孢子萌发（精选5篇）
孢子萌发 篇1
一、白僵菌的分类地位、形态特征及致病机理
白僵菌属于半知菌亚门丝孢纲丝孢目丝孢科白僵菌属。白僵菌主要分为球孢白僵菌, 卵孢白僵菌, 小孢白僵菌。菌株菌落多呈平绒状或茸毛状, 有时还呈放射形, 培养初期大多呈白色, 稍后变为淡黄色;背面无色, 或淡黄色。白僵菌对动物和植物无害, 且易于培养, 致病力较强, 防治害虫效果佳, 是一种广谱性的病原真菌。白僵菌主要通过昆虫的体壁侵入虫体, 也可以通过其消化道、气门及上口等途径侵入虫体。
二、白僵菌的应用状况及展望
近年来, 由于化学农药对环境的危害, 以及农药在蔬菜中的残留情况日益受到关注, 生物杀虫剂, 特别是真菌杀虫剂的应用逐渐受到人们的欢迎, 白僵菌是目前应用最广的一种真菌杀虫剂, 应用白僵菌防治蔬菜害虫, 害虫不易产生抗药性, 不影响非目标昆虫, 不杀伤害虫天敌, 不污染环境, 有利于增强生态系统的自控能力, 是一类非常符合综合治理原则的防治措施, 市场前景非常广阔。
三、研究的目的与意义
球孢白僵菌的分生孢子是否萌发是其活性和致病力的标志, 也是完成寄主侵染的前提。本实验研究了不同温度条件对球孢白僵菌菌株分生孢子萌发率的影响, 为今后球孢白僵菌制剂的研究提供了依据。
四、材料与方法
供试菌株:从沙棘木蠹蛾上分离的白僵菌
培养基:PPSA, 即马铃薯蔗糖蛋白胨培养基。土豆200克, 蔗糖20克, 琼脂20克, 蛋白胨10克, 蒸馏水1000毫升。培养基的制备及菌株分离、纯化。
(1) 先将1000毫升蒸馏水煮沸, 将200克土豆切成边长为1厘米小块, 投入沸水中煮30分钟, 将土豆过滤出, 用蒸馏水将滤液补齐至1000毫升, 再将琼脂和蛋白胨投入滤液中煮至完全溶化, 放入蔗糖, 待其完全溶入溶液后, 将溶液倒出补齐至1000毫升。将煮好的溶液分装在4个500毫升的三角瓶内, 每个三角瓶中装约250毫升的溶液。放入高压灭菌锅内, 在121±1℃下灭菌35分钟。
(2) 打开超净操作台内的紫外灯进行杀菌30分钟。
(3) 把经过高压灭菌锅消毒的培养皿放入操作台内, 然后把三角瓶内的培养基分装于培养皿内, 刚好盖住皿底即可。
(4) 取新鲜白僵虫尸, 75%酒精表面消毒3～5秒, 用无菌水洗3次后, 剪成小块, 经培养皿所盛的0.1%升汞水消毒2分钟, 然后用无菌水冲洗3次。
(5) 在无菌操作台内, 取消毒后的小块僵虫体表内侧1块, 放置于载玻片上, 滴一滴无菌水配成悬浮液, 用接菌环沾一环悬浮液在培养基上画线培养。
(6) 把接完菌的培养皿放进恒温箱内在26±1℃条件下培养48～72小时, 剔除杂菌, 纯化菌株。
药品与试剂:蔗糖, 琼脂, 蒸馏水
主要仪器设备:超净工作台, 灭菌锅, 电子天平, 电热恒温水浴锅, 智能人工气候箱, 显微镜。
五、实验步骤
取马铃薯蔗糖蛋白胨琼脂培养基上第三代培养15天的分生孢子, 用1%蛋白胨溶液为营养液配成孢子悬浮液, 采用载玻片悬滴法, 分别置于15℃, 20℃, 25℃, 30℃, 35℃的恒温箱中培养, 湿度控制在100%, 每个处理5个玻片, 设3个重复。培养10小时后开始观察, 以后每隔2小时镜检记数一次孢子萌发率, 以芽管长度超过孢子直径长度 (不是正圆形的孢子以直径小的一边为准) 的一半作为萌发标准, 18小时总计孢子萌发率。根据萌发率筛选出最适合孢子萌发的温度。观察不同温度对孢子萌发的影响。
