β热处理（精选7篇）
β热处理 篇1
摘要：应用数字图像处理技术探讨了定量检测植入β-半乳糖苷酶细胞的方法。得出以下结论:一是彩色图像分割中常用的HSV颜色模型方法,较难检测出植入少量β-半乳糖苷酶的细胞;常用的绿色特征提取方法(2G-R-B方法),也不适应于β-半乳糖苷酶的检测。二是所提出的G-R方法是植入β-半乳糖苷酶细胞特征检测的有效方法,该方法不仅可以有效地提取植入β-半乳糖苷酶较多的细胞,而且同样可以检测出植入β-半乳糖苷酶较少的细胞,并且处理过程简单,处理速度快。
关键词：β-半乳糖苷酶,数字图像处理,彩色图像分割
β-半乳糖苷酶又称乳糖酶,在生物技术领域如基因工程、酶工程、蛋白质工程方面都发挥着重要作用,并广泛应用于食品、医药、免疫、环境检测等各个领域。利用β-半乳糖苷酶筛选好的基因在各种表达系统中的可能表达效果是基因工程中常用的筛选基因表达的方法。免疫学方面,将β-半乳糖苷酶与人体胞外淀粉状蛋白前体融合形成融合蛋白,可作为Alzheimer病的免疫源,并进一步制备其单克隆抗体。在环境检测方面,大肠杆菌β-半乳糖苷酶活性检测可快速分析浴场和渔场地区海水水体受排泄污染的程度[1,2,3,4]。
由于β-半乳糖苷酶使用普通光学显微镜可以观察其表达,容易拍照、保存时间长,并且在β-半乳糖苷酶的应用中通常根据光学显微镜拍照的照片分析基因转移的效率转染率因而分析检测被植入β-半乳糖苷酶细胞的显微照片是β-半乳糖苷酶应用中不可缺少的环节。目前,在被植入β-半乳糖苷酶细胞的检测中大部分采用定性观察的方法,本文利用数字图像处理技术,探讨定量分析检测被植入β-半乳糖苷酶细胞的方法。由于被植入β-半乳糖苷酶细胞在光学显微镜下呈现绿色,因而,本文根据被植入β-半乳糖苷酶细胞的颜色特征,采用彩色图像分割中常用的HSV模型方法和绿色特征提取方法(2G-R-B方法),以及本文提出的G-R方法,对比探讨了被植入β-半乳糖苷酶细胞的定量分析检测的方法
1 用HSV颜色模型提取被植入的特征细胞
HSI颜色模型与人眼感觉颜色的原理相似,所以颜色特征参数提取中通常采用HSI颜色模型[5]。由于HSV模型比HSI模型更与人类对颜色的感知接近[6],并且可以消除光照和所用处理方法对采样图像的影响,颜色信息丢失少,所以本文采用HSV模型。由色度学理论可知,HSV颜色模型是根据物体的色度(Hue)、饱和度(Saturation)、亮度值(Value)来进行物体颜色区分的,符合人的视觉规律。HSV颜色模型的较大优点是可以缩小光照强度的变化给颜色判别所带来的影响。通常从摄像机获取的图像是R(红色)、G(绿色)、B(蓝色)分量,所以要将R、G、B的图像模式转换成HSV模型。其转换公式由下式给出[6]
式中,R,G,B分别表示红色、绿色、蓝色三原色的亮度值(0～255)。
本研究从多幅被植入β-半乳糖苷酶细胞的光学显微照片中的不同位置,截取多个被植入β-半乳糖苷酶细胞(绿色细胞)和未被植入β-半乳糖苷酶细胞(白色细胞),以及无细胞的灰色背景部分。图1显示了一幅特定的被植入β-半乳糖苷酶细胞的光学显微照片。正如图1所示,光学显微照片中有三个特征区域:白色区域是未被植入β-半乳糖苷酶细胞(白色细胞),灰色区域是背景区域,绿色区域是被植入β-半乳糖苷酶细胞(包括由于被植入β-半乳糖苷酶较多而呈现深绿色的细胞和被植入β-半乳糖苷酶较少呈现浅绿色的细胞)。为方便观察,图1中浅绿色细胞用白色提示线标出。公式(1)-(3)分别将被植入β-半乳糖苷酶细胞的光学显微照片中的绿色细胞、白色细胞和灰色背景的R、G、B转换为HSV颜色模型,并分别求出绿色细胞、白色细胞和灰色背景所对应的H、S、V的平均值和均方值。图2显示了绿色细胞、白色细胞和灰色背景的H、S、V的平均值。如图2所示,绿色细胞的H值接近绿色值,如图2(a),其饱和度S最高如图2(b),但是其亮度V最低,如图2(c)所示,根据绿色细胞H、S、V值的特点,结合H、S、V的均方值,确定绿色细胞的H、S、V值的区间,以该区间为基准,提取绿色细胞,即提取出被植入β-半乳糖苷酶细胞。图3显示了用HSV颜色模型提取出的图1所示的被植入β-半乳糖苷酶的细胞的特征图像。对比图1和图3可以看出,用HSV颜色模型可以提取出被植入较多β-半乳糖苷酶的深绿色细胞,但是,被植入较少β-半乳糖苷酶的浅绿色细胞(图1白线所围区域内)没有被提取出来。因此,可以说彩色图像分割中常用的HSV颜色模型方法,能够较好地检测出植入量较多的β-半乳糖苷酶的细胞,但是较难检测出植入少量β-半乳糖苷酶的细胞。此外,由于在使用HSV颜色模型提取特征图像时,需要把R、G、B的数值转换成HSV颜色模型中的H、S、V的值,根据公式(1)-(3),在转换成HSV颜色模型过程中需要进行较为烦琐的角度θ的计算,从而影响了图像处理的速度。
2 用2G-R-B方法提取被植入的特征细胞
在提取绿色特征图像中,为了加强绿色成分,去除灰色背景色(灰色背景的R、G、B三个分量值近似相等),通常采用2G-R-B的方法。2G-R-B方法是把绿色的亮度值2倍,然后再减去红色和蓝色的亮度值(表示为2G-R-B)。由于灰色背景的红色R、绿色G、蓝色B的亮度值接近,因此2G-R-B的值为零,处理后的图像其背景为黑色。而对于绿色的特征图像,2G-R-B的值接近255,因此绿色特征图像处理后为白色亮区。2G-R-B方法能把绿色特征图像从整个图像中分离出来,并且具有良好的对比度和稳定的处理结果[7]。本研究尝试用2G-R-B方法提取绿色细胞(被植入β-半乳糖苷酶细胞)时发现,并没有达到较好的预期效果。图4显示了用2G-R-B方法提取出的图1所示的被植入β-半乳糖苷酶的细胞的特征图像。在本研究中在提取绿色细胞的时候,不仅需要去除灰色背景,还要去除未被植入β-半乳糖苷酶的细胞(白色细胞)。从图4中可以看到,在提取绿色细胞的同时,背景信息基本被去除,但是白色细胞的一些信息仍被遗留下来,成为提取出的图像的噪音。如果进行减少白色细胞处理的同时,绿色细胞的面积也随之减少,这将影响绿色细胞定量分析检测的结果。
图5显示了灰色背景的R、G、B的亮度值。正如图5所示,R、G、B的亮度值非常接近,在105～115之间。因此,使用2G-R-B方法,可以很好地去除灰色背景,即处理后的图像灰色背景为黑色。图6显示了白色细胞的R、G、B的亮度值。正如图6所示,R、G、B的亮度值相差较大,在115～135之间。因此,在使用2G-R-B方法时,白色细胞区域的2G-R-B值不为零,即具有一定的亮度值,处理后的图像中有些白色细胞被留下来,被误判为绿色细胞基于以上的结果和分析表明方法不适合用于定量检测被植入β-半乳糖苷酶的细胞。
3 用G-R提取被植入的特征细胞
