Akt信号通路

Akt信号通路（精选7篇）

Akt信号通路 篇1

摘要：目的 研究RUNX3对胃癌细胞迁移的影响。方法 使用Western blot、Real-time PCR分别在蛋白和基因水平上观察RUNX3对Akt/β-catenin的影响, 使用细胞划痕实验观察RUNX3对胃癌细胞迁移的影响。结果 RUNX3能够下调Akt、β-catenin蛋白和基因的表达, RUNX3能够抑制胃癌细胞的迁移。结论RUNX3通过影响Akt/β-catenin抑制胃癌细胞的迁移。

关键词：RUNT相关转录因子3,β-链蛋白,免疫印迹

在全球范围内, 胃癌在癌症病死率中居第二位[1], 根据全球卫生组织2008 年报告, 每年大约新发胃癌一百万人。Runt相关转录因子是进化上保守的蛋白家族, 具有高度同源的Runt结构域, DNA结合域和约120 个氨基酸的异二聚体区。在哺乳动物中, RUNX家族包含三个成员, RUNX1、RUNX2 和RUNX3[2]。其中, RUNX3 作为转录因子, 能够调节种系特异性基因, 参与许多癌症的形成[3]。RUNX3 通过影响效应基因的表达来发挥抑癌作用, 这些效应基因参与胃上皮细胞的生长、凋亡及分化[4,5]。

Akt是一种丝氨酸/ 苏氨酸特异蛋白激酶, 分子量约为60 k D, 又被称为蛋白激酶B (PKB) , 在糖代谢, 凋亡, 细胞增殖, 转录和细胞迁移中发挥重要的生物学作用。有研究表明Akt能够通过调节SLUG蛋白表达, 引起肿瘤细胞发生上皮间质化 (EMT) , 促进肿瘤的侵袭转移[6]。β-catenin是一种多功能的蛋白质, 含有12 个重复的arm结构域, 能与多种蛋白相互作用包括TCF/LEF、APC、E- 钙粘素蛋白和α-连环链蛋白, 参与细胞间黏附和Wnt信号通路[7]。

本研究中RUNX3 下调Akt/β-catenin的蛋白和基因表达水平, 为进一步研究胃癌转移的机制提供依据。

1 材料和方法

1.1 细胞和质粒

GES1 和AGS胃癌细胞株购自于中国科学院细胞库。细胞均用含有10%胎牛血清的DMEM进行培养, 培养至90%融合, 进行细胞传代或用于实验。

Flag载体购自SIGMA公司, Flag-RUNX3 受赠于Yoshiaki Ito教授。

1.2 主要试剂和仪器

TRIzol RNA提取试剂, Lipofectamine 2000 购自Invitrogen公司, 逆转录试剂盒和Real Time PCR试剂盒购自大连Ta Ka Ra公司, Protein marker购自Fermentas公司, G418 购自Gibco公司, GAPDH抗体购自康成生物公司, RUNX3 抗体购于金斯瑞公司, Akt抗体, β-catenin抗体购自Cell signal公司;HRP标记的羊抗鼠Ig G购自北京中杉金桥生物技术有限公司, 引物合成由上海生物工程有限公司完成;ECL发光试剂盒购自Thermo公司, 其他试剂均为国产分析纯。实时荧光定量PCR仪为美国ABI公司7300 型。

1.3 Flag-RUNX3 稳定转染AGS细胞系

AGS细胞使用含有10%胎牛血清的DMEM高糖培养基培养, 将AGS细胞铺于六孔板至70%~80%融合, 按照Invitrogen公司提供的Lipofectamine 2000 转染六孔板的说明书进行操作。用G418 进行筛选后, 使AGS细胞中稳定表达Flag和Flag-RUNX3 蛋白, 进行划痕实验。

1.4 蛋白质提取与Western blot鉴定

转染24 h后, 弃掉培养基, 用PBS清洗两遍。在细胞中加入60μL含有蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液, 用橡皮刮刀将细胞缓慢刮下。收集所有液体到新的离心管中, 冰上放置10 min, 裂解细胞。13 000 g4℃离心30 min, 将上清转到新的离心管中, 取上清5μL, 选用G250 考马斯亮蓝方法进行蛋白定量。

将蛋白定量后, 取80μg总蛋白经10%SDS-PAGE凝胶分离, 4℃过夜40 V恒压转移到PVDF膜上, 5%脱脂奶粉封闭1 h。根据目标蛋白的分子量, 切割PVDF膜, 用一抗室温孵育2 h, 然后TBST洗膜3 次, 每次10 min。再用辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠 (1∶5 000 稀释) 二抗孵育2 h, 然后TBST洗膜3 次, 每次10 min。ECL显影。

1.5 细胞RNA提取及反转录

用10%胎牛血清的高糖DMEM培养基培养细胞, 分别将稳定表达Flag和Flag-RUNX3 的细胞接种在6 孔板中, 细胞数为1×106, 待细胞生长至90%融合, 24 h以后, 提取细胞总RNA。分别在每个孔中加入1 m L TRIzol, 用移液器反复吹打, 直到细胞全部裂解。RNA提取过程按照Invitrigen公司提供的TRIzol说明书进行操作。 测RNA的OD260/OD280 值, 计算比值和浓度。将提取的RNA稀释到浓度为1μg/μL, 进行反转录。操作步骤按照TAKARA反转录试剂盒说明书进行。

1.6 Real-time PCR体系

应用Primer Premier 5 设计引物, 引物序列见表1。 Real-time PCR反应体系为20μL (2 ×SYBR Premix Ex Taq TM 10μL, ROX Referenc Dye II 0.4μL, dd H2O 7.8μL, c DNA 1μL) , PCR反应程序:95℃ 1 min, 95℃ 10 s, 60℃ 15 s (信号采集) , 40 个循环, 溶解曲线程序:95℃ 10 s, 60℃ 30s→5℃ 30 s (全程信号采集) 。

RUNX3 引物上游序列5'-CAGAAGCTGGAGGA CCAGAC-3', 下游序列5'-GTCGGAGAATGGGTTCA GTT-3'。β-catenin引物上游序列为5'-TGCCAAGT GGGTGGTATA-3', 下游序列为5'-GGGATGGTGGG TGTAAGA-3'。Akt引物上游序列为5'-GAGCTGTTC TTCCACCTGTC-3', 下游序列为5'-TAATGTGCCCG TCCTTGT-3'。GAPDH引物上游序列为5'-ATGTTC GTCATGGGTGTGAA-3' 下游序列为5'-GTCTTCTG GGTGGCAGTGAT-3'。

1.7 细胞划痕实验

分别将稳定表达Flag和Flag-RUNX3 细胞接种在6 孔板中, 细胞数为1×106, 待细胞生长至90%融合, 用枪头比着直尺, 在培养皿中划痕, 枪头要垂直, 不要倾斜。用PBS洗细胞3 次, 去除划下的细胞, 加入无血清培养基。放入37℃、5%二氧化碳培养箱培养。按0、12 和24 h取样, 拍照。

2 结果

2.1 胃癌细胞中RUNX3 的表达

分别将GES1 和AGS细胞计数1×106接种在6 孔板中, 待细胞生长至90%融合, 收集细胞, 提取蛋白, western blot检测RUNX3 的表达, 结果显示AGS表达较低。见图1。

2.2 RUNX3 下调Akt/β-catenin蛋白的表达

稳定表达Flag和Flag-RUNX3 的AGS细胞接种在6 孔板中, 其中三个孔为稳定表达Flag, 另外三个孔为稳定表达Flag-RUNX3, 待细胞生长至90%融合, 收集细胞, 提取蛋白, western blot检测Akt/β-catenin蛋白的表达, 结果显示RUNX3 下调Akt/β-catenin蛋白的表达 (图2) 。

2.3 RUNX3 下调Akt/β-catenin m RNA的表达

稳定表达Flag和Flag-RUNX3 的AGS细胞接种在6 孔板中, 其中3 个孔为稳定表达Flag, 另外3个孔为稳定表达Flag-RUNX3, 待细胞生长至90%融合, 收集细胞, 提取m RNA, Real-time PCR检测Akt/β-catenin m RNA的表达, 结果显示RUNX3 下调Akt/β-catenin m RNA的表达 (图3) 。

2.4 RUNX3 抑制AGS细胞迁移能力

稳定表达Flag和Flag-RUNX3 的AGS细胞接种在6 孔板中, 待细胞生长至90%融合, 进行细胞划痕实验, 观察到AGS细胞的侵袭转移能力 (图4) 。结果显示, RUNX3 能够抑制AGS细胞迁移。

