实验性心肌梗死

实验性心肌梗死（精选7篇）

实验性心肌梗死 篇1

摘要：目的探讨hbFGF基因联合干细胞移植治疗心肌梗死的机制及效果。方法体外分离、纯化、培养猪骨髓MSCs, 制备、抽提、纯化质粒Pd-bFGF, 通过球囊堵闭法建立小型猪急性心肌梗死模型, 通过冠状动脉内给药方式灌注hbFGF基因到梗死部位。通过冠状动脉造影 (CAG) 、免疫组化计数及超声心动图观察梗死区血管计数、Rentrop分数、左室射血分数 (LVEF) 值、梗死面积等指标, 进而评价hbFGF基因联合干细胞治疗急性心肌梗死的疗效。结果A组、B组、C组均有促血管新生及心功能改善作用, A组的作用最强。结论基因联合干细胞移植是治疗缺血性心脏病的有效方法。

关键词：碱性成纤维细胞生长因子,基因转染,骨髓间充质干细胞,移植,血管新生

心肌梗死后应用传统的再灌注治疗对于已坏死的心肌无效, 对于冠状动脉全程弥散性病变经皮冠脉介入术 (PCI) 及皮腔内冠脉成形术 (CABG) 疗效有限, 心肌梗死后心力衰竭成为心肌梗死患者死亡的主要原因。治疗性血管新生成为保护缺血组织完整性及功能性的重要策略。目前常用的治疗性血管新生方法包括:给予生长因子蛋白, 细胞移植及基因治疗[1]。碱性成纤维生长因子 (bFGF) 已被公认为是刺激血管细胞增殖、迁移和分化的第一分子, 是典型的血管生长因子[2];骨髓间充质干细胞 (MSCs) 能分化为心肌细胞, MSCs移植能促进血管再生并改善心功能[3,4]。本课题利用Exvivo技术治疗缺血性心脏病, 探讨了基因治疗联合干细胞移植治疗心肌梗死的机制及效果。

1 材料与方法

1.1 骨髓间充质干细胞体外分离扩增及诱导分化为成心肌细胞

采用Percoll法和贴壁筛选法相结合从小型猪骨髓中分离MCSs, 体外传代培养, 在原代培养至第三天利用 5-zaz诱导其转化为成心肌样细胞。

1.2 pAdTrack/hbFGF重组腺病毒载体的构建

本实验通过细菌内质粒间同源重组法构建人碱性成纤维因子基因的复制缺陷型重组腺病毒载体pAdtrack/hbFGF。构建成功的线性复制缺陷型重组腺病毒载体, 感染293细胞, 可包装成完整的重组腺病毒颗粒。pAdTrack/hbFGF基因转染猪MSCs:猪骨髓MSCs培养60%～70%融合时, 用bFGF (100 ng/mL) 预处理24 h后, 换 5-zaz (终浓度为10 μmol/L) 诱导24 h, PBS洗涤, 更换为含有bFGF (2 ng/mL) 的完全培养基, 之后每3 d更换培养液, 诱导4周后, 固定细胞, 进行bFGF的免疫组织化学染色。

1.3 小型猪急性心肌梗死模型制作

在无菌条件下行左/右冠状动脉造影, 根据造影结果选择球囊 (血管/球囊比率为1∶1.05) , 在导丝指引下置入 2.0 mm×15 mm 或 2.5 mm×15 mm球囊至第一对角支以远1 cm处, 预适应3次或4次, 压力为3 atm～4 atm, 球囊充盈 20秒/次, 间隔3 min～5 min。然后以8 atm～10 atm打开球囊堵闭LAD, 造影显示球囊远端LAD血流中断, 120 min后撤除球囊及鞘管, 结扎血管, 逐层缝合包扎。

1.4 试验动物分组及干细胞/基因移植

小型猪制模后2周, 将20头模型动物随机分为4组:成肌细胞+hbFGF基因治疗组 (A组, n=6) ;hbFGF基因治疗组 (B组, n=6) ;成肌细胞治疗组 (C组, n=4) ;心肌梗死对照组 (D组, n=4) 。以上试验动物移植途径均为通过冠状动脉前降支OTW球囊内灌注。

1.5 移植后心脏超声及冠状动脉造影检查

心脏超声检查:小型猪肌注氯氨酮5 mg/kg镇静, 左侧卧位, 探头置于右侧胸骨旁及剑突下观察。主要观察指标为左室射血分数 (LVEF) 。实验动物麻醉后行冠状动脉造影检查, 通过采用Rentrop计分法[5], 判断缺血区灌注及心功能改善情况。

1.6 心肌梗死面积测定

沿左室长轴中点将LV一分为二, 横截切取厚度为10 μm的标本行HE染色制成病理切片, 用CMIAS系列多功能真彩色病理图像分析系统 (北京航空航天大学图像中心研制) 测量左室横截面积和瘢痕面积。

1.7 植入干细胞分化为心肌及血管新生情况测定

SP免疫组化法检测新生血管情况;以兔抗猪Ⅷ因子相关抗原单克隆抗体作为第一抗体进行免疫组织化学检测。血管计数方法参照Weidner方法进行。

1.8 ELISA 法检测血浆bFGF水平

分别于移植即刻、移植后1周、2周、4周取猪静脉血5 mL, EDTA 抗凝, 10 min内分离血浆, 置-20 ℃冰箱保存。用ELISA 法检测血浆bFGF水平。

2 结 果

2.1 MSCs的培养

分离的细胞培养24 h即有少量MSCs贴壁生长, 细胞初为淋巴细胞样小圆细胞, 48 h后贴壁细胞明显增多, 出现多个小克隆, 7 d细胞克隆增大, 并逐渐融合成单层, 此时细胞形态为圆形、多角形、梭形或不规则形, 并出现核分裂相。15 d左右细胞迅速增殖, 为形态均一的长梭形, 排列密集。

2.2 RT-PCR结果

MSCs经5-aza诱导后21 d所分化的心肌样细胞总RNA, 以此为模板, 用β-MHC为引物进行RT-PCR扩增, 扩增片段为688bp;GAPDH引物RT-PCR, 所得扩增片段为1 000bp。详见图1。

2.3 人碱性成纤维因子基因重组腺病毒载体构建

2.3.1成功构建pAdTrack/hbFGF重组腺病毒载体

由腺病毒骨架质粒pAdEasy-1和用来重组外源基因的穿梭质粒pAdTrack-CMV组成。

2.3.2 重组穿梭质粒的酶切鉴定结果

将hbFGF目的片段定向插入pAdShuttle-CMV质粒中, 提取质粒DNA, 再用Kpn I和Hind Ⅲ双酶切验证阳性克隆, 重组子被Kpn I、Hind Ⅲ酶切为约9.2KB (pShuttle-CMV片段) 和465bp (hbFGF片段) 大小两个片段, 以上的酶切结果均与相应的载体及目的片段的大小相符合。详见图2。

2.3.3 重组腺病毒质粒的酶切鉴定结果

同源重组质粒pAdhbfgf经PacⅠ酶切后, 产生一条大约30KB的大片段和4.5KB的小片段。详见图3。

2.4 干细胞移植及结合基因治疗对小型猪左室功能的影响

经干预治疗4周后行超声检查, A组的心功能及其他二组均较干预治疗前有明显改善, LVEF、短轴缩短率 (FS) 、RSWT值较治疗前均有明显增加, 其中A组与其他三组比较改善明显 (P<0.01) , 室壁厚度增加, 心室腔减小, 梗死面积缩小, EF值增加, 而D组心功能无明显变化, 左室前壁较移植前有不同程度的变薄、左心室腔扩大、LVEF值降低。详见表1。

%

与B组、C组、D组比较, 1) P<0.01;与D组比较, 2) P<0.05

2.5 冠状动脉造影检查结果

D组模型猪的左心室扩大, 搏动度降低。A组左心室缩小, 心肌收缩力增强, LAD及其分支充盈有明显改善, 可见局部侧支血管的形成, 新生毛细血管排列整齐, 位于梗死边缘区, 呈芽枝状伸向梗死中心; B组、C组则有不同程度心肌收缩力改善, 充盈改善, 但均较A组改善幅度小;D组则无明显心肌收缩力和充盈改善。各组在治疗前Rentrop分数无明显差异, 治疗后A组、B组、C组 Rentrop分数均有上升趋势, 但A组升高最明显, 其升高的程度与其他各组比较均有显著提高 (P<0.01) 。详见表2。

与B组、C组、D组比较, 1) P<0.01;与D组比较, 2) P<0.05

2.6 干细胞移植及结合基因治疗对心肌梗死面积的影响 (见表3)