调查被植入β-半乳糖苷酶细胞的光学显微照片的R、G、B亮度值的分布特性。从光学显微照片中随机选取多个位置的绿色细胞、白色细胞和灰色背景,根据组成这些所选位置的像素点的R、G、B的亮度值,计算橱这些所选位置(绿色细胞、白色细胞和灰色背景)的R、G、B的平均亮度值。图7显示了4个位置的绿色细胞、白色细胞和灰色背景的R、G、B的平均亮度值。图7中横轴为样品号,纵轴为R、G、B的平均亮度值。从图7可以看出:(1)未植入β-半乳糖苷酶细胞(白色细胞)的R、G的亮度值较高,并且两值相近,B的亮度值略低于R、G的亮度值;(2)灰色背景部分的R、G、B的亮度值相近,整体低于白色细胞的R、G、B的亮度值;(3)被植入β-半乳糖苷酶细胞(绿色细胞)的R、G、B的亮度值远远低于白色细胞和灰色背景的亮度值,并且G的亮度值最高,R的亮度值最低,
根据上述图像R、G、B亮度值的特点,本论文提出用G-R方法(即:用绿色(G)的亮度值减去红色(R)的亮度值)提取被植入β-半乳糖苷酶细胞(绿色细胞)的特征图像。如果采取G-R的方法,可以得到:(1)对于灰色背景而言,G的亮度值减去R的亮度值接近于零;(2)对于白色细胞而言,G的亮度值减去R的亮度值也接近于零;(3)对于绿色细胞而言,G的亮度值减去R的亮度值大于零(约为20),可以令其等于255(最亮)。最终,用G-R方法既可以去除灰色背景部分,又可以去除白色细胞,从而达到提取被植入β-半乳糖苷酶细胞(绿色细胞)特征图像的目的。图8显示了提取出的图1所示的被植入β-半乳糖苷酶的细胞的特征图像。正如图8所示,用G-R方法很好地获得了被植入β-半乳糖苷酶细胞(绿色细胞)特征图像。值得一提的是:对比图8和图3,G-R方法不仅提取出了植入量较多的β-半乳糖苷酶的细胞,而且还提取出了植入量少的β-半乳糖苷酶的细胞(白色线所围的区域)。从而表明:对于提取被植入β-半乳糖苷酶细胞(绿色细胞)特征图像而言,G-R方法优于彩色图像分割中常用的HSV颜色模型方法。
为了验证G-R方法的通用性,选取了其它一些被植入β-半乳糖苷酶细胞的光学显微照片,对它们用G-R方法进行了处理,也得到了良好的结果。图9显示了根据图7所示的各组R、G、B的亮度值计算得到的G-R的值和2G-R-B的值。图9中的横轴为样品号,纵轴为G-R和2G-R-B的值。纵轴的值越小表明去除的不需要信息的效果越好即提取绿色细胞的效果越好。从图9中也可以看出,对于灰色背景,不论是G-R方法还是2G-R-B方法,其结果都接近零。说明G-R方法和2G-R-B方法都可以有效地去除灰色背景部分。而对于白色细胞部分,G-R方法处理后的值接近零,2G-R-B方法处理后的值接近10,这一差距是非常大的。从这一结果可以看出:G-R方法在去除白色细胞方面优于2G-R-B方法。对于绿色细胞而言,虽然2G-R-B的值高于G-R的值,但是由于灰色背景和白色细胞的G-R的值都接近于零,因此绿色细胞的G-R的值远大于灰色背景和白色细胞的G-R的值。综上所述,对于提取被植入β-半乳糖苷酶细胞(绿色细胞)特征图像而言,采用G-R方法优于2G-R-B方法。
4 结束语
本文应用数字图像处理技术探讨了定量检测被植入β-半乳糖苷酶细胞的方法。比较了彩色图像分割中常用的HSV颜色模型方法、常用的绿色特征提取方法(2G-R-B方法)以及G-R方法对被植入β-半乳糖苷酶细胞特征图像提取的效果。得出以下结论:G-R方法能够最有效地提取被植入β-半乳糖苷酶细胞的特征图像并且处理过程简单处理速度快
参考文献
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β热处理 篇2
以天然高分子物质为原料, 经提取、改性制得的水处理剂, 具有来源广、效益高、无二次污染等优点。本试验以β-环糊精和聚丙烯酰胺为原料进行接枝反应合成β-CD-PAM絮凝剂, 并将其用于处理含微量Cr3+废水。β-CD-PAM既保留了β-CD的疏水空腔和外侧羟基, 可与Cr3+形成主客体包合物和络合物;又引入新的基团-NH-O-CH-能和Cr3+能形成稳定的配合物;引入PAM增大了β-CD相对分子质量, 有利于絮凝及沉降。
1.试验部分
(1) 主要仪器与药品。
紫外-可见分光光度计 (UV-1800) 、傅立叶红外光谱仪 (Nicolet Nexus 670) ;β-环糊精、聚丙烯酰胺、乙腈、对甲苯磺酰氯、二苯碳酰二肼、高锰酸钾、硫酸铬等均为分析纯。
(2) β-环糊精接枝聚丙烯酰胺试验。
(1) 合成β-环糊精磺酸酯。
称取4g重结晶的β-CD置于50m L蒸馏水中;将0.5g Na OH加到β-CD悬浮液中搅拌直至溶液变澄清;称取1g对甲苯磺酰氯溶于2m L乙腈, 在0℃下缓慢滴加到β-CD的混合溶液中;在4℃下搅拌5h, 用稀盐酸中和至p H=6, 过滤并收集沉淀, 在50℃下真空干燥得到白色固体, 即β-CD-6-Ots。
(2) β-环糊精接枝聚丙烯酰胺。
称取4g PAM加入到150m L蒸馏水中, 在50℃水浴锅中搅拌使其溶解;将3gβ-CD-6-Ots逐步加入到PAM水溶液中, 于50℃水浴锅中搅拌20h;将反应产物在50℃真空干燥, 所得固体分别用甲醇、乙醚洗涤数次, 用布氏漏斗过滤;真空干燥得到白色固体, 即β-CD-PAM。
(3) 含铬废水处理试验。
配制100mg/L的Cr3+标准贮备溶液;再用标准贮备溶液配制标准溶液;采用正交试验方法, 研究药品投加量、温度、p H值等因素对Cr3+废水处理效果的影响。
(4) 依据国标GB7466-87确定铬去除率。
绘制Cr3+浓度对吸光度的标准曲线;将处理过的Cr3+水样过滤, 用高锰酸钾氧化滤液, 稀释, 以二苯碳酰二肼做显色剂, 在波长540nm下测定吸光度, 利用标准曲线方程, 计算去除率。
2.实验结果与讨论
(1) 样品的红外光谱表征。
称取经干燥处理的1~2mg试样与200mg纯KBr在玛瑙研钵充分均匀研磨到粒度小于2微米, 将混合粉末用107Pa压力在油压机上压成透明薄片, 设置波长4000~500cm-1, 扫描次数32, 分辨率4cm-1, 测得红外光谱如图1:PAM在3300cm-1附近是伯酰胺的伸缩振动吸收;β-CD在3400cm-1附近出现-OH键伸缩振动吸收峰, 1000~1200cm-1是葡萄糖单元的特征吸收;β-CD-6-Ots保留了β-CD的葡萄糖单元特征吸收及-OH吸收峰, 且出现1178cm-1和1368 cm-1的磺酰基峰和1600cm-1附近苯的特征吸收峰, 在2971cm-1和2927cm-1附近出现了甲基的对称和非对称伸缩振动双峰;β-CD-PAM的红外光谱保留了β-CD的特征吸收峰, 且出现3340cm-1处的仲酰胺特征吸收峰, 证明β-CD接枝到了PAM上。β-CD-6-OTs与β-CD-2-OTs的红外图谱相似, 故需用其在水中溶解度区分:β-CD-2-OTs大于35g/100m L, β-CD-6-OTS则小于0.04g/100m L。