白僵菌分生孢子萌发的最适温度为25～30℃之间, 在25℃时菌株孢子萌发率89.58%, 在30℃是菌株孢子萌发率为86.28%。温度对于菌株萌发率的影响非常显著, 在20℃时, 菌株分生孢子萌发率还不到60%。而在15℃和35℃时, 菌株萌发率还未达到20%。菌株对温度的适应范围较窄, 极限温度在15～35℃。
六、实验结果与讨论
研究表明, 球孢白僵菌孢子萌发及菌丝生长的适宜温度范围在20～32℃之间。菌株在低温10～15℃环境中适于生成分生孢子, 但是孢子的萌发时间会延长, 萌发率不受影响。球孢白僵菌菌株在23～26℃条件下会达到最佳生长状态。在此范围内, 菌株的孢子萌发率、菌落生长速率和产孢量等生理指标均会随温度的升高而增大。适宜白僵菌孢子萌发及菌丝生长的温度也是害虫防治所应用的最佳温度。
孢子萌发 篇2
中国的鹿角海萝主要分布于浙江至广东沿海的岩相潮间带, 在广东沿海, 其生长期为10月～翌年5月, 而生殖器官形成于1月～4月[1]。与同属其他种类一样, 其发生过程除了藻体在夏季腐烂后留下的海萝座在秋冬季重新长出新藻体外, 另一途径是依靠孢子繁殖后代。孢子包括四分孢子和果孢子, 四分孢子产生于孢子体, 果孢子产生于寄生在雌配子体上的果孢子体 (囊果) , 由四分孢子发育成的藻体为配子体, 由果孢子发育成的藻体为孢子体[6]。文章对鹿角海萝孢子萌发过程的形态变化特征以及盘状体的生长等进行了研究, 旨在为其苗种生物学的研究提供理论和参考依据。
1 材料与方法
1.1孢子水的制备及孢子的附着
在繁殖季节, 采集广东汕头南澳县坪屿岛海域成熟的鹿角海萝藻体, 阴干8～10 h后放入盐度32的过滤海水中进行孢子放散制备孢子水, 然后将孢子浓度为3 600 ind·mL-1的10 mL孢子水倒入装有250 mL相同盐度海水且底部放有载玻片的烧杯中, 搅匀后静置, 让孢子自然下沉附着。孢子附着密度为4.4 ind·mm-2。
1.2孢子的培养及发育过程的观察
从孢子附着开始的整个试验过程在人工气候培养箱中进行, 培育水温为16±1℃, 光照度为6 000 lx, 光周期为12 h:12 h。每天搅动培养液1～2次;每5 d更换一次相同温度和盐度的过滤海水。孢子附着初期每天用显微镜观察并拍摄附着于载玻片上孢子的发育过程及形态变化, 孢子发育为盘状体后每隔10 d随机测量20个盘状体大小, 直到盘状体萌发出直立体。
2 结果
2.1附着孢子不同发育阶段的形态特征
鹿角海萝放散的四分孢子和果孢子的大小形状相似, 2种孢子附着与发育过程包括形态特征及发育速度也相似。孢子附着后经过不断的细胞分裂形成附着在基面上的盘状体, 盘状体在生长过程中除了在水平方向上扩展其直径外, 后期在其顶部形成生长点并长出直立体。紧贴附着基面的部分即成为以后藻体的盘状固着器, 直立体通过不断分枝长高成为藻体的直立部。
2.1.1 附着孢子
鹿角海萝放散的孢子没有运动器官, 仅利用其比重大于海水的重力作用下沉到附着基面上, 并依靠孢子表面的粘性物质完成附着过程。孢子接触生长基的1 min内完成附着。刚放散孢子附着力强, 随着时间延长, 附着力逐渐减弱。刚放散和附着孢子呈圆球形, 直径为20～23 μm, 分裂前附着孢子直径略增大, 内部中央有一细胞核, 在其外围细胞质中散布很多粒状黄褐色的色素体, 孢子表面为内外2层膜 (图1-a) 。
2.1.2 孢子分裂初期
在水温16℃条件下, 孢子附着后约22 h开始进行第一次细胞分裂, 其分裂面穿过细胞中央将孢子变成2细胞, 所形成的发生体近圆形 (图1-b) 。孢子附着约2 d后完成第2次分裂形成4细胞。一般情况下, 第2次分裂面与第1分裂面接近垂直相交, 其发生体接近球形 (图1-c) , 但有时也会沿着与第1分裂面平行或斜向进行第2次分裂, 所形成的发生体呈豆形至椭圆形。附着后3 d, 细胞继续分裂形成多细胞半球状发生体 (图1-d) 。