A:RUNX3 mRNA表达;B:Akt mRNA表达;C:β-catenin mR-NA表达

A、C、E稳定表达Flag载体;B、D、F稳定表达Flag-RUNX3

3 讨论

恶性肿瘤是严重危害人类健康的疾病之一, 其发生、发展是一个多因素作用、多基因参与和多阶段经历才最终形成的极其复杂的生物学过程。胃癌是高致死性的肿瘤之一。实验中检测了AGS细胞和GES1 细胞中RUNX3 的表达情况, 结果显示AGS细胞中RUNX3 表达较低。RUNX3 基因定位在染色体1p36, 其杂合性缺失在很多癌症中经常被报道, 其中包括胃癌、结肠癌、胰腺癌[8]。有文献报道RUNX3 在食管鳞癌中表达下调[9], RUNX3 杂合性缺失以及伴随的表达减少在胃癌、胆管、胰腺、肺癌细胞系中都普遍存在[10]。小鼠的小肠和大肠上皮细胞中RUNX3缺失, 提示了RUNX3 在肠上皮细胞中作为肿瘤抑制因子的功能, RUNX3-/- 的小鼠肠上皮展现出明显的增生和增殖, 这个现象可能是激活了Wnt信号通路, 上调了Wnt的靶基因例如:c-myc和cyclin D1[10]。实验中笔者发现AGS细胞中高表达RUNX3 后下调Akt/β-catenin的蛋白和m RNA表达水平。有文献报道在肠癌中RUNX3 作为参与肿瘤抑制的TGFβ信号通路的下游靶基因, 拮抗Wnt信号通路[11];RUNX3 作为肿瘤抑制因子, 与TCF4/β-catenin形成三重复合物, 抑制TCF4/β-catenin启动子转录活性, 从而负向调节Wnt信号通路[11]。在膀胱癌中PI3K/Akt调节GSK3β/β-catenin信号通路, 引起肿瘤细胞的迁移和侵袭[12]。YWHAZ能够激活 β-catenin的转录活性, 使其聚集在细胞浆和细胞核中。YWHAZ和 β-catenin相互作用后增加 β-catenin的稳定性, 促进了肺癌细胞的侵袭能力[13]。Akt能够增加β-catenin的转录活性, 从而加快肿瘤细胞的迁移和侵袭。 Akt活性增加能够增加β-catenin在肿瘤细胞中的浓度, 增加 β-catenin的核易位, 加速肿瘤细胞侵袭[14]。本试验中使用细胞划痕实验技术观察RUNX3 对胃癌细胞AGS迁移的影响, 结果显示, RUNX3 能够抑制AGS的迁移能力。初步证实了RUNX3 作为抑癌基因的功能, 为进一步探讨胃癌发病机制提供理论依据。

Akt信号通路 篇2

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2011年1月~11月来我院治疗, 年龄30~65岁的48例鼻咽癌患者和15例鼻咽黏膜慢性炎症患者作为研究对象。48例鼻咽癌患者以WHO分类标准为依据, 均确诊为未分化型角化性癌, 并通过活检、穿刺及免疫组化检测, 其中19例已出现颈部淋巴结转移, 另29例经影像学检查并未发现淋巴结肿大、浸润或转移。鼻咽癌患者中男27例, 女21例, 年龄43.28±2.94岁。15例鼻咽黏膜慢性炎症患者中, 男8例, 女7例, 年龄41.67±2.01岁。两组患者在性别、年龄方面无显著性差异, 具有可比性。

1.2 方法

对所有患者进行活检采集标本, 并对标本进行固定和包埋, 经连续切片后采取HE染色和免疫组化检测, 对检测出的阳性表达结果进行评估和分析。将所得数据进行记录及统计分析。

1.3 评定标准

活检标本以阳性表达的信号强度和面积为判断依据, 阳性表达的标准为:10%≤阳性细胞≤50%, 而阳性细胞>50%则为强阳性表达。对所有阳性表达结果记分, 记分标准:0分:阳性细胞≤10%;1分:11%≤阳性细胞≤50%;2分:阳性细胞>50%。

1.4 统计学处理

将所得数据进行统计学分析, 采用SPSS 13.0统计软件, 对所有计量资料进行t检验, 所有计数资料采用χ2检验, P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 AKT、p AKT在鼻咽癌和慢性鼻炎组织中的阳性表达

见附表。两组PI3K、AKT、p AKT的阳性表达具有显著性差异 (P<0.01) , 有显著统计学意义。

2.2 AKT、p AKT在转移组和非转移组中的阳性表达

PI3K阳性表达转移组17例, 占89.47%;非转移组18例, 占62.07%;两组比较, 差异明显 (P<0.01) , 具有显著统计学意义。AKT阳性表达转移组16例, 占84.21%;非转移组22例, 占75.86%;两者比较并无显著性差异 (P>0.05) , 无统计学意义。p AKT阳性表达转移组17例, 占89.47%;非转移组20例, 占68.97%;两者比较有明显差异 (P<0.01) , 具有显著统计学意义。

3 讨论

PI3K/AKT信号传导通路是一类由多种分子作用的传导途径, 其中PI3K在这一传导途径中主要起到产生肌醇脂激酶, 由一个p110催化亚单位和一个p85调节亚单位组成通过其上游和下游的信号分子作用, 起到调节细胞凋亡的作用。而AKT经研究证实, 是PI3K多种下游信号分子中的一种, 是PI3K直接的靶蛋白, 是PI3K/AKT信号传导通路的核心。因此, AKT的阳性表达可以直接反应PI3K的活性。从文中我们可以看出, 鼻咽癌和鼻咽慢性炎症两组组织比较, 鼻咽癌PI3K、AKT、p AKT的阳性表达要高出45%左右, 由此可以表明, PI3K、AKT、p AKT与鼻咽癌的发生有着密切的关系;其次在鼻咽癌转移组和非转移组的比较中可以看出, 转移组的PI3K、AKT、p AKT的阳性表达较非转移组都有一定的提高, 其中PI3K、p AKT表现尤为突出, 且具有显著的统计学意义, 由此可以表明, PI3K、p AKT与鼻咽癌的远处转移有着密切的关系。

而本次试验只是通过对鼻咽慢性炎症、鼻咽癌及鼻咽癌已转移三组患者的PI3K、ATK、p AKT的阳性反应率进行了观察, 并证实了三者与鼻咽癌的发生发展及转移都有着密切的关系。而PI3K是否是决定鼻咽癌转移的关键物质还需进一步的研究。现有相关研究已经证实, 可以通过使用PI3K的特异性抑制剂对PI3K/AKT信号传导通路进行阻断, 进而观察鼻咽癌的转移情况。因而, 我们将运用这一方式对PI3K与鼻咽癌转移的关系做进一步的研究。

摘要：目的 对PI3K/AKT信号通路与鼻咽癌的预后关系进行研究分析。方法 选取2011年1月11月在院治疗的48例鼻咽癌患者, 另选取15例鼻咽黏膜慢性炎症患者作为对照组, 共63例患者作为研究对象。48例鼻咽癌患者中已发生转移19例, 未发现浸润或转移性29例。将所有患者的活检标本进行HE染色和免疫组化检测, 对PI3K、AKT、pAKT的阳性表达进行数据统计和分析。结果 鼻咽黏膜慢性炎与鼻咽癌组织中PI3K、AKT、pAKT阳性表达有显著差异 (P<0.05) , 具有统计学意义;转移组与非转移组中PI3K、pAKT阳性表达有显著差异 (P<0.01) , 具有显著统计学意义。结论 鼻咽癌的发生、发展与PI3K/AKT信号传导通路有密切的关系, 其中PI3K、AKT、pAKT对鼻咽癌的转移和预后有关。

关键词：PI3K/AKT,鼻咽癌,预后

参考文献

[1]郭晔.转移性鼻咽癌的系统性治疗[J].中国癌症杂志, 2011, 21 (12) :927-931.

[2]Leung TW, Tung SY, Sze WK, et a1.Treatment results of 1070patients with nasopharyngeal carcinoma:an analysis ofsurvival and failure patterns[J].Head Neck, 2005, 27 (7) , 555-565.

Akt信号通路 篇3

2005年由美国加州大学圣地亚哥分校医学院药理学系的科研人员在人体中发现的PHLPP基因位于人体18号和16号染色体上, 它所编码的PHLPP蛋白为蛋白磷酸酶, 其生理作用是特异性地将磷酸化激活的Akt脱磷酸化而失去蛋白激酶活性, 从而抑制Akt的促细胞生长作用。而且, PHLPP在人体各组织器官及细胞中均有广泛表达。通过对人体多种肿瘤细胞进行分子和生化分析, 发现某些肿瘤 (如结肠癌) 细胞中PHLPP水平显著降低, 而Akt的磷酸化水平明显升高。提示, PHLPP可能参与肿瘤生长的负性调节。因此, PHLPP作为肿瘤抑制因子将可能用于所有与Akt水平升高的有关癌症的治疗。

1 PI3K/Akt信号转导通路的组成及其功能

1.1 PI3K的结构和功能

由Whitman M等首先发现的磷脂酰肌醇-3-激酶 (phosphoinositide 3-kinase, PI3K) 是参与细胞内信号转导的信号分子之一。根据其作用底物的不同, PI3K一般被分为Ⅰ型 (ⅠA型, ⅠB型) 、Ⅱ型、Ⅲ型3个亚型[2]。Ⅰ型PI3K在细胞内主要磷酸化PI-4, 5-P2, 此酶的产物主要是磷脂酰肌醇-3, 4, 5-三磷酸。Ⅱ型PI3K主要能磷酸化PI及PI4P;Ⅲ型PI3K仅能磷酸化PI, 生成PI3P。以上三种PI3K除磷脂酶活性外, Ⅰ、Ⅲ型还具有内源性蛋白激酶活性, 可使其自身或调节蛋白磷酸化, 进而影响磷脂激酶的活性。