(2) 处理含铬废水的影响因素。
(1) 药品用量对去除率的影响。
分别称取0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3g的β-CD-PAM、β-CD、PAM, 加入到100m L浓度10mg/L的Cr3+溶液, 在30℃水浴锅静置1h后过滤溶液, 计算Cr3+去除率。处理结果如图3:β-CD-PAM的去除率大于PAM和β-CD, 这是由于其-NH-O-CH-基团中的氧原子为给电子原子增加了氮原子周围电子云密度, 即增强了配体的碱性, 配体的碱性愈强, 和同一金属离子形成配合物的稳定性愈强, 且羟基对Cr3+具有络合作用;β-CD-PAM、β-CD、PAM的质量与水样体积比分别超过1.5%、2%、0.5%时, 絮凝剂过量会使之与水样难于分离, 导致滤液吸光度上升从而去除率下降。
(2) 温度对去除率的影响。
称取0.15gβ-CD-PAM、0.2gβ-CD、0.05g PAM, 分别加入到100m L浓度10mg/L的Cr3+溶液, 在20、25、30、35、40、50、60℃水浴锅静置1h后过滤溶液, 计算Cr3+去除率。处理结果如图4:低于20℃, 微粒扩散慢, 絮凝速率低, 铬去除率较低;随着温度升高, β-CD-PAM分子运动加快, 扩散快, 利于氧化还原反应及络合反应进行, PAM分子热运动剧烈, β-CD的溶解度增大, 能充分与Cr3+进行络合, 从而去除效率升高;超过50℃, β-CD-PAM会部分分解断链, 吸附粒子极易解吸, 影响絮凝效果, 导致去除率降低。
(3) p H值对去除率的影响。
称取0.15gβ-CD-PAM、0.2gβ-CD、0.05g PAM, 分别加入到100m L浓度10mg/L的Cr 3+溶液, 分别调节p H值为1、2、4、5、6、7, 在35℃水浴锅静置1h后过滤溶液, 计算Cr 3+去除率。处理结果如图5:当p H小于7时, 随着p H升高, β-CD-PAM、PAM和β-CD对Cr 3+的去除率都升高, 因为在络合的过程中, 配体的碱性越强, 和金属离子形成的配合物稳定性就越强, 碱性溶液可以提供电子, 增强配体的碱性;而当p H大于7时, Cr 3+在碱性溶液会逐步沉淀, 影响了测量结果, 故需在适宜p H范围内方能达到最佳包合效果。
(4) 最优化条件下Cr3+去除率。
经过正交试验, 如图6, 处理10mg/L的Cr 3+水样, 最佳条件组合为:β-CD-PAM投加量1.5g/L、温度35℃、p H值5~6, 去除率可达到87.23%;β-CD投加量2g/L、温度50℃、p H值为7, 去除率可达到63.51%;PAM投加量0.5g/L、温度40℃、p H值为7, 去除率可达到56.72%。
3.结论
(1) β-CD-6-OTs是合成6位取代环糊精衍生物必须经过的一种中间产物, 环糊精的磺酰化反应是酰化基与羟基的反应, 其产物结构受反应试剂活性和环糊精包结效应的影响。
(2) β-CD-PAM、β-CD、PAM对废水中Cr3+均有一定去除能力;β-CD-PAM与β-CD、PAM相比, 对Cr 3+去除能力有明显提高;β-CD-PAM处理微量Cr3+废水, 主要依靠絮凝作用、络合作用、共沉淀作用等, 其最优化条件组合为:药品投加量1.5g/L、温度35℃、p H值5~6, 去除率可达到87.23%。
参考文献
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β,β′-联萘酚的性质及应用 篇3
由于反应混合物存在诸多的异构体,反应产物取决于这些化合物的分布及反应活性,此时反应的立体选择性往往较低。控制不对称反应的对映选择性方法之一是在反应中使用具有纯旋转和Cn轴对称基团的唯一对称元素的手性试剂,这种手性试剂确定了单个给定反应物的对映选择性。具有C2对称轴手性的二醇、二酚、二胺等二齿配体是用于制备手性lewis酸催化剂最常用的手性源。因为C2对称性特征减少了竞争过渡态的数目。其中,具有光学活性的β,β'-联萘酚(BINOL)化合物是近年来研究得较多的C2轴手性联芳香化合物,其具有独特的立体化学性质,是一种优异的手性诱导源。人们已经使用β,β'-联萘酚合成出许多手性Lewis酸催化剂,并发现对于不对称Diels-Alder环加成、Aldol醇醛缩合、羰基化合物烷基化加成、潜手性酮还原、Michael加成及不对称环氧化等反应,都具有良好的催化活性和对映选择性,显示出广阔的应用前景。
本文主要介绍了β,β'-联萘酚的性质及联二萘酚类小分子和高分子手性催化剂在各种反应中的应用。
1 β,β'-联萘酚的性质
β,β'-联萘酚(BINOL)为白色针状品体或粉末,分子式C2OH14O21,熔点为218℃。溶于醚和碱液,微溶于醇,难溶于氯仿,不溶于水,沸点升华[1]。联萘酚是典型的手性化合物,具有很强的面不对称性,易于拆分成高纯度的对映体,具有轴不对称性、面不对称性、刚性和柔性等独特的立体化学性质,是近年来研究较多的C2轴不对称芳香化合物,其中因2个萘环的体积大空间阻碍而具有刚性,特别是8,8'位的2个氢旋转时受到阻碍;2个环之间由于共轴效应,仍然具有一定的旋转余地,具有一定的韧性,这使得由它制成的金属络合物催化剂在反应时能适应温度及过渡态的变化。这些都是它成为优异的手性源的条件。而且由于苯环的存在,在紫外灯下可以发出很强的荧光,使产物易于观察[2]。其结构见图1。
2 β,β'-联萘酚的应用
2.1 小分子β,β'-联萘酚手性催化剂的应用[3]
2.1.1 不对称Diels-Alder反应
Y amamoto[4]最早使用3,3-三苯基硅-2,2-二羟基-1,1-联-2-萘酚与ALMe3制得β,β'-联萘酚手性铝催化剂(R)-1,用于催化氧化不对称Diels-Alder反应(见方程式1)得到高产率,对映选择性高达95%e.e.以上。同时,其研究了取代基、溶剂、温度和催化剂用量对反应的影响,并初步提出了催化机理。
Yamamoto[5]同时发展了一系列BrΦsted酸协助的手性Lewis酸(BLA)[(R)-5,(R)-6],通过分子内氢键和过渡态中π-π供体-受体作用的双重影响,实现高度的立体选择性。Yamamoto发现(R)-5对于α-取代的α,β-烯醛与双烯体(环戊二烯)的环加成(见方程式2),具有极高的exo-立体选择性(exo:exdo>99:1)和对映选择性(e.e.>99%)。他们同时研究了α,β-炔醛与环戊二烯的环加成,产物e.e.值高达95%。
