI大鼠心肌组织Cx43与CK1、PKC

mRNA表达的相关分析结果经Pearson相关分析,MI大鼠心肌组织Cx43 mRNA表达与CK1mRNA呈显著正相关(P<0.01),与PKC mRNA呈显著负相关(P<0.05)。详见表3。

3 讨论

基因芯片技术是指通过微阵(Microarray)技术将高密度的DNA片段附着在固相表面,以同位素或荧光标记的DNA探针,借助碱基互补杂交原理,进行大量基因表达测试,具有高通量的特点[6]。基因芯片实验技术包括基因表达测试——生物信息学分析——验证实验三部分,本研究严格遵循了这些技术要求。基因表达测试采用了比较成熟的Agilent大鼠全基因组表达谱芯片,然后借助KEGG pathway数据库对芯片数据进行了初步的生物信息学的分析,最后用Real-time PCR技术进行了感兴趣基因的验证。

心肌梗死模型大鼠篇5

厄贝沙坦对离体大鼠心肌缺血再灌注细胞凋亡的影响

目的` 观察厄贝沙坦对离体大鼠心肌缺血再灌注细胞凋亡的影响,并初探其机制.方法应用Langendorff装置采用完全停灌复灌的方法制作离体大鼠心肌缺血再灌注损伤模型.将48只SD大鼠随机分为3 组:对照组(K-H缓冲液持续灌流110 min)、缺血再灌注组(K-H缓冲液持续灌注至各项指标稳定后,约20 min,停灌30 min,再灌60 min)、厄贝沙坦组(灌注方法同缺血再灌注组,但将K-H缓冲液内加厄贝沙坦10-6 mol/L).(1)取每组8只观察心肌组织氧化物歧化酶活性,丙二醛含量变化.(2)每组其余8只:①对照组K-H缓冲液持续灌流170 min.②缺血再灌注组和厄贝沙坦组持续灌注至各项指标稳定后停灌30 min,再灌注120 min.观察对细胞凋亡的影响.结果 (1)缺血再灌注组大鼠心肌组织中丙二醛含量较对照组明显升高(P<0.01),总超氧化物歧化酶活性较对照组明显降低(P<0.01).(2)厄贝沙坦组与缺血再灌注组比较,总超氧化物歧化酶活性明显升高(P<0.01),丙二醛含量明显降低(P<0.01).(3)缺血再灌注组细胞凋亡指数显著高于对照组(P<0.01).(4)厄贝沙坦组细胞凋亡指数与缺血再灌注组比较显著降低(P<0.01).结论厄贝沙坦有抑制心肌缺血再灌注损伤中心肌细胞凋亡的作用.其机制可能与厄贝沙坦清除氧自由基,减少脂质过氧化有关.

作者：张博 ZHANG Bo 作者单位：锦州市中心医院心内科,辽宁,锦州,121001刊名：辽宁医学院学报英文刊名：JOURNAL OF LIAONING MEDICAL UNIVERSITY年，卷(期)：30(1)分类号：Q954.56关键词：再灌注损伤细胞凋亡

心肌梗死模型大鼠篇6

关键词：维生素E；TSOD；心肌细胞

中图分类号：R332文献标识码：B文献编号：1671-4954(2010)08-602-02

绝经后女性身体各器官出现明显的衰老加速，发病率逐渐上升，研究表明雌激素水平下降是中老年女性患心血管疾病增加的主要原因。使用雌激素替代疗法(ERT)后许多生理功能保持相对稳定，延缓了衰老，特别是使心血管系统疾病的发生减少，程度减轻。但其引起阴道出血、乳房胀痛等不良反应及中远期致子宫内膜癌、乳腺癌等副作用无法排除，使其应用受到一定的限制。资料表明，VE作为有效的抗氧化剂可起到保护细胞、延缓衰老的作用。本研究用去卵巢大鼠，给予不同剂量的VE，观察和研究VE对老年大鼠心血管系统的影响，进一步寻求和探讨对心血管细胞的保护作用的途径和机制。

1材料与方法

1.1试剂及样品

维生素E注射液购于上海通用药业股份有限公司；植物油为食用色拉油；兔多克隆抗bax抗体、鼠单克隆抗bcl-2抗体及DAB染色试剂盒购于北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.2动物分组与模型制备

Wistar成年雌性大鼠40只，10月龄，体重(230±20)g，由吉林大学白求恩医学部实验动物中心提供。大鼠随机分成5组：正常对照组、去卵巢对照组、去卵巢小剂量组、去卵巢中剂量组、去卵巢大剂量组。

大鼠适应性喂养普通饲料1周后，除正常对照组外，各组大鼠以1％戊巴比妥钠(30mg／kg)腹腔注射麻醉，背位固定，无菌状态下，做腹正中切口，找到双角子宫，分别沿每侧子宫找到卵巢，分离后结扎切除，分层缝合关闭腹腔。大鼠去卵巢1周后，阴道涂片，已无性周期变化。各组大鼠继续喂养普通饲料，对照组大鼠腹腔注射植物油，实验组大鼠按5mg／kg、15mg／kg、60mg／kg腹腔注射维生素E，每日1次，持续9周。

1.3血清学指标的测定

实验结束时，实验动物均眼底静脉取血，血清置－20℃冰箱保存待测。采用黄嘌呤酶法测定血清总超氧化物歧化酶(T-SOD)活力。每毫升反应液中SOD抑制率达50％时所对应的SOD最为一个活力单位。测定时每份血清样品取20μl，按试剂盒说明书操作，结果以活力单位／毫升(U／ml)表示；采用硫代巴比妥酸法测定血清丙二醛(MDA)含量，操作按说明书进行，样品取0.1ml，结果以nmol／ml表示。

1.4免疫组织化学法检测bcl-2、bax蛋白表达

取心肌相关组织切片，常规二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水后，采用免疫组织化学法检测大鼠心肌细胞bcl-2、bax蛋白表达。DAB显色，细胞浆染成棕黄色的即为阳性细胞。

1.5统计学分析

实验数据用均数±标准差(x±s)表示，采用SPSS11.0统计软件包，先进行方差齐性检验，再行One Way ANOVA和Student Newman Keuls(SNK)检验。

