分子生物学鉴定

分子生物学鉴定（通用12篇）

分子生物学鉴定 篇1

摘要：本研究以检测冬小麦黄矮病毒(BYDV-PAV)的分子生物学特征为目的。首先,通过电击法将3种质粒(UV1304、UV1306、UV1304rtd)转化土壤农杆菌(EHA105、4404,GV3101等)。然后,通过机械损伤使含有上述质粒的农杆菌侵染小麦(西农749、小偃6号、张氏3个品种),并将侵染后的小麦放在室外进行处理,至表现出感染病毒的症状时提取病毒RNA并进行检测。经过一段时间的处理后,只有西农749表现出症状,RNA电泳也显示出提取物中存在RNA,但是经过RT-PCR反转录然后再PCR扩增c DNA后进行电泳出现负结果。3种质粒的c DNA电泳结果出现相似现象:以CP5′+MPR1为引物得到的c DNA电泳均无条带;其他引物得到的c DNA电泳均显示相似的条带,而且因引物不同条带位置也不同。

关键词：冬小麦黄矮病毒(BYDV-PAV),土壤农杆菌(GV3101),反转录PCR(RT-PCR),聚合酶链式反应(PCR)

1 研究背景和意义

1.1 研究背景

大麦黄矮病毒(Barley Yellow Dwarf Viruses),在全世界均有分布,其寄主广泛,可侵染150多种单子叶植物,特别是大麦、小麦、燕麦、水稻等多种禾谷类作物。每年在全球范围内,此类病毒对粮食生产会造成一定程度的危害,大发生时会导致严重减产。这类病毒除了在经济上的重要性外,它们的基因表达机制、进化与传播介体和寄主的作用机制,几十年来一直吸引着人们的研究兴趣[1,2,3,4]。

1.2 研究意义

小麦黄矮病是我国北方麦区的主要病毒病,由大麦黄矮病毒(Barley Yellow Dwarf Virus,简称BYDV)引起。该病的流行难以预测,发病后又不可治愈,被称为“小麦癌症”,一般年份减产5%~10%,流行年份减产30%以上,历史上因小麦黄矮病毒感染而导致巨大经济损失的实例普遍存在。本试验通过农杆菌介导法侵染冬小麦研究大麦黄矮病毒(BYDV-PAV)的分子生物学特性,并且研究BYDV-PAV在冬小麦中的表达情况,为培育抗病毒冬小麦提供条件。

2 试验材料与方法

2.1 材料与器材

2.1.1 材料

小麦黄矮病毒(PAV)毒源(国外友人提供);反转录酶;Taq DNA聚合酶和连接酶;PCR反应的引物;LB培养基;大肠杆菌DH5α;小麦品种:小偃、西农749、张氏;土壤农杆菌(EHA105、4404,GV3101等);3种质粒(UV1306、UV1304、UV1304rtd)由本实验室测序正确并保存;RT-PCR试剂盒;cD NA电泳所需要的琼脂胶。

2.1.2 器材

恒温培养箱、超净工作台、离心机、电转仪PCR仪、移液枪、微波炉、电泳仪、研钵和冰箱等。

2.1.3 LB培养基的配方

LB培养基的配方为蛋白胨10 g/L、酵母膏5 g/L、NaC l 10 g/L。待完全溶解后用5 mol/L的NaC l溶液调节p H值到7.0,加水定容至1 L,1.034 Pa高压蒸汽灭菌20 min。配制固体培养基时,每200 mL LB中加入3~4 g琼脂。

2.1.4 土壤农杆菌感受态细胞的制备

①将所选用的农杆菌菌株(EHA105、4404,GV3101等)从活化的平板上挑取单菌落,接种到加有3~5 m L LB培养基的试管中摇过夜培养。②按1%比例接种扩大培养。③5 000 rpm,5 min。收集菌体,用dd H2O洗6遍。④加入培养物体积0.003倍的10%甘油,分装。⑤电转化时取60 u L加小于2 u L的DNA质粒,进行电转。

2.1.5 R T-PCR体系

H2O:3.75 u L;10×Rtbuffer:1 u L;d NTPs:1 u L;MgCl2:2u L;1﹟RNA反转录酶:0.5 u L;2﹟RNAinhibitor:0.25 u L;引物:0.5 u L;RNA:1 u L。

2.1.6 PCR体系

H2O:14 u L;10×Buffer:2 u L;Primer:1 u L;Taq酶:1 u L;d NTP:1 u L;模板:1 u L。

2.2 方法与步骤

2.2.1 质粒DN A的提取

①将含有2 mL含卡纳霉素的LB液体培养基加入到试管中,分别接入上述的含3种质粒的大肠杆菌,37℃振荡培养过夜。②将培养物导入1.5 mL的离心管中,12 000 r/min离心30 s。③吸取培养液,使细胞沉淀尽可能干燥。④浆细胞沉淀悬浮于200μL溶液I中,用涡旋振荡器充分旋起沉淀,室温放置5 min。⑤加300μL溶液I(I新鲜配制),盖紧管皿,轻轻滚动,上下颠倒,使溶液I与溶液II充分混匀,冰上放置5 min。⑥加入300μL溶液III(冰上预冷),盖紧管口,轻轻颠倒数次,混匀,冰上放置10 min。⑦加入250μL氯仿,轻轻颠倒数次,使盖上的蛋白质沉淀。⑧12 000 r/min离心10 min,转移上清(约600μL)至新的离心管。⑨向上清中加入等体积的氯仿,反复混匀,12 000 r/min离心5 min,溶液分层,轻轻从离心机中取出。⑩小心吸取400μL上清至新的离心管。11向上清中加入2倍体积的无水乙醇,沉淀DNA后,进行混匀,室温放置5~10 min。12 000 r/min离心5 min,弃上清,用吸水纸吸干管口。1 mL 70%乙醇洗质粒2次,轻轻弹起沉淀,离心,弃上清,空甩,风干5 min。

2.2.2 质粒转化土壤农杆菌感受态细胞

①取3个1 mL离心管,每管装入80μL感受态细胞以及2μL质粒。②将质粒和感受态细胞转移到电击杯中。将电击杯插入电转仪内,按下pulse键,几秒后电转仪指示灯发生变化时提出电击杯。③将900μL培养基吸入电击杯内,移液枪打洗混匀。④将电击杯内液体吸净,转入原来的管内。

2.2.3 转化后菌体培养

①将转化完的菌液放入恒温箱中,28℃培养1 h。②配制培养基,倒平板(20 mL培养基中加入50μL利福平和20μL卡那霉素)。③涂平板,并将涂好的平板放入27℃培养48 h。④挑菌(每块板上挑取两个克隆)放入盛有3 mL培养液(每20μL培养液含50μL利福平和8~9μL卡那霉素)的试管中。⑤摇菌:27℃震荡培养20~24 h。⑥再次扩大培养:取6支装有20 mL的三角瓶,并标名(每瓶加50μL利福平、20μL四环素、20μL卡那霉素)分别加入400~600 u L菌液。⑦对应每支试管取两支离心管。一支加入10%甘油150μL加300μL菌液,放入-80℃保菌;另一支加入菌液,4℃短期保菌。⑧试管中剩余的菌液,在三角瓶中扩大培养摇菌48 h。⑨将菌液倒入大离心管中5 000 r/min,5 min弃去上清,加入10 mL小麦转化液悬浮。⑩用人工损伤小麦,接种农杆菌,对照组用小麦转化液处理,处理后将小麦放入室外。

2.2.4 R N A提取

①取黄花叶片4~5片,剪碎,立即液氮研磨成粉末状。②将粉末尽快转入细胞裂解液中并剧烈震荡至组织分散,室温下放置5 min。③加入0.2 mL氯仿充分震荡,室温下放置2~3 min。4℃,12 000 r/min,离心15 min。④冰浴上取上清液250μL于离心管中,并加入250μL异丙醇,静置10 min,4℃,12 000 r/min,离心10 min。⑤弃去上清,沉淀用DEPC水配制的70%~75%乙醇洗2次。⑥用30 u L DEPC灭菌水溶解,放在-80℃保存。

2.2.5 R N A电泳检测(琼脂糖凝胶电泳)

具体操作步骤略。

2.2.6 R T-PCR

用实验室已购买好的试剂盒加入模板进行反应。

2.2.7 cD N A进行PCR

CP5′+MPR1为引物,应该得到500 bp;CP5′+PAV3R为引物,应该得到603 bp;PAV3F+d MPR1为引物,应该得到100 bp;ORF6+PAV3R为引物,应该得到391 bp(阴性对照只加入水,阳性对照分别加入冰箱内保存的1304、1306、1304 rtd质粒)。

2.2.8 cD N A进行电泳检测(琼脂糖凝胶电泳)

3 结果与分析

3.1 试验结果

3.1.1 小麦出现的症状

西农749表现出病毒感染的症状,张氏和小偃6号这两个品种表现出被病毒侵染的症状。

3.1.2 R N A电泳结果

提取的RNA每一大管分为两小管,进行电泳,结果如表1所示。

3.1.3 反转录后进行电泳的结果

①以d MP1和PAV3R为引物进行反转录PCR,反转录成的cD NA经过PCR扩增,并将扩增产物进行电泳,没有出现条带。②以CP5′和PAV3R为引物进行反转录PCR,反转录成的cD NA经过PCR扩增,并将扩增产物进行电泳,3种质粒均出现大小稍微大于500 bp的条带。③以d MP1和PAV3F为引物进行反转录PCR,反转录成的cD NA经过PCR扩增,并将扩增产物进行电泳,3种质粒均出现大小为200 bp左右的条带。④以d MP1和PAV3R为引物进行反转录PCR,反转录成的cD NA经过PCR扩增,并将扩增产物进行电泳,3种质粒均出现大小600 bp左右的条带。

3.2 结果分析

由于试验具有随机性,又重复做了几次,反转录后进行PCR扩增后再电泳但都是出现类似结果,不能确定病毒的存在,无法对其进行分子生物学鉴定,所以试验得到的是负结果。

推测出现这种结果导致试验没有得出正结果的原因可能有以下几种:第一,试验过程中某些操作没严格执行,影响了结果;第二,反转录步骤出现了问题,只是转录了其中的一部分片段而且这一个片段的大小大于500 bp;第三,提取出的RNA为小麦RNA,并没有BY-DV-PAV病毒的RNA,用农杆菌介导侵染小麦后病毒基因并没有得到复制和表达,而表现的症状是其他病毒引起的;第四,试验进行时外界环境不合适。

参考文献

[1]晋治波.黄矮病毒GAV基因组全序列分析及运动蛋白介导的抗病毒小麦的研究[D].中国农业科学院植物保护研究所,2003.

[2]广和.世界大麦黄矮病研究概况[J].世界农业,1989,(7):38 241.

[3]吴云峰,李毅,魏宁生,等.大麦黄矮病毒的循回传播机理[J].西北农业大学学报,1997,25(6).

[4]常胜军,王锡锋,马占鸿,等.大麦黄矮病毒GAV株系外壳蛋白基因的克隆和序列分析[J].病毒学报,1999,15(4):1 000.

分子生物学鉴定 篇2

北京大学第一医院(100434)王端礼

真菌 的 鉴 定不仅是临床的需要，在植物病理学、生物退化、生物技术和环境的研究都很重要，分子鉴定。许多真菌已经鉴定到种，但是分类学家仍在忙于新种的描述和其分类的研究。有些菌种由于经济学的关系或是病理学的重要性，有深人的研究，其他则需要现代手段来进行研究。

一、形 态学

用表 型 特 征来进行分类鉴定，是过去和现在都普遍应用的方法。致病真菌的鉴定，需要光镜，现在更加上荧光显微镜和细胞化学，还有各种染色法，如子囊泡子染色法。真菌在宿主体内鉴定比较困难，如菌丝只能看到有无分隔，有无色素。需要培养来鉴定菌种。某些病例用种特异性抗体探针非常有用，但此种技术尚未在医真菌学领域内作为常规技术使用。合适的培养基培养鉴定菌种，是常用的方法。

医学 真 菌 学家常见到的是半知菌，要看抱子形态和抱子发生，看产抱细胞，即分生抱子梗。有两种型，一是芽生抱子发生，在产抱细胞上有一小点产生分生抱子，另一是叶状抱子发生，整个细胞是产抱细胞，分成一至数个细胞。基于超微结构观察，有许多词语，但未能普遍应用。有的真菌没有分生抱子，但仍有一些特征，如菌核(sclerotia)、厚壁抱子和一些特殊的菌丝结构，如皮肤癣菌。在少数情况下，一些机会真菌产生有性结构，有许多特点用于菌种鉴定，如子囊菌、担子菌和结合菌。

电镜，T EM是观察菌的断面，子囊菌酵母和担子菌酵母的横隔不同，SEM在实际应用有许多发现，如子囊菌的表面结构可以鉴定到种。

现 代 形 态学技术，如自动成像分析、电子颗粒体积、分数几何学分析形态学的特点。

由于 表 型 各种词语没有一定的标准，有很大的主观性，某些表型特征也不稳定，受环境影响，有的不能在人工培养基上生长，有一些真菌尚未分类，分类概念有待近一步建立，鉴定材料《分子鉴定》。