与B组、C组、D组比较, 1) P<0.01;与D组比较, 2) P<0.05

2.7 免疫组化法鉴定移植治疗后成肌细胞分化、迁移及新生血管情况 (见表4)

免疫组化法标测Ⅷ因子内皮细胞特异标记, 结果显示, 组Ⅳ明显血管新生;而经移植治疗后, A组、B组和C组心肌梗死区内部都有明显血管新生, 血管多分布于移植细胞和残存心肌细胞之间, 边缘区多于梗死区, 排列整齐, 呈芽枝状伸向梗死中心, 毛细血管管壁较薄, 无平滑肌, 由一层内皮细胞构成。正常心肌内无血管新生。以A组新生血管数量最多。C组新生血管少于B组和A组 (P<0.01) , 各组均未见瘤样细胞。

与B组、C组、D组比较, 1) P<0.01;与D组比较, 2) P<0.05

2.8 移植后各组bFGF水平的变化 (见表5)

移植后即刻各组间bFGF含量无统计学意义 (P>0.05) , 移植后第1周A组与其余三组比较均有统计学意义 (P<0.01) , 并且A组 bFGF含量达高峰, B组与C组比较有统计学意义 (P<0.05) , 且明显高于A组。第2周、第4周A组 bFGF含量与其余各组比较差异仍有统计学意义 (P<0.05) 。

3 讨 论

骨髓MSCs是骨髓中具有多向分化潜能成体干细胞, 在不同的微环境下可横向分化为多种组织细胞包括心肌细胞[3]。文献报道:骨髓MSCs是低免疫源性干细胞[4], 同种异体MSCs在异体存活且不引起排斥反应, 其机制可能与T细胞自身免疫耐受有直接关系[6,7]。本研究选用hbFGF基因作为生血管基因, 将其转染MSCs分化的成肌细胞, 使得植入动物心肌梗死模型的成肌细胞能在缺血缺氧的梗死局部自动分泌bFGF, 在细胞分化的同时刺激血管生成, 能够为冬眠、顿抑心肌提供丰富的血液灌注, 同时有利于成肌细胞的存活、分化为心肌细胞, 减少心肌梗死面积, 改善心肌功能及心肌顺应性。本试验通过检测Ⅷ因子阳性内皮细胞测量了梗死与正常心肌交界区的毛细血管密度, 证明了hbFGF的促新生血管作用。hbFGF在刺激血管生成的同时, 有促进成肌细胞定向分化的能力。经干预后, 做冠脉造影、心脏超声及新生血管测定, 结果显示:A组新生血管较多, 侧支循环明显, 心功能明显改善, 梗死面积缩小。C组新生血管少, 但在一定程度上可减少心肌梗死面积, 左室功能得到一定改善;两组比较有统计学意义 (P<0.01) 。而B组可见新生血管生成, 心功能虽有改善, 但不如C组, 更不如A组, 而D组心功能无明显变化。可见hbFGF可以通过血管新生, 增加血流灌注, 挽救一部分濒死、顿抑心肌, 但对于心功能的改善程度不如成肌细胞, 更不如干细胞移植及联合基因治疗。其机制可能为移植细胞参与了血管的形成、促进了新生血管的成熟, 使血液供应早期得以恢复。而单纯给予生长因子, 新生毛细血管与正常毛细血管存在一定差异, 缺乏平滑肌细胞、缺少壁细胞包绕、组织结构疏松易破裂, 需要一定时间才能达到正常血管。MSCs移植改变心肌顺应性, 阻止左室重构的发生, 直接提高心脏功能。MSCs移植后, 移植细胞分泌细胞因子, 诱导局部血管再生。此外, 联合转染hbFGF基因的MSCs移植, 移植细胞的存活率大大增高。本实验研究证实, hbFGF基因联合干细胞移植治疗缺血性心脏病可以增加缺血区新生血管的数量, 改善心肌灌注, 改变心肌顺应性, 延缓或阻止左室重构的发生, 提高心脏功能, 有望为缺血性心脏病的临床治疗提供崭新的手段。

参考文献

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实验性心肌梗死 篇2

1 单味药

1.1 人参

人参为五加科多年草本植物, 人参皂甙为其主要成分。人参二醇组皂苷是以20 (S) -Protoparaxadiol为甙元的人参皂苷, 主要包含人参Rb1、Rb2、Rc、Rd等皂苷单体。人参皂甙Rb1是二醇组人参皂甙含量最高、具有代表性的单体。研究发现, 人参皂甙Rb1治疗组可明显降低心梗后4周大鼠左室重量指数、左室截面直径、Ⅰ型胶原含量及左室舒张末压、左室梗死面积, 升高左室收缩压及左室内压最大上升和下降速率, 降低左心室肌肾素活性 (RA) 和血管紧张素Ⅱ (AngⅡ) 含量, 降低血清丙二醛 (MDA) 含量, 提高超氧化物歧化酶 (SOD) 活性。人参皂甙Rb1对心梗大鼠左室重构具有治疗作用, 其作用机制可能与抑制肾素-血管紧张素系统活性和抗氧化作用有关[4,5]。人参二醇组皂苷能明显降低心室重构大鼠血浆AngⅡ、心钠素 (ANP) 、醛固酮及内皮素含量, 降低血清MDA及心肌AngⅡ含量, 提高血清SOD及谷胱甘肽过氧化物酶 (GSH-Px) 活性。人参二醇组皂苷对大鼠心肌梗死后心室重构具有保护作用, 可能与其抑制肾素血管紧张素醛固酮系统从而降低缩血管物质水平及增强心肌的抗氧化能力有关[6]。

1.2 黄芪

黄芪具有正性肌力、降低氧自由基、保护缺血心肌、减少梗死面积等作用, 对梗死后左室形态学可产生有益的影响[7]。黄芪可改善心梗大鼠血流动力学指标, 降低血浆、非梗死区心肌AngⅡ及血浆醛固酮 (ALD) 水平, 明显升高左室最大收缩、舒张期压力微分水平, 减少非梗死区左室心肌羟脯氨酸的含量, 降低非梗死区左室心肌胶原含量及Ⅰ型及Ⅲ型胶原蛋白的比值, 减轻大鼠心肌梗死后梗死膨展及左室扩大值[8,9]。

1.3 三七

三七总皂苷 (PNS) 是三七主要有效成分, 其活性成分主要为三七皂苷R1、人参皂苷Rgl和人参皂苷Rb1[10]。有研究证实PNS可通过抑制AMI后左室重构大鼠脂质过氧化反应, 扩张冠状动脉增加其血流量, 降低动脉外周阻力, 改善心脏结构的病理损伤和心脏指数, 具有抑制心肌肥大和改善左室重构作用[11]。PNS能够抑制AMI后左室重构大鼠血清肿瘤坏死因子-α (TNF-α) 与基质金属蛋白酶-2 (MMP-2) 的分泌与释放, 通过提高左室收缩和舒张功能, 降低外周阻力, 减轻AMI后左室重构大鼠的心肌缺血再灌注损伤, 对病鼠AMI后左室重构心功能有保护和改善作用[12]。

1.4 当归

当归可降低大鼠心梗模型血浆MDA浓度, 升高血浆SOD浓度, 降低非梗死区心肌巨噬细胞阳性表达率、心肌胶原容积分数及血管周围胶原面积, 改善心功能。当归可能通过清除体内自由基、增强机体的抗氧化能力、抑制巨噬细胞在非梗死区的浸润和聚积, 阻断促左室肥厚和反应性纤维化发生等环节, 防治和逆转左室重构[13]。当归能显著降低心梗大鼠各时间点非梗死区巨噬细胞阳性表达率、升高血浆NO浓度, 并减轻心肌纤维化程度和改善心功能[14]。上调凋亡抑制基因Bcl-2和下调凋亡加速基因Bax的表达, 抑制梗死灶边缘区的心肌细胞凋亡, 减少梗死灶边缘区心肌细胞的坏死[15]。

2 复方药

2.1 益气活血药

杜立建等[16]研究益气活血化瘀汤 (黄芪、丹参、川芎、葛根、红花等) 对大鼠急性心肌梗死后心室重构的影响。建立大鼠AMI模型, 治疗4周后进行血流动力学、血浆SOD、血浆AngⅡ和血浆Ⅲ型前胶原氨基端肽 (PⅢNP) 含量检测和心肌病理分析。益气活血化瘀中药可降低左室收缩压、左室舒张压末、左右心室相对质量、AngⅡ、血浆Ⅲ型前胶原氨基端肽 (PⅢNP) 水平, 升高左室内压最大收缩率、舒张率和SOD水平。礼海[17]通过建立心梗后心力衰竭大鼠模型, 观察益气活血复方 (黄芪、红花、丹参、益母草、三七粉、葶苈子等) 对慢性心衰大鼠心肌基质金属蛋白酶-1 (MMP-1) 和基质金属蛋白酶特异性抑制物-1 (TIMP-1) 的影响。益气活血复方可降低心梗后心衰大鼠心肌MMP-1表达, 升高TIMP-1表达而抑制心室重构。