2结果

通过实验可知，去卵巢对照组SOD活力水平低于正常对照组(P<0.05)，小、中、大VE剂量组SOD活力水平呈递增趋势，且均高于去卵巢对照组。去卵巢对照组MDA含量显著高于成年对照组(P<0.01)，小、中、大VE剂量组MDA含量呈递减趋势，且均显著低于去卵巢对照组(P<0.01)。各剂量组较去卵巢对照组Bcl-2表达逐渐升高、bax表达逐渐降低，Bcl-2／bax比值随VE剂量逐渐加大而增大。

3讨论

维生素E又称生育酚，是人体内具有广泛生理功能的重要脂溶性维生素和抗氧化剂，可对抗自由基的破坏，降低不饱和脂肪酸的过度氧化，防止脂质过氧化物的形成，保护细胞膜，稳定心肌细胞。在动物和人体内，氧化应激损伤与自由基毒性在心血管系统发病中的作用，已经引起人们的重视和广泛的研究。

攻击生物膜中多聚不饱和脂肪酸，引发脂质过氧化作用，并因此形成脂质过氧化物及其分解产物，触发细胞凋亡，而MDA是脂质过氧化物中毒性最大的一种，能破坏膜结构和膜蛋白功能，影响核酸的功能和代谢，造成遗传信息改变。因此MDA的测定可反映机体脂质过氧化的程度，间接反映出机体组织、细胞损伤的程度。在哺乳类动物体内有两种自由基清除系统，即酶促体系(如SOD、GSH-PX等)和非酶促体系(如维生素c、VitE、还原性谷胱甘肽等)。本实验去卵巢对照组血清T-SOD的活力下降、MDA含量升高，提示衰老大鼠机体的酶促防御体系功能下降，且机体有明显自由基损伤。实验中发现随VE剂量的增加，各剂量组血清T-SOD的活力有所增高、MDA含量明显降低。提示VE不仅通过非酶促体系发挥抗氧化作用，还可激活酶促体系抗氧化因子，通过提高内源性抗氧化物质的水平，降低自由基对组织的损伤。此外，维生素E还可通过调节相关基因的表达等多渠道减缓心血管系统多种疾病的发生。

凋亡是细胞在各种死亡信号刺激后发生的一系列瀑布式激活的主动性细胞死亡过程，其发生受促进性和抑制性双向因素的共同调节。Bal-2和Bax分别是抑制和促进细胞凋亡功能相反的两类蛋白质。Bax蛋白是一个可溶性蛋白分子，主要位于细胞浆中，当Bax在细胞内超表达时，细胞对死亡信号的反应增强，细胞死亡增多；Bcl-2蛋白分布于线粒体外膜的胞浆面、内质网表面及核膜上，具有稳定线粒体膜的功能，当Bal-2超表达时，它与Bax形成异二聚体，死亡被抑制。因此，Bcl-2和Bax的比例可决定细胞凋亡的敏感性。本实验中，各剂量组较去卵巢对照组Bcl-2／bax比值随VE剂量逐渐加大而增大，说明不同剂量的VE可以减少心肌细胞的凋亡，尤以大剂量VE(每天60mg／kg)效果显著，接近成年对照组比值水平。提示一定剂量的维生素E可正性调节Bcl-2／Bax的比值，抑制细胞凋亡，保护心肌细胞。

心肌梗死模型大鼠篇7

传统医学认为,该病属于“心悸”“胸痹”等范畴,其发病的病机多为气虚血瘀水停或气阴两虚,在治疗上也多采用益气补血、益气养阴等法,以达到活血通络的治疗目的［３］。稳心颗粒由党参、黄精、三七、琥珀、甘松等组成,方中党参、黄精二药用以益气养阴;同时加入三七、甘松理气化痰;琥珀具有宁心活血之效,诸药合用,在活血通络的同时,又能不损其正气［４］。在临床上具有益气养阴、活血化瘀,主要用于气阴两虚、心脉瘀阻等所致各种症候。本研究采用儿茶酚胺引起心肌缺血的大鼠模型,以讨论稳心颗粒对于该模型的作用。

1材料与方法

1.1试验动物药品健康大鼠90只,体重250g~ 300g,雌雄各半。稳心颗粒(无蔗糖,山东步长制药有限公司),盐酸异丙肾上腺素注射液(上海禾丰制药有限公司),氯化钠溶液(浙江天瑞药业有限公司)。

1.2分组采用简单随机抽样,将90只大鼠分为3组:A组、B组、C组。A组是模型组,注射异丙基肾上腺素水溶液;B组是对照组,注射等剂量的生理盐水;C组是在模型组的基础上,采用灌胃方式给予稳心颗粒。

1.3动物模型的建造于大鼠后肢大腿内侧皮下注射异丙基肾上腺素水溶液,每日1次,每次剂量按10 mg/kg体重,连续注射5d。每次注射后1min、5min、 10min、30 min、45 min……均可记录心电图,观察急性心肌缺血改变。如能连续2d观察到心肌缺血心电图典型改变,则表明建模成功。

1.4实验操作方法A组和C组大鼠采用以上建模方法,建立心肌缺血动物模型。B组大鼠在大腿相同部位注射等剂量的生理盐水。建模成功后,A、B组每只大鼠每日给予生理盐水(1.0mL/100g)灌胃,C组大鼠每日给予生理盐水稀释的稳心颗粒15g/kg灌胃。连续用药一周以后。

1.5评判指标用乙醚轻度麻醉,仰卧位将头和四肢固定,用心电图机记录心电图,并记录下20 min以内ST段抬高的最大值。心电图记录完毕后,从下腔静脉取血5mL,离心1 5min后,测定血肌酸激酶(CK) 浓度。

1.6统计学处理采用SPSS18.0统计软件进行统计,计量资料采用独立样本t检验。

2结果

ST段抬高的最大值以及血肌酸激酶浓度比较,A组与B组差异具有统计学意义,心肌缺血性疾病的模型建立成功;A组大鼠与C组具有统计学意义。详见表1。

3讨论

缺血性心肌病是在原有的冠状动脉粥样硬化的基础上,心肌的血供已经呈现不足趋势,在寒冷、激动以及应激情况下,机体内分泌系统分泌的儿茶酚胺类激素则增加,使原来已经发生缺血的心肌症状加重,甚至出现梗死情况。而本实验中,采用异丙肾上腺素建立的动物心肌缺血性心肌病模型,即是人工模拟,注入大量外源性儿茶酚胺类激素引起的心肌缺血性疾病。