二、分 子 生物学

表型 分 类 受限，生理生化技术在丝状真菌鉴定方面，或是费时费事或是结果不准。分子生物学非常适用。有两种技术，第一，pCR技术，可以分析少量真菌细胞，甚至单个真菌抱子。第二，选择通用寡核昔酸对真菌种特异性引物，测定其核昔酸序列。分子生物学的研究目的由于生物多样性有四个目的。I)系统发生研究。2)分类学的研究，在属、种水平。3)鉴定应用，即决定明确的分类名称。4)流行病学和群体的遗传学研究。具体方法不再详述。

三、其 他 :

I，生 理 学 和生物化学

在纯 培 养 上真菌生长比较快，可以使用生理、生化方法来鉴定菌种。如黑酵母的鉴定。不同的生长温度也用于鉴定。有性和无性是一个辅助工具。在一定的培养基上，有对照，其生长速度也可用于鉴定，如青霉。Ap[系统也用于丝状真菌的鉴定。

2.次 级 代谢产物

次级 代 谢 产物既不是为了生长需要，也不是介导基本代谢，常常发现它是一个与分了有关的混合物，有特殊的和极罕见的化学结构。常见的是固醇、菇、类碱、香豆素等，某些是真菌毒素。将小量从培养皿切下来的标本，直接进行层析色谱法检查，比传统浓缩抽取提纯法简单易行。此法用于地衣的鉴定较好。很少用于真菌分类，由于对环境有一定影响，而且比较难，较少应用，但有人用于子囊菌的分类。

3.泛 酉昆 系统

是一 种 初 级代谢产物，起重要作用。泛酿即辅酶Q，是呼吸系统电子传播链的携带者。一些异戊二烯(isoprene)接触醒核各有不同，对鉴定到属或属以下水平很有帮助。主要鉴定细菌和酵母，也用于黑酵母和丝状真菌。

(Ya ma da Y ,e tal.In t.J.Genet 1989;5 6:309 Y ag uchiJ > e tal.M ycoscience 1996;3 7:55)0

4.脂 肪 酸组成此法 在 细 菌学方面是常规应用的。一是成分，二是相对浓度。极少用于真菌分类。使用热解气相色谱法、热解块状光谱仪、气相色谱仪、隔膜水相聚合物双相系统等，主要应用这些方法。近来应用气相色谱法合并多变量统计分析方法，成功地用于丝状真菌，包括卵菌、担子菌、结合菌、甚至只有菌丝的真菌。用于种间水平。应注意许多变化，如培养状态和温度是最主要的。

5.细 胞 壁组成子 囊 菌 和担子菌含有几丁质和葡萄糖，结合菌含有脱乙酞几丁质(chitosen)和葡聚糖醛酸。不同的皮肤癣菌含有不同的糖分，醉母细胞壁或是缺乏或是含有少量其他多糖(如岩藻搪、乳糖、鼠李糖、木搪等)。

分子生物学鉴定 篇3

【关键词】马铃薯纺锤块茎类病毒;生物学鉴定法

0.前言

马铃薯种薯退化的主要原因是感染病毒病和类病毒，病毒是造成马铃薯品质下降和产量降低的主要原因。

马铃薯纺锤块茎类病毒是世界上一类检疫病害，对于严格的植物检疫而言，类病毒是相当重要的，它也是育种和遗传资源保存中的一种棘手的病原。大田中，PSTVd可以造成严重减产，在中国，一些感病的地方品种的减产幅度高达80%,PSTVd和其他病毒复合侵染可能引起更严重的病害。

为了摸清马铃薯纺锤块茎类病毒在我省发生分布情况，我们于2008年开展了本项目的研究工作。

1.材料与方法

1.1材料

用来实验的品种—米拉、早大白、花525、克851、克新12号、东农303、克新1号、克新2号、克新3号、克新4号。上述品种分别来自于哈尔滨、齐齐哈尔、嫩江、扎兰屯、牙克石、绥化、依安、讷河、克山马铃薯种植区。

用于进行生物学鉴定所需设备：防虫温室、铁架子、花盆（大号、中号、小号）、黑土（必须用筛子筛才能用）、马粪（必须发酵后用筛子筛完后才能用）、大铁桶（储存水）、大衣盆、刷子、洗衣粉（这三样用来清洗花盆，花盆每年用前必须刷干净）。筛子、铁锹、筐、推车、喷壶、塑料管、遮阳网、尿素（用来促进植珠生长）、金钢砂、研钵。

用来进行生物学鉴定的指示植物，植物种类：黄苗榆烟、白肋烟、大千豆、心叶烟、伯尼烟、香料烟、三生烟、黄花烟、紫花球果蔓陀罗、白花剌果蔓陀罗、毛蔓陀罗、洋球浆、假酸浆、黄姑娘、小圆椒、指尖椒、千日红、Saco、S41956、直房丛生番茄、鲁特格尔斯番茄、天蓬子、莨菪、黑龙葵、黄龙葵、野生马铃薯（sdanam.Berthaulthii）。

1.2方法

1.2.1指示植物种子的培育

将以上列举的指示植物播种于花盆中，花盆中事先浇透水，播完种子后上面覆0.5cm厚土。

1.2.2指示植物的移栽

在指示植物长至2-4叶子并有较强的根系时可将植珠带土定植到另一花盆中。

1.2.3指示植物摆组接种鉴定

将上述提到的指示植物摆组，每组中包括上述提到的每种指示植物，每组中系统侵染的植株摆一盆，局部侵染的植珠摆两盆。接种前，将接种叶掐尖，每个指示植物掐4-6片叶子，然后三天后调查马铃薯纺锤块茎类病毒侵染各种指示植物的情况，仔细记录各个指示植物的症状表现。

从7月1日至7月23日前往哈尔滨、齐齐哈尔、嫩江、扎兰屯、牙克石、绥化、依安、讷河、克山马铃薯种植区，采取有病植珠叶片，每个种植区按照“X”路线，采取5个点采样法，每点采20个样品，每个种植区共采100个样品。每份样品剪碎后放入研钵中，加入1：10倍的磷酸缓冲液充分研碎成糊状。接种前，将接种叶掐尖，每个指示植物掐4-6片叶子，然后在叶片上用喷粉器喷上金钢砂，用一个手指蘸病毒汁液在接种叶上轻轻主摩擦，再用清水冲洗接种叶上的杂物（多余金刚砂和植物组织）。三天后调查马铃薯纺锤块茎类病毒侵染各种指示植物的情况，仔细记录各个指示植物的症状表现。

当从种植区采取的植珠叶片的汁液接种在鲁特格尔期番茄上在室温25-37℃和光照16小时强光条件下，接种半月后蕃茄中，上部叶片变窄小和扭曲时，植珠中含有马铃薯纺锤块茎类病毒病，无症状的或其它症状的不能证明该植珠中含有马铃薯纺锤块茎类病毒。

当从种植区采取的植珠叶片的汁液接种在莨菪(scorolio sinensis)上，在室温20-22℃和弱光条件下，接种3-5天或10-15天接种叶片沿脉，出现褐小坏死斑点时，该植珠含有马铃薯纺锤块茎类病毒，无症状的或其它症状的不能证明该植珠中含有马铃薯纺锤块茎类病毒。当从种植区采取的植珠叶片的汁液接种在天蓬子上，接种5-7天，温度在20℃弱光条件下，接种叶片沿脉出现褐色坏死点时，该植珠含有马铃薯纺锤块茎内病毒，无症状的或其它症状的不能证明该植珠中含有马铃薯纺锤块茎类病毒。

2.结果与分析

用生物学鉴定法分析黑龙江省马铃薯纺锤块茎类病毒的发生情况。

将2008年通过生物学鉴定法，鉴定黑龙江省马铃薯纺锤块茎类病毒的发生情况，见表1马铃薯品种含PSTVd的鉴定情况。

表1 马铃薯品种含PSTVd的鉴定情况

从上表看出：以黑龙江省主要马铃薯产区的马铃薯病株1000份作为被分离鉴定材料，共接种3000次。

2008年生物学的鉴定结果表明：哈尔滨、齐齐哈尔、嫩江、牡丹江、扎兰屯、牙克石、绥化、依安、讷河、克山均有马铃薯纺锤块茎类病毒病的发生。从表1中看出：哈尔滨PSTVd发病率4.6%、齐齐哈尔PSTVd发病率1.3%、嫩江PSTVd发病率2.6%、牡丹江PSTVd发病率6.0%、扎兰屯PSTVd发病率8.1%、牙克石PSTVd发（下转第285页）（上接第327页）病率4.8%、绥化PSTVd发病率6.1%、依安PSTVd发病率7.9%、讷河PSTVd发病率1.0%、克山PSTVd发病率2.3%。

3.结论

通过用生物学鉴定法，分析黑龙江省马铃薯纺锤块茎类病毒的发生情况，表明哈尔滨、齐齐哈尔、嫩江、牡丹江、扎兰屯、牙克石、绥化、依安、讷河、克山均有PSTVd存在，平均发病率在1.35～8.1％。应当积极研究防治马铃薯纺锤块茎类病毒的措施。

【參考文献】

［１］李芝芳,等.我省马铃薯退化及其防治的研究.黑龙江省农业科学,1980,1.

［２］k·A fernow.用番茄作为鉴定马铃薯纺锤块茎病弱系的试验植物.phgtophologg·vol·st(1967)pb47.

［３］r p sing.马铃薯纺锤块茎病毒的寄主范围.Amer potato J vol 50 No4.

木薯创新材料分子鉴定研究 篇4

为了实现获得淀粉含量提高或组成发生有益变化的实用育种新材料的研究目标[5,6], 采用生物信息学技术获得相应酶基因的DNA序列, 设计对应引物, 以PCR技术克隆到木薯淀粉合成关键酶基因蔗糖磷酸合成酶、ADPG焦磷酸化酶、淀粉合成酶, 并构建相应淀粉合成关键酶基因的表达干涉载体[7], 利用农杆菌介导的基因转化法导入木薯主栽品种 (SC205) 基因组中, 通过潮霉素抗性筛选、RT-PCR及Southern blot进行鉴定与分析[8], 获得阳性的转基因再生木薯株系, 结合植物学特性评价, 为今后从中筛选出实用的育种新材料奠定良好技术基础。

1材料与方法

1.1试验材料

1.1.1木薯材料。试验材料采用木薯 (SC205) 转基因株系p YLRNAi-Sporamin A-P-Me GBSS1-GB、p YLRNAi-Sporamin A-P-Me AGPase SU1-AG、p YL-Sporamin A-P-Me AGPase SU1 CTP-glg C336-No16、p YL-Sporamin A-P-Me AGPase SU1CTP-glg C336--No21及野生型木薯株系 (SC205) , 均为组培苗。

1.1.2主要试剂。Trizol试剂购自Invitrogen, RNAplant Plus购自天根公司, 反转录酶M-MLV购自Takara, 2×PCR premix购自百泰克公司, 限制性内切酶等常规分子生物学试剂购自Ta Ka Ra公司, DIG-High Prime试剂盒和DIG Nuc-leic Acid Detection Kit试剂盒购自美国Roche公司, 其余试剂均为国产分析纯。

1.1.3引物序列。包括PCR扩增快速鉴定引物序列 (HPT-F:5′-CTGAACTCACCGCGACGTCTGTC-3′;HPT-R:5′-tagcgc gtctgctgctccataca-3′) ;Southern Blot杂交探针序列 (HygProbe-F:5′-TATTTCTTTGCCCTCGGACG-3′;Hyg Pr-obe-R:5′-TGA AAAAGCCTGAACTCACCG-3′) 。

1.2试验方法

1.2.1 DNA的提取[9]。以野生型及转基因木薯株系的叶片为材料, 采用改良的CTAB法提取DNA。

1.2.2 RNA的提取及反转录[10]。分别以野生型及转基因木薯株系的叶片、根为材料, 叶片的总RNA的提取采用Trizol法, 根的总RNA的提取参照天根公司RNAplant Plus的使用说明进行;反转录c DNA参照Takara的使用说明进行。

1.2.3 PCR初步鉴定[11]。用半定量RT-PCR技术检测木薯转基因株系目标基因的转录水平, 以碱裂解法提取的转化再生株系及野生型的DNA为模板, 以HPT-F/HPT-R为引物, 进行PCR扩增并电泳检测。

1.2.4 Southern blot检测外源DNA插入[12,13,14]。分别以木薯SC-205叶片、根的c DNA作对照, 载体p YLRNAi-Sporamin A-P-Me GBSS1的转基因株系用颗粒型淀粉合成酶基因的引物Me GBSS1 c DNA-1006-Bam HI-F/Me GBSS1 c DNA-1465-Hind III-R分别检测该基因在叶片、根中的转录调控情况;载体p YLRNAi-Sporamin A-P-Me AGPase SU1的转基因株系用腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶小亚基基因的引物Me AGPase SU1 c DNA 582-Bam HI-F/Me AGPase SU1 c DNA1177-Sal I-R分别检测该基因在叶片、根中的转录调控情况;载体p YL-Sporamin A-P-Me AGPase SU1 CTP-glg C336的转基因株系用大肠杆菌腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的引物glg C336-999-F/glg C336-1012-R分别检测该基因在叶片、根中的转录调控情况[5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16]。