Kobayashi等[6]利用(R)-(+)-β,β'-联萘酚、Yb(OTf)3和叔胺与4分子筛混合制成的手性镧系金属三氟甲基磺酸盐(R)-14,催化3-酰基-1,3-唑烷-2-酮与环戊二烯的Diek-Alder反应(见方程式3),得到很高的光学产率(高达95%)。他们加入非手性配体(3-苯基乙酰基丙酮),结果发现endo主产物的优势构发生逆转,而且仍保持较高光学产率81%e.e.。这样,利用同一手性源R-(+)-β,β'-联萘酚和适当的非手性配体催化就可制备环加成产物的2种对映体,实现“对映面选择性(enantiofacialselectivity)”。
“离子液体(ionicliquids)”以其独特的物理化学性质(蒸汽压极低,热稳定性好,不吸湿)作为一种新型绿色反应介质在有机合成中的应用已引起人们极大关注。研究发现[7]用离子液体能够显著提高Diets-Alder反应的选择性和反应速率。这是由于离子液体极强的憎溶剂效应产生了一种“内压(intemalpressure)”,促进了活化过程中反应物在“溶剂洞腔”中的结合,从而加速环加成反应,提高选择性。Gunnoe小组以离子液体为溶剂使用BINOL-ALCL[(R)-29]催化不对称Diels-Alder反应,得到与常规分子溶剂体系明显不同的结果(见方程式4)。
2.1.2 Aldol醇醛缩合反应
Aldol醇醛缩合反应作为构建不对称C-C键最简单的一种方法,自20世纪80年代以来被人们广泛研究,BINOL作为手性源催化不对称Aldol反应已经引起人们的重视。Mikami等在研究催化不对称MukaiyamaAldol反应中发现使用(R)-BI-NOL-Ti(OPri)2[(R)-32]作为催化剂,可以以极高的化学收率得到反应产物(见方程式5)。
同时研究人员观察到,当加入一定量光学纯的(R)-BINOL或外消旋的(±)-BINOL后,化学产量和光学收率都有明显提高。加入非手性的酚类化合物(苯酚,2-萘酚,五氟苯酚)也能够有效提高反应的对映选择性。在用[(R)-32]催化Fluoral的不对称Friedel-Crafts反应中,他们也发现了类似的作用[8],Mikami将这种作用称为“不对称活化”[9],即一种手性或者外消旋的催化剂可以被另一种手性或非手性活化试剂通过分子识别对映选择地活化,从而以更高的活性催化反应生成光学活性物质。
2.1.3 羰基化合物的不对称烷基化反应
chan[10]和Nakai[11]将(S)-BINOL-Ti(OPr-i)2[(S)-32]催化体系用于醛的不对称二乙基锌烷基化反应(Schemell),在极温和反应条件下,得到高度对映选择性的仲醇,醛的转化率和产物的e.e.值都在90%以上。为达到有效的催化效果,有必要加入大量的Ti(OPr-i)4(见方程式6)。
丁奎玲和Mikami在研究(R)-BINOL-Zr(OBu-t)2[(R)-49]催化二乙基锌对醛的不对称亲核加成反应时,发现加入一定量的(R)-BINOL能明显提高反应收率和对映选择性(见方程式7)[12]。他们在研究手性二醇(酚)锌络合物催化醛类的不对称7烷基化反应中发现,加入手性含氮双齿配体有助于将锌络合物由低活性的多聚体转变为高催化活性的单体形式,从而对该类反应具有非常显著的活化作用。
2.1.4 潜手性酮的不对称还原
通过手性β,β'-联萘酚修饰NaBH4、BH3试剂,得到的催化剂可在底物的2个潜手性面之间进行有效的立体化学选择,用它们催化还原芳香酮、烯基酮和炔基酮等潜手性不饱和酮,都能得到很好的光学产率(e.e.值高达100%)。最近,Uang等[13]用原位法制得催化剂(R)-(BINOL)2-AI(56),通过进一步修饰还原剂BH3催化潜手性芳酮的不对称还原(Scheme2.14),产物的e.e.值达到83%。他们同时提出了催化机理,合理解释了产物优势构型为S型的原因(见方程式8)。
近年来,利用手性金属络合物催化不对称Michael加成反应已成为对映选择性C-C成键的一种有效方法。在不对称氰化反应的研究中,Shibasaki等设计合成了新型双官能团催化剂(R)-68,同时具有Lewis酸(A1原子)和Lewis碱(膦氧原子)的特性,可分别活化亲电试剂和亲核试剂。其用于催化不对称氰化的效果很好[14](见方程式9)。
2.1.5 不对称羰基-烯反应
Mikami最近使用β,β'-联萘酚钛络合物催化羰基-烯(Carbonyl-ene)反应,是运用不对称活化策略最为成功的例子之一。使用10 mol%的(±)-32与5 mol%的手性活化剂(R)-BI-NOL或(R)-5-C1-BIPOL形成的体系催化苯丙烯与丁酯的ene反应,产物的e.e.值由加入手性催化剂之前的0%提高到89.80%,化学产率也从5.9%提高到52%[15](见方程式10)。应当指出,不对称活化不仅能够提高催化剂的活性,而且可以增强反应的对映选择性,符合“手性经济”的原则,对于不对称催化剂的研究具有重要的指导意义。
2.2 高分子手性β,β'-联萘酚催化剂的应用[16]
手性试剂往往十分昂贵,而小分子试剂又常常难于回收,手性源的重复利用率低。为此,人们想到把手性源引入到高分子中,制得手性高分子催化剂。这样,通过简单的过滤就可以将手性试剂与反应体系分开,再生循环利用。手性源的重复利用率大大提高,为大规模连续生产提供了可能。同时,高分子配体可在位于活性部位的金属中心周围形成小分子体系所没有的特殊立体微观环境,提高对映选择性。传统手性高分子的制备是将手性金属络合物通过共价键支载到具有韧性和立体无规的高分子骨架上,近年来,人们利用手性β,β'-联萘酚及其衍生物合成了许多具有主链手性的共轭聚合物[17],直接在高分子骨架中引入具有良好光学活性和催化特性的β,β'-联萘酚基团,金属原子能够高度有序地络合在结构刚硬而且立体规整的手性高分子链上,为催化点提供了良好的微观环境。因此就可以通过系统地调整聚合物中金属原子中心的空间和电子特性来优化催化性能和立体选择性,得到性能优良的手性高分子催化剂。在这种高分子中,金属原子沿着聚合物骨架孤立地固定下来,聚合物骨架的刚性阻止了活性中心之间的双分子作用,同时,通过提高活性物质的稳定性,有助于催化体系在回收过程中保持活性,对于催化剂的循环利用具有重要意义。例如,Pu利用合成的手性高分子(R)-polymer-82与金属络合成功地催化了1,3-偶极环加成[18](见方程式11)和醛类的不对称二乙基锌烷基化反应[19](见方程式12)等,获得极高的化学收率和光学产率。
他们将再生过的手性高分子催化剂循环使用,发现其催化活性和对映选择性不变。对于不同分子量高分子催化剂的研究表明,催化性能与分子量的大小、分子量分布及制备方法无关。这预示着手性高分子催化剂具有较强的实用性。