本实验研究中,采用异丙基肾上腺素水溶液建立动物模型,符合冠状动脉缺血所致的心肌缺血性疾病模型。实验中稳心颗粒组ST段抬高最大值以及血肌酸激酶浓均低于未用稳心颗粒的大鼠模型,其对于缺血性心肌病在该模型中保护心肌以及减轻心肌缺血坏死的作用是肯定的。

缺血性心肌病是威胁人类健康的一个重要的非传染性疾病,其发病率呈上升态势并出现年轻化的趋势［５］。中药在抗心肌缺血过程中呈现出多靶点,多途经的作用方式,日益受到人们的关注［６］。近些年来,随着对缺血性心肌病的研究,也越来越认识到中医在治疗缺血性心肌病的优势,虽然在传统医学领域尚未对该类疾病进行明确分类以及命名,但是从其症状以及体征的分析,多数医家认为该病属于“心悸”“胸痹”等范畴,病因多与寒邪内侵、饮食不当、情志失调、年迈体虚诸因素有关,该病的进一步发展可以导致心力衰竭, 病理演变早期表现为心气不足,进而气阴两虚,中期阳气亏虚,阳虚水泛,最后发展到阴竭阳脱,生命进入垂危阶段［７］。

虽然在大鼠的模型中,已经得到了稳心颗粒对于缺血性心肌病的良好效果,但是动物实验结果与临床试验还有较远距离。在临床应用中还需要进一步研究其功效。

摘要：目的探讨稳心颗粒对于心肌缺血性疾病大鼠模型的影响。方法用儿茶酚胺类激素(异丙肾上腺激素)进行注射,制备大鼠心肌缺血性疾病的动物模型。将90只健康大鼠随机分为3组,A组和C组采用以上方法建立动物试验模型,B组作为对照,注射等剂量的生理盐水。C组在已经完成的动物模型后,灌胃给予稳心颗粒。一周以后,对大鼠进行轻度麻醉,分别记录其20min心电图情况,记录20min内每只大鼠ST抬高的最大值。记录心电图后,对于每只大鼠取静脉血5mL,离心后测量血浆中血肌酸激酶(CK)浓度。结果经统计学软件处理后,A组心电图ST段抬高的最大值均值与B组、C组比较,差异均有统计学意义(P<0.01);A组大鼠静脉血肌酸激酶浓度均值、B组与C组比较均有统计学意义(P<0.01)。结论稳心颗粒在大鼠缺血性心肌病的模型中,具有保护心肌以及减轻心肌缺血坏死的作用。

心肌梗死模型大鼠篇8

1 材料与方法

1.1 动物

选择80只体质量180~200g的SPF级Wistar雄性大鼠 (上海中国科学院实验动物中心提供, 合格证号SCXK (沪) 2007-0005;饲养于上海中医药大学实验动物中心, 合格证号SYXK (沪) 2009-0069) 。

1.2 药物

强心饮由附子、茯苓、白术、白芍、仙灵脾、补骨脂、炙鳖甲等组成, 总剂量173g, 均购自上海中医药大学附属曙光医院中药房, 按处方比例称取中药材, 加水煎煮、浓缩, 取上清, 置4℃备用;培哚普利 (施维雅, 批号9D0437) ;灭菌注射用生理盐水均为市售品;盐酸阿霉素粉针 (浙江海正药业股份有限公司, 批号091001) 。

1.3 试剂与仪器

BCA蛋白浓度测定试剂盒由碧云天生物技术研究所提供;大鼠Bcl-2、BAX ELISA试剂盒均由西唐生物技术研究所提供。DENLEY DRAGON Wellscan MK 3酶标仪, 芬兰;GE心动超声仪Vivid i S/N及探头10S-RS, 美国;奥林巴斯显微镜DP71, 日本;Leica TcsSP2型激光共聚焦扫描显微镜, 德国。

1.4 方法

1.4.1 分组及给药

Wistar雄性大鼠80只, 除空白对照为10只大鼠外, 余组数量相同。将盐酸阿霉素粉针用灭菌注射用生理盐水配成浓度为1mg/mL的阿霉素溶液 (避光) 。除空白对照组外, 其余各组大鼠分别于每周尾iv阿霉素溶液2mg/kg, 共6周造模。空白对照组ip等容积生理盐水。各治疗组在注射阿霉素同时, 开始ig强心饮低、中、高剂量组 (分别为含生药4.325g/kg、8.65g/kg、17.3g/kg) 和培哚普利4mg/ (kg d) ;空白对照组和模型组给予同体积蒸馏水ig。

1.4.2 取材

治疗结束后, 用25%乌拉坦5mL/kg腹腔注射麻醉大鼠, 应用心动超声仪分别测量血流动力学。然后心脏采血, 摘取左心室, 洗净, 以备后续实验。

1.4.3 TUNEL法检测凋亡细胞

切取部分左心室组织制作组织切片, 用4%多聚甲醛液固定, 常规制作切片。使用CHEMICON international ApopTag®Fluorescein In Situ Apoptosis Detection Kit S7110试剂盒。采用dUTP介导的末端标记技术原位检测凋亡心肌细胞。激光共聚焦扫描显微镜观察标记结果:凋亡细胞的形态特征为核中有荧光染色颗粒。

1.4.4 BCA蛋白浓度测定

组织匀浆制备:冰浴下迅速剪取部分左心室组织, 置冰冻组织于离心管, 按每200mg加入1mL匀浆介质中 (PH7.4, 0.01mol/L TrisHCL, 0.0001mol/L EDTA-2Na, 0.01mol/Lsugar) , 冰浴电动匀浆, 处理3~4min后, 冰浴10min, 振荡, 4℃, 12000 r/min离心15min, 取上清备用。采用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定组织蛋白浓度。酶标仪562nm处测定。根据标准曲线计算出蛋白浓度。