PI3K含有85KD的调节亚单位和110KD的催化亚单位组成的异二聚体, 是Akt活化的首要调节者。其调节亚基P85分子由以下几个结构域构成:SH3区域、2个富含脯氨酸的区域和2个Src同源结构域。该非编码区是P85和P110相互作用的区域, 2个SH2结构域是PI3K与受体酪氨酸激酶结合的区域, 通过与磷酸化的酪氨酸残基结合来传导酪氨酸信号[3]。在生长因子、胰岛素或受体酪氨酸激酶 (PTK) 的相互作用下, PI3K的P85调节亚单位募集P110催化亚单位到细胞膜。而P110通过使磷脂酰肌醇肌醇环上的D-3位点磷酸化而产生第二信使作用。PI3P水平受PTEN等磷酸酶的调控。值得注意的是, PI3P并不能直接活化Akt, 而是使Akt聚集到细胞膜, 从而发生构象变化, 使其得以被PDK-1磷酸化, 引起后续的细胞内信号传导过程[4]。

1.2 Akt的结构和功能

Akt是由于其与蛋白激酶A (protein kinase A, PKA) 及蛋白激酶C (protein kinase C) 有很高的同源性。目前发现Akt共有AktⅠ、AktⅡ、AktⅢ3种亚型, 三者之间有很高的同源性。但表达水平不同, AktⅠ在组织中广泛表达;AktⅡ主要存在于胰岛素效应组织, 如心肌、骨骼肌等;AktⅢ高表达于睾丸和脑组织中。Akt结构由三部分组成:位于氨基端的PH结构域、中间催化域和位于羧基端的调节域。Akt激活的主要机制是磷酸化, 其调节主要依赖于PI3K-磷酸肌醇依赖性激酶 (PDK) 信号通路。Akt的催化域和调节域具有Thr308和Ser473两个磷酸化位点, 只有两个位点同时磷酸化才能使Akt充分活化从而达到最大活化状态。Akt在PI3K受到细胞外胰岛素及胰岛素样生长因子等的作用下激活并在细胞膜产生的PIP2的作用下产生同二聚体并达到部分激活的状态, 进而Akt/PKB转位到细胞膜, 使Akt/PKB本身获得催化活性, 催化其自身的Ser124和Thr450磷酸化, 并且使Akt/PKB和PDK-1通过它们的PH结构域与Ptdlns (3, 4, 5) P3直接结合锚定在细胞膜上, 这样PDK-1就能催化Akt/PKB的Ser473和Thr308磷酸化, 使Akt/PKB完全活化。活化的Akt由细胞膜释放入胞引起信号转导的级联反应过程[5]。

2 PI3K/Akt信号通路与肿瘤

Akt是PI3K/Akt信号通路的关键分子, 活化的Akt通过调节下游多种信号途径而发挥促细胞生存抑制细胞凋亡等作用。近年来, 关于Akt的异常激活与肿瘤的发生、发展的研究取得了重大进展。

2.1 抑制细胞凋亡

2.1.1 Bad Bad是Bcl-2家族成员之一, 主要分布于线粒体外膜。Bad是第一个被发现的Akt下游靶分子, 在细胞凋亡的调控上发挥重要作用。Bad可与Bcl-2或Bcl-xL形成复合体促细胞凋亡, 当Akt将Bad的Ser136位点磷酸化, 即引起Bad与伴侣蛋白 (Chaperone) 14-3-3结合, 从而阻断Bad与Bcl-2或Bcl-xL形成二聚体, 使Bad不能发挥促细胞凋亡作用。同样也有研究表明, Akt也能将Bcl-2家族成员Bax的Ser184位点磷酸化, 使Bax停留在细胞质中, 促进它和Mcl-1、Bcl-xL形成异源二聚体, 因此抑制凋亡。

2.1.2 caspase-9 在细胞凋亡中, caspase-9前体能与Apaf-1等蛋白结合而自我激活, 从而启动天冬氨酸蛋白水解酶级联反应。Akt 可将caspase-9前体的Ser196位点磷酸化, 抑制其蛋白酶活性, 阻止其促凋亡作用。相应的, 若细胞中caspase-9前体的Ser196位点发生突变, Akt对caspase-9的抑制作用消失。

2.1.3 FKHR1 有报道, Akt也可通过Forkhead家族转录因子如Forkhead受体、FKHR等调节促细胞死亡基因转录。研究证实, 在没有Akt作用下, Forkhead家族主要定位于核内, 通过结合到特异顺式作用元件促进Fas-L、IGFBP1和Bim等凋亡相关基因的转录。在生长因子刺激下, Akt 可将Forkhead家族转录因子磷酸化, 改变其胞内定位。在Akt作用后, FKHRL1从核内移出, 被14-3-3蛋白隔离在胞质区并在此堆积, 从而阻止其发挥调节凋亡相关基因转录功能[6,7,8]。

2.2 促进细胞周期进展

Akt通过增加c-myc的转录, 上调该基因的表达, 这是最早明确由Akt直接作用影响细胞周期的是抑癌基因[9]。当c-myc过度活化或过度表达时, 是一种较强的细胞周期促进因子, 它通过使细胞逃离G0期而引起细胞增殖。后来研究发现, Akt还可以作用于多种细胞周期调控因子, 如Cyclin D1、p21、Mdm2、mTOR等, 通过多种途径促进细胞周期的进展。Akt作用于GSK-3, 引起由GSK-3介导的Cyclin D1降解, 致使其半衰期很短, 从而延长G1期;Akt可以磷酸化p21, 使其移位到胞质, 丧失抑制作用, 从而促进细胞周期进展;Akt还能结合Mdm2并磷酸化其Ser166、186位点, 诱导核输入或上调泛素连接酶的活性, 进而促进p53的失活或降解, 阻断p53介导的促凋亡转录反应[10]。

2.3 促进细胞侵袭和转移

Akt磷酸化激活后能够增加转录因子NF-KB的转录活性, 使MMP-9产量增加, 且细胞运动增强, 有助于癌细胞侵袭, NF-KB还能上调COX-2的表达, 促进细胞侵袭的发生; Akt也可经过mTOR/p70s6k途径促进肌动蛋白的细丝重构, 促进细胞运动。有研究表明, 用持续活化的Akt转染的鳞状上皮细胞癌细胞株, Akt可诱导上皮间叶细胞转换, 细胞转而获得纤维原细胞样特性, 而且E-钙黏素的转录下调, 有效减少细胞间的黏附, 增加了细胞的运动性和侵袭性[11,12]。

3 PI3K/Akt信号通路的负调控

近年来研究发现, 细胞内存在蛋白磷酸酶2A (PP2A) 、钙调蛋白磷酸酶 (PP2B) 以及肿瘤抑制因子PTEN等多种信号分子能够使Akt去磷酸化。PP2A和PP2B 的底物特异性低, 而PTEN是通过脱磷酸化Akt的上游调节酶PI3P来实现对Akt活化的抑制。但是, 多数实验发现, 某些细胞, 如LN229细胞对PI3K、PTEN并不敏感。另一方面, 仅应用PTEN来阻止PI3K-PI3P途径, 只能在上游部分抑制Akt的活化, 不能抑制已经活化的Akt, 例如, 2005年由Sarbassov等报道, 哺乳动物中一种Rapamycin不敏感的蛋白激酶复合物也能够磷酸化Akt的Ser473。上述情况降低了PTEN等蛋白磷酸酶在肿瘤抑制等方面的应用[13], 寻找Akt特异的蛋白磷酸酶及其负性调控因子对于肿瘤的生长调控具有重要意义。

4 PHLPP的结构和功能

4.1 PHLPP的结构

PHLPP家族有三种磷酸酶亚型:PHLPP1-α、PHLPP1-β和PHLPP2。PHLPP1-α和PHLPP1-β是由位于18号染色体上的同一基因 (18q21.33) 表达的不同亚型, 而编码PHLPP2 的基因位于16号染色体上 (16q22.3) 。PHLPP1-β比PHLPP1-α在N末端多出一个大约56KD的区域, 这两个亚型在对Akt信号通路的调控上发挥着不同的作用。PHLPP1和PHLPP2在PH结构域之后都含有一个亮氨酸重复基序 (LRR) , 另外均含有一个PP2C磷酸酶结构域和C末端的PDZ结合区[14]。此外, PHLPP1-β和PHLPP2在PH结构域前还有一个Ras结合区 (RA结构域) 。PHLPP1和PHLPP2在PH结构域和PP2C磷酸酶结构域中分别存在63%和58%相同的氨基酸基序。

4.2 PHLPP的表达

研究表明, PHLPP1和PHLPP2均可广泛表达于细胞质、细胞核和部分膜结构上, 在人体的大部分组织器官中都有表达。但在肿瘤细胞 (如乳腺癌细胞) 中, PHLPP的表达水平却明显降低。此外, 编码PHLPP2 的基因跨越了两个染色体脆性部位, 这些区域是染色体容易发生突变或断裂的地方, 因此肿瘤细胞中常表达结构异常的PHLPP2。

4.3 PHLPP对其作用靶点的调控作用

4.3.1 PHLPP对Akt的去磷酸化作用

Akt的三个亚型的完全活化需要Thr308和Ser473两个位点磷酸化, 才能使其得以到胞浆内引起信号转导通路的级联反应, 从而发挥其调控细胞周期、抑制细胞凋亡、促进肿瘤发生的作用。而PHLPP则可以特异地使细胞中Akt的疏水基团去磷酸化, 从而导致活化的Akt水平降低, 发挥促进细胞凋亡和抑制细胞增殖的作用。实验表明, PHLPP1在裸鼠恶性胶质瘤细胞中的大量表达, 可以使肿瘤缩小, 但是敲除PHLPP1上的PDZ结合区之后, PHLPP的这种抑瘤作用便会丧失, 因此PHLPP生物效应的发挥依赖于PHLPP上的PDZ结合区。实验表明, PHLPP1和PHLPP2均可以抑制活化的Akt表达的水平和时间, 但是缺失两者中任意一个, 正常乳腺细胞中磷酸化的Akt水平就会上升30%。敲除内源性的PHLPP1、PHLPP2基因后, 不仅会使相同的Akt信号通路底物分子 (如GSK-3b、TSC-2、p27) 的磷酸化水平升高, 而且会导致一些少见的Akt信号通路底物分子 (如E3连接酶、HDM2、GSK-3a) 的磷酸化水平升高[14]。