a.附着孢子;b.孢子的第一次细胞分裂 (22h) ;c.孢子的第2次分裂 (附着后2d) ;d.多细胞体 (3d) ;e.具薄壁细胞突起的多细胞体 (4d) ;f.初期盘状体 (6d) ;g.长出透明假根的盘状体 (7d) ;h.附着后8d的盘状体;i.附着后10d的盘状体;j.附着后20d的盘状体;k.1个月的盘状体;l.2个月的盘状体
a.attachmentspore;b.firstdivisionofspore (22h) ;c.seconddivisionofspore (2daysafterattachment) ;d.multicellular organism (3d) ;e.multicellularorganism originatedtranslucenttuber (4d) ;f.multicellulardisc (6d) ;g.discoriginated translucentrhizoid (7d) ;h.discat 8daysafterattachment;i.discat 10daysafterattachment;j.discat 20days;k.discat 1monthafterattachment;l.discat 2monthsafterattachment
2.1.3 盘状体形成期
孢子附着满4 d后, 在多细胞半球状发生体的底部边缘形成向外突出的颜色较淡的薄壁细胞, 数量为1至多个不等 (图1-e) 。每一薄壁细胞突起不断分裂, 有时沿着附着基平面形成2～3分枝的假根状薄壁细胞突起, 沿着附着基面在水平方向上向外伸展扩大其附着面积。这些假根状薄壁细胞突起最终相互合并成为边缘较规则的盘状体 (图1-f) 。在盘状体形成阶段, 其表面往往长出毛状透明的细长突起物 (假根) (图1-g) 。在盘状体周边薄壁细胞以同心圆状地向外生长扩大水面附着面积的同时, 顶部不断向上隆起形成1至若干个颜色较深的生长点 (图1-h～i) , 这些生长点继续分化生长, 使盘状体在不断扩大面积的同时向上生长 (图1-j) 。
2.2盘状体生长速度
在鹿角海萝附着孢子发育过程中, 其盘状体一直在生长增大。在水温16℃, 盐度32, 光照强度6 000 lx (光照周期为12 h:12 h) 的条件下, 孢子附着开始约1个月, 发育最快的盘状体直径可达140 μm左右 (图1-k) , 2个月时, 盘状体直径可达269 μm (图1-l) , 80 d时, 发育最快的盘状体可见有芽体长出 (图2) 。盘状体的生长曲线见图3。
3 讨论
海萝属不同种的生活史相同, 藻体分为孢子体、雌、雄配子体和寄生在雌配子体上的果孢子体。孢子体成熟时产生四分孢子, 四分孢子放散附着后萌发成雌、雄配子体;雄配子体产生精子囊、释放出精子, 使其果孢受精形成内含果孢子的果孢子囊即果孢子体, 成熟果孢子放散附着后萌发成孢子体, 这一过程属有性生殖。海萝属不同种的无性生殖、有性生殖过程分别产生的四分孢子和果孢子无论在形态上还是附着、萌发过程都相似, 所萌发成的初期藻体形态也相似[2,3,4,5,6]。