1.4.5 凋亡因子检测

采用ELISA法检测大鼠胞浆Bcl-2, BAX含量。检测方法参照试剂盒说明书。

1.4.6 统计方法

计量资料以表示, SPSS13.0软件包处理数据, 组间比较用方差分析。P<0.05为存在明显统计学差异。

2 结果

2.1 强心饮对心肌损伤有保护作用

我们的前期研究结果表明, 强心饮能够通过调节模型大鼠的部分神经内分泌指标的过度增高, 从而减轻心肌重构, 改善心功能, 保护心脏[3,4]。

2.2 强心饮对心肌细胞凋亡影响

心肌凋亡免疫荧光结果显示:空白对照组细胞凋亡数很少, 基本很难检测到阳性信号 (图1-A) ;阿霉素造模6周后, 模型组凋亡明显增加 (图1-B) , 与模型组相比:培哚普利组、强心饮组细胞凋亡数较模型组明显减少 (图1-C、D) 。

2.3 强心饮对心肌Bcl-2、Bax含量的影响

见表1。与空白对照组比较, 模型组Bcl-2含量明显降低, 而Bax含量明显升高 (P<0.05) 。与模型组比较, 培哚普利组和强心饮高剂量组的Bcl-2含量明显提升 (P<0.05) ;强心饮各剂量组的Bax含量均明显下降 (P<0.05、P<0.01) ;各治疗组的Bcl-2/Bax比值较模型组显著提高 (P<0.01) 。

A、空白组;B、模型组;C、培哚普利组;D、强心饮 (高剂量组)

注:与模型组比较1) P<0.05, 2) P<0.01

3 讨论

心力衰竭是心脏病的危重阶段, 多数患者常因心力衰竭进行性加重而死亡或因心律心常而发生猝死, 因其发病率及病死率高而成为亟待解决的难题。在中医学中, 并无心肌病心力衰竭之病名, 但有类似症状的描述, 根据患者的临床表现, 此病可归于中医“心悸”、“怔忡”、“胸痹”、“喘证”“痰饮”“水肿”之范畴。心主血脉, 心藏血脉之气, 血脉之运行依赖于心阳、心气温煦和推动。心力衰竭多病重日久, 致心气阳虚, 心主血脉功能失司, 血脉瘀阻。而久病及肾, 亦可致命门火衰, 不能温煦心阳, 则致君火更衰。可见, 本病重在阳气亏虚, 并由此继发水饮瘀血等标实之候, 且水饮瘀血一经产生, 再伤阳气, 而致阳气更虚, 故本病为本虚标实之候, 且虚实错杂, 多脏受累, 缠绵难愈。强心饮以温补心肾、利水化痰消瘀为治疗原则, 标本兼顾, 在临床上收到了良好的疗效。

我们选择采用大鼠尾静脉注射阿霉素复制心慢性力衰竭模型, 造模时间为6周, 使心肌和心功能慢性损害更接近临床[5]。本实验结果表明, 当大鼠尾静脉间断注射小剂量阿霉素而出现心肌病心力衰竭时, 大鼠的心肌细胞凋亡明显增多, 而空白对照组大鼠的心肌细胞凋亡数量极少。用强心饮干预的大鼠, 心肌细胞凋亡的数量也较模型组明显减少。这一结果证实心肌细胞凋亡与心肌病心力衰竭的发生发展有密切关系。

在细胞凋亡中, 线粒体被认为是起着中央调控作用[6]。现在普遍认为, 在对细胞线粒体的调控中, Bcl-2家族的Bcl-2和BAX起着重要的作用。Bcl-2位于线粒体的内外膜交接处的抗凋亡蛋白, 抵抗细胞凋亡。相反Bax作为一种促凋亡蛋白, 一旦接受细胞凋亡信号时构象发生变化, 导致线粒体内物质的释放。又有实验证实, Bcl-2和BAX等具有成孔性质, 可直接调节线粒体膜的通透性[7], 它们的表达比例变化可影响线粒体内的促凋亡物质流入胞浆而引发细胞凋亡。

从本实验结果可以看出, 与空白对照组相比, 模型组Bcl-2含量下降, Bax含量升高, 而强心饮治疗组及培哚普利组Bcl-2升高、Bax降低, Bcl-2与Bax的比例较模型组有显著的提高。由此可见, 强心饮通过调控Bcl-2和Bax的平衡, 起到阻止细胞凋亡的发生、延缓或改善心肌重构的发生及发展的作用。其更详细的作用机制, 还有待于进一步的深入研究。

摘要：目的研究强心饮对阿霉素诱导的心肌病心力衰竭大鼠模型的细胞凋亡相关因子表达的影响, 以探讨强心饮对心肌细胞凋亡的作用机制。方法雄性Wistar大鼠分为6组, 除空白组外, 均采用尾静脉每周注射阿霉素2mg/kg, 共6周, 治疗组同时分别给于强心饮高、中、低剂量 (含生药17.3g/kg、8.65g/kg、4.325g/kg) , 西药对照组给予培哚普利。治疗结束后, 观测心力衰竭大鼠心肌细胞的凋亡情况 (TUNEL法) , 检测B细胞淋巴瘤/白血病基因2 (Bcl-2) 和Bcl-2相关蛋白X (BAX) 。结果强心饮能够减少模型大鼠心肌细胞凋亡, 提高Bcl-2/BAX的比值。结论强心饮通过调控Bcl-2/BAX的表达, 有效的阻止了心肌细胞凋亡发生。

关键词：强心饮,心肌细胞凋亡,B细胞淋巴瘤/白血病基因2 (Bcl-2) ,Bcl-2相关蛋白X (BAX) ,大鼠

参考文献

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[3]严骅, 高俊杰, 蒋梅先, 等.强心饮对阿霉素心肌病心力衰竭大鼠模型心肌重构的影响[J].上海中医药大学学报, 2010, 24 (3) :65.

[4]严骅, 高俊杰, 蒋梅先, 等.强心饮对阿霉素诱导大鼠慢性心肌损伤的保护作用[J].中国中医基础医学杂志, 2010, 16 (7) :557.

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[6]Newmeyer DD, Ferguson-miller S.Mitochondria:Releasing power for life and unleashing machineries of death[J].Cell, 2003, 112 (4) :481.