2.2 益气温阳活血药

孙慧茹等[18]观察益气温阳活血方 (人参、黄芪、制附子、毛冬青、益母草) 对AMI模型大鼠左心室重构的影响, 治疗8周后, 中药组心脏质量指数、左心室壁面积、左心室腔面积和膨胀指数均较模型组下降。郑锵等[19]应用补阳还五汤改善心肌梗死后心室重构大鼠左心室功能, 治疗90d后, 超声显示左心室舒张末期内径、左心室收缩末期内径、收缩末期左心室后壁厚度、左室射血分数、左心室短轴缩短率与模型组比较, 差异均有统计学意义 (P<0.01) 。有研究表明[20,21], 益气温阳活血方 (人参、黄芪、丹参、益母草、白术、茯苓、桂枝等) 能减少心肌中炎症因子TNF-α、白介素-18 (IL-18) 的含量和抑制心肌信号转导通路中核因子-κB (NF-κB) 及蛋白质的表达, 并通过减少心肌细胞中钙离子的含量, 抑制钙调磷酸神经酶 (CaN) 信号通路的活化, 阻断AngⅡ受体等基因的表达, 改善心肌供血、供氧, 减少心肌细胞肥大和胶原产生, 逆转心腔扩大、心室肥厚, 最终改善左室重构和心脏功能。

2.3 益气养阴活血解毒药

王伟[22]观察益气养阴活血解毒中药 (西洋参、熟地、白芍、麦冬、丹参、三七、川芎、茯苓皮、竹沥、黄连、炙甘草) 对大鼠AMI后梗死心肌与心室重构的影响, 中药组大鼠心脏质量、心脏质量指数、左心室质量、左心室质量指数、心肌梗死面积、血清胶原蛋白Ⅰ和Ⅲ含量均显著减小 (P<0.05) , 益气养阴活血解毒中药可缩小AMI后心肌重构大鼠心肌梗死面积, 抑制胶原蛋白合成、分泌和心肌肥厚、心肌纤维化。徐伟等[23]研究益气养阴活血与解毒活血中药对心肌梗死后大鼠早期心室重构的影响及作用机制, 结果显示解毒活血组能明显降低血清IL-6, 益气养阴活血组和解毒活血组均能使心肌组织PPAR-γ和NF-κBp65mRNA表达明显降低。益气养阴活血与解毒活血中药组分通过不同途径减轻大鼠AMI后组织炎症基因的表达, 抑制大鼠AMI后的心室重构。

3 中成药

3.1 芪参益气滴丸

据实验研究报道[24,25], 芪参益气滴丸组可降低左室重量指数、室间隔厚度、左室舒张末压和梗死面积, 光镜和电镜观察显示芪参益气滴丸组可减轻心肌损害, 并可通过降低血清AngⅡ、BNP、TNF-α和内皮素 (ET-1) 水平, 降低心肌细胞凋亡指数、Bax蛋白阳性表达, 升高心肌Bcl-2蛋白阳性表达, 改善心梗模型大鼠心室重构。

3.2 芪苈强心胶囊

李娅等[26]研究发现, 经芪苈强心胶囊治疗后左室功能有明显改善, 基质金属蛋白酶2、9活性降低, α肌球蛋白重链/β肌球蛋白重链mRNA的比值升高。林锐波[27]观察芪苈强心胶囊对心梗后心力衰竭大鼠心功能及凋亡蛋白Caspase-3表达的影响, 芪苈强心胶囊治疗组与模型组相比, 均能有效降低心梗后心衰大鼠体重、心脏质量指数、左室质量指数, 并可降低左室舒张末压, 增加左室收缩末压、左室最大压力上升及下降速度, 降低Caspase-3蛋白表达。

3.3 通心络胶囊

研究发现[28,29,30], 通心络胶囊组可降低心梗大鼠胶原含量、心肌AngⅡ水平, 降低血浆降钙素基因相关肽、ET、ANP的含量, 并可降低血清Ⅰ型胶原羧基末端肽 (PICP) 、血清Ⅲ型胶原氨基N末端肽 (PⅢNP) 含量, 提高心肌细胞钙调控蛋白mRNAd的转录和蛋白质的表达。电镜观察显示通心络胶囊组可减轻心肌损害, 可在一定程度上抑制心梗后大鼠的心室重构。

4 中药注射剂

实验研究表明[31,32], 心梗模型大鼠经参麦注射液治疗1周、2周后均能明显升高左室内压最大上升速率和下降速率、左室收缩压, 并能明显降低、左室舒张末压, 降低心梗后2周心脏湿重、心室重量指数和左室截面直径, 提高心肌细胞活力、降低AngⅡ诱导的心肌细胞凋亡率, 同时, 参脉注射液组心肌肌丝排列规则、整齐, 保留心肌组织增多, 间质水肿减轻, 梗死区面积减小, 线粒体肿胀、峭断裂等损伤液得到明显改善。有报道[33,34], 心梗后兔经黄芪治疗后左室重量和全心重量均下降, 心肌AngⅡ含量明显下降, 梗死区羟脯氨酸 (HP) 含量略有下降, 并下调凋亡基因Caspase-3表达, 改善大鼠心肌梗死后左室重构。杨阳叶等[35]观察参麦注射液与川芎嗪注射液配伍可抑制AMI后早期左室重构的发生, 并利于心功能改善。推测其作用机制可能与益气活血中药能改善心脏血流动力学、干预心脏局部内分泌、抑制心肌细胞凋亡、降低外周血肿瘤坏死因子水平、改善心肌线粒体三羧酸循环和氧化磷酸化过程, 解决心衰心肌的能量供应等作用有关。

5 结语

心室重构是AMI后心力衰竭的主要病理机制, 心肌梗死属于中医“胸痹心痛、真心痛”的范畴。中医认为, AMI的病机属本虚标实, 本虚以气虚 (阳虚) 、阴虚为主, 标实以血瘀、痰浊阻滞多见。如张伯臾[36]认为:真心痛由心痹发展而来, 为本虚标实证, 所不同者, 正气更虚, 邪气更实, 而邪气是指痰、瘀、气滞。蒲辅周、赵锡武认为心梗虚多实少, 因虚致实为其病机。邝安堃等[37]也强调本虚为心梗的根本, 明确AMI的病机是因虚致实。中国中医研究院等通过430例心梗患者的观察, 认为心梗以气虚或阴虚为本, 血瘀为标, 本虚标实贯穿于病程的始终, 而以气虚血瘀占主导地位[38]。因此, 在AMI所致的心室重构中, 其基本病机为本虚标实, 以气虚血瘀为主。

中医药对心室重构的研究多以益气活血类药物做为干预手段。宋启刚等[39]利用Meta分析方法评价益气活血中药对心肌梗死后心室重构的疗效。益气活血中药是通过多靶点干预或逆转心肌梗死后心室重构的发生和发展, 今后应在中医理论指导下积极探索和寻找防治心梗后心室重构的有效方药, 对预防心梗后心力衰竭有重要意义。

实验性心肌梗死 篇3

高血压、心肌梗死、心力衰竭等许多心血管疾病中,心肌肥厚是共有的病理过程。研究表明高血压发生后早期即可出现左室壁结构改变。主要表现为左室后壁厚度(PWT)、室间隔厚度(IVST)增厚及左室腔的球形变,其结构基础是心肌细胞增生肥大和心肌间质胶原沉积纤维化。并发现循环与心肌组织神经内分泌激素在致EH及并发左室肥厚(LVH)中起重要作用[1]。ET和NO构成了一对具有拮抗效应的血管活性物质,血管内皮细胞能按一定比例同时分泌ET和NO,此为调节血管基础张力、维持血压稳定的最主要因素[1]。CGRP广泛分布于心血管系统,是目前已知体内最强的舒血管活性多肽之一,对心血管系统具有明显的调节作用[2],但对肥厚心肌有无逆转作用目前尚未完全阐明。本实验采用腹主动脉部分缩窄术建立压力超负荷性心肌肥厚大鼠模型,用降钙素基因相关肽(Calcitonin gene related protein CGRP)干预心肌肥厚大鼠,利用放射免疫法和硝酸还原法测定心肌组织匀浆中NO、ET的含量,探讨心肌中NO、ET含量的变化与心肌肥厚的相互关系,以及CGRP对心肌肥厚的影响及可能机制。