2结果与分析

2.1 PCR检测

随机抽取14份木薯转基因材料DNA作为模板, 并用潮霉素磷酸转移酶基因上的引物HPT-F/HPT-R进行PCR扩增快速鉴定检测试验, 结果表明:供试材料3、4、6、8、11、12共6份呈阳性 (图1) , 阳性转基因材料筛选率为42.9%。

注:M为DL2000 Marker;1为野生型的阴性对照;2为转化载体的阳性对照;3~16为木薯转化再生株系。

2.2 Southern blot检测

为了进一步确认转基因材料为阳性材料, 以及目标基因插入的拷贝数, 采用Southern blot对载体p YLRNAi Sporamin A-P-Me GBSS1转化的11份材料进行了分析 (图2) , 结果表明:材料1、2、4、11均为为单拷贝片段插入, 材料1、2相同片段插入, 可以说明均为阳性材料;材料7和10表现为多拷贝片段插入;材料3、5、6、8、9均没有获得杂交标记带, 可以说明均为阴性材料。对载体p YLRNAi-Sporamin A-PMe A-GPase SU1转化的11份材料进行了分析 (图3) , 结果表明:材料10、11、12为单拷贝插入, 而V11和V12的相同的单拷贝插入, 可以说明均为阳性材料;材料2~9均没有获得杂交标记带, 可以说明均为阴性材料。从Southern blot检测的22份材料中有7份为阳性材料, 初步可以统计转化率31.8%, 其中单拷贝材料获得率为22.7%, 多拷贝材料获得率为9.1%。

注:M为地高辛标记MarkerⅡ;1~11为木薯转化材料;12为野生型阴性对照。

注:M为地高辛标记MarkerⅡ;1为野生型阴性对照;2~12为木薯转化材料。

2.3半定量RT-PCR转录水平检测

为了快速检测木薯转基因株系中, 淀粉合成关键酶基因的表达情况, 采用半定量RT-PCR技术对部分转基因株系叶片及根中的目标基因表达情况进行了研究。图4、图5和图6为叶片中目标基因的表达检测情况, 图7、图8和图9为根中目标基因的表达检测情况。

2.4表型评价

目前已经对不相同转化载体获得的转基因材料进行了相关植物学性状观测、记录、评价, 与SC205 (CK) 相比较分析获得了初步的结果:发现幼叶片畸形、幼茎颜色变深和根系都有不同程度的膨大等变异 (图10、图11、图12和表1) 。

3结论与讨论

木薯的再生及遗传转化体系建立于20世纪90年代末, 利用模式种进行的转基因研究在阐明木薯基因功能方面起到了重要作用, 但在生产实际中应用前景不大。因此笔者紧紧围绕实用为中心, 以栽培品种SC205为材料, 建立了遗传再生、转化体系, 获得了一些转化再生株系, 通过分子检测技术, 初步统计遗传转化阳性材料获得率31.8% (其中单拷贝材料获得率为22.7%, 多拷贝材料获得率为9.1%) , 获得了45份木薯转化阳性再生编号材料;根据半定量RT-PCR结果可知, 目标基因在转基因株系叶片中的表达与野生型差异不大;而在根中目标基因的表达情况与野生型相比有明显差异, 这与笔者采用的块根特异的启动子的设计预期是相吻合的。按照m RNA水平决定蛋白水平, 酶蛋白水平决定代谢途径的强弱推断, 获得的转基因株系是有可能调控木薯块根淀粉的含量与组成。综上研究, 可以说明建立的木薯栽培品种SC205的遗传转化体系是可靠的, 该技术平台的建立为今后采用植物分子育种技术改良这些木薯栽培品种奠定了坚实的基础。

注:CK为SC205正常叶片;1为p YLRNAi-Sporamin A-P-Me GBSS1转化材料叶片;2为p YLRNAi-Sporamin A-P-Me AGPase SU1转化材料叶片;3为p YL-Sporamin A-P-Me AGPase SU1 CTP-glg C336-No16转化材料叶片。

注:CK为SC205正常根系;1为p YLRNAi-Sporamin A-P-Me GBSS1转化材料根系;2为p YLRNAi-Sporamin A-P-Me AGPase SU1转化材料根系;3为p YL-Sporamin A-P-Me AGPase SU1 CTP-glg C336-No16转化材料根系。

注:W为野生型 (SC205) 根系生长;T-M为p YLRNAi-Sporamin A-P-Me AGPase SU1转化材料根系生长。

人们都知道导致植物发生变异是一个复杂的生物系统调控过程, 就目前获得转化木薯材料的明显的变异现象而言, 还无法确定导致变异表达因子以及性状变异对材料生长的利弊意义, 这也就是需要后续深入研究。根据国家《农业转基因生物安全管理条例》的相关规定, 笔者已按计划将这些材料在可控温室条件下进行扩繁、盆栽种植试验, 进行其相关农艺性状、块根淀粉含量和淀粉合成关键酶活性测定等工作, 分析目标基因表达情况, 综合评价获得的木薯创新材料;期望从中筛选到淀粉含量提高或组成发生有益变化的具有实用价值的转基因木薯株系作为育种新材料。

摘要：对木薯转基因创新材料进行分子水平的鉴定、评价, 通过PCR扩增快速检测, 阳性转化材料筛选率为42.9%;Southern Blot检测, 阳性材料获得率31.8%, 获得了45份木薯转化阳性再生编号材料;半定量RT-PCR检测, 目标基因在阳性株系叶片中的表达与野生型差异不大, 而在根中的表达与野生型相比有明显差异;并观测、记录、评价其表型变异特征。说明建立了可靠的遗传转化再生体系, 为今后木薯育种奠定良好的技术与材料基础。

积极分子考察鉴定 篇5

考察内容：

既要考察入党积极分子的政治素质、学习成绩、工作表现，也要考察其入党动机、理想信念;既要考察平时表现、组织纪律观念、群众基础，更要考察其在关键时刻的表现和在重大政治问题上的态度和立常考察内容要真实、具体、正确，能反映出入党积极分子表现的特点。

考察的具体方法：

1、日常考察。在日常工作、学习、生活中考察，可通过与入党积极分子面对面的交流，了解他们的思想;也可以向党内外群众了解入党积极分子的一贯表现。

2、任务考察。党组织要有意识地给入党积极分子分配一定的工作和任务，给他们压担子，并提出具体要求，观察他们的表现。

3、活动考察。吸收入党积极分子参加党的一些活动，了解他们的心得体会和思想反映。

4、关键考察。观察和了解入党积极分子在关键时刻的表现，对大是大非问题的态度和立常

入党积极分子被确定为发展对象后，党组织要进行政治审查，政治审查的主要内容是：

对党的路线、方针、政策的态度，本人的政治历史和在重大政治斗争中的表现及现实表现(要明确写出缺点或不足)，直系亲属和与本人关系密切的主要社会关系的政治情况等，鉴定材料《积极分子考察鉴定》。

入党积极分子分阶段培养考察意见_评语鉴定2008-06-16 22:32第一阶段考察意见

同志自进入入党培养考察以来认真学习马列主义毛泽东思想，邓-小-平理论和“三个代表”重要思想，学习党的十六大和四中全会精神，政治上与党中央保持一致坚决拥护党的路线方针，政策，该同志在班级担任职务，工作认真负责在各项活动中起良好的带头作用，在学习生活中同志能努力按照一名共-产-党员的标准严格要求自己，尊敬师长，关心同学，乐于助人，生活俭朴，处世得当，具有较好群众基础，学习努力成绩优良，学习态度端正，该同志积极向党组织靠拢，经常主动向党组织汇报自己的思想，入党动机端正。积极表现认真学习党的先进思想理论与方针政策用先进的理论指导实践，同时也应该意识到自身存在的不足，群众批评与自我批评相结合，找出自身的缺点，多多团结身边的同志，争取共同进步。

第二阶段考察意见

同志在更方面都有了较大的进步，学习生活中，能够联系群众，本着全心全意为人民服务的宗旨，热心助人，在专业课程的学习中刻苦努力，有明确的学习目标，在同学当中树立了良好的榜样，但是，还应该看到同志在自身性格的历练方面应多多加强，待人接物应更加热情开朗，做事也应更加大胆泼辣，争取自身的全面突破

分子生物学鉴定 篇6

关键词：广西莪术；蛀茎害虫；桃蛀螟；生物学特性；天敌；姜科植物

中图分类号： S43567文献标志码： A

文章编号：002-302（204）2-072-04

姜科植物广西莪术（Curcuma Kwangsiensis S G Lee et C F Ling）的块根，药材上称为桂郁金，为广西地区的道地药材，具有利胆、抗动脉硬化、利尿、抗菌等药用功效。广西壮族自治区钦州市、贵港市、隆安县等地为广西莪术的传统种植区，自栽培种植以来主要害虫为姜弄蝶（Udaspes folus Cramer），以卷叶危害，危害性不大。随着药材与其他作物种植结构的不断调整，以及周边环境的不断变化，近年来广西莪术受蛀茎害虫危害严重，危害初期植株症状表现不明显，中后期主要表现为新叶凋萎、茎干中空折断、植株枯萎，严重影响药材的生长。目前，有关广西莪术蛀茎害虫的研究未见报道。20—203年，笔者对广西壮族自治区钦州市、隆安县等莪术产区及广西药用植物园姜园进行田間观察和系统调查，旨在明确该害虫的种类，掌握该害虫的发生危害规律、寄主范围及自然天敌，为科学防治提供依据。

材料与方法

形态观察及种类鉴定

利用Leica Z6体视显微镜观察测量幼虫、卵、蛹的体长、体宽，每种虫态测量20头。测量时，成虫、幼虫体长以头顶至腹末为准，体宽以胸部宽度为准，卵长以两侧最尖端长度为准。通过观察记录各个虫态的形态特征，鉴定害虫种类。

2生物学特性研究

2生活习性及危害特性在虫口密度较大的地块设置固定调查样地，定期在样地内调查桃蛀螟的发生情况。观察记录该虫的危害特征、危害部位、虫态、数量及各虫态发育进度、生活习性、活动情况等。

22生活史[2]田间样地定点定时调查结合室内饲养完成该害虫的生活史研究。实验室条件下采用常规方法饲养幼虫：采集越冬蛹（200头），连同干枯茎干一起放置在平底试管中（直径 280mm）中让其羽化，记录羽化时间；将羽化的成虫配对饲养于养虫笼中，笼内放置莪术嫩茎或心叶及浸有蜂蜜水的棉球，定期观察产卵情况，待卵完全孵化后统计卵孵化期；低龄幼虫主要用广西莪术的心叶及幼嫩茎干饲养，随着食量的增加，老龄幼虫主要用较粗壮的老茎干饲养，每天观察幼虫生长发育和蜕皮情况，记录幼虫发育历期，测量幼虫的体长，统计各龄幼虫的平均体长；老熟幼虫停止取食进入预蛹期后，观察记录蛹发育历期；蛹开始羽化后，定期观察记录羽化情况。

3姜科寄主植物调查

姜科植物寄主调查主要在广西药用植物园姜园内进行，共调查姜科8属72种植物，这72种姜科植物在广西药用植物园引种栽培的历史有20多年，每个品种随机成畦种植，畦间距50～60cm。调查时先观察植株是否有蛀孔、粪便，进一步拨开植株茎干，将收集到的卵、幼虫、蛹、成虫编号后带回实验室饲养，镜检成虫，确定是否为寄主植物。

危害程度调查：在害虫发生高峰期，对不同寄主上的危害程度进行调查。每种寄主植物采用随机5点取样法，每点取20株，共00株，调查是否受害。以受害植株数为主要依据进行分级：级，受害植株0～5株；2级，受害植株6～0株；3级，受害植株～20株；4级，受害植株2～30株；5级，受害植株30株以上；分别标记为“”“[KG-3]”“[KG-3][KG-3]”“[KG-3][KG-3][KG-3]”“[KG-3][KG-3][KG-3][KG-3]”；未受害为“-”。

4自然天敌调查

主要采用田间调查的方式，观察记录田间桃蛀螟幼虫、蛹受自然天敌寄生、捕食等情况，并带回实验室饲养，镜检成虫，鉴定种类。

2结果与分析

2形态特征及种类鉴定

卵：椭圆形，长约06 mm，宽约04 mm，初产时为乳白色，后渐变为暗红色。

幼虫：根据室内饲养情况，该害虫幼虫共有5龄，老熟幼虫体长22 mm左右，背面暗红色，腹部略带淡绿色，背线不明显，各节毛片呈灰黑色（图），腹足趾钩双序缺环，腹部末端有6根卷曲的臀棘，其他各龄特征见表。