实验研究还发现, PHLPP1和PHLPP2对于Akt信号通路的微调节发挥着不同的调控作用。PHLPP1主要使AktⅡ和AktⅢ去磷酸化, 而PHLPP2则影响AktⅠ和AktⅢ的磷酸化。除此之外, 细胞中含有明确的PHLPP-Akt-底物作用路径, 如PHLPP1-Akt2-HDM2和PHLPP2-Akt3-p27。然而PHLPP1和PHLPP2的抑瘤功能的强弱是有差别的, PHLPP2的抑瘤作用强于PHLPP1。敲除PHLPP1可使细胞G1/S率的水平降低25%, 而敲除PHLPP2可使细胞G1/S率的水平降低50%[15]。总之, PHLPP1和PHLPP2在使磷酸化的Akt去磷酸化过程中发挥重要作用, 两者相辅相成, 缺一不可, 共同发挥着抑瘤的重要作用。

4.3.2 PHLPP对PKC的去磷酸化作用

PKC是促肿瘤佛波酯的受体, 是与肿瘤发生密切相关的一种蛋白激酶。1995年, 在PKCβⅡ和p70S6激酶中发现PKC分子中含有一个疏水基团。此疏水基团的磷酸化控制着细胞中活化的PKC的水平从而调控PKC信号通路的强度。PHLPP1和PHLPP2均可以使传统的或新的PKC分子中的疏水基团去磷酸化, 但是对于非典型的PKC毫无作用, 因为这些非传统的PKC在此位置有一个谷氨酸。PHLPP的这种去磷酸化作用降低了PKC的水平, 在PHLPP敲除细胞中, PKC的水平明显增加。研究还发现, 在mTORC2复合物缺陷的细胞中, 其PKC疏水基团的磷酸化水平降低, 这表明此复合物促进PKC的磷酸化。虽然这个机制并未阐明, 但是可以明确的是PHLPP对mTORC2复合物具有拮抗作用[16]。因此推断PHLPP还通过使PKC去磷酸化而发挥抑瘤作用。

5 PHLPP在疾病中的潜在作用

5.1 肿瘤

PHLPP1和PHLPP2通过使磷酸化的Akt去磷酸化, 补充PTEN功能的不足, 降低细胞内活化的Akt水平, 从而抑制PI3K/Akt信号通路的调控细胞周期、抑制细胞凋亡、促进肿瘤发生的作用。通过对人体多种肿瘤细胞进行分子和生化分析, 发现某些肿瘤 (如乳腺癌、结肠癌) 细胞中PHLPP水平显著降低, 而Akt的磷酸化水平明显升高。因此, 推断PHLPP作为肿瘤抑制因子将可能用于与Akt水平升高的有关癌症的治疗。此外, PHLPP还可以使PKC去磷酸化而发挥抑瘤作用。这些均为研制抗肿瘤药物提供了新的研究方向。

5.2 糖尿病

Akt信号通路是胰岛素在细胞内的主要效应通路, 促进细胞对葡萄糖的摄取。Akt通过促进葡萄糖载体Glut4易位, 从而促进葡萄糖的跨膜摄取。Cozzone等在Ⅱ型糖尿病患者的骨骼肌肌管中发现, Akt2的Ser473位点磷酸化水平降低, Akt1的Thr308位点的磷酸化水平降低。此外, 他们还观察到Ⅱ型糖尿病患者的细胞中编码PHLPP1的mRNA的表达水平上调。而PHLPP-1恰好能使Akt2的Ser473磷酸化位点去磷酸化[17]。因此推测抑制细胞中PHLPP-1的表达, 可以提高Akt磷酸化的水平, 调节胰岛素敏感性。从而促进细胞对葡萄糖的摄取作用, 降低血糖, 达到一定的治疗糖尿病的效果。

5.3 脑缺血再灌注损伤

来自临床研究的结果显示, 脑内Akt会在脑缺血再灌注损伤3~12 h后激活, 并且缺血损伤半影区的脑组织中Ser2473磷酸化Akt的表达显著增强, 主要以星形胶质细胞为主, 而损伤中心脑区中的Akt却只有微弱的激活。研究发现, 利用Akt的激动剂, 脑缺血再灌注后上调Akt的激酶活性能有效抑制神经元的死亡[18]。因此推断, 利用药物抑制缺血再灌注损伤脑组织中的PHLPP的活性, 以此提高损伤脑组织中Akt的激活程度, 将有利于神经元的存活, 抑制神经元损伤。

5.4 冠状动脉支架置入术后再狭窄 (RS)

冠状动脉支架置入术后再狭窄是困扰临床冠心病救治效果的严重问题。在众多导致RS的因素中, 血管平滑肌细胞 (VSMC) 过度增生、血管内皮功能损害等是RS发生发展的重要因素。有学者提出, PTEN转基因治疗抑制VSMC增生, 对预防RS具有一定效果。但是, 因PTEN仅能从上游途径抑制Akt的活化, 不能抑制已经活化的Akt, 并且PTEN转基因也损害内皮细胞的正常生长。这些限制严重制约了PTEN在防治RS中的应用。而磷酸酶PHLPP在防治RS的研究中显示出巨大潜力, 它可以特异性地将磷酸化Akt发生去磷酸化失活。更为重要的是, PHLPP在内皮细胞HUVEC中无表达, 并且转基因研究发现其对HUVEC生长无抑制作用。这显示出了PHLPP在内皮细胞和VSMC中存在截然不同的信号转导机制。PHLPP对内皮细胞和VSMC的选择性调节, 使人们可能通过PHLPP转基因治疗来实现新的RS防治策略, 即:在抑制VSMC过度增生的同时又不影响内皮细胞再生和支架内皮化进程。这是目前其他目的基因治疗所难以回避的难题[19]。

6 展望

Akt信号通路 篇4

1 材料与方法

1.1 材料

人神经母细胞瘤细胞株SK-N-SH购自中国医学科学院肿瘤研究所;DMEM培养基,胎牛血清购自Hyclone公司;小白菊内酯购自北京泰乐奇公司;四甲基偶氮唑蓝(MTT)购自Sigma公司;Annexin V/PI凋亡试剂盒购自BD公司;兔抗人p-Akt1/2/3(Ser473)及鼠抗人NF-κB p65均购自Santa Cruz公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

SK-N-SH细胞接种于含10%胎牛血清的DMEM培养基中,置37℃、5%CO2培养箱中培养,常规胰酶消化传代。

1.2.2 MTT法测定细胞增殖抑制率

取对数生长期细胞,配制成1×104个/ml细胞悬液,接种于96孔板,每孔加100μL。细胞贴壁达30%-40%时加入含不同浓度PTL及相应溶剂(DMSO)对照的新鲜培养基。PTL最终浓度为2.5、5、10、15、20、30、50μmol/L,同时设对照组。37℃孵育48 h后每孔加入新鲜配制的0.5 g/L的MTT,继续孵育4 h,弃培养基,每孔加入DMSO溶液150μL,震荡10 min,酶标仪(波长490 nm)测定吸光度(A),每组设4个平行孔,独立重复3次,以溶剂处理肿瘤细胞为对照组。抑制率(%)=[(对照组平均A值-实验组平均A值)/对照组平均A值]×100%。

1.2.3 倒置显微镜观察细胞形态学变化

选对数生长期的细胞用于实验,配制成1×104个/m L细胞悬液,每孔1 m L细胞悬液接种到24孔板中,24 h后换含不同浓度PTL(0、10、15μmol/L)的培养液培养48h,倒置显微镜下观察细胞形态学变化。

1.2.4 流式细胞术检测PTL对SK-N-SH细胞凋亡的影响

收集对数生长期细胞,分别用10μmol/L和15μmol/L的PTL处理48 h,收集各组细胞,调整细胞浓度为1×106/m L,各取1 m L,1 000 r/min离心5 min,吸取上清,PBS离心洗涤两次后,弃上清备用。并设空白对照组。PBS洗涤样品细胞后,以稀释的结合缓冲液(蒸馏水1:4稀释结合缓冲液),调整细胞浓度为(2-5)×105/m L,取100μL细胞悬液,加入5μL Annexin V-FITC和10μL PI,混匀,室温避光反应15 min,PBS洗涤1次,再加300μL稀释的结合缓冲液,1 h内用流式细胞仪分析,每个样本收集1×104个荧光信号,采用Cellquest软件分析结果。实验重复3次。