3 结语
β热处理 篇4
为研究Aβ42的性质及与其它蛋白或金属离子的相互作用,需获得足量且高纯度的蛋白。化学合成Aβ42多肽价格较为昂贵,且多肽溶解后容易聚集沉淀。本研究采用大肠杆菌谷胱甘肽- S - 转移酶( GST) 融合表达系统表达GST - Aβ42蛋白,通过比较不同温度的表达情况确定诱导表达的最佳温度。利用亲和纯化获得较高纯度的融合蛋白,然后用凝血酶切除GST融合标签从而获得Aβ42多肽。本研究为建立一种高效表达纯化可溶的Aβ42多肽的方法提供理论参考。
1 材料与方法
1. 1 材料
1. 1. 1 实验材料
Escherichia coli DH5α 和Escherichia coli BL21( DE3) 为作者实验室保存; p GEM - T Easy载体购自Promega公司; p GEX - 4T - 1 由作者实验室保存。
1. 1. 2 试剂
限制性内切酶Bam HⅠ和XhoⅠ、r Taq DNA聚合酶、蛋白质低分子量标准( 14. 3 ~ 97. 2 k Da) 为Ta KaRa公司产品; 酵母抽提物和胰蛋白胨购自英国Oxoid公司; T4 DNA连接酶购自NEB公司; Gstrap FF亲和色谱纯化柱购自美国GE公司; 30 ∶ 0. 8 凝胶储液购自美国Bio - Rad公司; 氨苄青霉素、琼脂糖、琼脂粉、蛋白电泳试剂等购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司; 质粒抽提试剂盒与DNA凝胶回收试剂盒购自北京天根生化科技有限公司; 引物合成和DNA序列测定由上海立菲生物技术有限公司完成; 其它试剂均为国产分析纯。
1. 1. 3 仪器
PCR仪、蛋白垂直电泳仪购自美国Bio - Rad公司; 台式高速冷冻离心机购自德国艾本德公司; 蛋白质快速纯化系统购自美国GE公司; 水平电泳仪购自北京六一仪器厂; 恒温摇床购自上海智城分析仪器制造有限公司。
1. 1. 4 培养基
LB培养基: 胰蛋白胨10 g / L,酵母抽提物5 g /L,Na Cl 10 g / L。
1. 2 方法
1. 2. 1 人Aβ42基因的设计与合成
根据已知的Aβ42基因序列,设计5 条引物用于目的基因的扩增,其序列分别是: P1: 5' - GATGCAGAATTCCGACATGACTCAGGATATGAAGTTCATC ATCAAAAATTGGTGTTCT - 3'; P2: 5' - ATTGCACCTTTGTTTGAACCCACATCTTCTGCAAAGAACACCA ATTTTTGATGATG - 3'; P3: 5' - GGTTCAAACAAAGGTGCAATCATTGGACTCATGGTGGGCGGTGTTGTCA TAGCG - 3'; P4: 5' - CGCTATGACAACACCGCC -3'; P5: 5' - GATGCAGAATTCCGACATGAC - 3'。PCR扩增Aβ42基因全长的反应条件为: 反应(1): P1、P2 引物各0. 4 μmol / L,r Taq 2. 5 U; 混合好后,94℃ ,2 min,然后94℃ ,15 s,50℃ 退火30 s,72℃ 延伸20 s,30 个循环; 反应(2): P3、P4 引物各0. 4 μmol / L,r Taq2. 5 U,PCR条件同前。PCR实验完,1. 5% 琼脂糖电泳观察结果,分别切胶回收小于200 bp的片段。反应(3): P4、P5 引物各0. 4 μmol/L,P1、P2 引物扩增片段和P3、P4 引物扩增片段各0. 1 μmol/L,混合均匀后,置于PCR仪上,按以下反应程序进行: 94℃,2min,然后94℃ ,15 s,50℃ 退火30 s,72℃ 延伸20 s,30 个循环; 72℃ ,10 min。反应结束后,1. 5% 琼脂糖电泳鉴定PCR产物。
1. 2. 2 p GEX / Aβ42融合表达载体的构建
天根胶回收试剂盒回收和纯化上一步的PCR产物,T4 DNA连接酶通过T/A克隆的原理将Aβ42基因与p GEM-T于16℃连接过夜,转化E.coli DH5α感受态细胞。挑克隆,提取质粒,测序确定序列的正确性。根据p GEX-4T-1载体的多克隆位点设计引物,正向引物:5'-ATTGGATCCGATG-CAGAATTCCGACATGACTC-3',反向引物:5'-AT-TCTCGAGCTACGCTATGACAACACCGCCC-3'。其中正向引物加有Bam HⅠ酶切位点(下划线),反向引物加有XhoⅠ酶切位点(下划线)和终止密码子。以T载体的Aβ42基因为模板,按以下程序进行PCR:94℃,2 min;94℃,15 s,56℃退火30 s,72℃延伸20s,30个循环。反应结束后,1.5%琼脂糖电泳,回收PCR产物。用Bam HⅠ/XhoⅠ分别双酶切Aβ42基因和p GEX-4T-1载体过夜,回收Aβ42基因和p GEX-4T-1载体的酶切产物,用T4连接酶按8:1的比例16℃连接过夜,转化E.coli DH5α感受态细胞。挑克隆,提取质粒,Bam HⅠ/XhoⅠ双酶切鉴定转化子,测序确认序列的正确,重组载体命名为p GEX/Aβ42。
1. 2. 3 GST - Aβ42的试表达
将构建好的表达载体p GEX/Aβ42转入表达宿主菌E. coli BL21( DE3) 感受态细胞,待菌落长出后,挑单克隆接种至1 ml LB培养基中培养。4 ~ 5 h后,将菌液转至50 ml培养基中扩大培养至OD600达到0. 5 ~ 0. 6,加入IPTG至终浓度0. 5 mmol / L,37℃ 诱导表达4 h。离心收菌,用PBS缓冲液洗涤菌体1次,液氮冻融,加适量PBS重悬菌体,置于冰上搅拌2 h。超声破碎菌体,10% 的SDS - PAGE鉴定表达效果。
1. 2. 4 GST - Aβ42表达温度的优化
转化步骤同前,单克隆接种摇菌,待菌液变浓后转至200 ml LB中培养至OD600达到0. 5 ~ 0. 6,均分为4 瓶,加入IPTG至终浓度0. 5 mmol/L,分别在16℃ 、25℃ 、30℃ 和37℃ 诱导表达24 h、24 h、6 h与4h。表达结束后,菌体处理方法同前,菌体经超声破碎后分别分离4 个温度的上清和沉淀,取等量进行10% 的SDS - PAGE。
1. 2. 5 GST - Aβ42的大量表达及分离纯化