1 方法

1.1 动物分组

健康雄性Wistar大鼠40只,三月龄,体重(220±20) g,由内蒙古大学实验动物中心提供。动物适应性饲养一周后,将其随机分为4组:对照组、缩窄组、CGRP干预组、卡托普利组。

1.2 制备压力超负荷心肌肥厚大鼠模型

采用Anderson方法制作压力超负荷心肌肥厚大鼠模型[3]。术前禁食禁水12 h,术后动物单笼饲养。

1.3 给药

对照组:术后一周[4]起腹壁皮下注射与体重相匹配的生理盐水,1次/d,持续4周。

缩窄组:术后一周起腹壁皮下注射与体重相匹配的生理盐水,1次/d,持续4周。

CGRP干预组:术后一周起腹壁皮下注射CGRP 8 ug/(kg·d-1),持续4周[5,6]。

卡托普利组:术后一周起连续给卡托普利30 mg/(kg·d-1),灌胃持续4周[7,8]。

1.4 心肌组织标本处理

4周后处死大鼠,处死前12 h禁食水,麻醉后称重,将动物断头处死,迅速开胸取出心脏,去除心房及右心室组织,保留左心室及室间隔,小心去除左室壁脂肪和结缔组织,用预冷的生理盐水清洗,滤纸吸干,称重,计算左心系数(左室重/体重比,LVW/BW,mg/g)。由左心室游离壁中部分别纵行切取部分心肌组织,常规制作HE染色切片,Olympus光学显微镜下观察左心室肌组织结构的变化,并进行显微照相。

其余的左心室组织用于检测心肌中NO、ET的含量。

1.5 观测指标及实验方法

1.5.1 动脉收缩压(systolic blood pressure,SBP)的测定

采用大鼠尾动脉检压仪重复测量3次,取平均值,以kPa表示。测量时间设置在上午8:00～12:00,每只进行3次测定,取3次结果的平均值作为血压数值,术后每天测量血压1次。

1.5.2 大鼠左心系数(left ventricular weight / bodyweight,LVW/BW)的测定

动物称体重(BW)后,断头处死并取出心脏,清洁滤纸吸去血迹后小心地沿室间隔剔除心房和右心室,保留左心室和室间隔并置于电子天平上称重(LVW)算出LVW/BW(mg/g),即左心系数,作为评价左心室肥厚程度的指标。

1.5.3 放射免疫法检测心肌组织中ET含量

采用放射免疫法严格按放免试剂盒说明书(北京东雅生物技术研究所))操作。

1.5.4 硝酸还原法检测心肌组织中NO含量

将心肌组织于冰浴环境中剪碎,加入已预冷的0.3 mol/L高氯酸后进行匀浆化处理。收集匀浆液,于4 ℃环境中以15 000 g离心10 min,取上清液,参照比色法检测试剂盒说明书,测定每毫克蛋白中亚硝酸盐、硝酸盐(NO-2/NO-3)含量(nmol/mg)来间接反映NO的生成量。

2 统计学处理

所有统计数据以均数士标准差(X±S)表示,数据采用SPSS13.0统计软件进行分析,多组间比较用方差分析,部分资料进行相关性分析,P<0.05表示差异有统计学意义。

3 结果

3.1 各组SBP及LVW/BW的比较

同对照组相比,缩窄组SBP及LVW/BW均升高,差异有统计学意义(P<0.05),CGRP干预组与缩窄组相比,SBP 及LVW/BW均降低,差异有统计学意义(P<0.05),CGRP干预组与对照组相比,SBP及LVW/BW升高,差异有统计学意义(P<0.05),CGRP干预组与卡托普利组相比,差异无统计学意义(P>0.05),见表1及图1—图2。

﹡表示与对照组相比P<0.05;﹟表示与缩窄组相比P<0.05;▲表示与卡托普利相比P>0.05

3.2 各组心肌NO、ET水平的比较

同对照组相比较,缩窄组ET升高有显著性差异(P<0.05),NO、CGRP干预组、卡托普利组与缩窄组相比较,心肌中NO、ET降低有显著性差异(P<0.05)。使用CGRP、卡托普利干预后心肌中NO、ET含量均明显降低,但未降到对照组的水平,分别与对照组相比差异有显著性(P<0.05)。见表2及图3—图4。

﹡表示与对照组相比P<0.05;﹟表示与缩窄组相比P<0.05;▲表示与卡托普利相比P>0.05

3.3 相关性分析

左心系数与心肌中ET水平呈正相关,相关系数分别为r=0.565,P<0.01。

动脉血压与心肌中、ET水平呈正相关,相关系数分别为r=0.933,P<0.01。

3.4 左心室心肌组织病理学改变

对照组表现为心肌纤维成束排列,排列整齐,心肌细胞形态及排列正常;模型组:细胞核位于中央,心肌纤维间连接相对紧密,横纹清晰间质见少量纤维结缔组织。缩窄组可见心肌纤维横径较对照组明显增粗,细胞核肥大,深染,异型,心肌纤维间隙增宽,间质纤维结缔组织增生明显。CGRP组和卡托普利组心肌纤维横径及细胞核较缩窄组缩小,间质增生程度较缩窄组明显减轻。

4 讨论

心肌肥厚是心脏对神经介质和压力超负荷等应激反应的一种代偿机制。有关心肌肥厚的发病机制,一直是心血管疾病研究领域的热点。心肌肥厚主要表现为心肌细胞的肥大和间质成分的改变,心脏顺应性和循环泵功能降低。从分子水平上看心肌肥厚的病变过程分三个环节:胞外肥大刺激信号的出现、胞内信号转导及核内基因转录活化,最终诱发细胞发生肥大表型变化。心脏的自分泌、旁分泌、内分泌系统及其受体介导的细胞信号转导途径和机械张力受体及其信号转导途径在心肌肥厚的发生中起着重要的作用。在应激状态下心肌组织产生各种分泌因子如内皮素(ET)、一氧化氮(NO)、血管紧张素(AngⅡ)等诱导特异性的心肌细胞肥大[10]。大量研究表明它们在心肌肥厚发生中起到比循环体液因子更为重要的直接作用。预防与逆转这种改变是目前临床医学研究的重要方面。

高血压是心肌肥厚重要和常见的原因之一,本研究通过腹主动脉部分缩窄术建立压力超负荷性心肌肥厚大鼠模型,通过增加外周循环阻力造成压力超负荷心肌肥厚,与临床相关性好,是研究心肌肥厚病理生理过程、神经激素改变、分子生物学机制以及心血管药理学较为理想的动物模型,尤其适合探讨压力负荷过度时心肌肥大的发生,也适用于药物预防和逆转心肌肥厚机制的探讨。

本实验大鼠腹主动脉部分缩窄术后四周,缩窄组动脉血压(SBP)及左心系数(LVW/BW)升高,与对照组相比较有显著性差异(P<0.05)。病理组织学检查结果显示:缩窄组心肌细胞肥大,形状有轻微的不规则;细胞核增大,位于细胞边缘,核仁浓染;心肌纤维增粗、排列紊乱,部分有断裂;小血管壁增厚,管壁外有少量炎细胞浸润;心肌间质增生,间质中有炎症细胞浸润。以上结果说明压力超负荷心肌肥厚大鼠模型制备成功。

结果显示,大鼠压力负荷4周后,缩窄组与对照组比较,动脉血压(SBP)及左心系数(LVW/BW)均显著升高(P<0.05),心肌中ET的含量显著升高(P<0.05),NO含量显著降低(P<0.05);且心肌中ET的含量与左心室系数成正相关性,NO的含量与左心室系数成负相关性,表明ET、NO与心肌肥厚可能具有直接的关系。腹主动脉缩窄术后经CGRP干预使心肌肥厚程度显著减轻,心肌中ET的水平降低,NO的水平升高。这一结果提示压力负荷性心肌肥厚、心肌中CGRP、ET和NO四者之间存在着内在的相互联系以及CGRP具有逆转心肌肥厚、改善压力超负荷对心肌所造成的损害。

本研究应用卡托普利有效地防治了心肌肥厚。经卡托普利处理的大鼠,其血压和左心室重量指标较心肌肥厚组均明显降低,而与对照组相似。卡托普利作为治疗高血压的药物在临床上已经广泛应用,用于降低血压,预防和逆转高血压心肌肥厚,它的主要副作用有干咳、高血钾[10]。在本实验中发现CGRP干预组与卡托普利组均能降低压力超负荷心肌肥厚大鼠SBP、左心系数和心肌中ET的含量,而升高了NO的含量,并且二者之间进行比较,没有统计学意义(P>0.05),这就表明通过外源性的及时补充因压力超负荷引起的CGRP不足,可以预防和逆转高血压心肌肥厚,其机制可能一方面通过减轻心脏后负荷, 从而改善血流动力学因素对心肌重构的影响。另一方面可能通过降低心肌 ET 活性, 减轻促心肌细胞生长因子的作用, 同时也增强了刺激NO合成和分泌的因素, 使心肌NO水平相应升高。CGRP与卡托普利相比,它是机体内源性的舒血管物质, 作为抗高血压心肌肥厚的辅助用药安全无毒,无负作用,具有广阔的临床应用前景。