蛹：长3～5 mm，宽3～4 mm，椭圆形，光滑，头向下垂。蛹初期为淡黄色，逐渐变为红褐色，接近羽化时变为黑褐色（图2）。

成虫：为黄色且具有许多黑斑的小蛾子（图3）。体长2 mm左右，翅展25～29 mm。触角丝状，长约为前翅的一半；下唇须发达，向上弯曲，形似镰刀状，上着生黄色鳞毛，其前半部背面外侧具黑色鳞毛。复眼发达，黑色，近圆球形。喙发达，基部背面有黑色鳞毛。胸部领片中央有个黑色鳞毛组成黑斑，肩板前端外侧及近中央处各有个黑斑，胸部背面中央有2个黑斑。前翅正面黄色，前缘基部有个黑斑，沿基线3个黑斑；中室前端有黑横条，中央有近圆形黑斑；内外横线及亚外缘线均由黑斑排列而成；内侧线有4个黑斑，外横线及亚外缘线各有8个黑斑。后翅中室内有2个黑斑，外横线及亚外缘线分别由7至8个黑斑排列而成，腹部背面黄色，第、3、4、5节背面各有3个黑斑。根据上述虫态特征，鉴定该害虫为螟蛾科野螟亚科蛀野螟属桃蛀螟（Dichocrocis punctiferalis Guenee）[2]

nlc202309020708

22生物学特性

22生活史据室内饲养和姜园试验地观察，桃蛀螟在广西南宁每年发生5代。每年4—月为田间危害期，月后老熟幼虫或蛹在寄主茎干内或落叶堆下过冬。翌年4月陆续羽化、产卵，第代幼虫出现在5月上旬，5月下旬为盛发期，幼虫田间历期为22～25 d；化蛹盛期为6月中旬，蛹期8～0 d；第代成虫羽化盛期为6月下旬；第2代幼虫开始出现世代重叠，始期为6月下旬，盛期为7月上旬；第3代幼虫始期为8月上旬，盛期为8月中下旬；第4代幼虫始期为8月下旬，盛期为9月中旬；第5代（越冬代）幼虫始期为0月下旬，月后以老熟幼虫或蛹越冬。表2数据显示，桃蛀螟的卵期、幼虫期、蛹期、成虫期因不同世代而异，第至第4代完成个世代需要35～47 d；除了越冬代，第2代的卵期、幼虫期、蛹期、成虫期的平均值要明显小于其他世代，说明该世代各虫态历期较短，初步分析原因为第2世代田间温度适宜（25～28 ℃），寄主植物生长旺盛，食料充沛，因此发育进度迅速。[FL）]

[FK（W8][HT6H][Z]表2桃蛀螟各世代卵、幼虫、蛹的发育历期[HTSS][STBZ]

[H5][BG（！][BHDFG3，WK8，WK6。2，WK8，WK6，WK8，WK6。3W]世代卵历期（d）卵历期平均值（d）幼虫历期（d）幼虫历期平均值（d）蛹历期（d）蛹历期平均值（d）成虫历期（d）成虫历期平均值（d）

[BHDG2]第代6～87222～2523508～09207～873

[BHDW]第2代4～6457～28608～28606～768

[BH]第3代5～86320～242657～00507～878

[BH]第4代5～86420～2322008～9807～875

[BH]第5代（越冬代）7～98222～604820～8056007～982[H][BG）F][FK）]

[FL（2K2]

222生活习性及危害特性由图4可知，每年4月越冬蛹开始羽化，全天均可羽化，以晚上居多，且多在20：00—22：00时进行，成虫羽化后需停息5～0 min才开始爬行或飞翔。在室内条件下，成虫会在浸泡过蜂蜜水的棉球上吸取蜂蜜水，昼伏夜出，有趋光性。在田间，莪术、姜黄等姜科植物花期正好为每年4—5月，羽化后的成虫大多飞到莪术、姜黄等姜科植物的花上取食花蜜，补充营养后交配产卵。产卵多在夜间进行，以晴天20：00—22：00时最盛， 主要将卵产在心叶或嫩叶主脉两侧，或产在靠近花序的基秆上，散产，粒或2～3粒。初孵幼虫蛀食叶肉，形成～2 cm长的透明食道，发育至2～3龄后经短距离爬行后，蛀入植物的嫩茎取食危害，造成心叶枯黄凋萎；随着虫龄的增大，幼虫不断往下钻蛀、取食、发育，蛀道内较潮湿并有丝状体，茎干至上而下排列有孔径约为2～3 mm 的排粪孔3～5个，植株近地面处可见明显虫粪排出。有些植株茎干上还出现有2～3头幼虫同时危害，有转主危害的特点，后期茎干大多中空，易折断。老熟幼虫多在蛀道底部近地面处吐丝结茧。通常条蛀道内有个蛹，也时常出现个蛀道内有2个蛹。

23姜科植物寄主范围

姜科植物在中国有22属208种0变种，广西地区有属74种3变种[3]，笔者对广西药用植物园姜园内种植的8属

[FK（W0][TN4tif][FK）]

7种姜科植物进行调查，由表3可以看出，砂仁属（3种）、闭鞘姜属（3种）、山柰属（4种）3个属的植物均未受到桃蛀螟危害，桃蛀螟主要危害姜黄属、姜属、姜花属3个属的植物，[FL）]

[FK（W77mm][HT6H][Z]表3桃蛀螟危害姜科植物调查[HTSS][STBZ]

[H5][BG（！BTXDF][BHDFG3，WK25，WK22。2，SK25，WK22。2W]姜科植物是否寄主发生程度姜科植物是否寄主发生程度

[BHDWG3，WK25ZQ0，WK22。2，SK25ZQ，WK22。2W][XXZSX2-ZSX292]山姜属（Alpinia） [XXZSX2-ZSX292]3闭鞘姜属（Costus） -

[BHDW][3]竹叶山姜（A bambusifolia CFLiang et DFang） 否-闭鞘姜[C speciosus （Koen） Smith]否-

[BH]云南草寇（A blepharocayx KSchumvar blepharocalyx）否-斑叶闭鞘姜[C speiosus （Koen） Smith cv Marginatus]否-

[BH]距花山姜（A calcarata Rosc）否-光叶闭鞘姜（C tonkinensis Gagnep）否-

[BH]节鞭山姜（A conchigera Griff）否-4姜黄属（Curcum）

[BH]香姜（A coriandriodora DFang）是郁金（Ca aromatica Salisb）是[KG-3]

[BH]美山姜（A formosana KSchum）是[KG-3]广西莪术（Ca kwangsiensis SG Lee et CFLiang）是[KG-3][KG-3][KG-3]

[BH]红豆蔻[A galangal（Linn）Willd]否-姜黄（Ca longa Linn）是[KG-3][KG-3][KG-3]

[BH]海南山姜（A hainanensis KSchum） 否-莪術[Ca zedoaria （Christem）Rosc] 是[KG-3][KG-3]

[BH]光叶山姜（A intermedia Gagnep）否-川郁金（Ca sichuanensis xxChen） 是[KG-3]

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[BH]山姜[A japonica （Thunb）Mip]否-温郁金（Ca aromatica SalisbcvWenyujin） 是[KG-3][KG-3][KG-3]

[BH]长柄山姜（A kwangsiensis TLWu）否-印尼莪术（a zanthorrhiza Roxb）是[KG-3]

[BH]假益智（A maclurei Merr）否-5舞花姜属（Globba）

[BH]毛瓣山姜[A malaccensis （NLBuman） Rosc]是[KG-3]毛舞花姜（G barthei Gagnep）是

[BH]黑果山姜[A nigra （Gaertner） BLBurtt]否-舞花姜（G racemosa Smith） 是

[BH]华山姜[A chinensis （Retz） Rosc]是-[4]小珠舞花姜（G schomburgkii Hookfvarangustata Gagnep）是-

[BH]高良姜（A officinarum Hance） 是[KG-3][3]双翅舞花姜（G Schombergkii Hookfvarschombergkii）是-

[BH]卵果山姜（A ovoidocarpa HDong et GXu） 否-6姜花属（Hedychium）

[BH]益智（A oxyphylla Miq）否-矮姜花（H brevicaule DFang） 否-

[BH]多花山姜（A polyantha DFang）否-姜花（H coronarium Konig） 是[KG-3][KG-3]

[BH]花叶山姜（A pumila Hookf）否-峨眉姜花（H flavescens Carey ex Rosc）否-

[BH]箭杆风（A sichuanensis ZYZhu）是黄姜花（H flavum Roxb）是[KG-3]

[BH]球穗山姜（A strobiliformis T L Wu et Senjen） 是圆瓣姜花（H forrestii Diels）是[KG-3][KG-3]

[BH]滑叶山姜（A tonkinensis Gagnep）否-疏花草果药（H spicatum Smith varacuminatum）否-

[BH][3]艳山姜[A zerumbet （ersoon） BLBurtt et RMSmith]否-草果药（H spicatum Smith varspicatum） 否-

[BHDWG22/3][ZK（]雨花山姜[A zerumbet （ersoon） BLBurtt et RMSmith cvSpringle][ZK）]否-[ZK（]小毛姜花（H villosum Wallvartenuiflorum WallexBaker）[ZK）]是

[BHDWG2]2砂仁属（Amomum）滇姜花（H yunnanense Gagnep）是

[BH]海南假砂仁（A compctum Chun）否-7山柰属（Kaempferia）

[BHDW]爪哇白豆蔻（A compactum Soland ex Maton）否-山柰（K galanga Linnvargalanga）否-

[BH]长序砂仁（A gagnepainii TLWu et al）否-[5]大叶山柰（K galanaga Linnvarlatifolia Donn ex Gagnep）否-

[BH]野草果（A koengii FGmelin）否-海南三七（K rotunda Linn）否-

[BH]白豆蔻（A kravanh ierre ex Gagnep）否-8姜属（Zingiber）

[BH]海南砂仁（A longiligulare TLWu）否-珊瑚姜（Z corallinum Hance） 是

[BH]长柄豆蔻（A longipetiolatum Merr）否-蘘荷[Z mioga （Thunb） Rosc]否-

[BH]九翅豆蔻（A maximum Roxb）否-红葶姜（Z nudicarpum D Fang） 否[KG-3]

[BH]细砂仁（A microcarpum CFLiang et DFang）否-姜（Z officinale Rosc）否-

[BH]疣果豆蔻（A muricarpum Elmer） 否-红冠姜[Z roseum （Roxb） Rosc]否-

[BH]红壳砂仁（A neoaurantiacum TLWu） 否-阳荷（Z striolatum Diels）是

[BH]草果（A tsaoko Crecost et Lemarie） 否-红球姜[Z zerumbet （Linn） RoscexSmith]是[KG-3][KG-3][KG-3][KG-3]

[BH]砂仁（A villosum Lourvarvillosum）否-[H][BG）F]

注：发生程度栏中，“-”表示未受害，“”“[KG-3]”“[KG-3][KG-3]”“[KG-3][KG-3][KG-3][KG-3]”“[KG-3][KG-3][KG-3][KG-3]”分别表示受害级别为、2、3、4、5级。[FK）]

[FL（2K2]其中姜黄属7种植物都受到不同程度的危害，广西莪術、姜黄、温郁金3种寄主受害程度4级（[KG-3][KG-3][KG-3]），姜属的红球姜受害最为严重，危害级别达5级（[KG-3][KG-3][KG-3][KG-3]）。据田间调查，危害严重的地块危害率高达95%。可见桃蛀螟虽然是杂食性昆虫，但对姜科寄主植物还是有一定的选择性，最嗜红球姜，其次为广西莪术、姜黄、温郁金等。

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24天敌

田间调查发现桃蛀螟的主要天敌有螟黑点瘤姬蜂（Xanthopimpla stemmator Thunberg）（图5）和巨首蚁属（heidologeton sp）蚂蚁（图6），前者寄生于蛹，后者捕食蛹，在田间具有一定控制害虫种群的作用。特别是巨首蚁，对桃蛀螟蛹具有较强捕食性，据初步调查，捕食率可达到30%左右。该蚁通常会通过桃蛀螟靠近地面的排粪孔进入莪术被蛀空的蛀道内，先以2～3头兵蚁撕咬蛹体，僵持并使之致死后大量工蚁分食蛹体，并从原来的排粪孔向蛀道外推填细密的茎渣，形成了个临时的“蚁窝”（图7），田间极易辨认。鉴于管氏肿腿蜂（Scleroderma guani Xiao et Wu）对钻蛀性害虫有较强的需找和寄生能力，被广泛用于森林、园林、经济作物和药用植物等钻蛀性害虫的防治上[4-5]。此外，笔者还初步试验了肿腿蜂对桃蛀螟幼虫的寄生能力，经室内寄生试验发现该虫吐丝拉网的习性对肿腿蜂构成很大的阻碍，而且蛀道内较潮湿，寄生蜂活动能力减弱，寄生效果不理想，田间不宜采用该蜂进行人工释放防治桃蛀螟。[FL）]

[FK（W][TN5tif][FK）]

[FL（2K2]3讨论与结论

本研究明确了严重危害广西省道地药材——广西莪术的蛀茎害虫为桃蛀螟；广西莪术、红球姜等姜科植物为首次报道的桃蛀螟新记录寄主；并掌握了该虫在广西莪术等姜科植物上的危害特性及生活史，该虫在广西一年发生5代，各虫态在不同世代的发育历期不同。尽管国内对桃蛀螟形态特征、发生危害特点以及防治措施等进行过报道[6]，但对形态识别特征报道较为简单，且缺乏对各世代各不同虫态发育历期、成虫羽化节律等方面的系统报道。本研究得到的这些生物学参数结合田间发生规律，不仅对明确桃蛀螟田间种群增长机制具有重要意义，而且为科学制定其预测预报技术、防控技术奠定一定的理论基础。此外，桃蛀螟的发生危害与环境之间的关系及其机理等生态学、生理学方面的研究尚属空白，还有待进一步研究。