重新转化p GEX/Aβ42,接种摇菌后转至800 ml培养基,加入终浓度为0. 5 mmol/L的IPTG,选择可溶表达效果最佳的温度进行诱导。离心收菌,液氮冻融后用50 ml PBS缓冲液重悬菌体,超声破碎,4℃ 、20 000 r / min离心20 min,弃沉淀。上清以0. 5ml / min的流速上样预平衡好的GSTrap FF柱。用50 mmol / L Tris - HCl缓冲液( 含10 mmol / L还原型谷胱甘肽,p H 8. 0) 以1 ml/min洗脱柱子,收集洗脱液,进行SDS - PAGE鉴定。将检测含有高浓度和纯度的蛋白合并,超滤浓缩样品,然后透析至含20%甘油的PBS缓冲液中。根据Bradford法测定蛋白质浓度[11],分装冻存于- 80℃。
1. 2. 6 凝血酶酶切融合蛋白GST - Aβ42
分别用2 单位的凝血酶酶切0. 62 和0. 93 μmol GST - Aβ42融合蛋白,室温反应2 h。10 000 r/min离心10 min,15% 的SDS - PAGE鉴定酶切产物。
2 结果与分析
2. 1 Aβ42基因的合成及表达载体的构建
Aβ42基因长度只有129 bp,利用合成的引物P1、P2 和P3、P4 分别扩增了基因的5' 端和3' 端( 图1A) ,由于前一个PCR产物的5' 端与后一个PCR产物的3'端互补,最后利用两个末端引物P4、P5 扩增出了完整的Aβ42基因( 图1B) 。将基因连入T载体后,经DNA测序确认,Aβ42基因序列正确。将Aβ42亚克隆到p GEX - 4T - 1 表达载体,Bam HⅠ/XhoⅠ双酶切及DNA测序确认插入序列的正确。
A:引物P1、P2和P3、P4分别扩增Aβ42基因的5'端和3'端;M:DNA分子量标准;泳道1:引物P1、P2扩增片段;泳道2:引物P3、P4扩增片段。B:全长Aβ42基因的扩增。A:Primers P1,P2 and P3,P4 were used to amplify the 5’and 3’end of Aβ42gene;M:DNA molecular weight marker;Lane 1:the DNA fragment amplified by P1 and P2;Lane 2:the DNA fragment amplified by P3 and P4.B:the amplification of full-length Aβ42gene.
2. 2 GST - Aβ42融合表达的确定
为确定p GEX/Aβ42是否有效表达GST - Aβ42融合蛋白,我们进行了试表达,同时以p GEX空载体作表达对照。如图2 所示,在29 k Da分子量位置,与空载体所表达的蛋白( 泳道1) 相比,p GEX/Aβ42所表达的蛋白( 泳道2 ~ 5) 在凝胶上的位置略微滞后( 箭头处) 。由于p GEX空载体表达的GST蛋白分子量为27. 9 k Da,而p GEX/Aβ42表达的GST - Aβ42融合蛋白的理论分子量为30. 7 k Da。两者分子量的差异与它们凝胶电泳的差异一致,表明p GEX/Aβ42能有效表达GST - Aβ42融合蛋白。
M:蛋白分子量标准;泳道1:p GEX空载体表达对照;泳道2~5:p GEX/Aβ42表达全菌,上样量分别为2、3、4、5μl。M:Protein molecular weight marker;Lane 1:p GEX vector expression control;Lane 2-5:IPTG-induced total cell lysates,the loaded volumes were 2,3,4 and 5μl.
2. 3 确定GST - Aβ42的最佳表达温度
为确定GST - Aβ42蛋白的最佳表达条件,我们比较了16℃、25℃、30℃ 和37℃ 四个温度的表达情况。如图3 所示,16℃、25℃ 和37℃ 三个温度,蛋白主要以包涵体的形式表达,在菌体破碎上清里可溶蛋白量较少。而在30℃ 条件下,上清里可溶蛋白量相比较其它三个温度大大增加( 泳道6,箭头所示) 。因此,我们确定30℃ 为GST - Aβ42融合蛋白的最佳表达温度。
2. 4 GST - Aβ42融合蛋白的亲和纯化
30℃ 、0. 5 mmol / L IPTG诱导表达6 h,可溶的GST - Aβ42融合蛋白占菌体上清总蛋白含量的40%左右。菌体上清经Gstrap FF柱纯化后可得到纯度超过90% 的目的蛋白( 泳道3 ~ 6) 。将泳道4 ~ 6 对应的蛋白合并浓缩,测定浓度。估算GST - Aβ42蛋白的得率约为1. 2 mg /L培养基。
M:蛋白质分子量标准;泳道1:诱导前菌液对照;泳道2、4、6、8分别为16℃、25℃、30℃和37℃菌体破碎上清;泳道3、5、7、9分别为16℃、25℃、30℃和37℃菌体破碎沉淀。M:Protein molecular weight marker;Lane 1:none-IPTG induced cells;Lane 2,4,6 and 8 were supernatant of the cell lysate at 16,25,30 and 37℃,respectively;Lane 3,5,7 and 9 were precipitate of the cell lysate at 16,25,30 and 37℃,respectively.
M:蛋白质分子量标准;泳道1:上柱前样品;泳道2:上样穿透样品;泳道3~6:柱纯化洗脱收集蛋白样品。M:Protein molecular weight marker;Lane 1:the sample before loading the column;Lane 2:the unbinding sample;Lane 3-6:the collected protein samples through column purification.
2. 5 凝血酶酶切GST - Aβ42融合蛋白
如图5 所示,当用2 单位凝血酶酶切GST -Aβ42融合蛋白后,在29 k Da前可见明显的蛋白条带,该条带与26 k Da的GST蛋白标签大小一致,表明凝血酶可将GST - Aβ42融合蛋白中的GST蛋白标签有效切除。在凝胶最前沿,可见一条较弱的条带( 箭头所示) ,无GST标签的Aβ42肽分子量大约为4. 8 k Da,从分子量和剂量效应上可以确定该条带即为Aβ42肽。
M:蛋白质分子量标准;泳道1、2:2单位凝血酶酶切0.62μmol和0.93μmol融合蛋白。M:Protein molecular weight marker;Lane 1,2:2 units thrombin cleaved 0.62 and 0.93μmol GST-Aβ42fusion protein,respectively.