鹿角海萝与海萝、小海萝的发育均属于直接盘状型[5], 即孢子附着后都进行第一次细胞分裂萌发变成2细胞、第2次分裂形成4细胞, 经多次分裂形成多细胞半球状发生体, 发生体的底部边缘形成薄壁细胞, 薄壁细胞突起不断分裂, 最终相互合并成为边缘较规则的盘状体, 其顶部不断向上隆起形成颜色较深的生长点, 生长点继续分化生长, 使盘状体在扩大面积的同时向上生长, 最终萌发出芽体。这三者孢子萌发过程不同发育阶段的形态也都相似。日本的资料中有关于海萝、小海萝萌发过程形态变化的图片及描述, 但图片比较模糊且重点针对早期发育, 此试验不仅清楚展示了孢子早期萌发过程中细胞的分裂和假根的萌出, 还拍摄了后期盘状体萌发出芽体的图片且对盘状体的生长进行测量。这些不仅能为该种类的发生生物学提供参考, 且能为其育苗生产提供依据。
鹿角海萝孢子的萌发速度与水温、光照和盐度等关系密切。此试验在水温16℃, 海水盐度32, 光照强度6 000 lx (光照周期为12 h:12 h) 条件下, 鹿角海萝孢子附着后80 d才可见芽体长出, 在不同水温、盐度和光照下, 其发育速度将不同, 有关此方面的研究内容将另文发表。
参考文献
[1]吴进锋, 陈素文, 陈利雄, 等.广东沿海海萝属藻类生态与分布调查[J].南方水产, 2007, 3 (5) :7-13.
[2]曾呈奎, 张德瑞.中国经济海藻志[M].北京:科学出版社, 1962:123-178.
[3]須藤俊造.フノリの胞子の放出, 浮游及び着生 (海藻の胞子附け研究第四报) [J].日本水产学会誌, 1949, 14 (4) :184-188.
[4]須藤俊造.フノリのparasporeに就いて (海藻胞子附けの研究第三报) [J].日本水产学会誌, 1948, 14 (2) :87-89.
[5]猪野俊平.海藻の發生[M].东京:日本笠井出版社, 1947:140-144.
孢子萌发 篇3
1 材料与方法
1.1 材料
大果榛子白粉病病菌(Phyllactinia guttata)无性孢子采于铁岭市林业局林改办引种的大果榛子病叶。品种(品系)为五年生达维榛子,选择长势基本一致的植株作为试验材料树,榛子的株行距为2.0m×3.0m。
供试碳源和氮源有葡萄糖、果糖、麦芽糖、乳糖、木糖、蔗糖、L-丙氨酸、L-亮氨酸、甘氨酸、硝酸铵、硫酸铵、硝酸钾[3]。
1.2 方法
1.2.1 碳源和氮源
撕取洋葱表皮1cm×1cm,用75%酒精处理1h后,蘸取采集的大果榛子病叶上的白粉病病菌无性孢子,显微镜低倍镜下单一视野内孢子数量不少于40个,置于配置好的1%蔗糖溶液的培养皿中,每皿3片。分别以葡萄糖、果糖、麦芽糖、乳糖、木糖、蔗糖取代蔗糖;在配置好的0.5%蔗糖溶液中分别加入1%L-丙氨酸、L-亮氨酸、甘氨酸、硝酸铵、硫酸铵、硝酸钾,共12个处理,重复3次,均置于室温下培养24h后,观察记录孢子萌发情况[4]。
1.2.2 pH
按照1.2.1方法,以0.1%NaOH和HCl配置成pH为4、5、6、7、8、9、10的蔗糖溶液,共7个处理,重复3次,置于室温下培养24h,观察记录孢子萌发情况。
1.2.3 温度
按照1.2.1方法,以蔗糖溶液为基础培养基,将培养皿分别置于5、10、15、20、25、30℃共6个处理的恒温生化培养箱(SHP-1500,GZH-268B)培养24h后,观察记录孢子萌发情况。
1.2.4 光照
按照1.2.1方法,以蔗糖溶液为基础培养基,设置全光照、全黑暗、光暗交替条件,重复3次,置于恒温生化培养箱(SHP-1500,GZH-268B)培养24h,记录孢子萌发情况。
2 结果与分析
2.1 不同碳和氮源对孢子萌发的影响