桃蛀螟是杂食性昆虫，已知桃蛀螟的寄主植物有00余种[7]，[2]经田间调查发现，桃蛀螟危害姜科植物也多达24种，但严重程度不一，且对红球姜有特别的嗜性，驱性强。可见，桃蛀螟虽然是杂食性昆虫，但对姜科植物寄主还是有较强的选择性。笔者曾试验将健康的红球姜种植到姜园 km以外的科研基地，危害率还高达85%，可见红球姜中可能含有某种挥发性气味吸引桃蛀螟成虫产卵，因此，破译红球姜植物中能吸引桃蛀螟的化学活性物质，制成诱芯进行野外监测和防治，是有待深入研究的内容，也是近年来国内外此研究领域的热点。

桃蛀螟是一种重要的农业害虫，但有关桃蛀螟天敌的研究报道甚少，已知的天敌有：绒茧蜂（Apanteles sp）、廣大腿小蜂[Brachymeria lasus （Walker）]、抱缘姬蜂（Temelucha sp），还有黄眶离缘姬蜂[Trathala flavororbitalis （Cameron）]等寄生蜂类；捕食性天敌有蜘蛛类，如奇氏猫蛛（Oxyopes chittrae），但对天敌的寄生能力及应用等方面的研究报道较少，绒茧蜂、广大腿小蜂、抱缘姬蜂自然寄生率仅为294%～8698%[6，8]。本研究发现了桃蛀螟的2种优势天敌：螟螟黑点瘤姬蜂、巨首蚁，均为首次报道，但巨首蚁目前只鉴定到属，鉴于该蚁具有较强捕食能力，将进一步开展巨首蚁的种类鉴定及田间应用技术研究工作，以更好发挥其生物防治的潜力和优势。

[HS2][HT85H]参考文献：[HT8SS][H85mm]

[ZK（#]国家药典委员会 中华人民共和国药典：一部[M] 北京：中国医药科技出版社，200：93

[2]黄其林，田立新，杨莲芳 农业昆虫鉴定[M] 上海：上海科学技术出版社，984：7-87

[3]潘体常，戴蕃瑨 中国姜科植物地理分布初探 渝州大学学报：自然科学版，992（3）：26-33

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[5]蒋妮，缪剑华，谢保令 管氏硬皮肿腿蜂防治广西罗汉果愈斑瓜天牛研究 植物保护，2006，32（3）：29-32

[6]鹿金秋，王振营，何康来，等 桃蛀螟研究的历史、现状与展望 植物保护，200，36（2）：3-38

[7]王振营，何康来，石洁，等 桃蛀螟在玉米上危害加重原因与控制对策 植物保护，2006，32（2）：67-69

[8]黄玉清，张晓俊，魏辉，等 桃蛀螟及其天敌的初步研究 江西农业大学学报，2000，22（4）：523-525

孔雀嗉囊毛细线虫的分子鉴定 篇7

本项试验拟进一步深入研究形态学所不能解决的问题, 欲通过分子生物学技术鉴定孔雀嗉囊内的毛细属线虫, 以期能确定到种。这是首次在云南采用分子生物学的方法对孔雀寄生虫的种属关系进行鉴定。对保护世界濒危物种及鉴定寄生虫的种类来丰富虫种资源有重要的意义。也为今后孔雀体内线虫的分类、鉴别诊断、分子流行病学调查以及本病的防治等更深入的研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

虫体样品:由昆明市圆通山动物园提供。

主要试剂:购买于北京百泰克生物技术有限公司。

1.2 方法

1) 虫体的分离及处理。将园内发病死亡的1只成年孔雀, 用寄生虫学完全解剖法获取寄生于孔雀嗉囊内的线虫, 将洗净的虫体转移到新的离心管中用75%乙醇保存备用。

用镊子将保存在75%乙醇溶液中的虫体材料取出, 用双蒸水反复吹打冲洗2~3次后, 置于一新的1.5 m L的离心管中。

2) 虫体DNA的提取。虫体DNA提取按细胞/组织基因组DNA提取试剂盒使用说明进行。

3) 虫体DNA的PCR扩增。扩增体系中各试剂的量分别是dd H2O 10.75μL, 10×PCR buffer 3.0μL, Mg Cl2 (25 mmol/L) 4.0μL, d NTPs (2.5 mmol/L each) 3.0μL, Forward primer (50 pmol/μL) 0.5μL, Reverse primer (50 pmol/μL) 0.5μL, r Tap (5 U/μL) 0.25μL, 模板 (g DNA) 3.0μL, 共计25μL。混匀然后于PCR扩增仪中按已设好PCR扩增条件进行扩增。

PCR扩增条件:94℃预变性5 min, 94℃变性30 s, 55℃退火30 s, 72℃延伸30 s, 共30个循环, 最后72℃延伸5 min。

扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳, 于紫外透射仪上观察结果, 并拍照记录。

4) 引物的设计。依据Bowles文献[10]设计1对引物, 扩增了从孔雀嗉囊内分离的线虫线粒体DNA (mt DNA) 细胞色素C氧化酶第1亚基 (COX1) , 由上海生物工程技术有限公司产品合成。

JB3 (5′-TTTTTTGGGGATCCTGAGGTTTAT-3′)

JB4.5 (5′-TAAAGAAAGAACATAATGAAAATG-3′)

2 结果与分析

2.1 测序结果

电泳后, 通过线性DNA条带的相对位置可初步估计样品的分子量大约为450 bp左右, 如图1所示。

序列碱基数共计417个bp:

CCAATCATGATCTCGCATTTGGTGCAGTTTCT GAGCTTTGATAAATATTTCAGGAAAGTTTAAAGTA TTTGGCCCATTAGGAATAATCTATGCTATAATAAG AATCGGCTTATTAGGCTGTTTTGTTTGAGGTCATCA TATATATACTGTAGGAATAGACGTGGACACACGA GCATATTTTACTGCTGCTACTATGATCATTGGAGTC CCTACTGGAGTAAAAGTATTTAGCTGAATGGCTAC TATATACGGAACTTCCACTAAATCTTCACCTCTTTT ACTATGAACTTTAGGATTTATTTCATTATTTACAAT TGGAGGTCTAACCGGAATTTCTCTCTCTAATGCTT CTTTAGATCTTCTACTTCATGATACATACTACGTAG TAGGTCATTTTCATTATGTTCTTTCTTTAAA

注:1代表孔雀线虫, 2和3分别代表宿主和阴性对照, M代表DNAmarker。

测序结果与预期的一致, 将上述测序结果上传到网上进行Blast分析, 结果显示该线虫与澳大利亚袋鼠体内的毛细线虫有77.3%的同源性, 因此确认该线虫为毛细线虫。

2.2 COX1序列的分析与比较

测序后去掉引物, 找到COX1序列的头尾, 结果发现孔雀毛细线虫样品的COX1序列的长度为417 bp, 而澳大利亚袋鼠毛细线虫COX1序列 (Gen Bank注册号AJ288162.1) 的长度为374 bp。

将该线虫的COX1序列与网上公布的澳大利亚袋鼠毛细线虫COX1序列用DNA Star软件进行比较相似百分比分析 (图2~3) 可知, 其COX1相似性为77.3%, 序列差异较明显 (图4) 。发现孔雀毛细线虫单独形成一个分支, 说明孔雀毛细线虫不同于袋鼠毛细线虫, 他们存在着地域及遗传背景的差异。也说明了孔雀毛细线虫COX1序列存在种的特异性, 可作为鉴别孔雀毛细线虫与相似种的有效遗传标记。

注:Austrian澳大利亚袋鼠的毛细线虫;Peacock为样品。

注:A为澳大利亚袋鼠毛细线虫COX1序列;K为孔雀毛细线虫样品COX1序列;“·”表示与A位置的碱基相同;“-”表示与A位置缺失1个碱基。

3 结论

野生动物寄生虫研究较少, 很多寄生虫严重威胁着我国珍贵野生动物。将该线虫的COX1序列与Gen Bank公布的澳大利亚袋鼠的毛细线虫的COX1比较分析, 相似性为77.3%。说明孔雀毛细线虫与袋鼠毛细线虫具有遗传背景差异, 也说明孔雀毛细线虫COX1序列存在种的特异性, 可作为鉴别孔雀毛细线虫与相似种的有效遗传标记。但对野生动物寄生虫的研究远远还不够, 需要投入更多的人力和物力来填补这方面的空白[2,3,4,5,6,8]。

近年来线粒体DNA已被广泛用作多态性研究的重要遗传标记, 结合PCR扩增及其他方法已成功地应用于多种寄生虫的分子鉴定和分类, 通过其序列的变化可反映生物种群内和群体间的遗传变异, 且mt DNA特别适用于相似种和亚种的鉴定[7,8]。

参考文献

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分子生物学鉴定 篇8

关键词：双生病毒,稀莶,DNA-A,DNAβ,分子鉴定

1 引言

粉虱传双生病毒(Whitefly transmitted geminivirus, WTG)是一类广泛发生在热带、亚热带地区植物上的具有孪生颗粒形态的单链DNA病毒。在分类上属双生病毒科(Geminiviridae)的菜豆金色花叶病毒属(Begomovirus)。该属的大多数病毒是双组份双生病毒,其基因组为两条长度相似(每条约2.8kb)的闭合环状ssDNA分子,分别为DNA-A和DNA-B。少数病毒为单组分双生病毒,仅有一个DNA-A组分[1]。目前,在亚洲和非洲等许多国家的单组份begomoviruses上发现了伴随有DNAβ的病害复合体。DNAβ对于begomoviruses诱导典型症状是必需的,并可能在决定病毒寄主范围中起重要作用,为病毒适应更多的寄主提供了机会[2,3,4,5]。我国自1982年报道[6]发现双生病毒以来,在云南、海南、广西、和广东等18省区的番茄、番木瓜、烟草和番薯等已相继发现多种双生病毒[7,8,9,10,11]。双生病毒在我国的危害日益严重,随着全球气候变暖、农业生态环境变化、烟粉虱赖以越冬的地域不断北移以及交通、旅游、农产品贸易全球化等因素,我国双生病毒发生地区不断北移,并给生产上造成较大的损失[12]。本文对从福建漳州稀莶(Siegesbeckia orientalis)上采集到具典型双生病毒症状的样品进行了分子检测,并对序列进行了分析。

2 实验方法

2.1 植物样品

2012年2月,在福建漳州地区采集到表现双生病毒的典型黄脉症状稀莶样品。

2.2 DNA提取及PCR扩增

利用CTAB法提取的稀莶病样总DNA作为模板[13]。利用引物PA/PB[11] (TAATATTACCKGWKGVCCSC/TGGACYTTRCAWGGBCCGCACA)扩增双生病毒基因组DNA-A的部分序列,根据测出的序列设计引物FJ12F/R(ACAGAATGTACAAAAGCCCTGA/ATCTGCTGGTCGCTTC GACAT)扩增近全长的DNA-A,扩增的PCR产物克隆至pMD-18T Vector,测序。利用通用引物PCRC1/PBL1V 2040[14](CTAGCTGCAGCATATTTACRARWATGCC/ACCTCTGCAGCARTGRTCCKATYTTCATAC)扩增双生病毒DNA-B组分。利用通用引物Beta01/02(GTAGGTACCACTACGCTACGCAGCAGCC/AGTGGTACCTACCCTCCC AGGGGTACAC) [15]扩增双生病毒伴随卫星DNAβ分子。利用通用引物DNA101/102(GTAGGTACCACTACGCTACGCAGCAGCC/AGTGGTACCTACCCTCCCAGGGGTAC AC) [16]扩增双生病毒伴随卫星DNA1分子。

2.3 序列分析

序列测定由上海生物工程有限公司完成。数据处理借助DNAStar软件(DNASTAR Inc., Madison, USA)和DNAMAN Version 6.0(Lynnon Biosoft, Quebe Canad)进行。利用BLAST程序在GeneBank数据库中寻找与DNA-A和DNAβ序列最相近的基因组序列。采用DNAStar分析软件(Madison, Wis., U.S.A)中ClustalV方法对DNA-A和DNAβ序列的核苷酸或者氨基酸的相似性进行分析。采用Mega4.0临近法绘制亲缘关系树,设置种子重复数是1000 [17]。

3 实验结果与分析

3.1 病毒基因组DNA-A的分子特征

FJ12 DNA-A全长2770nts,具有典型的双生病毒基因组结构,即编码6个开放读码框架(ORFs),其中病毒链编码AV1(CP)和AV2两个ORFs,互补链编码AC1(Rep)、AC2、AC3和AC4共4个ORFs。DNA-A还含有一个较长的非编码区,又称基因间隔区(Intergenic Region, IR),并含有保守序列TAATATTAC及TATA盒(核苷酸2672-2675位),还有重复序列GGTGTC(核苷酸2625-2631位,重复于核苷酸2654-2659位和2661-2666位,反方向重复于核苷酸2654-2659位2680-2685),该重复序列是复制酶蛋白的结合位点。

从全基因组看,相似性与稀莶黄脉病毒的同源性最高,为95.7%,其次与中国番木瓜曲叶病毒PaLCuCNV的相似性较高,为76.8%。而FJ12 IR除了与稀莶黄脉病毒的同源性最高为86.8%外,与其它begomoviruses的相似性都很低,只有39.9%～58.6%。对编码的蛋白序列进行比较时,FJ12编码的6个基因都与SbYVV的同源性最高,其中AV1为96.6%,AV2为95.3%,AC1为97.3%,AC2为91.2%,AC3为94.0%;AC4为93.8%(表1)。