1.2.5 Western blot检测p-Akt(Ser473)及NF-κB p65蛋白表达

收集0、10μmol/L、15μmol/L PTL分别作用48 h的细胞,加入RIPA裂解液(10mmol/L Tris-HCl,pH7.4,5 mmol/L EDTA,1%Triton X-100,150 mmol/L氯化钠,0.1 mmol/L PMSF),冰上操作,4℃低温12 000 r/min离心10 min,提取上清,考马斯亮蓝蛋白定量。以SDS-PAGE电泳分离蛋白后,电转移至NC膜,封闭后分别加入一抗,4℃过夜,室温孵育2 h,漂洗后二抗(Goat anti-MS Ig G和Goat anti-Rabbit IgG)孵育2 h,再次漂洗后用ECL化学发光试剂盒进行检测。以β-actin作内参照,用凝胶图像分析软件进行光密度积分值分析。

1.3 统计学方法

所有数据采用SPSS 13.0软件进行分析,数据均以均值±标准差表示。三组间比较用单因素方差分析,多个独立样本两两比较采用LSD检验。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 PTL对SK-N-SH细胞增殖的影响

经不同浓度PTL处理后的人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞生长明显受到抑制,与对照组比较,差异有显著性(F=998.243,P<0.01),随着PTL浓度增加,抑制作用逐渐增加(图1),在30μmol/L时抑制作用最强,再增加PTL浓度(50μmol/L),抑制率增加不显著(P=0.271)。

2.2 PTL作用48 h后SK-N-SH细胞形态学改变

见图2。对照组细胞生长良好,成多边形,核质清晰;PTL作用48 h后,10μmol/L组细胞数量减少,部分细胞变圆;15μmol/L组细胞数量明显减少,细胞固缩呈圆形,单个散在存在,少量细胞溶解。

2.3 PTL对SK-N-SH细胞凋亡的影响

流式细胞术检测PTL(10μmol/L,15μmol/L)作用SK-N-SH细胞48 h后细胞凋亡的变化。结果显示:随着PTL浓度的增加,细胞早期凋亡率和晚期凋亡率逐渐增高,两实验组与对照组比较,早期凋亡率和晚期凋亡率的差异均有显著性(P<0.01);两实验组间比较差异具有统计学意义(P<0.01)。(见表1,图3)

2.4 PTL对SK-N-SH细胞p-Akt(Ser473)和NF-κB p65蛋白表达的影响

SK-N-SH细胞内存在p-Akt及NF-κB p65蛋白表达;与对照组比较,10μmol/L、15μmol/L PTL可使p-Akt(Ser473)和NF-κB p65蛋白表达下降,并呈浓度依赖性,不同浓度实验组之间差异有统计学意义(表2,图4)。

3 讨论

PTL在西方过去常用于治疗炎症性疾病,最近发现其具有抗肿瘤的作用,并证实其在体外对多种肿瘤细胞有明显抑制作用。该实验结果显示,PTL对SK-N-SH细胞的增殖有抑制作用,在一定浓度范围内呈浓度依赖性;PTL作用于SK-N-SH细胞后,细胞数量减少,细胞固缩,核质界限不清且细胞破裂溶解;流式细胞术显示PTL可诱导SK-N-SH细胞凋亡。

Akt和NF-κB这两条主要的抗凋亡及促生存的信号通路在人类大多数肿瘤中呈超激活状态[7,8]。Akt,也称为蛋白激酶B(protein kinase,PKB),是一种原癌基因。生理状态下,Akt以低活性(失活状态)存在于细胞浆,当暴露于各种刺激因素如生长因子缺乏或DNA损伤时,Akt在其上游分子的调节作用下发生磷酸化而激活,激活的Akt与相应部位的底物蛋白发生作用,使底物蛋白特定部位的丝氨酸、苏氨酸磷酸化,在促进肿瘤细胞存活、增殖,保护细胞逃避凋亡,促使细胞侵袭和转移,促血管生成,抵抗化疗和放疗中细胞凋亡等方面起重要作用[9]。Akt在NB发病机制的研究中越来越受关注,国内外关于针对Akt的靶向治疗均有研究[10,11]。正常情况下,NF-κB与抑制剂IκB结合滞留在细胞质中保持沉默,IκB激酶(IKK复合物)可以磷酸化降解IκB,使NF-κB与细胞核内靶基因结合,发挥调节细胞分化、增殖和抗凋亡等生物学活性[12],NF-κB与NB的发生发展及浸润转移密切相关[13]。文献[14,15]报道,PTL可以直接结合IKK复合物,抑制IKK复合物激活,阻止其磷酸化降解IκB进而阻止NF-κB激活;PTL还可以使NF-κB p65亚单位的半胱氨酸残基烷基化,阻止NF-κB与DNA结合,从而抑制了与肿瘤侵袭、转移及药物抗性有关的基因活化与转录。本研究结果显示,PTL可以降低SK-N-SH细胞内p-Akt及NF-κB p65蛋白的表达,且随PTL浓度增加,p-Akt及NF-κB p65蛋白表达降低更明显,这说明PTL可阻断Akt,NF-κB传导通路,从而抑制NB的增殖。

Akt信号通路 篇5

1 材料和方法

1.1 试剂和抗体

主要包括DMEM/F12培养液(Gibco)、胎牛血清(FBS,Gibco)、重组TGFβ1(biosource)、磷酸化Akt(p-Akt)单克隆抗体(cell signaling technology)、E-钙黏蛋白(E-cadherin)单克隆抗体(Abcam)、平滑肌肌动蛋白(a-SMA)单克隆抗体(CST)、Wortmannin(Upstate),HRP-标记的羊抗二抗(Jackson Immuno Research)。

1.2 细胞培养及试验分组

采用原代人腹膜间皮细胞体外培养方法[3]培养HPMC。细胞体外扩增采用含10%FBS的DMEM/F12(1∶1),培养条件为5%二氧化碳,37℃恒温培养。第3代用于实验。在倒置显微镜下观察细胞生长情况和细胞形态变化。

将HPMC按1×106接种于50 cm2培养瓶中,先用完全培养基培养,待细胞融合到60%~70%,改用无血清培养基同步24 h,弃培养基。依实验要求加入10 ng/m L TGFβ1的0.5%培养液分别作用0、0.5、1、2和4 h后测定p-Akt水平。将HPMC细胞分为正常对照组、T组(加入10 ng/m L TGFβ1)及W组(先用10 nmol/L Wortmannin预处理1 h,再加入10ng/m L TGFβ1),刺激1 h后检测p-Akt水平,48 h后检测E-cadherin和α-SMA表达水平。

1.3 Western blot试验

冰上裂解细胞,14 000 r/min,4℃离心15 min,留取上清,用Bradford法测定蛋白质浓度。取不同体积含总蛋白20μg的样本加样至10%SDS-PAGE胶电泳,电转移至硝酸纤维膜上。封闭液1 h,加入一抗α-SMA(1∶400)、E-cadherin(1∶1 000)、p-Akt(1∶1 000),GAPDH(1∶1 000)4℃孵育过夜,洗膜,用辣根过氧化物标记的二抗(1∶2 000)孵育1小时,ECL显色并曝光成像,用凝胶成像系统扫描分析测定目标蛋白质含量。

1.4 统计学方法

定量资料用均数±标准差(x±s)表示,组间比较采用单因素方差分析。采用SPSS11.0进行统计学处理。P<0.05为差异有显著性。

2 结果

2.1 HPMC细胞形态的改变

正常对照组细胞为鹅卵石样紧密排列生长,TGFβ1组细胞在作用48 h后细胞基本呈长梭形,细胞间隙增大;而TGFβ1+Wortmannin组细胞在48h后细胞形态与正常组比较无明显改变。见图1。

2.2 TGFβ1对P13K/Akt信号通路的影响

Western blot结果显示,正常HPMC细胞蛋白水平的p-Akt表达很弱,加入10 ng/m L TGFβ1刺激0.5 h后,p-Akt水平即显著增加(P<0.05),1 h升至顶峰,后p-Akt水平随时相而逐渐下降。见图2。

2.3 Wortmannin对TGFβ1激活P13K/Akt通路的作用

Western blot结果显示,TGFβ1组细胞经10ng/m L TGFβ1刺激1 h后p-Akt水平较正常对照组显著升高(P<0.05),TGFβ1+Wortmannin组p-Akt水平较TGFβ1组显著减弱,且差异具有统计学意义(P<0.05),与正常对照组相比无明显差异(P>0.05)。见图3。

2.4 E-cadherin和α-SMA蛋白水平的表达

Westem blot结果显示,E-cadherin在正常对照组和TGFβ1+Wortmannin组中表达明显高于TGFβ1组(P<0.05);而α-SMA在TGFβ1组中表达明显高于正常对照组和TGFβ1+Wortmannin组(P<0.05),TGFβ1+Wortmannin组表达高于正常对照组(P<0.05)。见图4。

3 讨论

P13K/Akt通路的功能主要通过磷酸化磷酸肌醇4,5二磷酸(PIP2)成为磷脂酞肌醇-3,4,5一三磷酸(PIP3),进而激活PKB/Akt,p7 0S6kinase,蛋白激酶C(PKC)等细胞因子来实现。PKB/Akt是PI3K下游最重要的蛋白因子,是一种分子量为60Kda的蛋白激酶,因其蛋白序列与蛋白激酶A(PKA)和C(PKC)有高度一致性而被又命名为PKB,其磷酸化水平可以反应PI3K活性[3,4]。文献报道[5,6]细胞内Akt激活时间为5~60 min不等,激活持续时间有1~4h不等。RUNYAN等[7]也发现肾小球系膜细胞中经TGFβ1刺激15 min后即可见AKT磷酸化,给予PI3K抑制剂LY294002可减少TGFβ1诱导的1型胶原的表达。本实验中发现,在体外培养的HPMC中加入10 ng/m L TGFβ1诱导后,至30 min时逐渐增加,至1 h时活化达到顶峰,此后Akt磷酸化水平逐渐下降,但2 h时Akt磷酸化表达仍较对照组高(P<0.05)。这与相关文献报道基本相符,不同刺激因素和不同的组织细胞类型结果可能有所不同。