由表1可见,不同的碳源处理中,蔗糖与麦芽糖处理间大果榛子白粉病菌孢子萌发率差异显著,但未达到极显著水平,蔗糖与其它处理间(麦芽糖除外)差异极显著,所以大果榛子白粉病病菌孢子萌发的最适碳源为蔗糖。不同氮源处理中,甘氨酸、硝酸铵、L-丙氨酸处理间差异不显著,L-丙氨酸、硫酸铵、硝酸钾、L-亮氨酸处理间差异不显著。甘氨酸与硝酸钾、L-亮氨酸处理间差异极显著,硝酸铵与L-亮氨酸处理间差异极显著。说明大果榛子白粉病病菌孢子萌发的最适氮源为甘氨酸、硝酸铵。
表1 不同碳源、氮源对大果榛子白粉病病菌孢子萌发的影响Table 1 The effect of different carbon resource and nitrogen resource on the spore germination
表中同列不同大、小写字母,分别表示0.01和0.05水平差异显著。下同。Different capital letters and lowercases mean significant difference at 0.01and 0.05levels.The same below.
2.2 不同pH对孢子萌发的影响
由表2可知,pH为7的处理大果榛子白粉病病菌孢子萌发率与pH为6、8、5、9处理间的大果榛子白粉病病菌孢子萌发率差异不显著,而与pH为4、10的处理间大果榛子白粉病病菌孢子萌发率差异达极显著水平,说明过酸、过碱均不适合孢子萌发,比较pH 7、6、8处理的大果榛子白粉病病菌孢子萌发率,pH 7的萌发率最高,平均为23.06%,说明中性条件下最适宜孢子萌发。
表2 pH对大果榛子白粉病病菌孢子萌发的影响Table 2 The effect of pH value on the spore germination
2.3 不同温度对孢子萌发的影响。
从表3可知,温度为20、15、25℃三个处理间大果榛子孢子萌发率差异不显著,温度为20℃处理与5、10℃处理的大果榛子孢子萌发率均达显著水平,与30℃处理达极显著水平,其中20℃时孢子的萌发率最大,平均为40.89%,所以大果榛子白粉病病菌孢子萌发最适宜的温度为20℃。
表3 温度对大果榛子白粉病病菌孢子萌发的影响Table 3 The effect of temperature on the spore germination
2.4 不同光照条件下对孢子萌发的影响
由表4可见,全光照与明暗交替处理间的孢子萌发率差异显著,全光照、明暗交替与全黑暗处理间差异极显著,说明24h全光照条件下更适宜大果榛子白粉病病菌孢子萌发,全黑暗不利于孢子的萌发。
表4 光照条件对大果榛子白粉病病菌孢子的萌发的影响Table 4 The effect of light on the spore germination
3 结论
试验结果表明,不同的碳源、氮源处理中最适于大果榛子白粉病病菌无性孢子萌发的碳源为蔗糖,氮源为甘氨酸、硝酸铵;中性条件下,适于孢子的萌发;适于孢子萌发的温度为20℃;全光照条件下更适宜孢子萌发。本试验是首次对铁岭地区大果榛子发生的白粉病病菌进行生物学特性研究,其结果可为大果榛子白粉病发生规律等进一步研究奠定基础。
参考文献
[1]梁维坚,解明,董德芬,等.榛子新品种选育研究[J].中国果树,2000(2):4-6.
[2]王成达,王秀云,张来春.榛子生长特性及其研究利用现状[J].林业勘察设计,2009(04):83-84.
[3]时洁,李玉,李亚,等.吉林省白粉菌Ⅱ.单囊壳属Sphaerotheca Lév.[J].吉林农业大学学报,1991(4):1-6.