为了进一步明确这FJ12分离物与其它病毒的系统亲缘关系,笔者构建了基于DNA-A核苷酸序列的系统关系树(图1A)。从图上可看出,与序列比较的结果相似,FJ12在系统树上与SbYVV聚类在一起,稀莶黄脉病毒进化关系相对其它begomoviruses较近。

根据双生病毒科分类标准,即病毒全基因组核苷酸序列同源性小于89%,往往定名为不同病毒,大于89%,则认为是同一病毒的不同株系[1]。以上分析结果表明:FJ12 DNA-A是稀莶黄脉病毒在福建的一个新的分离物。

3.2 卫星DNAβ分子的分子特征

利用特异性引物beta01/beta02扩增到约1300 bp的片段,经测序后发现是DNAβ分子(FJ12β)。FJ12β全长为1331 nts,具有典型的伴随卫星分子的基因组结构:含有一个保守的ORF,是编码116个氨基酸的βCl基因;含有一个保守的SCR区,并在SCR的3’端具有九核苷酸TAATATT/AC;一个富含腺嘌呤A的区域(A-rich region),序列的位置在717～979nts,其中A含量达到51.0～52.5%,A的重复数最高为7个。

序列比较分析结果显示,FJ12β与已知的卫星分子的同源性都很低,只有30.6%～70.2%。其中,FJ12β与SbYVV DNAβ相似性最高,为70.2%。βCl相似性也与SbYVV DNAβ最高,为92.2%,其余都在25.0%～44.8%之间。SCR是DNAβ分子中最保守的区域,其相似性为74.8%～97.0%,其中与SbYVV DNAβ最高,为97.0%。这说明稀莶样品中的DNAβ分子确实可以用保守的SCR区作为探针检测到,但它是一类全新的DNAβ分子,伴随于稀莶样品中发现的DNA-A (表2)。

为了进一步明确这FJ12β与其它卫星分子的系统亲缘关系,构建了基于DNAβ核苷酸序列的系统关系树(图B)。从图上可看出,与序列比较的结果相似,FJ12在系统树上与SbYVV聚类在一起成一个小分支,与稀莶黄脉病毒进化关系相对其它begomoviruses较近。

根据双生病毒科卫星分子分类标准,即病毒卫星分子全基因组核苷酸序列同源性小于78%,往往定名为不同病毒,大于78%,则认为是同一病毒卫星的不同株系[18]。以上分析结果表明,FJ12 DNAβ是双生病毒伴随卫星的一个新种,建议命名为福建稀莶黄脉病毒伴随卫星分子。

4 结语

(1)FJ12稀莶样品都由双生病毒侵染,该病毒是单组份双生病毒,基因组由一个DNA-A组分(FJ12DNA-A及其伴随卫星DNAβ分子(FJ12DNAβ)组成。不含有DNA-B和DNA-1组分;

(2)FJ12 DNA-A全基因组的核苷酸序列与稀莶黄脉病毒的同源性最高,为95.7%。根据双生病毒分类标准,说明FJ12稀莶样品上的双生病毒为稀莶黄脉病毒在福建的一个新的分离物。

(3)FJ12DNAβ分子全基因组的核苷酸序列与稀莶黄脉病毒伴随卫星的同源性最高,为70.2%。根据双生病毒伴随卫星的分类标准,说明FJ12DNAβ是一个新型的卫星分子,我们推荐将其命名为福建稀稀莶黄脉病毒伴随卫星分子。

分子生物学鉴定 篇9

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料:

从事故发生地点收集到蘑菇残块,编号CSUFT200705X。

1.1.2 试剂:

基因组DNA提取试剂盒,天根生化科技(北京)有限公司。

1.1.3 仪器:

离心机(Eppendorf),PCR仪(ABI公司),电泳仪(北京六一),凝胶成像仪(上海天能)。

1.2 方法

1.2.1 蘑菇样品总DNA的提取:

采用试剂盒。

1.2.2 DNA抽提、ITS区扩增及产物检测

转录间隔区(Internal Transcribed Spacers ITS)扩增采用真菌通用引物ITS1、ITS4(由上海生工生物工程有限公司合成)。PCR反应体系(25μl):10×缓冲液2.5μL,dNTP(各2.5mmol/L)1μL,引物各1μL,Taq酶(5u/μL)0.25μL,模板DNA稀释50倍后取2μL(对照组加双蒸水,其它条件同),ddH2O 18.25μL。PCR反应条件:95℃变性5min;95℃变性30s,56℃退火30s,72℃延伸1min,共35个循环;72℃延伸10min;取4μL PCR产物,1%琼脂糖凝胶电泳,EB染色,凝胶成像系统检测[1]。

1.2.3 PCR产物测序

将PCR扩增产物纯化后直接送上海生工生物工程技术服务有限公司做正反双向测序,保证测序正确率。

1.2.4 分子系统发育树构建

将测得的序列和从GenBank中搜索到的相似序列,经Clustal X 1.8软件对位排列,并辅以人工校对。ITS1和ITS2的起止范围参照GenBank中Amanita属真菌的ITS范围确定。系统发育分析采用MEGA4中的邻近相邻法(NJ)分析,各分支的置信度经bootstrap法1 000次循环检验各分支的系统学意义与可靠性。

2 结果与分析

2.1 PCR产物电泳检测

蘑菇样品核糖体DNA 转录间隔区(ITS区)PCR扩增产物电泳结果见图1(泳道M为Marker)。从图1中可以看出泳道2有一条清晰的扩增条带,且无杂带出现;泳道1为对照组,无特异性扩增条带出现;说明ITS区扩增产物质量较高,可用于下一步直接测序。

2.2 rDNA ITS区段测序结果

测序所用测序仪器为ABI PRISM 3730,测序试剂为BigDye terminator v3.1。CSUFT200705X的rDNA ITS区段(含5.8S区)长度为593bp,其中ITS1长207 bp、5.8S长161bp、ITS2长225bp,序列如图2所示。

2.3 菌株ITS序列BLASTN搜索

把所测CSUFT200705X菌株ITS区序列在GenBank核酸序列数据库中进行BLASTN搜索,得到一系列同源性较高的同属不同种的ITS序列,其中与GenBank接收号为EF411081的Amanita phalloides菌ITS区同源性最高,593个碱基中仅有3个碱基的差异,序列相似性大于99%,见图3。根据Renske L等[2]认为真菌通过ITS区域比对,序列相似性≥99%,鉴别为相同种;序列相似性大于95%且小于99%,鉴别为相同属;序列相似性≤95%,鉴别为相同科。可初步确定CSUFT200705X菌株应该就是Amanita phalloide,即条纹毒鹅膏菌。

2.4 分子系统发育树的构建

所测序列在GenBank中Blast收索后,得到同源性较高菌株的ITS序列,它们都是Amanita属种,下载具有代表性菌株序列与本实验所测CSUFT200705X的ITS序列利用Clustal X软件将序列匹配排列后,以Tricholoma magnivelare作为外类群,用MEGA4软件采用邻近相邻法构建系统发育树(bootstrap值大于50%被显示),树枝下方数值为bootstrap值,结果见图4(图中A.为Amanita缩写)。

Taylor John W等[3]概述的用PSR(Phylogenetic Species Recognition来作为鉴定种的标准。从NJ系统树可看出,基于ITS序列,同种菌都以较高置信度聚为一支。CSUFT200705X以93%的置信度与三株Amanita phalloides聚为一支,基于系统树其它分支上物种的种内和种间遗传距离可以确定CSUFT200705X菌株就是条纹毒鹅膏菌(Amanita phalloide)。

3 讨论

条纹毒鹅膏菌(Amanita phalloides)又名毒伞、毒鹅膏、绿帽菌、蒜叶菌,是最著名的一种致死性菌类,约有90%～95%的蕈中毒死亡事件与之有关。这种蕈通常生长于夏末或秋季,菌体较大,能生长到20cm高。这种菌的菌盖颜色可由绿褐色到黄色。条纹毒鹅膏菌因为其尺寸大小与其他可食的蘑菇种类相似,因而经常被误食。中国的剧毒鹅膏物种资源是十分丰富的,在大江南北、长城内外的丘陵山地林下和高山森林中都有剧毒鹅膏分布,而且它们常与可食的鹅膏菌出现在同一环境中[4]。因此,在采撷此类野生食用菌时须格外小心,注意区分,最好不要采食鹅膏属真菌,避免意外中毒。

转录间隔区(ITS)在属种分类鉴定上应用十分广泛[5,6]。真核生物编码核糖体核酸的基因是一个串联的重复转录单位,约100～200拷贝,包括编码区和非编码区,分隔编码区18S、5.8S、28S rDNA亚单位ITS为非编码区,编码区序列相对保守,而ITS在两代之间进化很快,常发生变异,在同一属种间甚或种内可有不同程度的差异,所以 rDNA ITS序列具有种水平上的分类鉴定意义[7]。同时,通过构建系统发育树结合形态学鉴定菌种是目前最好的鉴定方法[8,9,10]。

摘要：目的:对一起中毒事故的蘑菇进行分子鉴定。方法:测定菌株核糖体DNA的转录间隔区序列。结果:该序列与Gen-Bank中已有的序列进行比较,得到一系列同源性较高的序列。其中与接受号为EF411081的Amanita phalloides同源性最高,达到99%以上;利用所得序列构建分子系统发育树,发现所测定的序列以较高的置信度与Amanita phalloides聚为一支。结论:确定引起中毒事故的蘑菇为毒性较高的Amanita phalloide,即条纹毒鹅膏菌。

关键词：毒蘑菇,ITS,分子鉴定

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分子生物学鉴定 篇10

真菌核糖体基因转录间隔区 (internal transcribed spacer, 简称ITS) , 又叫内转录间隔区, 是位于真菌核糖体DNA上18 s和28 s基因之间的区域片段, 其两侧分别是18 s RNA基因和28 s RNA基因[2], 它的长度一般为650~750 bp。自White设首个ITS引物以来[3,4], ITS序列分析技术在真菌分类和鉴定的研究中应用越来越广泛。Amicucci et al[5]分析了块菌属真菌ITS区段的DNA序列, 设计出块菌的特异性引物, 该特异性引物能对块菌属真菌的ITS区段进行专一性扩增。利用该引物对与块菌形态相似的未知菌株进行扩增, 通过扩增结果, 可以推断出菌株的确切种类[6]。

该研究将传统的形态学鉴定与现代分子生物学技术相结合, 通过对一种野生大型真菌的菌丝、孢子、子实体等形态特征鉴定, 结合它的ITS序列分析初步弄清该菌株在分类学中的地位, 为进一步的深入研究奠定了良好基础。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试菌株系笔者于2006年6月2日在福建农林大学金山校区的竹林内采集 (图1) , 通过组织分离并驯化后的菌株, 子实体经福建省医科所动物实验室完成其急性和慢性毒性试验, 证明其无毒可以食用。

1.2 菌丝形态观察

将配制好的PDA培养基分装于三角瓶中, 120℃, 0.13k Pa, 灭菌25 min后待其冷却后倒入灭菌的平皿中备用。在无菌条件下将活化好的菌种接入已制备好的PDA平板中, 然后轻轻用镊子在平板内与平板成45°插入3~4片在酒精灯火焰上灭菌的盖玻片, 平皿封口后置于28℃的恒温箱中培养。3~4 d后将盖玻片取出, 分别进行菌丝宏观观察和微观观察。

1.3 子实体、孢子及单菌落形态观察

选取适当的草粉培养基混匀后调整含水量至60%, 常压灭菌12 h, 菌袋冷却至室温后, 在无菌条件下接种, 在28℃培养室中培养, 待菌丝充满整个菌袋, 脱袋、覆土厚2~3cm, 整齐地排放在树林里的畦上进行出菇管理。当子实体高度达到15~25 cm时可以进行采收, 采收后观察子实体形态 (菌盖、菌褶、菌柄等) , 然后选择朵形完整、盖厚、无腐烂、无病虫害、成熟度适度的子实体用无菌水冲洗数遍后, 再用滤纸吸干表面水分;在无菌条件下, 用铁线固定, 放在培养皿上或挂在玻璃漏斗下, 菌褶朝下, 然后用有孔钟形玻璃罩培养皿上或用玻璃漏斗盖在盛有培养基的培养皿上, 该装置在25℃的温度下保持12~20 h, 待孢子印形成, 进行孢子收集[7,8], 分别用40×16倍、100×16倍显微镜观察孢子形态, 并挑取单个孢子于含PDA培养基的平板上, 置于28℃恒温培养3~4d, 从而获得该菌株单菌落形态。

1.4 ITS序列测定

样品DNA的提取方法参照改进的CTAB方法进行[9]。PCR扩增反应在美国应用生态系统公司的2720型PCR扩增仪上进行, 反应体系为25μL, 内含双链DNA模板 (约15ng) , Mg Cl2 (215 mmol/L) , d NTP (200μmol/L) , 正、反引物分别为ITS1:5′-TCCGT AGGTG AACCT GCGG-3′和ITS4:5′-TCCTC CGCTT ATTGA TATGC-3′2μmol/L, 由上海英俊生物技术有限公司合成, Taq DNA聚合酶 (1U) , 10×PCR Buffer (100 mmol/L Tris-HCl p H值8.3, 500 mmol/L KCl) 均为Takara公司的产品。扩增反应程序:95℃预变性5 min, 95℃变性1min, 55℃退火1 min, 72℃延伸90 s, 循环35次;72℃延伸7 min, 4℃条件下保存。扩增得到核糖体DNA的ITS片段 (包括ITS1, 5.8 Sr DNA和ITS2) 。PCR产物用QIAGEN公司的PCR纯化试剂盒进行纯化, 用OMEGA公司的凝胶回收试剂盒回收, 测序工作由上海博尚生物技术有限公司完成。