3 讨论
Aβ 肽的分泌是淀粉样前体蛋白被 β - 分泌酶和 γ - 分泌酶连续切割的结果[12]。含有39 ~ 43 个氨基酸的Aβ 蛋白以淀粉样肽沉积在AD病人大脑中。由于 γ - 分泌酶切割的不均一性,产生较多的Aβ40,而Aβ42产生较少[13,14]。研究表明由39 或40个氨基酸组成的Aβ40主要沉积在脑血管壁上,而较长的Aβ42则是淀粉样老年斑的主要成分。Aβ42加速Aβ 纤维聚集的形成,引发AD级联[15]。因此,Aβ42肽目前已成为临床上治疗AD的有效靶点[16]。
化学合成Aβ 是常规采用的方法,但这种方法低效耗时,需要配备专门的设备,成本相对较高,不适合大量制备。现普遍采用大肠杆菌重组表达Aβ多肽。该方法Aβ 表达形成包涵体,后续通过离子交换色谱和离心过滤纯化[17,18,19]。为探索一种获得可溶表达Aβ 的方法,我们采用大肠杆菌GST融合表达系统进行Aβ 的表达。GST原核表达系统的优点是将小分子肽连接到较大的GST上,表达的融合蛋白一般都可溶,便于亲和纯化,并可维持蛋白的高级结构和生物学活性[20,21]。同时可用凝血酶或Xa因子切除融合的GST蛋白。实验表明,该系统的确可以有效表达GST - Aβ42融合蛋白。为获得更多的可溶蛋白,我们对表达条件进行了摸索。虽然在16℃ 、25℃ 、30℃ 和37℃ 四个温度,蛋白均主要是以包涵体的形式表达,但相比其它温度,30℃ 时可获得最多的可溶蛋白。因此,我们确定了30℃ 作为蛋白的最佳诱导温度。利用GST融合标签,通过GSTrap FF柱纯化和还原型谷胱甘肽洗脱,我们获得纯度超过90% 的融合蛋白。估算蛋白的最终产率为1. 2mg / L培养基。该结果显示GST系统可有效表达GST - Aβ42融合蛋白,同时利用亲和纯化可获得较高纯度的蛋白。为获得单一的Aβ42多肽,利用GST融合标签上带的Leu - Val - Pro - Arg - Gly - Ser序列,采用凝血酶切断Arg与Gly之间的肽键,从而释放Aβ42。实验结果表明凝血酶可有效切除GST标签,但检测Aβ42的量较少。原因可能为失去GST标签的保护,Aβ42在溶液中易于聚集沉淀,反映出Aβ42特有的纤维聚集性质[22,23]。
4 结论
β热处理 篇5
在蛋白质结构中,2个平行的β-strand被较长的loop连接,loop中间包含α螺旋(α-helical),并且2个β折叠片之间存在氢键,形成的结构模体β-loop-α-loop-β叫做β-α-β模体,它是含有平行的β折叠(sheet)的蛋白质中的常见模体[1,5]。因此,对β-α-β模体的统计分析及预测是十分有意义的。
在本文中,对1423条相似性小于33%的蛋白质链中包含的β-α-β模体和非β-α-β模体作为训练集,5交叉检验预测总精度和相关系数分别是75.51和0.49。将此模型应用于另外1个独立检验集进行检验预测精度达到72.23%。
1 材料和方法
1.1 材料
数据库选取了EVA的1423个相似性小于33%的蛋白质作为训练集[4],同时选取了426个非冗余的蛋白质链组成,作为独立检验集。文中对训练集,获得二级结构为ECHCE模式的片断为3878个,利用PROMOTIF[3]获得β-α-β模体分别为1622个,与ECHCE模式相匹配的1459个片断确认为β-α-β,其余2419个确认为非β-α-β;对独立检验集,有257条蛋白质链中至少包含一个β-α-β模体,这个数据库中共得到310个β-α-β模体和480个非β-α-β模体。
1.2 最佳序列片段长度的选取
由于二级结构是形成蛋白质超二级结构的基础单元,而超二级结构的构象类型与连接肽所连接的二级结构单元的种类、连接肽的长度以及连接肽残基的构象密切相关,所以有必要对序列对应的每一种二级结构进行详细的统计和分析,过程如下:
由于Loop-α-Loop结构中含有6~29个氨基酸的序列数占83.6%,为保证大部分序列被选入,且所选取的序列两端β折叠至少含有2个氨基酸残基,序列总长确定为33个氨基酸残基。确定β-α-β模体的固定长时采取以Loop-α-Loop为中央标准位置对齐,选取时需满足:当序列总长大于33时,只保留Loop-α-Loop长小于等于29的序列。选取方式参考了Kuhn[2]、Kumar[4]和Cruz[3]等的对β发夹固定模式片段截取方法。
1.3 方法
1.3.1 矩阵打分算法(PCSF)
此算法分为下面3步介绍
1.3.1. 1 位置打分矩阵的构建
考虑到氨基酸频率计数时的标准偏差的影响,引入了伪计数[6]来计算折叠子的位置概率作为打分矩阵的矩阵元,公式如下:
其中,l表示参数的个数,j表示各种参数,Ni表示第i个位置上所有参数出现的总数,nij表示第i个位置上第j种参数出现的频数,P0j表示参数j出现的背景概率。
1.3.1. 2 位点保守性参量
位点的保守性参量反映了位点氨基酸的保守性,位点的保守性参量Ii,定义如下:
1.3.1. 3 矩阵的相似性打分函数
根据(1)的矩阵元定义和(2)位点的保守性参量定义,可以组合成下列的打分函数:
F(S)称为片段打分值。其中,pi,mi n和pi,max分别是位置概率矩阵的第i列上出现的最小值和最大值。Ii由公式(2)可以求得。
1.3.2 距离函数(DM)
距离函数(DM)可以衡量所研究的样品之间存在的相似性,已被成功的应用于蛋白酶的预测研究。距离函数的计算公式如下[9]:
其中P表示20维向量(f1,f2,….f20),fi表示第i个氨基酸(20个氨基酸)出现的概率,P·Pi表示P和Pi的点积,‖P‖和‖Pi‖分别是它们的模。可以证明0≤△(P,Pi)≤1。
序列片段P被预测为△(P,Pβ-α-β)和△(P,Pnon-β-α-β)中的最大值所属的类别,可以由下面的公式表示:
1.3.3 二次判别方法(DQ)
由Chou等人提出的二次判别方法(DQ)是协方差判别函数的应用。具体计算为:
ξ将给出片段所属类别。
使用QD方法预测β-α-β和非β-α-β,对任意一序列片段,组合由PWM方法得到的2个分值、DM方法得到的2个距离值,将这4个值作为QD的输入参数。
1.3.4 精确评价指标
为了评价预测的正确率和预测方法的可信度,精度(S)、相关系数(Mcc)、β-α-β模体的敏感性(Sn)、非β-α-β模体的敏感性(Sn N)、β-α-β模体的特异性(Sp)和非β-α-β模体的特异性(Sp N)如下计算:
p为真阳性样本序列数,r为真阴性样本序列数,u假阴性样本序列数,o为假阳性样本序列数。
2 结果与讨论
训练集5交叉检验的预测结果
2.1 QD方法的预测结果
为了进一步提高预测性能,组合上述计算的PCSF和DM值作为QD的输入参数,得到了较好的预测结果见表1。Mcc的值上升为0.49,总精度也提高到了75.51%,预测效果得到了改善。
2.2 独立检验集中β-α-β模体预测结果
为了检验预测方法,对独立检验集中的β-α-β和非β-α-β模体使用同样的方法进行预测。对独立检验集分别使用PCSF、DM和QD方法的预测结果见表2。
由表2的预测结果可以看出,独立检验集使用QD方法的预测结果好于PCSF和DM方法,独立检验集中的Mcc值0.43,预测总精度72.23%。
3 结论
本文使用的数据库包含的蛋白质结构类型有全β型、α+β型和α/β型,选择的数据库远远大于Taylor和Thornton在1983和1984年对β/α类的18个蛋白质中的62个β-α-β模体进行预测的数据库[5,6],而且本文进一步运用了距离函数,以组合向量为参数进行预测,预测效果得到了明显的改善。成功的预测指出:应用的参数包含了模体的序列信息和结构信息;距离函数的引入,更反映出了数学模型应用于蛋白质超二级结构是成功的;用打分函数和距离函数值来表示位点氨基酸组分信息,保证了序列片段的保守性。因此基于数学模型的组合向量的二次判别方法是一种预测酶蛋白质中复杂超二级结构的有效方法。
摘要：蛋白质超二级结构β-α-β模体是蛋白质的重要组成部分,所以蛋白质超二级结构β-α-β模体的研究有重要的生物学意义。根据蛋白质超二级结构的保守性,用打分值、距离函数值构成的向量来表示序列信息,通过二次判别方法对蛋白质中β-α-β模体进行识别,得到了较好的预测结果。
关键词：蛋白质结构预测,β-α-β模体,打分矩阵,距离函数,二次判别方法
参考文献
[1]阎隆飞,孙之荣.蛋白质分子结构[D].清华大学出版社,1999:43-59.