心肌梗死模型大鼠篇9

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

SPF级Wister大鼠, 雄性, 体重150~180 g (合格证号SCXK粤2006-0015) , 由南方医科大学实验动物中心提供。

1.1.2 主要药物与试剂

Naringin粉沫 (广东省梅雁蓝藻公司, 纯度98%) ;链脲佐菌素 (美国SIGMA公司) ;血糖试纸 (强生“中国”医疗器材有限公司) ;兔GSK-3βBeta多克隆抗体 (上海恒斐生物科技有限公司) ;TDZD-8 (GSK-3β抑制剂) (上海甄准生物科技有限公司) 。

1.2 方法

1.2.1 分组与处理

将60只Wister大鼠随机分为以下四组:对照组、DCM组、柚皮苷组、TDZD-8组, 各15只。对照组予普通饲料喂养, 其余均高糖高脂饲养6周, 在第6周时, 对照组同时采用柠檬酸缓冲液腹腔注射, 一次性腹腔注射链脲佐菌素 (STZ 60 mg/kg, 临用前用0.1 mol/L枸橼酸缓冲液溶解, p H=4.2) 腹腔注射;注射72 h后, 如连续2次空腹血糖>11.1 mmol/L视为糖尿病模型成功。随后6周, 柚皮苷组每天予柚皮苷100 mg/ (kg·次) 灌胃1次, TDZD-8组每天静脉注射1次TDZD-81 mg/ (kg·次) , 对照组及DCM组每天予生理盐水灌胃1次。对照组继续予普通饲料喂养, 其余均继续高糖高脂饲养6周, 此时DCM模型成功。

1.2.2 左心室功能参数检测

使用GE Vividi便携式心脏彩超 (探头频率为12 MHz) 分别于动物造模前及实验第12周分别行超声心动图检查, 测量LVED、LVES、LVPWT及LVEF。每组数据均取连续3个心动周期的平均值。

1.2.3 心肌组织GSK-3β

免疫组织化学检测石蜡切片经兔GSK-3βBeta多克隆抗体, DAB显色后, 采用Motic 6.0数码医学图像分析系统测定阳性光密度值。

1.3 统计学方法

采用SPSS19.0统计学软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差 (±s) 表示, 采用t检验;计数资料以率 (%) 表示, 采用χ2检验。P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 实验各组大鼠空腹血糖的变化

一次性腹膜腔内注射小剂量链脲佐菌素72 h后, 柚皮苷组及TDZD-8组及DCM组血糖明显升高, 血糖>11.1 mmol/L, 可认为糖尿病模型造模成功。实验第12周, 柚皮苷组及TDZD-8组血糖降低, 与DCM组比较差异有统计学意义 (P<0.05) 。见表1。

2.2 超声心动图检测结果

DCM组12周时LVDD、LVDS增大, LVEF下降, 与动物造模前及对照组比较差异有统计学意义 (P<0.05) , 提示糖尿病心肌病模型制备成功。柚皮苷组及TDZD-8组LVDD、LVDS、LVEF等与动物造模前及对照组差异无统计学意义 (P>0.05) , 与DCM组12周时结果比较差异有统计学意义 (P<0.05) 。见表2。

注:与对照组比较, aP<0.05;与DCM组比较, bP<0.05

注:与对照组比较, aP<0.05, bP>0.05;与DCM组比较, cP<0.05

2.3 心肌细胞GSK-3β的表达

采用CMIAS系列Motic.Med6.0数码医学图象分析系统测量表示GSK-3β表达水平的阳性目标面光密度值, 柚皮苷组及TDZD-8组GSK-3β表达明显低于DCM组, 差异具有统计学意义 (P<0.05) ;DCM组高于对照组 (P<0.05) 。由此表明, 柚皮苷及GSK-3β抑制剂能够抑制GSK-3β表达。各组PKC的阳性目标面密度值的比较见表3。

注:与对照组比较, aP<0.05;与DCM组比较, bP<0.05

3 讨论

糖原合成酶激酶3β (glycogen synthase kinase 3β, GSK-3β) 是真核细胞内一种多功能丝氨酸、苏氨酸蛋白激酶, 参与糖原合成酶、电压依赖性阴离子通道等50多种底物的活化[3], 并参与调控糖代谢、脂代谢、细胞增殖和死亡等过程[4]。本研究中, DCM组较TDZD-8组血糖升高, 差异具有统计学意义 (P<0.05) , 心脏功能恶化。在大鼠DCM模型, 抑制GSK-3β通路, 可改善糖脂代谢和胰岛素作用减轻糖脂毒性;从而改善DCM的症状[1,2]。所以, 有效调控GSK-3β的表达对糖尿病心肌病的心肌保护具有重大意义。

近年来研究证实糖尿病心肌病经柚皮苷干预后心肌肥厚、心肌损伤、心力衰竭减轻, 同时柚皮苷作用效应具有剂量依赖性[2,5]。本研究显示柚皮苷及GSK-3β抑制剂在有效调节糖代谢的同时, 可改善心功能恶化, 而且两者间效应差异无统计学意义 (P>0.05) 。另外柚皮苷组及TDZD-8组GSK-3β表达较DCM组明显下降, 但两者间比较差异无统计学意义 (P>0.05) 。因此作者认为柚皮苷通过有效调控GSK-3β表达而起到糖尿病心肌病心肌保护作用。

参考文献

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[2]游琼, 吴铿, 涂焰明, 等.柚皮苷调控心肌核因子NF-κB炎症信号通路对糖尿病心肌病大鼠防治作用.中国免疫学杂志, 2013, 29 (2) :121-124.

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[4]Takahashi-Yanaga F.Activator or inhibitor?GSK-3 as a new drug target.Biochemical pharmacology, 2013, 86 (2) :191-199.