5 结论

(1) 心肌中ET水平上调,NO水平下降可能参与了压力超负荷性心肌肥厚的发生发展, 可能是作为心肌自分泌和( 或) 旁分泌激素在局部起介导心肌肥厚的作用。

(2) CGRP可能通过降压,减轻心脏后负荷,降低心肌ET含量而起到抑制心肌肥厚的作用。

(3) CGRP通过cAMP途径增加NO含量,松弛心肌,改善心脏舒张充盈功能,降低心脏前后负荷,从而影响心脏的结构和功能。

参考文献

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[3] Anderson P G.Increased ischemic Injury but decreased hypoxic inju-ry in hypertrophied rat hearts.Circ Res,1990;67(4):948—959

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实验性心肌梗死 篇4

1 材料与方法

1.1 MCSCs的培养和筛选

将新生1 d～3 d雄性SD大鼠拉颈处死,取双侧股骨和胫骨,暴露骨髓腔,用含有肝素的PBS冲洗骨髓腔。收集冲洗液,离心。用DMEM培养液混悬沉淀细胞。均匀接种到培养瓶中,培养箱中培养,当细胞达到70%～80%汇合时,用血细胞计数板计数细胞,根据细胞数目以等阶式稀释的方式将细胞悬液稀释至细胞密度为103个/mL。取0.1mL稀释后的细胞悬液加入10 mL培养液中,使最终细胞密度为10个/mL。将稀释后的细胞悬液加入96孔细胞培养板,每孔150μL,进行单细胞克隆培养。通过多能干细胞标志物c-kit的免疫荧光标记和早期心肌形成转录因子Nkx2.5的RT-PCR检测,从c-kit+MMSCs克隆中筛选出具有特异心肌分化潜能的MCSCs[6]。

1.2 实验分组与细胞移植

将心肌梗死模型大鼠随机分为对照组、MCSCs移植组、预处理MCSCs移植组。每组8只。各组分别在大鼠心肌梗死模型建立成功后30 min,在梗死区边缘设4点,用针头规格为29 G的胰岛素注射器注入MCSCs或200μmol/L二氮嗪预处理30 min的MCSCs,细胞的数目为107个/mL,用80μL PBS混悬,每点注射20μL。在对照组注射等量PBS。移植后逐层缝合,术后肌肉注射抗生素,连续注射1周。

1.3 细胞移植后大鼠心功能检测

在细胞移植后4周,将大鼠麻醉,呈仰卧位固定,剃去胸部毛发,将线阵探头置于左胸壁,进行超声检查获得M型超声心动图。测定左室舒张内径(LVDd)和左室收缩末期内径(LVDs)。应用Teichholz校正公式进行分析。

1.4 Masson染色和胶原纤维的测定

取近左冠状动脉前降支结扎处的心肌组织冰冻切片,每只大鼠6张。蒸馏水清洗后,用丽春红酸性品红液染色10 min。蒸馏水清洗后,用1%磷钼酸溶液染色2 min,再用苯胺蓝或亮绿染色液染色5 min。然后,蒸馏水清洗,无水乙醇脱水,二甲苯透明,中性树胶封片。光镜下Masson染色心肌纤维着红色,胶原纤维着蓝色。用Image Pro Plus 6.0图像分析系统测量胶原纤维(蓝色区域)的比率。1.5移植细胞的Y染色体原位荧光杂交将各组的冰冻切片置于通风处干燥,然后置于甲醇和乙酸液中固定。取出晾干后,将25μL蛋白酶K滴加在切片上,在室温条件下消化30 min。用2×SSC清洗3次,每次5 min。将切片放入变形液中,在95℃条件下处理在条件下经梯度酒精脱水然后让切片自然干燥。将生物素标记的Y染色体特异DNA探针与杂交液HybrisolⅦ混合,在95℃水浴中变性5 min。将变性后的探针滴加在切片上,随后将切片放入湿盒中,置42℃恒温箱内杂交过夜。将切片取出,用已预热至42℃的2×SSC清洗2次,每次5 min。用0.1×SSC清洗2次,每次5 min。加入FITC标记的链霉亲和素,在37℃条件下孵育30 min。用PBS清洗3次,然后用DAPI复染细胞核。在显微镜下观察Y染色体在心肌细胞核内的分布。Y染色体阳性细胞呈绿色荧光,Y染色体阳性细胞数。

1.6 微血管密度分析

取各组冰冻切片,以小鼠抗大鼠vWF单克隆抗体作为第一抗体进行免疫组织化学检测,Cy3标记的驴抗小鼠IgG作为二抗,封片。每组取6张vWF染色切片。微血管密度(MVD)计数参照Weidner法进行。

1.7 统计学处理

采用SPSS 11.5统计软件处理,数据用均数±标准差表示,各组间的差别采用单因素方差分析,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞移植后大鼠的心功能变化

在细胞移植4周时各组大鼠进行M型超声心动图检查,结果显示,两个细胞移植组与对照组相比,大鼠心功能都有明显改善,差异均有统计学意义(P<0.01),预处理MCSCs移植组大鼠心功能恢复优于MCSCs移植组(P<0.05)。详见表1。

%

2.2 细胞移植后梗死区组织结构的变化

细胞移植4周后,取各组大鼠心脏作组织切片进行Masson染色,光镜下观察到心肌纤维着红色,胶原纤维着蓝色。梗死区胶原纤维明显增多,呈条索状,分割包绕心肌束,部分胶原纤维融合。用Image Pro Plus 6.0图像分析系统测量各组大鼠左心室室壁胶原纤维的比率,用%表示。经统计学分析结果显示,两个细胞移植组与对照组相比,大鼠左心室室壁胶原纤维的比率都有明显减小,差异均有统计学意义(P<0.01)。预处理MCSCs移植组大鼠左心室室壁胶原纤维的比率小于MCSCs移植组(P<0.05),详见表2。2.3二氮嗪预处理对MCSCs存活的促进作用本实验是将雄性大鼠的MCSCs移植到雌性大鼠心肌梗死模型的心肌梗死区边缘,所以通过荧光原位杂交技术检测Y染色体阳性细胞,示踪移植细胞的存活和分化情况。荧光显微镜下,对照组没有观察到Y染色体绿色荧光信号。二个细胞移植组心肌组织内均有散在的呈现绿色荧光的Y染色体阳性细胞。经统计学分析显示,预处理MCSCs移植组大鼠Y染色体的阳性细胞数多于MCSCs移植组(P<0.05),详见表2。

2.4 微血管密度的变化

在细胞移植4周后,各组大鼠心脏梗死区和梗死区边缘的微血管密度分析显示,两个细胞移植组与对照组相比,大鼠心脏的微血管密度都有明显增高,差异均有统计学意义(P<0.01)。与MCSCs移植组相比,二氮嗪预处理细胞移植组大鼠心脏的微血管密度差异无统计学意义。详见表2。

3 讨论

移植细胞的选择是决定干细胞移植治疗效果的关键。MMSC因具有多向分化潜能和独特的低免疫原性,成为许多疾病细胞疗法研究的热点。实验和临床研究均证实MMSCs移植治疗心肌梗死的安全性和有效性。然而,由于MMSCs中含有多种具有不同分化潜能的干细胞,临床研究发现移植的MMSCs后向心肌细胞分化的效率很低。MCSCs是从骨髓间充质干细胞中筛选出的具有心肌特异分化潜能的多能干细胞,动物实验研究显示,MCSCs在心肌内可以定向分化为心肌细胞。MCSCs在受损心肌中的存活率是提高其治疗效果的重要保障。由于缺血心肌处于氧化应激状态是移植干细胞存活率低的主要原因之一,以及Mito KATP是缺血预处理对心肌具有保护作用的终末效应器[8],所以本实验利用Mito KATP特异性开放剂针对MCSCs干细胞进行预处理后再移植,目的就是增强细胞的抗氧化应激能力,提高供体细胞的存活率,从而提高MCSCs移植治疗心肌梗死的效果。