腹膜纤维化、新鲜血管发生及血管通透性增加是腹膜超滤失败的主要因素[8,9],实验证明在有明确的腹膜损伤之前已有腹膜上皮-间皮细胞转分化(EMT)的发生[10]。转分化后的间皮细胞获得了更强的迁移性从而侵入间皮旁区域,参与腹膜纤维化及血管生成,最终导致腹膜功能丧失[11,12]。EMT受多种细胞因子、生长因子和激素的调节,其中TGFβ1是最重要的细胞因子,在病理条件下可触发和完成EMT的全过程。DUBOIS等通过腺病毒载体向大鼠腹膜内注射重组TGFβ1证实腹膜间皮细胞EMT的存在[13]。在本实验中,体外培养的HPMC经TGFβ1刺激48 h后细胞形态逐渐变成长梭形,细胞间隙增大生明显拉长,间质细胞表型的特异性抗原α-SMA蛋白表达明显升高,而上皮细胞特征性抗原E-cadherin蛋白表达则明显下降。加入PI3K特异性抑制剂Wortmannin后,能显著抑制TGFβ1诱导的a-SMA表达,说明PI3K/Akt通路不仅可以被TGFβ1激活,而且参与了其诱导的HMPC转分化过程,阻断PI3K/Akt通路可以有效抑制TGFβ1诱导的上皮-间质细胞转分化。

TGFβ1与细胞表面受体结合后可激活一系列的细胞因子及其相关信号转导通路,目前研究发现的涉及到EMT的主要包括Smads、MAPK、Wnt、Rho、P38以及PI3K/Akt通路等。LI等发现由Smad通路诱导的整合素连接激酶(ILK)表达升高是诱导上皮-间质转分化的重要原因[14],而LEE等研究进一步证实Akt磷酸化对于ILK的激活是必需的[15],说明在EMT过程中Smad通路与PI3K/Akt通路相互协作。本实验发现PI3K/Akt通路阻断剂Wortmannin作用后,虽然a-SMA表达明显下降,但仍高于正常对照组,这说明不能完全阻断TGFβ1诱导的EMT,尚存在不依赖与PI3K通路的途径导致细胞的转分化,其具体机制尚待进一步阐明。

摘要：目的探讨磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/Akt通路在转化生长因子β1(TGFβ1)体外诱导的人腹膜间皮细胞(HPMC)上皮-间质细胞转分化(EMT)过程中的作用。方法从人腹膜组织中分离和培养人原代腹膜间皮细胞。观察TGFβ1对人腹膜间皮细胞Akt磷酸化的影响,在不同时间点检测p-Akt的表达水平。采用免疫印迹方法检测应用PI3K特异性抑制剂Wortmannin对TGFβ1诱导后细胞内p-Akt、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和E-钙黏附蛋白(E-Cadherin)表达的影响。结果10ng/mLTGFβ1刺激HPMC0.5h后p-Akt水平开始升高,1h后达到顶峰,2h后逐渐减弱。TGFβ1诱导HPMC48h后α-SMA表达显著升高,E-cadherin表达显著下降;同时加用Wortmannin则p-Akt、α-SMA表达明显抑制。结论PI3K/Akt信号系统参与TGFβ1介导的人腹膜间皮细胞EMT过程,提示对其通路的抑制可有效阻止TGFβ1介导的腹膜纤维化。

Akt信号通路 篇6

1 材料与方法

1.1 主要试剂

人结肠癌细胞系SW480 (武汉大学保藏中心) 、人脐静脉内皮细胞 (HUVEC) 来自武汉大学消化实验室保存, PD98059, LY294002购自碧云天公司, 胎牛血清购自个Gibco公司, DMEM-F12培养基购自Hyclone公司, 细胞培养瓶, 培养板, Matrigel胶胶购自BD公司, 倒置相差显微镜日本Olympus。

1.2 主要实验材料和仪器

CO2恒温培养箱、倒置相差显微镜、超净工作台、37℃恒温烤箱等。

1.3 肿瘤血管内皮细胞的诱导

人脐静脉内皮细胞 (HUVEC) 自液氮中取出后, 即放于37℃水浴箱中, 震荡复融20~60 s, 待管中内容物完全溶解, 把细胞悬液加入10 m L离心管, 再缓慢加入8 m L 10%的胎牛血清完全培养液, 1000 r/min, 3 min离心后弃上清, 加入适量培养基溶解沉淀细胞, 移入25 m L培养瓶内, 置37℃、5%CO2培养箱内培养, 2~3 d换液1次, 当细胞融合到80%左右时传代培养。SW480细胞用含10%的DMEM-F12培养, 当细胞融合达到80%的时候换为无血清的DMEM-F12培养液, 0.22μm的滤膜过滤, -80℃保存备用。用含体积分数为50%的SW480细胞上清DMEM-F12培养48 h, 当融合至80%时收集细胞, 即为肿瘤血管内皮细胞 (Td-EC) [6], 该细胞具有结肠癌肿瘤细胞活性的肿瘤内皮细胞, 当Td-EC处于对数生长期时, 用于做管道形成试验。

1.4 细胞的同步化

采取血清饥饿法[7], 用无血清培养基同步化TdEC 24 h, 使不同细胞同步于G0~G1期, 实验前24 h将对数生长期的Td-EC用无血清培养基同步化, 便于对实验结果的分析。

1.5 药物浓度的准备

公司提供PI3K抑制剂LY294002及MEK抑制剂PD 98059用无血清培养基将其稀释为浓度2.5、5、10、20μmol/L供实验时使用。二甲基亚砜 (DMSO) , 分子量为78.13, 将其用无血清培养基稀释为0.1%DM-SO, 供实验时使用。

1.6 管道形成实验

采用BD公司Matrigel胶, 使用前应从-20℃转移至4℃待其自然溶化 (如过夜放置) , 同时将实验需要与Matrigel胶接触的96孔板、200μL移液吸头均应预冷于4℃, 铺胶所有过程均在冰上操作。在96孔板的每个孔内缓慢加入50μL BD Matrigel胶, 不稀释。小心摇动使胶分布在孔的各个部位, 避免产生气泡, 同时在冰上静止5 min, 使胶能够铺平, 然后将96孔板水平轻轻放入5%CO2、37℃细胞培养箱中1 h, 使用前需用无血清培养基轻洗Matrigel胶, 水化基底膜。铺胶完毕后, 应用细胞计数法计算细胞浓度, 方法是用血细胞计数板计数细胞悬液中的细胞数目, 以测定细胞增殖的状态和调整接种细胞浓度。消化法计数同步化细胞使其浓度为3×105个/m L, 取100μL即含3×104个细胞, 离心后弃上清, 按照实验设计要求, 分为对照组、实验组, 实验组根据抑制剂浓度的不同分为2.5、5、10、20μmol/L, 将已配好浓度的液体分别加入离心后的细胞中, 充分混匀后加入96孔板中, 将96孔板放入CO2、37℃恒温培养箱中培养。6 h后在倒置相差显微镜 (10×20) 下观察, 并采集图像, 每个孔取上、下、左、右、中5个区域.每个区域随机取一张图片, 通过实验室中奥林巴斯倒置相差显微镜中的cellsens standard软件对每张图片进行测量, 测出每张图片上管道形成的总长度 (单位mm) , 每个实验均设3个复孔, 每组有15个数据。

1.7 统计学方法

采用统计软件SPSS 16.0对实验数据进行分析, 计量资料数据以均数±标准差 (±s) 表示, 各组数据比较用单因素方差分析, 组间两两比较用q检验。计数资料以率表示, 采用χ2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PI3K/AKT信号通路抑制剂对结直肠癌血管内皮细胞管道形成的结果

采用单因素方差分析比较, 对照组中结直肠癌血管内皮细胞在Matrigel基质胶上形成管道状结构, 逐渐相连呈网状, 而实验组形成的管道长度较对照组均减少, 差异有统计学意义 (P<0.05) ;q检验比较结果显示, 随着抑制剂浓度增高, 各组管道形成总长度逐渐减少, 差异有统计学意义 (P<0.05) 。见表1。图1结果显示, 对照组中的正常组和0.1%DMSO组即开始由原来的多角形变成长梭形, 并向Matrigel基质胶中延伸生长, 而后呈线形排列成管状结构, 6 h后多个管状结构相互连接形成三维网状结构;而在2.5μmol/L组可以看到一定数量的管腔结构, 大部分为数量较长的线状结构, 在5μmol/L组中的管腔结构较2.5μmol/L组有所减少, 多为线性结构, 在10μmol/L组和20μmol/L组中基本上看不到管腔形成, 10μmol/L组可见看到较多内皮细胞组成的线形结构, 而在20μmol/L组中看到的内皮细胞皮细胞均为圆形, 基本上无线性结构。