蜈蚣草孢子萌发的最适培养基研究 篇4
蜈蚣草的繁殖一般有成熟孢子繁殖、分株法繁殖和组织培养繁殖3种方法。由于前2种技术繁殖效率不高, 所以现在的研究多集中在利用组织培养的方法, 通过孢子萌发来获得大量组培苗。
1 实验材料及方法
1.1 实验材料
蜈蚣草成熟的孢子 (采自湖北宜昌) 。
1.2 培养基配方
(1) MS培养基, (2) 将原来MS培养基中p H值调为7.0, 另外在培养基中加入CaCO3粉末。
1.3 操作步骤
1.3.1 培养基的配置。
按照培养基配方分别配置MS和MS (改) 培养基, 将各种液体试剂按照用量规格加入1000ml大烧杯中, 轻轻摇匀后, 用p H试纸进行溶液酸碱度测定, 在烧杯中加入盐酸或氢氧化钠将p H调到培养基所要求的范围之内;之后称取相应分量的琼脂加入烧杯中, 在加入适量蒸馏水, 放置于微波炉中加热知道琼脂全部溶解, 溶液为透明的为止。
1.3.2 分装培养基。
将煮好的培养基冷却至50℃左右时分装到各个培养盒中, 每盒大约装盒子的2/5, 然后等待培养基冷却凝固。
1.3.3 播孢。
待培养基凝固后, 将蜈蚣草孢子均匀地撒在培养基表面, 盖上盖子, 保持空气的流通。
1.3.4 培养。
将撒上孢子的培养基放置于25℃的恒温箱中, 日光灯作为光源, 光照强度为2000～3000Lx, 光照时间16h/d。
1.3.5 观察记录。
培养期间每天到实验室进行观察, 记录孢子萌发的时间, 萌发情况, 原叶体形成时间及形成情况等。
1.3.6 数据分析。
将观察到的试验结果, 数据进行分析整理, 找出最适合蜈蚣草孢子萌发的培养基。
2 结果与分析
从播孢后的第2天开始记录, 我们发现培养基中的萌发情况大概为:
13d后各培养基先后出现绿色小点, 孢子开始萌发, 17d后出现绒毛状丝状体, 23d后孢子发育成绿色, 逐渐形成叶片状原叶体且体积不断增大, 40d后绿色块状周边形成绿色紧密球, 球状体在培养基上迅速增殖并在较短时间内形成疏松的群体块;随着小球状体的继续增殖而不断变大, 60d后逐渐形成芽, 并开始分化出小叶片, 即孢子体。
通过实验观察可以得到以下2组图表 (图1、2) 。
考虑到蜈蚣草的生长环境是偏碱性的, 所以此次研究不仅继续利用传统MS培养基进行培养对照, 还对MS培养基进行改动, 主要是提高培养基的p H值, 以接近蜈蚣草真实的生活环境。在培养基中加入CaCO3粉末, 也是增强碱性环境。实验结果表明, 改良的MS培养基更适合蜈蚣草孢子萌发, 有利于蜈蚣草的快繁研究。
3 研究展望
据国际上的报道, 在正常土壤中普通植物的含砷量一般不超过3mg/kg, 我国谷类作物的含砷背景值为0.07～0.08mg/kg, 豆类为0.02～0.56mg/kg, 蔬菜类为0.001～0.039mg/kg, 木本植物小于0.78kg/mg。蜈蚣草的最大含砷量约相当于普通植物体中大量元素磷的含量, 比普通植物的含砷量高数万倍、甚至数十万倍。
摘要：通过在不同培养基上进行培养, 观察统计了蜈蚣草孢子的萌发情况, 包括萌发率、萌发时间, 寻找出了蜈蚣草孢子组织培养的最佳孢子萌发培养基。
关键词：蜈蚣草,培养基,孢子萌发
参考文献
[1]周向军.砷超富集植物蜈蚣草的离体培养及植株再生[J].资源开发与市场, 2010 (8)
孢子萌发 篇5