建立心肌梗死动物模型是研究心肌梗死病理生理变化的重要手段,本研究采用结扎雌性大鼠左冠状动脉前降支的方法建立大鼠心肌梗死模型,其优点是心肌梗死的部位、面积比较固定,有助于客观地观察和评价心肌梗死后干细胞移植治疗效果。在干细胞移植研究方面,为了更好地评价移植细胞在体内的存活和分化情况,需要对细胞加以标记。细胞标记方法主要有荧光染料标记、基因标记和Y染色体标记。虽然用荧光染料标记方法简单方便,但荧光染料可能污染受体心肌,故可造成假阳性。在转染报告基因标记方面,基因表达稳定可靠,但是否影响移植细胞的生物学活性仍不清楚[9]。Y染色体是雄性特异性遗传标志,不受时间和细胞表型转化过程中基因沉默与激活的影响,同时可避免对细胞生物学活性的影响[10]。因此,本实验将雄性大鼠的MCSCs移植到雌性大鼠心肌梗死模型,并通过荧光原位杂交技术检测含有Y染色体的细胞,以更加客观地观察和分析移植MCSCs的分化状态,有助于研究MCSCs移植治疗心肌梗死的机制。

心肌梗死后梗死区心肌细胞坏死崩解,心肌胶原网架破坏严重,大量成纤维细胞增生,产生并分泌大量胶原,其意义在于保持心肌结构完整。然而,由于胶原聚合成粗纤维,其硬度高,弹性差,因此增加了心肌的僵硬度,影响左室舒缩功能[11],因此,胶原纤维在心肌组织所占的比率是检测心脏功能的重要指标之一。为此,本实验除常规测量各组大鼠的心肌梗死面积外,还定量检测胶原纤维在心肌组织中的比率。结果显示,大鼠在心肌梗死4周后,心肌的胶原纤维比率明显增加,并且大鼠在心肌梗死4周时的左室功能与心肌的胶原比率成负相关,预处理MCSCs移植组大鼠左心室室壁胶原纤维的比率明显小于MCSCs移植组。

实验性心肌梗死 篇5

1 材料和方法

1.1 研究对象

动物实验:选择21头中国小型雄性家猪21头(徐州医学院动物房提供,经检疫合格),3～4月龄,体重30～40 kg。

临床实验:选择本院2006年10月至2007年4月急性心肌梗死致HF患者8例,其中男5例,女3例,年龄(54±8)岁;下壁心梗2例,前壁心梗6例;合并糖尿病4例,高血压5例;2例前壁心梗合并功能性室壁瘤。所有入选患者左室射血分数(LVEF)<45%,B型钠脲肽(BNP)>100 pg·ml-1。

1.2 动物心力衰竭模型的制备

经股动脉穿刺行选择性左冠状动脉造影,经6F导管送入0.014 inch导丝,导丝先端达回旋支(LCX)或前降支(LAD)远端后固定导丝。在连续X线透视下缓慢退出右冠状动脉导管,再沿导丝导入球囊(2.0～2.5×7～10 mm)至LCX或LAD远端。以4 atm(1 atm=101.325 kPa)扩张5 min共3次,然后以4 atm扩张50～75 min制作心肌梗死模型,术中注意心电图改变,撤出球囊及导丝,术毕结扎股动脉。术后心脏彩超及单光子发射型计算机断层扫描(ECT)测定LVEF<45%及BNP>100 pg·ml-1的动物定为心肌梗死后HF模型成功,随机将模型动物分为实验组(n=11)及对照组(n=10)。

1.3 MSCs的分离、培养及移植

动物实验:所有动物抽取髂骨骨髓40 ml,以40 ml DMEM培养液稀释,与等量percoll液(相对密度1.077)梯度水平离心分离骨髓单个核细胞,将上述所得骨髓单个核细胞按个2×106个·cm2接种于DMEM培养液中,并在孵育箱中应用贴壁法培养MSCs,MSCs扩增至108数量级后进行移植。动物心肌梗死后10～14 d在局麻下行冠状动脉造影,实验组在梗死区中心经微导管注入2 ml MSCs悬液(约108个细胞),对照组则以同法注入PBS。

临床试验:患者抽取髂后上棘骨髓40～60 ml,骨髓液移至肝素生理盐水离心管中等倍稀释,同法进行骨髓单个核细胞分离、培养至第3代MSCs,移植前稀释成10 ml肝素生理盐水细胞悬液备用,细胞计数约108个细胞。患者在局麻下行冠状动脉造影,在0.014 inch导丝导引下,将微导管置于病变血管处,撤出导丝后经微导管缓慢将细胞悬液注入冠状动脉内,推注时间10 min。

1.4 结果判定

所有动物及患者均于MSCs移植术前及术后8周应用心脏彩超(惠普5500)行超声心动图(UCG)测定左室收缩末期直径(LVSd)、收缩末期容积(SYS vol)、梗死区室壁厚度(IWT)及LVEF;美国博适Triage快速测定和诊断仪测定BNP;西门子SPECT行心肌灌注扫描,同时使用Emory University的Cardiac Toolbox心肌分析软件包获得心肌梗死部位面积大小和灌注图像心肌缺血总分值。

1.5 统计学处理

采用SPSS 12.01统计软件处理数据,计量资料以undefined表示,心功能比较采用方差分析,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况

动物实验:实验组中1头动物于干细胞移植麻醉时死于HF,另有2头动物未达到HF标准;对照组中2头动物于模型制备时死于室颤和急性心包填塞,1头经UCG及ECT证实制模不成功,故最终实验组及对照组分别有8头和7头制模成功。

临床试验:8例患者中靶血管为LAD 6例,右冠脉(RCA)2例;其中5例行经皮冠脉血管成形术(PCI)。所有患者术中均顺利,无一例发生心律失常、心肌梗死及HF,仅1例术后寒战数分钟自行缓解。术后除1例患者因经济原因未能随诊外,其余7例患者获随访资料,动物实验和临床研究的具体情况见表1。

2.2 心功能变化

2.2.1 动物实验

MSCs移植后8周UCG显示,实验组室壁活动与移植术前增强,对照组室壁活动与移植术前比较无明显变化;实验组MSCs移植后LVEF增加,BNP水平由(298±17)pg·ml-1下降至(87±15)pg·ml-1,对照组无明显改变(图1、表2)。

2.2.2 临床试验

MSCs细胞移植后8周心脏彩超结果显示,LVEF较细胞移植前增加(表3),ECT检查示梗死面积缩小,LVEF升高(图2),BNP由(326±34)pg·ml-1下降至(101±7)pg·ml-1。

A. 实验组;B. 对照组

与对照组移植后比较,*P<0.05;与同组移植前比较,#P<0.05

与细胞移植前比较,*P<0.05

1、3、5排为术前ECT检查结果; 2、4、6排为术后8周ECT检查结果

3 讨论

心力衰竭已经成为心血管病中最常见的、对患者危害最大的疾病之一,严重影响患者的生活质量,造成医疗费用支出庞大,因此,必须寻找有效的HF的治疗方法。近年来,MSCs移植作为一种崭新的生物学疗法,引起了人们日益广泛地关注。

2001年,自Orlic等[1]首次采用骨髓干细胞移植成功地治疗动物心肌梗死以来,已有许多动物实验证实,骨髓干细胞移植能明显改善动物缺血心肌的心脏功能。2001年Strauer等[2]的临床研究结果显示,与对照组比较,自体骨髓干细胞移植后,室壁运动障碍范围减少约20%。2004年,由德国Wollert等[3]完成的首次将干细胞随机移植到心肌的研究结果显示,接受干细胞移植患者的左心室功能得到改善。本研究应用UCG、ECT及BNP作为诊断心力衰竭和评价疗效的指标,尤其采用了BNP定量检测,用量化的标准使实验结果更加客观可靠。本研究结果显示,动物MSCs移植后8周,实验组左室功能整体增强,室壁运动得到改善,收缩末期左室容积减少,室壁厚度增加,心室重构程度、心脏收缩功能的改善明显优于对照组。临床研究中我们选择了8例急性心肌梗死后心力衰竭患者,有5例患者行支架植入术同时予MSCs移植,其中1例未能随诊,4例UCG及ECT均提示左室收缩功能和室壁运动改善。余3例因经济原因未行支架置入术,仅予MSCs移植,其中1例患者UCG示心功能无明显改善,但ECT示梗死面积缩小,收缩功能改善。本研究结果显示,MSCs移植后左心室射血分数增加,与Bolognese等[4]研究结果相近。我们认为虽然自体MSCs移植可改善心功能,但自体MSCs移植成功与否还有赖于心肌局部环境、血流供应等因素,在心力衰竭早期MSCs移植辅以PCI术,由于局部充分的心肌血供,可以更有效地改善心肌收缩功能。我们的动物及临床实验证实,自体MSCs取材方便,移植过程简单安全,对机体损伤小,排斥性小,较心肌细胞移植有更好的可塑性,且治疗过程中患者多无不适,无明显的副作用,术后数小时即可活动,在临床治疗心力衰竭方面有更好的应用前景。