注:DMSO:二甲基亚砜

2.2 ERK/MEK信号通路抑制剂对结直肠癌血管内皮细胞管道形成的结果

方差分析结果显示, 不同浓度PD98059作用结直肠癌血管内皮细胞6 h后形成管腔结构情况是不同的, 各组间差异有统计学意义 (P<0.05) , 提示随着PD98059浓度的增高, 管道形成长度逐渐减少, 见表2。由图2可见, 在浓度为20μmol/L时, 看不到管腔结构, 有少量较短的内皮细胞连接在一起的线状结构, 多数为单个的圆形内皮细胞, 而在10μmol/L时, 线状结构较20μmol/L数量多一些, 在5μmol/L时可以看到少量的管腔结构, 2.5μmol/L时可以看到多一些管腔结构, 连接成三维网状, 对照组可见多个管状结构相互连接形成三维网状结构。

2.3 PI3K/AKT信号通路抑制剂及ERK/MEK信号通路抑制剂管道形成之间比较

LY294002及PD98059抑制剂均能显著抑制肿瘤内皮细胞管道形成。表3显示在相同抑制剂浓度作用下, 其间管道形成的长度不同, 差异有统计学意义 (P<0.05) , 由此可以说明LY294002对肿瘤血管内皮细胞管道形成的抑制作用较PD98059强。见表3。

1:正常组;2:DMSO组;3:2.5μmol/L组;4:5μmol/L组;5:10μmol/L组;6:20μmol/L组;DMSO:二甲基亚砜

注:DMSO:二甲基亚砜

3 讨论

结直肠癌是我国目前常见的恶性肿瘤之一, 它的生长可分为两个时期即无血管期和血管期, 无血管期的肿瘤细胞主要依靠扩散作用进行物质交换, 肿瘤生长缓慢, 肿瘤的营养供给及代谢物排泄仅能靠简单的物理弥散, 但随着肿瘤细胞的不断增殖, 扩散作用不能满足肿瘤细胞进一步增长的需要, 肿瘤将启动血管生成这一复杂过程, 新生血管为肿瘤提供丰富的血液灌注和充足的营养物质, 在良好的生长环境下, 肿瘤组织迅速生长, 它是肿瘤细胞代谢产物排泄的有效途径, 它也是肿瘤细胞向远处转移的重要通道, 肿瘤细胞通过血管才能到达转移地点[8]。体内的血管新生是由于恶性肿瘤自身分泌许多促进血管新生因子[9]而转向促血管新生, 内皮细胞的增生、移动、管道形成是血管生成所必需的步骤, 肿瘤血管生成是导致肿瘤从“良性休眠”的无血管期状态过渡到“恶性疯长”的血管期状态的关键[10]。有学者研究Notch信号通路途径在血管发育的过程中起着重要作用, 可以直接影响血管重构、血管稳定性、血管平滑肌细胞的分化、动静脉发生选择等[11,12]。

1:正常组;2:DMSO组;3:2.5μmol/L组;4:5μmol/L组;5:10μmol/L组;6:20μmol/L组;DMSO:二甲基亚砜

本实验选用的信号通路抑制剂是PI3K/AKT及ERK/MEK信号通路抑制剂。其中PI3K/AKT信号通路控制着众多在肿瘤发生发展中至关重要的细胞生物学过程, 包括细胞凋亡、转录、翻译、代谢、血管生成以及细胞周期的调控[13], PI3K是AKT/m TOR通路的上游分子, 其异常激活可以引起一系列的反应, 包括细胞的生长、增殖和转移、上皮细胞向间叶细胞的转变以及血管的生成, PI3K/AKT信号通路的激活能活化AKT, AKT又称蛋白激酶B, 是一类调节细胞凋亡与存活的胞浆信号转导蛋白, 生理状态下, AKT以低活性 (失活状态) 存在于细胞浆, 当各种外因刺激时, AKT在三磷酸酰肌醇蛋白激酶作用下发生磷酸化而激活[14,15], 在胃肠道肿瘤、胰腺癌等组织中AKT均高表达及活化, AKT信号通路的激活在肿瘤的发生、发展过程中起重要的纽带作用, 体内许多肿瘤发生均与该通路异常激活密切相关, 而活化的AKT通过磷酸化作用激活或抑制多种底物来调节细胞功能, 包括细胞代谢、蛋白质合成、细胞凋亡、细胞周期进程, 进而调节细胞的增殖、分化、凋亡以及迁移等[16,17]。内皮细胞一氧化氮合成酶 (endothelial nitric oxide synthase, e NOS) 是调节血管生成和血管张力的重要因子。内皮细胞体外培养表明:转染IGF-1和VEGF可以通过PI3K通路诱导e NOS的合成, 其活性磷酸化序列为RIRTQS (1177) F;AKT可以和e NOS共定位于细胞膜、并使Ser1177磷酸化;而PI3K抑制剂可以降低AKT的活性和Ser1177的磷酸化水平[18], 另外一项研究表明:PI3K抑制剂可以阻断雌二醇介导的e NOS释放, 而雌二醇可以刺激AKT的活性和e NOS的磷酸化水平[19]。研究发现人类的多种肿瘤如胃癌、大肠癌、乳腺癌、肝癌、肾癌等均与PI3K/AKT信号通路密切相关, 且PI3K/AKT信号通路中多种上下游分子的改变均可影响肿瘤的发生和发展, 信号通路可从凋亡、炎性反应、免疫等多方面影响肿瘤的发生和发展。其靶向抑制剂不仅能减少VEGF的分泌, 还可抑制血管形成, 该通路具有重要的临床意义[20], 其中LY294002[21]是PI3K-AKT信号通路抑制剂最经典的抑制剂, 具有靶向抑制PDK催化亚基pl10的作用, 从而抑制肿瘤生长及肿瘤血管形成[22]。

ERK/MEK信号通路中有丝分裂原激活蛋白激酶 (MAPK) 是细胞内重要的信号传导通路, 需被细胞因子激活后才起作用, 多种肿瘤或增殖性疾病与其有关[23], 具有调控机体细胞的增殖、分化、转化及凋亡等多种功能, 细胞外信号调节激酶 (ERK) 通路是其中重要的传导通路, MEK是其中的重要一环, PD98059是一种特异性的MEK抑制剂, 通过与MEKl/2的非活化形式结合阻止其磷酸化, 进而抑制ERKl/2的磷酸化而阻断细胞信号转导, 它几乎可以抑制所有ERK亚族的活性, 从而抑制肿瘤细胞的增殖[24]。PD98059是选择性的细胞内MAPK传导通路的特异抑制剂, 能够抑制ERK的上游激酶MAPK激酶 (MEK) , 理论上能够阻断增殖信号的传递, 从而抑制肿瘤细胞的生长。

本实验所采用的BD公司Matrigel胶, 它是从富含胞外基质蛋白的EHS小鼠肿瘤中提取出基底膜基质, 其主要成分有层粘连蛋白、Ⅳ型胶原、巢蛋白、硫酸肝素糖蛋白, 还包含生长因子和基质金属蛋白酶等。在室温条件下, Matrigel聚合形成具有生物学活性的三维基质, 模拟体内细胞基底膜的结构、组成、物理特性和功能。通过实验结果看, 对照组中TD-EC在Matrigel基质胶上形成管道结构, 逐渐相连呈网状, 两者之间差异无统计学意义 (P>0.05) , DMSO是两种抑制剂LY294002及PD98059的初始溶剂。因此, 检测DMSO组与正常组之间TD-EC管道形成能力有无差别, 实验发现两者之间管道形成无任何差别, 说明小剂量DMSO作为LY294002、PD98059的溶剂不影响肿瘤血管内皮细胞的管道形成能力, 随着抑制剂浓度的增高, 管道形成长度逐渐减少, 经过统计学分析其间差异有统计学意义 (P<0.05) 。两种抑制剂之间相互比较发现, LY294002对肿瘤血管内皮细胞管道形成的抑制作用较PD98059强。

为了进一步早期抑制肿瘤发生, 有必要对结直肠癌疾病进行深入研究, 以明确结直肠癌危险因素和切实其病因从而采取有效的防治措施, 减少结直肠癌的发病率。本研究通过两种不同的信号通路抑制剂LY294002及PD98059检测对肿瘤血管内皮细胞管道形成的影响, 使其有可能成为抑制肿瘤生长的潜在治疗靶点。P13K/AKT信号通路及MEK/ERK信号通路在肿瘤血管的发生发展过程中发挥重要作用, 尤其是其抑制剂在肿瘤靶向治疗方面的研究已取得可喜的进展, 但因信号通路内的关系错综复杂, 目前抗肿瘤的研究多局限于单一靶向治疗, 但其具体机制及与其他信号途径之间的相互影响、相互联系尚不完全清楚, 如多种信号通路联合使用能否更加有效抑制管道形成, 其相关实验需进一步证实。本实验中PI3K/Akt及ERK/MEK信号通路抑制剂能够显著抑制肿瘤内皮细胞小管形成, 从而抑制肿瘤血管新生, 为今后在肿瘤的临床监测、基因靶向治疗、预后评估、药物疗效及新药研发等提供科学的实验依据。