2 结果与分析

2.1 供试菌株菌丝体形态特征

供试菌株菌丝为淡黄略带白色, 呈绒毛状, 不致密, 爬壁力较弱。在40×16倍和100×16倍的显微镜下观察发现, 菌丝有隔膜 (图2 a) , 有锁状联合现象 (图2 b) 。

2.2 供试菌株单菌落形态

供试菌株的菌丝为乳白色, 边缘规则, 略成半球状突起。单菌落菌丝不太致密, 白且细, 呈放射状向外扩张, 边缘规则 (图3) 。

2.3 ITS序列测定

用CTAB法提取供试菌株菌丝体中的基因组DNA, 进行体外扩增, 2条引物分别ITS1 (TCCGTAGGTGAACCTGCGC) , ITS4 (TCCTCCGCTTATTGATATGC) , 所得ITS序列产物片段大小在500~750 bp (图4) 。

将供试菌株的ITS序列进行TA克隆并转化, 挑取若干单克隆扩大培养后送样测序, 结果扩增的目的片段为565 bp, GC含量为41.24%, 其中带框部分的为5.8 s RNA序列 (图5) 。

注:M:Marker;1、2均为供试菌株。

将测序后的结果在EMBL上进行比对, 发现供试菌株与金福菇 (Tricholoma giganteum, 登陆号EU051917) 的物种同源性最高, 由序列比对结果可知 (图6) , 结合传统的形态特征鉴定结果, 发现这株未知菌株与口蘑属亲缘关系较近, 对得到的ITS序列进行进一步分析 (表1) 。发现此结果与传统的系统分类学结果一致, 最后笔者将该供试菌株经初步鉴定属无隔担子菌亚纲 (Homobasidiomycetidae) 伞菌目 (Agaricales) 口蘑科 (Tricholomataceae) 口蘑属 (Tricholoma) , 暂命名为金山巨菇 (Tricholoma sp.) 。

3 讨论

形态学特征的传统分类法优势主要表现为形态特征不仅易于观察和比较, 而且由于是多基因同时决定, 具有相对的稳定性。但传统形态学分类方法也存在许多不足之处, 无管是从宏观形态特征进行描述, 还是从微观结构进行描述, 由于外界的环境条件、表型的可塑性和基因变异等原因, 尤其是地域分隔的原因, 造成了食用菌种内的形态多样性较高的现象, 这就使得菌物分类学家对它们的种和亲缘种的鉴定存在分歧, 难以统一。而当遇到形态学方法已不能有效区分的疑难种的时候, 就可以引入分子生物学技术作为它们的重要补充, 为之提供更多有效的分类信息。现代分类学研究的趋势将以形态学研究为基础, 结合分子生物学技术、生物化学、生态学等方法进行综合分类研究, 使其在解释系统发育、生物进化和生物亲缘关系上可以使用更多信息, 研究结果更趋于自然。

该研究将传统的形态学鉴定方法与现代分子生物学技术相结合, 真实反映物种间的差别。核糖体r DNA基因转录内部间隔区 (ITS) 序列分析可以应用于属下种间及亚种水平的鉴别, 研究具有可行性, 通过对菌株系统发育树的绘制。因此, 菌株的分类地位也更加清晰, 可为菌株命名提供理论基础。

参考文献

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分子生物学鉴定 篇11

关键词 香草兰 ；芽孢杆菌 ；16S rDNA 鉴定 ；脂肽类化合物

分类号 S435.73 Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2016.01.009

Abstract Ten bio-control Bacillus strains were selected via dual culture method from the isolates obtained from vanilla rhizosphere of Wanning city and Qionghai city in Hainan province. The selected isolates were highly antagonistic against vanilla pathogens：Fusarium oxysporum，Phytophthora nicotianae and Erwinia carotovora. Seven B. amyloliquefaciens strains， two B. subtils strains and one B. methylotrophicus strain were identified by the assays of 16S rDNA sequence and the phylogenefic tree. Lipopeptide compound analysis via dual culture method showed that all 10 lipopeptide extractions from each bio-control strain exhibited highly antagonistic against F. oxysporum and P. nicotianae， while 4 lipopeptide extractions were highly antagonistic against E. carotovora. Lipopeptide compound analysis via MALDI-TOF/TOF -MS showed that strain VX2R11 produced Surfactin and IturinA，while strain VX2S02 produced Iturin A， suggesting that strainVX2R11and VX2S02 might via the production of IturinA to antagonize pathogens F. oxysporum and P. nicotianae， while strainVX2R11 might via the production of Surfactin to antagonize pathogen E. carotovora.

Keywords Vanilla fragrans ； Bacillus spp ； 16S rDNA sequence ； lipopeptide

香草兰[Vanilla fragrans（salisb.）Ames（V.planifolia）]是一种经济附加值极高的热带经济作物，素有“食品香料之王”的称誉。香草兰根（茎）腐病是一种危害极大的土传病害，其病原物是尖孢镰刀菌（Fusarium. oxysporum）[1]。镰刀菌土传病害是世界性防治难题，其化学防治成本高、风险大；而且香草兰栽培品种极其单一，没有抗性品种，目前对该病害严重缺乏简单有效的防治手段。近年来，香草兰根（茎）腐病已在我国香草兰种植区爆发流行，造成很多香草兰种植园荒废，严重阻碍了香草兰产业的发展[2]。同时，香草兰疫病和香草兰细菌性软腐病也是香草兰上重要病害，其病原物分别为烟草疫霉（Phytophthora nicotianae）和胡萝卜欧文氏杆菌（Erwinia carotovora），每种病害每年给香草兰产业造成约15%～30%的损失，也是香草兰生产上的重要问题。

生物防治技术日益兴起，其防治谱广和对环境友好的特点使其成为当前的研究热点之一。目前，国内外已经开始利用生防菌防治香草兰病害的探索。Ramalingam等[3]发现荧光假单胞（Fluorescent pseudomonads）等生防菌株在温室和田间均能够显著降低香草兰根（茎）腐病的严重度。Radjacommarea等[4]发现17株木霉（Trichodema）对包括香草兰根（茎）腐病菌有抑制活性，其中2株木霉菌与荧光假单胞菌和壳多糖相结合获得了良好的大田防病效果。曾会才等[5]发现枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）OBS-2菌株在盆栽和大田试验上对香草兰根（茎）腐病和香草兰疫病具有良好的防治效果。李霞等[6]在对搜集到的9株木霉、枯草芽孢杆菌和荧光假单孢菌进行了平板抑制活性分析。

迄今为止，国内外对香草兰生防菌筛选和应用的报道极少，对香草兰疫病和香草兰细菌性软腐病的报道几乎空白。已报道的生防菌株也多为分离自其他作物的外源菌株，鲜有来自香草兰生境的天然生防菌。这些香草兰生防菌的生防机制也尚未见报道。本研究以香草兰上主要病害香草兰根（茎）腐病、香草兰疫病和香草兰软腐病菌为靶标，对香草兰根际生防细菌开展了筛选、鉴定及作用机理分析等工作，为进一步研究香草兰重要病害的绿色高效防控提供基础。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 培养基

本研究中平板对峙培养所用培养基为马铃薯葡萄糖琼脂培养基（Potato Dextrose Agar，PDA），细菌培养所用培养基为Luria-Bertani（LB）培养基；生防菌发酵所用培养基为Landy培养基[7]。

1.1.2 菌株

本研究所用3种病原菌香草兰根（茎）腐病菌、香草兰疫病菌和香草兰细菌性软腐病菌均来自中国热带农业科学院香料饮料研究所。

1.1.3 试剂和引物合成

本研究基因组的提取和PCR扩增均使用天根生化科技（北京）有限公司“快速DNA提取扩增套装”试剂盒完成；PCR片段纯化均采用天根生化科技（北京）有限公司“琼脂糖凝胶回收试剂盒”完成；PCR引物的合成均在深圳华大基因科技服务有限公司完成；其他试剂如氯化钠、磷酸二氢钾、七水硫酸镁、氯化钾、L-苯丙氨酸、硫酸锰、五水硫酸铜、七水硫酸亚铁等均为分析纯。PCR所用引物为细菌16S rDNA通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-GGYTACCTTGTTACGACTT- 3′）[7]。

1.2 方法

1.2.1 生防菌筛选

采用平板对峙培养法进行生防菌筛选。将香草兰根（茎）腐病和香草兰疫病的病原菌在PDA平板上活化后打成直径0.5 cm的圆形菌丝块，然后将菌丝块接种在新平板中央并在四周接种活化后的香草兰根际细菌。将浓度为109 cfu/mL的香草兰细菌性软腐病菌以2%比例加入到冷却至约50℃的PDA培养基中，摇匀后倒平板；然后将浓度为109 cfu/mL的香草兰根际细菌液5 μL接种在含菌平板上。所有平板均放置在28℃恒温培养箱中培养，5～7 d后测量抑菌圈直径。

1.2.2 生防菌16S rDNA序列分析鉴定

生防菌提取基因组DNA后，采用细菌16S rDNA通用引物进行16S序列扩增[7]。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分离后通过紫外凝胶成像仪检测并切胶回收，回收产物送到深圳华大基因科技服务有限公司测序。测序结果在NCBI网站的基本局部比对搜索工具（The Basic Local Alignment Search Tool， BLAST）进行序列比对分析。

将本研究获得的生防菌16S rDNA序列上传到GenBank，下载近源菌株的16S rDNA序列用于系统发育树的构建。用Clustal X 2.1和MEGA6.06软件进行系统发育树构建[7]。

1.2.3 脂肽类化合物分析

将待测菌株接种在LB培养基中200 r/min 37℃条件下培养12 h；然后以3%比例转接入50 mL landy培养基，在200 r/min 30℃条件下发酵40 h；用酸沉淀法[8]提取脂肽类化合物，粗提物浓缩至3 mL后经0.22 μm孔径滤膜过滤后备用。采用平板对峙培养法检测各菌株脂肽类粗提物的抑菌活性，方法见本研究“1.2.1生防菌筛选”，仅将“接种生防菌”更换为“滴加10 μL脂肽类粗提物”。通过AB SCIEX 5800 MALDI-TOF/TOF-MS仪器进行飞行时间质谱检测，根据质谱结果初步判断物质种类[9-10]。

2 结果与分析

2.1 生防菌筛选

通过平板对峙培养法从香草兰根际细菌中筛选到对香草兰根（茎）腐病菌、香草兰疫病菌和香草兰细菌性软腐病菌3种病原菌均有良好抑菌效果的菌株10株；对香草兰根（茎）腐病菌和香草兰疫病菌的抑菌圈平均直径均>15 mm，对香草兰细菌性软腐病菌的抑菌圈平均直径均>10 mm（图1、表1）。

2.2 香草兰根际生防菌鉴定

以生防菌DNA 为模板扩增 16S rDNA 片段，获得大小约 1.5 kb的 PCR片段，将测序结果在 NCBI 网站通过BLAST 软件与 GenBank 中己知序列进行比对分析。结果表明：GenBank 中与10株生防菌16S序列同源性最高的菌株均为芽孢杆菌属菌株；其中菌株VD18S15与甲基营养型芽孢杆菌 HB26的 16S rDNA 的序列同源性为 99%，菌株VD18R19和VX1R02与枯草芽孢杆菌 168的16S rDNA 的序列同源性均为100%，菌株VD18S27与解淀粉芽孢杆菌D15的 16S rDNA 的序列同源性为100%，菌株VD21R27和VX1S06与解淀粉芽孢杆菌 D12的 16S rDNA 的序列同源性均为100%，菌株VX2R11和VX2S02与解淀粉芽孢杆菌的 16S rDNA 序列同源性均为100%，菌株VX4S09和VX4S18与解淀粉芽孢杆菌 SQR-7的 16S rDNA 序列同源性均为100%。

以1株荧光假单胞菌株WCS365（登陆号：KP253039）为外群，以枯草芽孢杆菌168（登陆号：KP318826）、甲基营养型芽孢杆菌HB26（登陆号：KM659227）和解淀粉芽孢杆菌SQR-7（登陆号：KC888017）为参照，构建系统发育树（图2）。结果发现：10株生防菌被聚类为3个分支；其中菌株VX4S09、VX2S02、VX4S18、VD18S27、VD21R27、VX2R11、VX1S06与解淀粉芽孢杆菌SQR-7聚类在同一分支，菌株VD18S15与甲基营养型芽孢杆菌 HB26被聚类在相同分枝，菌株VD18R19和VX1R02与枯草芽孢杆菌168被聚类在同一分支。