骨髓干细胞移植改善心功能的可能机制为[5]:(1)移植细胞分化为心肌样的细胞,与宿主同步收缩从而改善心功能;(2)移植细胞通过分泌血管内皮生长因子(VEGF)、白细胞介素-1(IL-1)等细胞因子,促进血管再生和内源性血管新生,再生的心肌细胞同样有营养需要,因此维持心脏微血管的血液供应是心肌再生治疗的一个关键。

综上所述,自体MSCs可作为心肌细胞重建术的来源,自体骨髓干细胞移植具有方便、微创,易于开展的特点,但自体骨髓干细胞的存活与否依赖于环境、血液供应、局部炎症反应等因素。细胞移植结合PCI术是移植细胞改善心功能的理想方法,有可能成为HF患者的一种新的治疗模式和选择,对此,临床上还需要进行更大规模随机、双盲研究,以观察其疗效和可能的副作用,同时更需要进一步的基础研究阐明其机制。

摘要：目的观察自体骨髓间充质干细胞(MSCs)移植对心肌梗死后心力衰竭的疗效。方法选择21只中国小型家猪,应用闭胸经股动脉介入法制作心肌梗死后心力衰竭模型,术后动物左室射血分数(LVEF)<45%、B型钠脲肽(BNP)水平>100 pg.ml-1为心力衰竭建模成功。随机将动物分为实验组(n=11)和对照组(n=10),术后2周内实验组及对照组经冠状动脉途径分别移植MSCs及磷酸盐缓冲液,8周后,行心脏彩超、单光子发射型计算机断层扫描(ECT)及BNP检查,观察心功能的改变。同时,选择心肌梗死致心力衰竭[左室射血分数(LVEF)<45%,BNP>100 pg.ml-1]患者8例,发病2周内经皮冠状动脉途径植入MSCs,术前及术后8周行心脏彩超、ECT及BNP检查,监测心功能的变化。结果动物实验组和对照组分别有8头和7头猪造模成功;心脏彩超结果显示:实验组MSCs移植后LVEF由(39±1.70)%增加至(51±3.52)%,ECT心血池显像显示LVEF由(35.08±3.12)%升高至(52.15±1.21)%,BNP水平由移植前的(298±17)pg.ml-1下降至(87±15)pg.ml-1;对照组以上指标无明显改变。临床观察显示:MSCs移植后患者心脏彩超显示LVEF由(34.06±2.13)%增加至(52.08±1.02)%,ECT心血池显像显示LVEF由(34.12±3.09)%增加至(53.03±1.01)%,BNP水平由(326±34)pg.ml-1降低至(101±7)pg.ml-1。结论自体MSCs移植是治疗急性心肌梗死后心力衰竭安全、有效的新方法。

关键词：心肌梗死,急性,心力衰竭,细胞移植,自体骨髓间充质干细胞

参考文献

[1]Orlic D,Kajstura J,Chimenti S,et al.Mobilized bone marrowcell repair the infarcted heart,improving function and survival[J].Proc Natl Acad Sci USA,2001,98:(18)10344-10349.

[2]Strauer B E,Brehm M,Zeus T,et al.Myocardial regeneration after interacoronary transplatation of human autogous stem cells following acute myocardial infarction [J].Dtsch Med Wschr,2001,126(34- 35):932- 938.

[3]Wollert K C,Meyer G P,Lotz J,et al.Intracoronary autologous bone-marrow cell transfer after myocardial infarction:the BOOST randomised controlled clinical trial [J].Lancet,2004,364 (9429):141- 148.

[4]Bolognese L,Neskovic AN,Parodi G,et al.Left ventricular re-modeling after primary coronary angioplasty:patterns of leftventricular dilation and long-term prognostic implications[J].Circulation,2002,106(18):2351-2357.

制马钱子治疗脑梗死的实验研究 篇6

本实验旨在通过制马钱子治疗脑梗死的实验研究, 以初步探讨制马钱子治疗脑梗死的安全性, 对瘫痪肢体功能恢复的影响及可能作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

清洁级雌性SD大鼠23只, 体重200 g～300 g (合格证号:0015753) ;18 g～24 g昆明种小鼠24只, 雌雄各半 (合格证号:0015751) , 均由广州中医药大学实验动物中心提供, 动物使用许可:SCXK (粤) 2003-0001。

1.2 药物及实验材料

制马钱子粉 (广州中医药大学第三附属医院药房提供) 、雷霆牌渔线 (直径约0.22 mm) 、弯剪、刀片、眼科镊、动脉止血夹、外科缝合线、络合碘等。

1.3 实验方法

1.3.1 小鼠活动及药物安全性实验

将24只昆明种小鼠随机分为实验组和对照组, 每组12只。制马钱子混悬液配制:砂烫法炮制。取制马钱子粉适量, 用乳钵研磨, 溶于蒸馏水中, 调整其浓度, 使其达到浓度为10 mg/mL。实验组按100 mg/kg, 用配制的制马钱子混悬液灌胃。对照组灌服与实验组等容量的生理盐水。灌胃后记录小鼠的活动、呼吸、体重, 及有无兴奋、安静、闭目烦躁、肢体痉挛等变化。

1.3.2 SD大鼠大脑中动脉脑梗死 (MCAO) 制备

将23只SD大鼠用10%水合氯醛腹腔内注射麻醉, 将颈总动脉和颈内动脉拉成直线看到颈总分叉与颈内动脉和翼额动脉的分叉, 在颈总动脉分叉处用眼科剪剪一切口, 用直径约0.22 mm的渔线, 经小口插入颈内动脉 (18～20) mm, 遇有阻力立即停止, 将大脑中动脉起始端阻塞, 结扎颈内动脉备线, 剪断栓线外端, 缝合皮肤, 常规消毒后放回笼中。随机分为两组, 治疗组11只, 对照组12只。

1.3.3 SD大鼠给药方法

治疗组以制马钱子混悬液 (100 mg/kg) 灌胃, 每日1次, 连灌7 d。对照组灌服生理盐水 (2 mL/只) , 每日1次, 连灌7 d。

1.3.4 观察方法

参考Zea-Longa等[4]的方法对两组大鼠进行神经行为学评分, 评价动物的神经功能缺损, 于大鼠MCAO模型制备后记录一次, 以后每天1次, 连续7 d。

1.3.5 血液流变学变化

治疗1周后两组大鼠心脏采血每只约2 mL, 肝素抗凝, MDK- B100全自动血液流变分析仪测全血高、中、低切血液黏度。

1.4 统计学处理

计量资料采用t检验。

2 结果

2.1 两组小鼠自主活动及安全性实验

小鼠自主活动实验发现, 100 mg/kg制马钱子对小鼠行为学变化无明显影响, 小鼠自主活动无明显变化, 无小鼠死亡。

2.2 两组神经行为学评分 (见表1)

2.3 两组血液流变学变化 (见表2)

3 讨论

中医学认为马钱子具有散结消肿、通络止痛之功, 主要用于治疗跌打损伤、痈疽肿痛、风湿顽痹、麻木瘫痪等病症, 取得较好的疗效。据现代研究, 马钱子含有总生物碱, 主要为番木鳖碱 (士的宁) 、马钱子碱、番木鳖次碱、伪番木鳖碱、伪马钱子碱等。其中士的宁主要能兴奋脊髓的反射机能, 并能兴奋延髓的呼吸中枢及血管运动中枢。小鼠活动及安全性实验发现, 制马钱子100 mg/kg灌胃量对小鼠行为学变化无明显影响, 无小鼠死亡。为马钱子临床使用的安全性提供了一定依据。

采用线栓法建立SD大鼠右侧MCAO, 结果显示治疗后治疗组神经功能缺损评分明显降低 (P<0.05) 。血液流变学全血高、中、低切明显下降 (P<0.05) 。制马钱子可以改善血液黏稠度, 促进血液循环, 增加脊髓兴奋性, 对于脑梗死后神经功能的恢复可能具有促进作用。

摘要：目的 探讨制马钱子治疗脑梗死的安全性和对脑梗死瘫痪肢体恢复的有效性及可能作用机制。方法 选取18g～24g昆明种小鼠24只, 随机分为实验组和对照组, 每组12只。采用线栓法建立SD大鼠右侧大脑中动脉脑梗死 (MCAO) 模型23只, 随机分为治疗组 (11只) 和对照组 (12只) , 观察两组神经功能缺损恢复、血液流变学变化。结果 小鼠自主活动实验发现, 100mg/kg制马钱子对小鼠行为学变化无明显影响, 小鼠自主活动无明显变化, 无小鼠死亡。制马钱子可以明显减少MCAO模型SD大鼠神经功能缺损评分, 差别具有统计学意义 (P<0.05) 。治疗组SD大鼠血液流变学高、中、低切明显低于对照组 (P<0.05) 。结论 制马钱子100mg/kg灌胃量对小鼠行为学变化无明显影响, 无小鼠死亡。制马钱子可以降低血液黏稠度, 促进MCAO模型SD大鼠神经功能的恢复。

关键词：马钱子,脑梗死,偏瘫

参考文献

[1]李贞兰, 安莲华, 刘世文.神经生理学康复训练技术回顾与展望[J].中国康复医学杂志, 2005, 3 (20) :231.