摘要：目的 探讨PI3K/AKT信号通路抑制剂 (LY294002) 及MEK/ERK信号通路抑制剂 (PD98059) 对结直肠癌血管内皮细胞管道形成的影响。方法 实验分为对照组和实验组, 其中对照组分正常组和二甲基亚砜 (DMSO) 组 (0.1%DMSO) , 实验组分PI3K/AKT信号通路抑制剂组LY294002及MEK/ERK信号通路抑制剂组PD98059 (实验组设4个浓度梯度) , 比较结直肠癌血管内皮细胞在不同抑制剂浓度 (2.5、5、10、20μmol/L) 作用下在Matrigel胶上管道形成的情况, 6 h后观察并取每个孔上、下、左、右、中5个区域中的图片, 测其管道形成的总长度, 每组均设3个复孔, 数据以均数±标准差表示, 采用SPSS 16.0软件进行统计分析, 以P<0.05为差异有统计学意义。结果 对照组中正常组与DMSO组两者管道形成总长度之间差异无统计学意义[ (4.16±0.26) mm比 (4.17±0.18) mm], 而实验组管道形成总长度较对照组都有明显减少 (P<0.05) 。其中LY294002浓度在2.5、5、10、20μmol/L管道形成的长度分别为 (3.08±0.51) 、 (2.65±0.24) 、 (2.02±0.18) 、 (1.08±0.13) mm, 而PD98059管道形成的长度分别为 (3.39±0.18) 、 (2.98±0.12) 、 (2.53±0.18) 、 (1.88±0.12) mm, 随着浓度的增加, 管道形成长度逐渐减少, 差异有统计学意义 (P<0.05) 。LY294002与PD98059相比, 在相同浓度下, LY294002管道形成长度较PD98059减少 (P<0.05) 。结论PI3K/AKT信号通路抑制剂及ERK/MEK信号通路抑制剂能够明显抑制结直肠癌血管内皮细胞的管道形成, 且随着抑制剂浓度的升高, 管道形成能力进一步降低, PI3K/AKT信号通路抑制剂抑制肿瘤血管内皮细胞管道形成的能力比ERK/MEK信号通路抑制剂明显。

Akt信号通路 篇7

1 材料与方法

1.1 主要试剂

Apigenin、MTT和LY294002购自美国Sigma公司,RPMI-1640培养液购自Gibco公司,新生牛血清购自杭州四季青生物工程公司,Akt、p-Akt、cyclin D1、β-actin抗体由Santa Cruz公司生产,辣根过氧化物酶标记的羊抗兔、羊抗鼠二抗均购自武汉博士德公司。

1.2 细胞与细胞培养

人肝癌Bel-7404由中国科学院上海细胞生物学研究所引进。用含有10%小牛血清、100 u/m L青霉素和100μg/m L链霉素的RPMI-1640培养液,在37℃,含5%二氧化碳的饱和湿度的培养箱内培养传代。

1.3 实验方法

1.3.1 MTT法

取对数生长期Bel-7404细胞,调节浓度为5 000个/m L,接种于96孔培养板,每孔200μL,培养24 h,吸弃培养基,分别加入含API(终浓度分别为5、10、20、40和80μmol/L)的培养基200μL/孔,溶媒对照组加入相同体积含终浓度为0.1%DMSO的完全培养基,每组3孔,培养48h,吸弃培养基,加入含0.5 mg/m L MTT的无血清培养基200μL/孔,继续培养4 h,吸弃培养基加入200μL/孔DMSO,振摇混均,用EXL-800型酶标仪在570 nm波长下测定吸光度值(A)。按公式:IR(%)=[1-药物处理组A均值/对照组A均值]×100%计算细胞增殖相对抑制率;半数抑制浓度IC50采用Calcus Zn程序计算。以上实验重复2次。

1.3.2 流式细胞术分析

Bel-7404细胞用含0.1%的小牛血清培养基培养24 h,使细胞周期同步化,分别加入不同浓度API使其终浓度分别为20、40和80μmol/L,溶媒对照组加入相同体积含终浓度为0.1%DMSO的完全培养基分别处理48 h后,收集细胞,用PBS吹打细胞成单细胞悬液,离心,冷PBS洗2遍,用4℃的70%乙醇固定24 h后,经碘化丙啶(PI)染色,用流式细胞仪检测细胞周期分布情况。

1.3.3 Western blot

分别加入40μmol/L的API或10μmol/L的LY294002,溶媒对照组加入相同体积含终浓度为0.1%DMSO的完全培养基处理24 h,收集细胞,用PBS洗3次,细胞裂解液[0.1 M Na Cl,0.01 M Tris-cl.(p H 7.6),0.001M EDTA(p H8.0),1μg/m L Aprotinin,100μg/m L PMSF]裂解后,4℃,13 000×g离心10 min,用酶联免疫检测仪进行蛋白定量。取蛋白样品(25μg总蛋白/泳道)加入等体积上样缓冲液,100℃煮10 min,10%或6%SDS-PAGE电泳后转移(105 m A,3 h)至PVDF膜上。用含5%脱脂牛奶的TBST室温下封闭2 h,1∶200加入p Akt、Akt、cyclin D1和β-acting抗体37℃孵育2 h;TBST洗涤30 min,每10 min换液1次,加入相应的二抗室温孵育1 h后,用TBST洗膜3次,每次15 min。然后在含化学发光剂A、B的溶液中激发荧光,于暗室中压片,显影、定影。结果用图像分析仪分析,以面积和光密度的乘积表示蛋白表达丰度变化。

1.4 统计学分析

各组实验数据均用表示,采用SPSS windows 13.0软件One Way ANOVA方式行方差分析,两两比较采用Student's t检验,P<0.05为统计学意义显著性标准。

2 结果

2.1 AP I对人肝癌Be l-7404细胞活性的影响

MTT法结果显示:API对体外培养人肝癌Bel-7404细胞活性具有抑制作用,呈浓度依赖性,IC50值为59.4μmol/L,见图1。

2.2 AP I对人肝癌Be l-7404细胞周期的影响

为观察API对人肝癌Bel-7404细胞周期的影响,我们用PI染色流式细胞术测定DNA含量分析细胞周期。结果发现:API能使Bel-7404细胞周期阻滞在G1/G0期,见图2。

2.3 AP I对人肝癌Be l-7404细胞Akt蛋白磷酸化水平的影响

Western blot分析结果显示:经40μmol/L的API或10μmol/L的LY294002处理24 h后,Bel-7404细胞p-Akt蛋白水平较溶媒组分别下降18.4%和23.6%,见图3。cyclin D1蛋白表达与溶媒组比较下调至63.2%和56.7%,见图3B。

2.4 AP I对人肝癌Be l-7404细胞cyclin D1蛋白表达的影响

Western blot分析结果显示:经40μmol/L的API或10μmol/L的LY294002处理24 h后,Bel-7404细胞cyclin D1蛋白表达与溶媒组比较下调至63.2%和56.7%,见图4。

3 讨论

本文所获得的主要实验数据证实:API具有抑制人肝癌Bel-7404细胞活性作用,诱导细胞周期停滞于G1/G0期,降低细胞磷酸化Akt蛋白水平和Cyclin D1蛋白表达,为将API作为抗肝癌活性先导化合物提供了实验和理论依据。

乙肝病毒X(HBx)蛋白、胰岛素样生长因子-1以及肝细胞生长因子都被认为是肝细胞癌变中Akt信号通路的激活剂。胰岛素样生长因子已知可以通过它的受体激活包括Akt在内的多种细胞系统中的信号通路。血清中肝细胞生长因子水平已经被证实和未经治疗的肝癌患者的预后相关[4]。因此,Akt/蛋白激酶B的激活在肝细胞癌的发生、发展中起了重要的作用[3]。本文证实API抑制Akt信号传导具有普遍的肝癌治疗意义。

有研究表明,Akt激活通过m TOR磷酸化将有丝分裂信号传递给p70S6K,使细胞周期的主要蛋白如细胞周期素(cyclin)、细胞周期依赖性蛋白激酶4(CDK4)的翻译上调,同时抑制CDK4抑制剂p21CIP1等的表达,促进G1期进展,使细胞周期加速,促进细胞增殖,从而促进肿瘤的发生与发展[5,6]。本实验结果亦证实API能通过抑制Akt蛋白磷酸化,下调cyclin D1蛋白表达,进而抑制Bel-7404细胞活性,提示API的抑制肝癌细胞活性作用涉及抑制Akt信号传导。

参考文献

[1]GUPTA S,AFAQ F,MUKHTAR H.Involvement of nuclear fac-tor-kappa B,Bax and Bcl-2in induction of cell cycle arrest and apoptosis by apigenin in human prostate carcinoma cells[J].Oncogene,2002,[21]:3727-3738.

[2]胡太平,曹建国.芹菜素诱导人胃癌细胞凋亡作用及机制研究[J].国际病理科学与临床杂志,2007,27[1]:6-9.[2]HU TP,CAO JG.Study on pro-apoptotic effect of apigenin on human gastric cancer cells and its underlying mechanisms[J].Int J Pathol Clin Med,2007,27[1]:6-9.Chinese

[3]MICHL P,DOWNWARD J.Mechanisms of disease:PI3K/AKT signaling in gastrointestinal cancers[J].Z Gastroenterol,2005,43[10]:1133-1139.

[4]MOTTET D,DUMONT V,DECCACHE Y,et al.Regulation ofhypoxia inducible factor-1alpha protein level during hypoxic conditions by the phosphatidylinositol3-kinase/Akt/glycogen syn-thase kinase3beta pathway in HepG2cells[J].J Biol Chem,2003,278[33]:31277-31285.

[5]SHI DY,LIU HL,STERN JS,et al.Alpha-lipoic acid inducesapoptosis in hepatoma cells via the PTEN/Akt pathway[J].FEBS Lett,2008,582[12]:1667-1671.