玉米丝黑穗病是玉米丝轴团散黑粉菌(Sphacelotheca reiliana)引起的一种幼苗侵入的系统性病害,病菌主要以冬孢子在土壤、粪肥中或附在种子表面越冬,成为次年的初侵染来源,牲畜取食的病菌孢子经消化道消化后仍具有侵染力。病菌厚垣孢子在土壤中可存活3～5 a,且侵染期较长。冬孢子萌发产生的“+” 、“-”不同的冬孢子萌发后相结合形成的双核菌丝才具侵染力,侵入寄主幼苗生长锥,完成侵染过程,以侵染胚芽为主,根部侵染次之,在胚芽上,胚芽鞘侵染率高于中胚轴,根的各个部位均可侵染,以胚根感染率最高。冬孢子侵染玉米的适宜温度为21～28℃,需较低或中等的土壤含水量。土壤缺氮时易发病。康绍兰[2]等证明玉米丝黑穗病菌冬孢子还可以从叶片侵入,引起局部黄斑症状,病菌在寄主的组织间或细胞内扩展,接种后50 d就可以在寄主组织内形成冬孢子。冬孢子能否顺利完成侵染则取决于寄主植物的抗性,土壤中的孢子数量与适宜的侵染时期的温度和土壤湿度。主要危害雌穗和雄穗。侵入前是防治的最适时期[3]。冬孢子能否萌发是导致病害发生的重要因素。因此抑制冬孢子萌发是玉米丝黑穗病生物防治的关键。目前玉米丝黑穗病普遍使用种衣剂进行防治,存在对环境兼容性差、病菌产生抗药性等不足。因此筛选防效较好且能与环境亲和的生防制剂具有重要的理论价值和实践意义。
本文针对冬孢子萌发的抑制作用筛选出几株生防放线菌,为玉米丝黑穗病的生物防治奠定了理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 土壤样品
取自黑龙江省农垦科学院玉米试验田根际土壤,沈阳农业大学玉米试验田玉米根际土壤。
1.1.2 供试病原菌
玉米丝轴团散黑粉菌(Sphacelotheca reiliana):黑龙江省农垦科学院保存菌种。
1.2 方法
1.2.1 玉米丝黑穗冬孢子萌发培养基的筛选
筛选培养基 L-氏培养基[4]、改良PDA培养基(1%麦芽浸汁,1.8%葡萄糖,2%马铃薯浸汁,1.8%琼脂)、水琼脂+蔗糖培养基、MB-50培养基(0.1%磷酸二氢钾,0.06%酵母膏,0.04%硫酸镁,0.06%尿素,0.003%硫酸亚铁,5%蔗糖,1.8%琼脂)、营养琼脂培养基、PDA培养基、水琼脂+葡萄糖、水琼脂+麦芽糖、G.A(2%蔗糖,0.08%硫酸镁,0.3%醋酸氨,0.063%柠檬酸,0.3%磷酸氢二钾,0.008%硫酸铁,0.0014%硫酸锰,0.00004%硫酸铜)、MM培养基(1%麦芽浸汁,1%麦芽糖,1%马铃薯浸汁,1.8%琼脂)、水+麦芽糖培养基、寄主培养基(2%玉米叶浸汁,1.8%琼脂)。
筛选方法:制备上述11种培养基平板,将冬孢子配成一定浓度的孢悬液涂沫在11种培养基平板上,低倍镜下每视野30～40个冬孢子,每处理重复3次,48 h后观察计算孢子萌发率。
萌发率/%=冬孢子萌发数/观察冬孢子总数×100%
1.2.2 土壤放线菌的分离
土壤样品经阴凉处风干后,称取10 g于90 mL无菌水中,振荡30 min后静止10 min系列梯度稀释[5],取200 μL稀释10-4的土壤悬浮液涂布于高氏1号培养基上,置于28℃恒温培养,7 d后分离放线菌并进行纯化。
1.2.3 拮抗放线菌的筛选