2.3 脂肽类化合物分析

10株生防菌发酵后均能成功得到脂肽类粗提物。所有的脂肽类粗提物对病原真菌F. oxysporum VFO62和病原细菌P. nicotianae VPN01的抑菌圈平均直径均>15 mm，大部分粗提物的抑菌圈平均直径达20 mm以上（表1、图3）。说明脂肽类化合物在这10株生防芽孢杆菌的抑制真菌机制和抑制卵菌机制中均起重要作用。但是对病原细菌 E. carotovora VEC03的抑菌效果呈现两极分化，出现强烈抑菌和完全不抑菌两组（表1、图3）：VD18R19、VD18S15、VX1S06、VX2R11等4个菌株的抑菌圈平均直径均 >20 mm；其他6个菌株检测不到抑菌效果。该结果表明，脂肽类化合物在菌株VD18R19、VD18S15、VX1S06和VX2R11的抑制细菌机制中起重要作用；同时推测，其他6株生防菌可能产生其他种类的抑细菌物质。

从生防菌脂肽类粗提物中选取对真菌、卵菌和细菌均有良好抑制效果的VX2R11以及仅对真菌和卵菌抑制效果良好的VX2S02进行MALDI-TOF/TOF-MS检测。检测图谱显示（图4），菌株VX2R11在m/z值为1 030.631 0，1 044.621 9，1 058.660 9处有离子峰的出现，这3个离子峰对应于表面活性素的分子质量[9]； 在m/z值为1 065.534 1，1 079.546 6，

1 093.562 1，1 109.535 8处有离子峰的出现，这4个离子峰对应于伊枯草素A的分子质量[10]。菌株VX2S02在m/z值为1 065.504 0，1 079.515 4，

1 093.533 1，1 109.505 4处有离子峰的出现，这4个离子峰对应于伊枯草素A的分子质量[10]。MALDI-TOF/TOF-MS质谱分析结果表明，菌株 VX2R11 产生脂肽类化合物表面活性素和伊枯草素A，菌株 VX2S02 仅产伊枯草素A。

3 讨论与结论

香草兰通常种植于温暖、潮湿、荫蔽的环境中，该环境适于病原菌孳生，极易产生病害。本研究从香草兰根际筛选生防菌，希望利用香草兰生境中天然的生防菌来抑制病原菌数量达到防病的目的。本研究以香草兰上3种重要的病害为靶标进行抑菌筛选，得到了广谱生防菌10株。经过16S rDNA序列鉴定和系统发育树分析，发现10株生防菌均为芽孢杆菌属菌株，包含解淀粉芽孢杆菌7株、枯草芽孢杆菌2株和甲基营养型芽孢杆菌1株。芽孢杆菌类生防菌广泛分布于各种自然环境中，容易进行人工培养，可以产生芽孢抵抗紫外线、干旱、高温、低温等逆境，耐贮藏和运输，使芽孢杆菌类生防菌在开发和应用上更具优势。

当前国内外对香草兰生防菌的研究多在应用层面，对其生防机制知之甚少。脂肽类化合物是芽孢杆菌产生的最主要的抑菌物质[11-14]，其分子量一般在900～2 000[15]。本研究通过生防菌脂肽类化合物分析来探讨其生防机制。采用酸沉淀法提取生防菌脂肽类化合物进行抑菌分析，结果发现，10株生防菌脂肽类粗提物对病原真菌和卵菌有良好的抑菌效果，4个菌株的脂肽类粗提物对病原细菌抑制效果良好。该结果说明，脂肽类化合物在生防菌抑制香草兰病原真菌、卵菌和细菌过程中起重要作用。

为了进一步分析香草兰生防菌的生防机制，本研究选出2个菌株，脂肽类粗提物对3种病原菌均有良好抑制活性的VX2R11菌株以及仅抑制2种病原菌的VX2S02菌株进行MALDI-TOF/TOF-MS检测，发现菌株 VX2R11产生表面活性素和伊枯草素A两种脂肽类化合物，菌株 VX2S02 仅产生伊枯草素A。前人研究表明，芽孢杆菌产生的脂肽类化合物中，表面活性素对细菌和病毒有良好的抑制活性[12，16]，伊枯草素A对真菌和卵菌具有强烈的抑制活性[14-15]，与本研究结果相符。由此推断，菌株VX2R11及VX2S02对香草兰根（茎）腐病菌和香草兰疫病菌的拮抗效果可能通过产生伊枯草素A实现；菌株VX2R11对香草兰细菌性软腐病菌的拮抗效果可能通过产生表面活性素实现；菌株VX2S02对病原细菌的拮抗效果可能来自于菌株产生的非脂肽类物质，其物质种类还有待于进一步研究。

本研究从拮抗物质的角度初步探讨了香草兰根际生防菌的生防机制。此外，还可能存在竞争、诱导寄主植物抗性等生防机制，需要更多的深入研究。虽然生防菌的应用目前尚不成熟，但是生防芽孢杆菌自身的天然、环境友好、易培养、耐贮藏、广谱等特性赋予其广阔的应用前景。

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分子生物学鉴定 篇12

据当地农民介绍, 近几年连续严重干旱, 造成食物和饮水短缺, 经常看到喜鹊和乌鸦像鹰一样捕捉农户的雏鸡吃。根据这一情况, 笔者会同当地的兽医部门进行联合临床诊断, 采集病料进行实验室诊断。由于当地兽医部门和一些村民采取有效的控制措施和消毒工作, 迅速控制了该疫病的传播和蔓延, 取得良好的效果, 现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料来源

2005年9月份, 从吉林省镇赉县某地临床诊断为因鸡新城疫病死的土种鸡以及当时死亡的喜鹊体内无菌采集脑组织、脾脏、肝脏等作为病料, 置于-70 ℃冰柜中保存。

1.1.2 血清与抗原

禽流感病毒 (H9和H5) 单因子标准阳性血清以及新城疫病毒、产蛋下降综合征病毒标准阳性血清, 产蛋下降综合征病毒和禽流感病毒诊断抗原, 均由长春军事兽医研究所王兴龙博士惠赠。新城疫病毒弱毒株La Sota, 吉林正业生物制品有限责任公司提供。

1.1.3 鸡胚及试验动物

10日龄SPF鸡胚和1日龄、6周龄SPF雏鸡, 吉林正业生物制品有限责任公司提供。

1.2 方法

1.2.1 病毒分离

将病死土种鸡和喜鹊的脾脏、脑组织用灭菌生理盐水分别制成1∶10的乳剂, 每毫升加入青霉素2 000 IU、链霉素2 000 IU, 置4 ℃冰箱中3 h, 然后6 000 r/min离心25 min, 用0.22 μm孔径的一次性细菌滤器过滤, 分别取滤液于尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚各5枚, 0.2 mL/胚, 培养120 h后分别收集死亡鸡胚和活胚尿囊液, 测定鸡胚尿囊液的HA效价, 如果分离培养的病毒血凝价低, 可连续传代3次。将从土种鸡体内分离的毒株命名为JLzhlj050901, 将从喜鹊分离的毒株命名为JLzhlx050902。

1.2.2 病毒鉴定

HI试验:将有血凝性的JLzhlj050901和JLzhlx050902病毒SPF鸡胚尿囊液用特异性新城疫病毒 (F48E9) 、禽流感病毒 (H9和H5) 、产蛋下降综合征病毒等单因子阳性血清进行HI交叉抑制试验做鉴别诊断, 同时设禽流感、新城疫、产蛋下降综合征等标准诊断抗原对照。

鸡胚ELD50的测定:将收获冻存的JLzhlj050901和JLzhlx050902病毒液用无菌生理盐水作10倍递进稀释, 每种待测毒株选定3个稀释度 (1×10-6、1×10-7、1×10-8) , 每个稀释度用0.22 μm孔径的一次性细菌滤器过滤后分别接种5枚10日龄SPF鸡胚, 0.2 mL/胚, 置37 ℃孵化箱中孵育, 每天照蛋2次, 弃去接种后24 h内死亡的鸡胚, 分别记录接种不同稀释度鸡胚的死亡情况, 连续观察120 h;死亡的鸡胚放入4 ℃冰箱过夜, 等量混合收集死胚尿囊液, 用1%鸡红细胞测定SPF鸡胚尿囊液的HA效价, 按Karber法计算。

病毒中和试验:分别将JLzhlj050901和JLzhlx050902 2株病毒液稀释至含1×105EID50/0.1 mL, 与等量新城疫病毒 (F48E9) 、禽流感病毒 (H9和H5) 、产蛋下降综合征病毒等病毒单因子阳性血清进行混合, 室温中和1 h, 每组接种SPF鸡胚10只, 0.2 mL/胚, 37 ℃继续孵化120 h。记录每组鸡胚的死亡情况, 死胚尿囊液等量混合, 活胚分别采集尿囊液作HA试验。

1.2.3 病毒生物学毒力的测定

按照参考文献[1, 2]的方法, 利用10日龄SPF鸡胚和1日龄、42日龄SPF鸡分别对JLzhlj050901和JLzhlx050902病毒进行最小致死量致死鸡胚的平均死亡时间 (MDT) 、1日龄雏鸡脑内致病指数 (ICPI) 和6周龄雏鸡静脉致病指数 (IVPI) 的测定 (在吉林正业生物制品有限责任公司强毒免疫舍进行) 。

2 结果

2.1 病毒分离结果

土种鸡和喜鹊病料处理物接种SPF鸡胚后, 鸡胚于24～48 h内死亡, 尿囊液透明清亮;胚体皮肤出血, 头颈部及四肢出血严重;其尿囊液对1%健康鸡红细胞有凝集作用, 接种土种鸡病料的鸡胚尿囊液的血凝价平均为8.55 lb, 接种喜鹊病料的鸡胚尿囊液的血凝价平均为7.13 lb。

2.2 病毒鉴定结果

2.2.1 HI试验结果

通过HA试验配制4HA50的JLzhlj050901和JLzhlx050902病毒液均与新城疫病毒单因子血清产生HI, 与禽流感病毒 (H9和H5) 、产蛋下降综合征病毒单因子血清无反应, 初步证实分离的2株病毒为新城疫病毒, 结果见表1。

2.2.2 鸡胚ELD50的测定结果

JLzhlj050901的ELD50为1×107.3, JLzhlx050902的ELD50为1×106.8。鸡胚在55 h以内死亡, 鸡胚尿囊液HA效价达到512×以上, 鸡胚全身出血严重。

2.2.3 病毒中和试验结果

JLzhlj050901和JLzhlx050902病毒完全被新城疫病毒 (F48E9) 单因子阳性血清抑制, 接种的SPF鸡胚分别是90%、100%健活, 胚尿囊液HA试验结果为阴性。JLzhlj050901和JLzhlx050902病毒完全不能被禽流感病毒 (H9和H5) 、产蛋下降综合征病毒单因子阳性血清抑制, 接种的SPF鸡胚分别是100%死亡, 死胚混合尿囊液HA试验结果阳性, HA效价均达到28以上。此中和试验结果充分证明分离的2株病毒是新城疫病毒。

2.3 病毒生物学毒力测定结果 (见表2)

JLzhlj050901株的MDT、ICPI和IVPI分别为49.8 h、1.98和2.87;JLzhlx050902株的MDT、ICPI和IVPI分别为53.3 h、1.83和2.74, 见表2。表明从种蛋分离到的2个毒株属速发型新城疫病毒强毒株。

动物回归试验结果表明, 2个分离株脑内和静脉接种的所有SPF鸡均在72 h内全部死亡。剖检出现典型的新城疫症状:气管、腺胃乳头、十二指肠、泄殖腔黏膜、盲肠扁桃体等严重出血, 鸡群发病症状与临床完全一致。

3 讨论

研究从临床诊断为新城疫发病死亡的土种鸡和死亡的喜鹊病料中分离到2株病毒, 具有HA特性, 且可被新城疫疫毒标准阳性血清所抑制和中和, 不能被禽流感病毒 (H9和H5) 标准阳性血清及产蛋下降综合征病毒阳性血清抑制, 确定2个病毒株为新城疫病毒。为确定分离株毒力的强弱, 对2个新城疫病毒分离株按照国际上规定的新城疫病毒毒力判定标准进行了MDT、ICPI和IVPI等项生物学特性测定, 结果表明:JLzhlj050901毒株的MDT、ICPI和IVPI分别为49.8 h、1.98和2.87, JLzhlx050902毒株的MDT、ICPI和IVPI分别为53.3 h、1.83和2.74。说明2个毒株的毒力属于速发型强毒株。从喜鹊体内分离新城疫病毒国内首次。从死亡的土种鸡和喜鹊病料中分离到新城疫病毒强毒, 可以判定喜鹊死亡是由死亡的土种鸡体内的新城疫强毒引起的。

目前, 虽然各地区都对新城疫采取了高强度的免疫注射, 但是近年来, 随着我国密集养禽业的快速发展, 新城疫流行仍很严重, 成为最难以防治的疫病之一。特别是不少地区发生和流行一些类似于新城疫的临床表现和病理变化的典型和非典型病例, 分别从猪、鸭、鹅体内分离到新城疫病毒, 此外关于鹌鹑、鸽子、鸵鸟、孔雀、火鸡、雉鸡新城疫诊断和病毒分离鉴定的报道也很多。由此看来, 新城疫病毒的感染谱越来越宽, 一些动物长期带毒不显症状, 而成为病毒遗传变异、毒力改变的宿主和传染源, 因而给新城疫控制和消灭带来极大困难。