心肌梗死模型大鼠篇10

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康雄性Sprague Dauley(SD)大鼠30只,实验动物合格证号SCXK鄂2008-0004,体重(100±30)g,4～6周龄。分笼饲养,每笼5只,饲养笼选用塑料制品,并配用不锈钢罩、塑料吸水瓶和不锈钢吸水管,垫料经高压消毒灭菌,标准啮类动物饲料喂养,饲料由C060照射灭菌,自由饮食。动物室温度22～28℃,相对湿度50%～65%。大鼠进行适应性喂养2周后,开始实验。

1.2 主要仪器与试剂

1%链脲佐菌素(STZ)溶液购自南京建成生物工程研究所,武汉博士德生物工程有限公司提供的转化生长因子β1(TGF-β1)、胶原蛋白Ⅲ(collagenⅢ)免疫组化试剂盒。德国Leica公司的自动脱水机、包埋机、切片机,姜堰市医疗器械有限公司的80-2低速离心机,日本Olympus公司的显微镜,德国KontronmAS 2.5全自动图像分析仪。江苏盒坛市荣华仪器制造公司的FSH-2可调高速电动匀浆器。美国SHELLAB公司的恒温水浴箱。

1.3 分组与造模方法

大鼠适应性喂养2周后,按照大鼠的体重从小到大进行标号,采用随机数字表法进行分组,共分为A、B、C三组,每组10只,其中B、C两组腹腔注射1%链脲佐菌素(STZ)溶液建立糖尿病大鼠模型,每只大鼠注射1%STZ溶液65 mg/kg,于注射后第3天及第7天取尾静脉血测定血糖浓度,以随机血糖≥16.7 mmol/L,具有明显的多饮、多食、多尿以及体质量减轻症状者作为糖尿病模型的判断标准,20只SD大鼠均造模成功。B、C两组组大鼠血糖、体重无明显差异,具有可比性。C组腹部皮下注射胰岛素,用量约为1.5 U/(kg·d),注射期间检测血糖调整胰岛素用量,使大鼠血糖控制在7～8mmol/L之间。A、B组两组大鼠与C组大鼠相同的时间腹腔注射1 mL的生理盐水。大鼠每周进行称重,根据体重调整用药的剂量,三组大鼠造模时间为4周。

1.4 指标检测与方法

实验取材于造模的第29天进行,禁食12 h,禁饮2 h后,水合氯荃腹腔麻醉。仰位固定于手术板上,备皮,开腹部后腹主动脉取血1～2 mL,-20℃低温保存待检。取血后开胸,从左心室切取3 m×3 m×3 m大小心肌组织,放入4%的多聚甲醛溶液固定24～48 h后进行脱水,石蜡包埋。(1)心肌病理观察:将包埋后的石蜡组织连续5μm切片,制成切片标本,常规脱蜡水化,HE染色,光镜下观察。(2)血糖、血脂检测:血液标本在低速离心机3 000 r/min,离心20 min后,取上清液,测定三组大鼠的血糖、三酰甘油(TG)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)。用日立7060全自动生化分析仪测定血糖、血脂。(3)TGF-β1、collagenⅢ检测:微波炉最低档抗原修复,滴加1︰100稀释的兔抗鼠TGF-β1、collagenⅢ多克隆抗体,4℃冰箱过夜,每张切片加100μL新鲜配制的DAB工作液显色,光镜下观察。在400倍光镜下,每张切片随机检测5个视野,采集的图像,由IPP 6.0图像分析软件测定各图像的平均光密度(mean density)=阳性染色区域的累积光密度(IOD)/有效测量区域面积。

1.5 统计学方法

使用统计软件SPSS 11.0,计量资料采用均数±标准差(x±s)表示,以one-way ANOVA方法进行总体比较,组间比较采用t检验,以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 造模情况

B、C两组共20只SD大鼠均造模成功,实验期间B组大鼠死亡2只,共28只大鼠进入实验终点。

2.2 三组大鼠血糖、血脂的测定结果

B、C两组大鼠的TG、TC均显著高于A组(P<0.05)。C组的血糖、TG、TC、LDL-C显著低于B组(P<0.05),HDL-C显著高于B组(P<0.05)。见表1。

注:与A组比较,*P<0.05;与B组比较,△P<0.05

2.3 三组大鼠心肌组织病理改变

A组大鼠心肌细胞结构正常,细胞核居于细胞中央,肌原纤维排列整齐,无心肌细胞固缩性坏死,无心肌纤维断裂及重排(图1);B组大鼠心肌细胞排列紊乱,局灶性心肌纤维溶解,可见变性、坏死(图1);C组大鼠心肌细胞排列比较完好,无明显的溶解断裂,无变性坏死(图1)。

2.4 三组大鼠的TGF-β1、collagenⅢ的表达

TGF-β1的阳性表达呈棕黄色,位于胞质内,A组的心肌细胞胞质内可见少量阳性表达,B组的心肌细胞胞质及血管周围可见阳性物质较多,C组较B组的阳性表达少。collagenⅢ阳性表达呈棕黄色,位于心肌细胞周围或小血管周围,其在心肌细胞中的表达与TGF-β1类似。B、C两组大鼠心肌组织中的TGF-β1、collagenⅢ表达显著高于A组(P<0.05)。但C组中的TGF-β1、collagenⅢ表达显著低于B组(P<0.05)。见表2。

3 讨论

糖尿病与多种心血管疾病密切相关,糖尿病心肌病是发生于糖尿病患者的一组独立的特异性心肌病变,是独立存在的心血管并发症之一,也是导致糖尿病患者死亡的首要原因之一。糖尿病心脏病的病理、发病机制迄今尚未阐明,可能与脂代谢异常引起的能量供应不足,高血糖的毒性作用,缺氧和血液动力学的改变以及多种神经内分泌等因素可能共同导致和促进糖尿病患者心功能的降低[3,4]。糖尿病心肌病的主要病理改变主要累及心肌及中、小血管,表现为心肌肥厚和心肌纤维化[5]。本研究中的糖尿病大鼠模型中心肌排列紊乱,灶性溶解,间质扩张充血,甚至片状坏死,线粒体肿胀,线粒体嵴突模糊,甚至空泡样变。就目前而言,除了有效控制血糖外,还没有一种药物能针对性的阻止心肌超微结构的病理改变。胰岛素是人体内调节糖代谢的重要激素,同时参与脂肪和蛋白质代谢。皮下注射胰岛素是降低血糖的最有效方法,其不仅可抑制环磷腺苷的形成,提高细胞膜葡萄糖的通透性,而且可以干扰糖的代谢使血糖降低[6],最近的研究表明,胰岛素在血糖控制外,还可调控多项心血管系统生理功能,具有心肌保护作用[7]。