(1) 发酵液制备:发酵培养基 1.5%大豆粒(加适量水煮沸0.5～1.0 h取滤液),0.5%蛋白胨,0.25%硫酸氨,2.0%葡萄糖,1%淀粉,0.025%硫酸镁,0.02%磷酸二氢钾,0.4%氯化钠,配成水溶液,调pH至7～8,加入1%碳酸钙 湿热灭菌30 min[6]。将纯化培养好的放线菌菌株接入原始发酵培养液中,在28℃,180 r·min-1 的条件下进行振荡培养。4 d 后,将培养物用灭菌的滤纸过滤,然后再将滤液经3 000 r·min-1 离心15 min。取上清液用孔径为0.45 μm滤膜过滤,得到代谢产物[7]。(2)病原菌孢子悬浮液的配制: 用接菌钩挑取少量冬孢子粉经甲醛高锰酸钾混合液表面消毒。用无菌水配制低倍镜下每视野30～40个冬孢子的孢悬液[8]。(3) 发酵液对冬孢子萌发抑制率的测定[9]: 将上述配制好的孢悬液与发酵液1∶1混合置于水麦芽糖琼脂培养基中。28℃恒温培养2 d,计算萌发率。孢子萌发以先菌丝长度超过冬孢子半径为准。以孢悬液与发酵培养液1∶1混合置于水麦芽糖琼脂培养基中培养作为对照,每处理3次重复,计算20个不同视野冬孢子萌发数。
孢子萌发率/%=萌发孢子数/孢子总数×100%,孢子萌发抑制率/%=(对照孢子萌发率-处理孢子萌发率)/对照孢子萌发率×100%[10]
2 结果与分析
2.1 玉米丝黑穗病菌冬孢子萌发培养基的筛选
对11种培养基进行筛选,结果表明(见表1):水琼脂与麦芽糖的混合培养基最有利于玉米丝黑穗病菌冬孢子的萌发,冬孢子萌发率达到84.49%,其次是改良PDA培养基(在PDA中加入1%的麦芽浸汁),冬孢子的萌发率为74.77%,两种培养基对冬孢子萌发的促进作用在5%的水平上差异显著,但在1%的水平上差异不显著,筛选出水琼脂与麦芽糖的混合培养基为冬孢子萌发的最适培养基。
2.2 放线菌的分离
采用稀释平板法分离土样中的放线菌,挑取单菌落进行纯化,共获得47株放线菌分离物,分别编号为H-1～H-29,S-1～S-18,以玉米丝黑穗为靶标菌进一步筛选出有高拮抗活性的放线菌。
2.3 拮抗放线菌的筛选
通过47株放线菌发酵液对冬孢子萌发抑制率的测定,从供试的47株放线菌中筛选出6株对玉米丝黑穗病菌冬孢子萌发有抑制作用的菌株(见表2),分别为:H-1,H-4,H-13,H-21,S-1,S-12。其中对冬孢子萌发抑制率超过70%的有2株:S-1和H-21,S-1发酵液对玉米丝黑穗病菌冬孢子萌发的抑制率最高,达到76.56%(见图1)。
3 讨论
病菌冬孢子萌发产生的先菌丝可在玉米5叶期前完成对玉米的侵染并在植株体内繁殖[4]。因此本试验从抑制冬孢子的角度出发,从玉米根际土壤中分离得到放线菌47株,其中S-1发酵液对玉米丝黑穗冬孢子萌发有较强的抑制作用。对冬孢子的萌发抑制率达到76.56%。推测放线菌菌株发酵代谢物中可能存在某种物质抑制冬孢子的萌发,有待于进一步的研究。
摘要：从土壤样品分离得到47株放线菌,通过对冬孢子萌发率的测定得到6株(S-1、H-21、S-12、H-4、H-13、H-1)对冬孢子萌发有较好的抑制作用,S-1菌株及代谢产物对冬孢子萌发抑制率达到76.56%,其次为H-21和S-12,抑制率分别为70.15%和56.87%。
关键词：放线菌,冬孢子,代谢产物
参考文献
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