[2]陆敏.脑卒中患者肢体痉挛的发生率及其与功能的关系[J].中国康复, 2005, 20 (5) :281-282.

[3]于维东.偏瘫康复的理论与实践[J].现代康复, 2001, 5 (2A) :5-8.

实验性心肌梗死 篇7

1 材料与方法

1.1 仪器与药品 MPA-心功能分析系统(MPA-CFS,上海奥尔科特生物科技有限公司),高原模拟实验舱自动监控系统(V1.01,宏远集团);红景天(批号1007069),丹参(批号1010042),仙鹤草(批号1009006),木香(批号1003007),砂仁(批号1012057),刺五加(批号1101055),均为江苏江阴天江药业有限公司出产。

1.2 实验动物与实验方法 雄性SD大鼠84只,中国军事医学科学院动物实验中心提供,清洁级。以国家标准啮齿类动物饲料分笼饲养,自由饮食,室内空气流通。84只大鼠随机分为7组:平原对照组(PC)、模拟高原低氧1 d组(H1)、模拟高原低氧3 d组(H3)、模拟高原低氧7 d组(H7),模拟高原低氧1 d加中药干预组(Z1)、模拟高原低氧3 d加中药干预组(Z3)、模拟高原低氧7 d加中药干预组(Z7),每组12只。平原对照组不予任何处理,正常饲养。其余6组大鼠置于低压低氧舱内(舱内大气压约405 mmHg,大气氧分压约85 mmHg,相当于海拔5 000 m高度),制备模拟高原低氧动物模型。分别放置1 d(H1、Z1)、3 d(H3、Z3)、7 d(H7、Z7),其中Z1、Z3、Z7组大鼠在进入低压低氧舱前,以灌胃法喂服由红景天、丹参、仙鹤草、刺五加、木香、砂仁6味中药组成的复方合剂。中药复方合剂颗粒制成100 %水溶液,每毫升含药品1 g,剂量为每只大鼠2 mL/d。平原对照组和其他模拟高原各组大鼠则以等量的生理盐水灌胃。实验大鼠每天返回平原(离开低压低氧舱)1 h,以便进行喂食和打扫卫生。

1.3 心肌力学指标测定 大鼠以25 %氨基甲酸乙脂溶液(0.5 g/kg)腹腔注射麻醉,仰卧位固定,颈部手术,分离一侧颈总动脉,将充满1 %肝素的聚乙烯管(内径0.5 mm,外径1 mm)插入颈动脉并延伸插入左心室,连接MPA-心功能分析系统,记录HR、左心室等容收缩期最大压力变化速率(+dp/dt max)和左室舒张期压力下降最大速率(-dp/dt max)。

1.4 数据处理 数据以均数±标准差($\overline{x}\pm s$)表示,全部数据资料用SPSS 13.0统计软件进行方差分析。

2 结果

H7组和Z7组大鼠HR加快,与PC组比较差异有统计学意义(P<0.01),其它各组大鼠HR在相同时间段组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。与PC组比较,H7组和Z7组大鼠+dp/dt max、-dp/dt max均升高(P<0.01),且Z7组大鼠+dp/dt max、-dp/dt max高于H7组(P<0.01)。其它各组+dp/dt max、-dp/dt max在相同时间段组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

*与PC组比较P<0.01;△与H7组比较P<0.013 讨论

久居平原的人进入高原低气压、低氧分压环境后,会发生急性高原反应,其中心血管反应极为显著。心血管反应的早期主要表现为心率增加,并且心率与氧耗量呈明显正相关[1]。+dp/dt max是评定心肌收缩性能的一项最常用指标,-dp/dt max是反映舒张性能较好的指标。dp/dt max主要受心肌收缩性的影响,心肌收缩性与肌球蛋白ATP酶的活性有关。常荣等[2]研究发现,吸入低浓度氧后的藏羚羊+dp/dt max明显升高,表明基础状态下藏羚羊通过较低的心肌收缩力使耗氧量保持在一个较低水平,有利于对低氧环境的适应。低氧应激状态下,左心功能代偿性增强,收缩期室内压上升的速率增大,心输出量增加,有利于氧运送到全身器官,这与在海拔4 300 m世居的藏族与移居汉族青年的血流动力学的观察结果一致[3]。

本实验结果显示:与PC组比较,H7组大鼠的心率明显加快,Z7组与H7组比较差异无统计学意义。H7组和Z7组的+dp/dt max、-dp/dt max均升高,且Z7组+dp/dt max、-dp/dt max明显高于H7组。H7组+dp/dt max、-dp/dt max升高,可能由于急性缺氧兴奋中枢及外周化学感受器,引起交感神经兴奋,释放去甲肾上腺素,激活心肌细胞膜上的β1受体,产生正性变时作用,心率增快;正性变力作用,心肌收缩力增强。

Z7组的+dp/dt max、-dp/dt max升高,在神经体液调节的基础上,还可能与中药的作用相关。文献报道服用红景天能改善和提高人体在高原的机能状态及有氧劳动能力等功效,对提高机体耐力、降低能量消耗、改善机体代谢水平取得了较理想的试验结果[4]。周逸等[5]指出,刺五加皂甙B对线粒体ATP敏感性钾通道的作用,对心肌有一定的保护。孙学刚等[6]认为,丹参酮ⅡA降低了缺氧引起的心肌细胞内Ca2+浓度升高。因而推测服用红景天等组方中药复方制剂,可能通过提供机体的耐受力以及对线粒体Ca2+浓度的维持和线粒体膜转运系统的保护作用,进而增强心肌收缩力,使+dp/dt max、-dp/dt max升高。

因此,模拟高原低氧可引起大鼠心脏的收缩和舒张功能代偿性增强,红景天等组方中药复方合剂对大鼠心肌力学有一定的正性作用。

摘要：目的:观察模拟高原低氧对大鼠心肌力学的影响,探讨红景天等组方中药复方合剂对其的作用。方法:雄性SD大鼠84只,随机分为平原对照组(PC)、模拟高原低氧1 d组(H1)、模拟高原低氧1 d加中药干预组(Z1)、模拟高原低氧3 d组(H3)、模拟高原低氧3 d加中药干预组(Z3)、模拟高原低氧7 d组(H7)、模拟高原低氧7 d加中药干预组(Z7),每组12只;采用MPA-心功能分析系统,记录大鼠HR、+dp/dt max、-dp/dt max。结果:H7组和Z7组大鼠心率加快,+dp/dt max、-dp/dt max均升高(P<0.01),且Z7组大鼠+dp/dt max、-dp/dt max明显高于H7组(P<0.01)。结论:模拟高原低氧可引起大鼠心脏收缩和舒张功能代偿性增强,红景天等组方中药复方合剂对大鼠心肌力学有一定的正性作用。

关键词：模拟高原,低氧,+dp/dtmax,-dp/dtmax,大鼠,中药复方

参考文献

[1]刘福玉,黄庆愿,高钰琪,等.模拟高原游泳运动对大鼠血液粘滞度及心功能的影响[J].中国应用生理学杂志,2004,20(1):7-10.

[2]常荣,杨应忠,马祁生,等.藏羚羊和藏系绵羊左心室收缩功能的比较研究[J],中国病理生理杂志,2010,26(8):1498-1502.

[3]王伟,陈占诗,张西洲,等.海拔4300m世居藏族与移居汉族青年血流动力学对比观察[J].高原医学杂志,2000,10(2):18-20.

[4]王伟,哈振德,张芳,等.药物对高原人体运动时心率的影响[J].临床军医杂志,2003,31(4):5-7.

[5]周逸,唐其柱,史锡滕,等.刺五加皂甙B对心肌线粒体ATP敏感性钾通道的作用[J].中国心脏起搏与心电生理杂志,2004,18(6):473-475.