注:与A组比较,*P<0.05;与B组比较,△P<0.05

本研究结果显示,采用皮下注射胰岛素的糖尿病大鼠的心肌肥大细胞的排列也比较完好,无明显的溶解断裂,无变性及坏死,较糖尿病大鼠明显改善。且胰岛素大鼠的血糖、TG、TC、LDL-C显著低于糖尿病组(P<0.05),HDL-C显著高于糖尿病组(P<0.05)。这提示胰岛素可纠正能量代谢的异常,恢复损伤的心肌细胞结构。

TGF-β1在糖尿病心肌病变中起着重要作用,其一方面可促进心纤维细胞合成胶原蛋白、纤维连接蛋白,另一方面可影响细胞周期表达,促进细胞肥大。collagenⅢ是细胞外基质的主要成分,TGF-β1可通过抑制蛋白水解酶的表达,减少细胞外基质的讲解,促进胶原沉积,进而加速心肌纤维化,降低心室的收缩和舒张功能[8]。研究结果显示,糖尿病组大鼠的TGF-β1、collagenⅢ较正常大鼠显著增高(P<0.05),而胰岛素大鼠中两者的表达较糖尿病组大鼠显著降低(P<0.05)。这提示胰岛素可能通过降低心肌组织中TGF-β1、collagenⅢ的表达而阻断病理效应,延缓或抑制糖尿病心肌纤维化的发生、发展。

综上所述,胰岛素可调节糖尿病大鼠的糖、脂质代谢紊乱,降低的心肌纤维化程度,其机制可能与其降低了心肌组织中TGF-β1及collagenⅢ的表达有关。

参考文献

[1]Ban CR,Twigg SM.Fibrosis in diabetes complications:pathogenic mech-anisms and circulating and urinary markers[J].Vasc Health Risk Man-ag,2008,4(3):575,596.

[2]耿静,宋敏,葛志明.糖尿病心肌病的研究进展[J].中国心血管病研究杂志,2007,5(6):468-471.

[3]White NH,Cleary PA,Dahms W,et al.Beneficial effects of intensivetherapy of diabetes during adolescence:outcomes after the conclusion ofthe diabetes control and complications trial(DCCT)[J].J Pediatr,2001,139(6):804-812.

[4]金秀平,吴云丹,崔路坤,等.甘精胰岛素对糖尿病大鼠心肌纤维化及超微结构的影响[J].西安交通大学学报:医学版,2009,30(6):732-734.

[5]Aughsteen AA,Khair AM,Suleiman AA.Quantitative morphometric studyof the skeletal muscles of normal and streptozotocin-diabetic rats[J].JOP,2006,7(4):382-398.

[6]Leask A.TGFβ,cardiac fibroblasts,and the fibrotic response[J].Car-diovasc Res,2007,74(2):207-212.

[7]穆长征,王远征,王晓梅,等.二甲双胍对糖尿病大鼠心肌保护作用的形态学观察[J].中国组织工程研究与临床康复,2007,11(4):661-664.

心肌梗死模型大鼠篇11

【中图分类号】R589.2 【文献标识码】A 【文章编号】1007-8517（2013）10-0013-01

早在本世纪50年代中期，人们就发现鱼油具有降血脂的生理作用，但因其生产加工成本高，推广和普及尚难惠及众人。

亚麻籽油也因其富含α-亚麻酸正备受医学界关注，现代研究表明其降血脂作用明确。我国亚麻植物种植面积和亚麻籽产量居世界第二位，仅次于加拿大，资源极其丰富。但存在易氧化、不易贮藏等诸多问题，造成了不宜多食用的困境。

现代实验研究明确了深海鱼油和亚麻籽油调节血脂的作用主要是通过降低血清TC、TG和升高血清HDL-C来实现，本实验通过以上途径验证鱼油和亚麻籽油配伍使用具有协同效应的研究，为不同的降脂资源优势互补开发利用提供依据，为开发更为经济和有效的降脂产品带来启示。

1、实验材料

1.1 仪器 KR-20000T型低温高速离心机（日本Kubota公司）；C-8000型全自动生化分析仪（美国雅培公司）。

1.2 药物与试剂亚麻籽油（EPAX公司提供，批号：2101243），鱼油（Sanmark公司提供，批号：112155D），甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）试剂盒（南京建成生物工程研究所）。

1.3 动物与饲料雄性SD大鼠50只，体重160±10 g，由湖北省实验动物研究中心提供（动物使用许可证号：SCXK（鄂）2008-0005）。高脂饲料：60%基础饲料、10%猪油、10%鸡蛋、9%蔗糖、5%花生、5%奶粉、1%麻油。

2、方法

2.1 复制模型 50只大鼠随机分为正常对照组（10只）、高血脂造模组（40只）。正常对照组喂饲普通饲料。造模型高血脂组大鼠喂饲高脂饲料l周后，称重，尾静脉取血，测定每只大鼠血清TC。根据大鼠体重与血清TC值将40只造模大鼠随即分为模型对照组、亚麻籽油组（剂量90mg/Kg）、鱼油组（剂量90mg/Kg）和鱼油亚麻籽油组（剂量鱼油80mg/kg、亚麻籽油10mg/kg）组。分组ig给药，正常对照及模型对照组给予等量生理盐水，每天1次，连续30 d。正常对照组喂饲普通饲料，其余各组继续高脂饲料喂饲。

2.2 检测指标

2.2.1 体重给药45d后，禁食不禁水12h，称取体重。

2.2.2 血清中甘油三脂（TG）、总胆固醇（TC）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）含量

末次给药后，大鼠禁食不禁水12h，腹主动脉取血，分离血清，用全自动生化分析仪测定血清中TC、TG及HDL-C含量。

2.3 统计学方法所有实验数据均以表示，采用SPSS13.0软件进行数据处理，采用t检验进行统计学处理。P<0.05为差异有统计学意义。

3、结果

3.1 对体重的影响对体重的影响结果见表1。与空白对照组比较，模型组大鼠体重显著升高（P<0.01）。与模型组比较，亚麻籽油、鱼油组及鱼油亚麻籽油组组大鼠体重显著降低（P<0.05），鱼油亚麻籽油组体重降低程度略高

3.2 对血清TG、TC、HDL-C含量的影响各组对大鼠血脂水平的影响结果见表2。与正常对照组比较，模型组大鼠血清TG、TC含量显著升高（P<0.01），HDL-C含量显著降低（P<0.05）。与模型组比较，亚麻籽油、鱼油组及鱼油亚麻籽油组组大鼠血清TG含量显著降低（P<0.05）；亚麻籽油、鱼油组及鱼油亚麻籽油组组大鼠血清TC含量显著降低（P<0.05）；亚麻籽油及鱼油亚麻籽油组组组大鼠血清HDL-C含量显著升高（P<0.05）。从表2可以看出：鱼油亚麻籽油组血清TG、TC降低程度大于亚麻籽油、鱼油组，HDL-C升高程度大于亚麻籽油、鱼油组。

4、讨论

心肌梗死模型大鼠篇12

关键词：下肢缺血预处理,急性心肌梗死,MDA,SOD,血红素氧合酶-1,一氧化氮

缺血预处理在预防心肌梗死方面的研究是近几年的热门话题,本文从下肢缺血预处理入手,探讨缺血预处理对心肌组织的影响及对心肌的保护作用,现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

清洁级健康雄性成年SD大鼠45只,体质量240～340g(由河北医科大学动物实验中心提供)。随机分为3组即急性心肌梗死组(AMI)、下肢缺血预处理线(LIP组)和正常对照组(NC),每组15只。

1.2 方法

(1)AMI组:采用selye法结扎大鼠心脏冠状动脉左前降支(LAD)制做AMI模型:以结扎冠脉20min内ST段、T波进行性抬高及结扎线以下心肌颜色变暗为LAD成功结扎的标志。(2)LIP组:分离双侧股动脉,用无损伤动脉夹夹闭双侧股动脉,夹闭5min,开放5min,反复4次(一侧夹闭时另一侧开放)。随后进行LAD结扎制做AMI模型。(3)NC组健康大鼠不作任何处理。

1.3 心肌梗死面积的计算

实验各组大鼠心肌组织用1%伊文思蓝和2%TTC染色后分区:蓝色为正常心肌,砖红色为缺血心肌,灰白色为梗死心肌。染色后吸干水分,在手术显微镜下仔细分离白色梗死部位(IS)和砖红色的缺血危险区(AAR),用精密分析天平称质量,并计算IS与AAR质量比值(IS/AAR)。

1.4 测定方法

取心肌组织制备匀浆,离心取上清液,硝酸还原酶法测定NO水平,用硫代巴比妥酸法测定心肌组织MDA含量,用邻苯三酚氧化法测定SOD活性。

1.5 心肌组织、血红素氧合酶-1(HO-1)活性检测

取心室肌组织加入5体积冷蔗糖Tris/HCl缓冲液(pH 7.4)制备组织匀浆,4℃13 500r/min离心20min,取上清液105 000r/min离心60min。将获得的微粒体悬浮于100mmol/L磷酸钾缓冲液(含0.1mmol/L EDTA,pH 7.4)中,制成微粒体悬液。反应总体积1ml,含微粒体0.5mg、大鼠心肌组织匀浆液600μl、氧化型辅酶Ⅱ0.8mmol/L、6-磷酸葡萄糖1mmol/L、6-磷酸葡萄糖脱氢酶0.2U,2.5mmol/L氯化高铁血红素10μl,混匀后,37℃振荡水浴避光反应10min,置冰上终止反应。用紫外分光光度计在463nm和530nm双波长测吸光度值,并计算出反应生成的胆红素量。胆红素摩尔吸光系数为40,以生成的胆红素量表示HO活性,单位为nmol/(mg·protein·h)。

1.6 统计学方法

计量资料以 $\bar{x} \pm s$ 表示,组间比较采用单因素方差分析(ANOVA),P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 伊文思蓝、TTC染色结果

LIP组梗死区比重为(46.89±6.45)%低于AMI组梗死区(67.58±19.12)%,差异有统计学意义(P<0.05)。

2.2 心肌组织NO、MDA、SOD的变化

AMI组和LIP组的心肌组织NO、MDA、SOD与NC组比较差异有统计学差异(P<0.01和P<0.05);LIP组与AMI组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

注:与NC组比较,*P<0.01,#P<0.05;与AMI组比较,△P<0.05

2.3 HO-1活性测定结果

LIP组酶活性升高,与AMI组比较差异有统计学意义(P<0.05);且2组酶活性均高于正常对照组,差异有统计学意义(P<0.01)。

3 讨论

缺血预处理对心肌的保护作用报道很多[1]。远端器官预适应(RPC)[2]在临床应用方面也有成功的病例报道[3]。HO-1作为细胞保护因子起到抗氧化应激及损伤作用,并且这种作用在多种动物模型及组织器官的体内、外实验中均被证实[4]。缺血预处理能减少心肌乳酸生成,从而减轻细胞内钙超载,短暂缺血可促使腺苷释放,通过α1受体对心肌代谢进行调节,扩张冠状动脉,增加血流,减低钙超载,抑制血小板的聚集以及中性粒细胞的浸润,减轻儿茶酚胺介导的细胞毒性作用,从而对心肌损伤起到保护作用。HO-1也称热休克蛋白,热休克蛋白对心肌保护作用是通过促进变性蛋白的复性与水解,维持蛋白质的结构,促进新合成的蛋白质取代老化蛋白质,实现热休克反应,从而减轻膜脂质过氧化损伤,提高缺血心肌细胞内SOD的活性,增强对氧自由基的清除能力,减轻自由基所致的细胞损伤。本研究LIP组MDA含量较AMI组明显降低,SOD活性明显增加,同时心梗面积明显减小,与有些报道相似[5]。

NO主要通过激活可溶性鸟苷酸环化酶介导,与可溶性鸟苷酸环化酶的亚铁血红素结合,使其变构、激活,增加cGMP的生成,舒张血管平滑肌。在病变发展过程中,由于内皮功能受损,内源性NO产生减少,产生大量NO自由基,与过氧阴离子反应形成过氧化亚硝酸盐,引起组织损伤。缺血预处理可使HO-1活性增加,增加的HO-1进一步增加cGMP,而NO与cGMP的亲和力很强,在生理状态下NO起主要作用,代偿产生的NO的功能不足[6]。在本研究中,LIP组NO较AMI组明显降低,证实了HO-1能够通过对NO的调节和代偿作用抑制病变的发展。总之,下肢缺血预处理能够有效地保护心肌损伤,不失为一种可行的手段。