[2]Kuhn,M,Meiler,J.and Baker,D.Strand-loopstrand motifs:prediction of hairpins and diverging turns in proteins[J].Proteins:Struct Funct Bioinform,2004(54):282-288.
[3]Cruz,X,Hutchinson,E.G,Hepherd,A.S.et al.Toward predicting protein topology:an approach to identifying B hairpins[J].Proc Natl Acad Sci,USA,2002(99):11157-11162.
[4]Kumar,M,Bhasin,M.Bhair Pred:prediction ofβ-hairpins in a protein from multiple alignment information using ANN and SVM techniques[J].Nucl Acids Res,2005(33):154-159.
[5]Taylor,W.R,Thornton,J.M,Recognition of supersecondary structure in proteins[J].Mol Biol.1984 Mar15,173(4):487-512.
β热处理 篇6
聚-β-羟基丁酸酯(PHB)是一种由细菌发酵产生的热塑性聚酯[9],具有良好的生物降解性和生物相容性。但其存在易结晶、疏水性强和降解时间长[10]等缺点。本研究设计用PHB改性PMLA,以期改善聚苹果酸的性能。以苯甲酸四乙铵为引发剂,通过阴离 子开环引 发β-苹果酸苄 基内酯(MLABe)和β-丁内酯 (BL)开环共聚,得到一定 分子量的P(MLABe-co-BL)共聚物,氢化苄基 后得到两 亲性的P(MLA-co-BL)共聚物,为后续作为药物载体和组织工程支架材料等生物医学研究和应用方面奠定基础。
1 实验
1.1 原料与仪器
硫酸、正己烷、氯仿、二氧六环、四氢呋喃、苯甲醇(分析纯),购自国药集团上海化学试剂有限公司。亚硝酸钠、溴化钠、氢氧化钠、无水硫酸 镁等购自 天津市登 封化学试 剂厂。苯甲酸四乙基铵参考文献[11]的方法,实验室自制。β-丁内酯[β-Butyrolactone]购自Sigma-Aldrich公司,为分析纯 试剂,实验前没有纯化处理。L-天冬氨酸购自上海楷洋生物技术有限公司;三氟乙酸酐购自济南万兴达化工有限公司,为分析纯试剂。采用FT-IR8400S红外光谱仪(日本岛津公司)对合成样品进行红外表征,分析条件为共聚物溶于氯仿,用毛细管吸入少量滴到KBr片上,挥干测定。采用核磁共振波谱仪(美国Bruker公司,400 MHz,1 H-NMR和13 C-NMR)确定合成样品的结构。采用凝胶渗透色谱仪(GPC美国Wa-ters公司AllianceGPCV-2000)测定样品的分子量,测定条件为单分散聚苯乙烯标定,35℃。采用差示扫描量热仪(DSC,法国SETARAM Instrumentation)测定合成样品的玻璃转化温度,测定条件为将50mg样品在氮气下以1℃/min从0℃加热到50℃测定。采用粒度分析仪(美国Beckman Coulter公司Delsa Nano C Particle Analyzer)测定样品的Zeta电位(mV),测试条件为样品溶于蒸 馏水中形 成1 mg/mL的溶液。
1.2 单体和共聚物的合成
1.2.1 β-苹果酸苄基内酯单体的合成
参考文献[12]的方法,以L-天冬氨酸为原料,经重氮化反应生成溴代丁二酸;将得到的溴代丁二酸溶于无水四氢呋喃中,在三氟乙酸酐的作用下脱水得到溴代丁二酸酐;再把得到的溴代丁二酸酐溶于无水四氢呋喃中,与苯甲醇45℃油浴反应12h;减压蒸馏除去溶剂后用2mol/L的氢氧化钠调节pH至7.2,加入与溶液相当量的二氯甲烷,45℃油浴反应24h,分离,水洗和硅胶柱(规格:3,粒度:300~400目的柱层层析硅胶填充)分离纯化得到纯度较高的β-苹果酸苄基内酯(图1),产率为39%±0.8%,1 H-NMR(400MHz,CDCl3):δ7.3~7.45 (5H),δ3.8~4.1、5.24 (2H),δ5.1~5.2(1H)。
1.2.2 聚-β-羟基丁酸酯(PHB)的合成
参考文献[13,14]的方法,按所需的单体与引发剂的物质的量比(M/I=1000)投料,先把引发剂苯甲酸四乙铵乙醇溶液(86mg/mL)加入到圆底烧瓶中,抽真空形成白色固体,保持真空状态,取一定量的BL加入到引发剂中,抽真空、充氮气重复3次抽走空气,充分混匀后,保持真空60℃下聚合;聚合完成后加入一定量的氯仿溶解,然后加入大量的正己烷沉降,真空干燥,得到苄基共聚物。
1.2.3 聚(β-苹果酸苄基酯-co-β-羟基丁酸酯)(P(MLABe-co-BL))的合成
同上,取一定比例的MLABe和BL加入到另一圆底烧瓶中,抽真空、充氮气重复3次抽走空气,充分混匀后,在氮气保护下用带长针头的注射器吸取注入到真空状态下的引发剂瓶中,再抽真空、通氮气重复3次后,保持真空60℃下聚合;聚合完成后加入一定量的氯仿溶解,然后加入大量的正己烷沉降,真空干燥,得到苄基共聚物(图2)。
1.2.4 P(MLABe-co-BL)的氢化
P(MLABe-co-BL)溶于二氧六环后,加入催化剂10%的钯-碳,常温常压搅拌下氢化脱苄基。反应12h后滤除钯-碳,浓缩滤液,用大量乙醚沉淀,得到两亲性共聚物P(MLA-co-BL),真空干燥(图2)。
2 结果与讨论
2.1 β-苹果酸苄基内酯单体的结构分析
图3(a)是β-苹果酸苄基内酯的1 H-NMR(CDCl3)图谱,其中,δ7.3~7.45(C6H5,5H)为苯环特征峰;δ5.24(CH2,2H)为苄基亚甲基峰;δ5.1~5.2(CH,1H)为内酯环中次甲基特征峰;δ3.6~4.1(CH2,2H)为内酯环中亚甲基峰。图3(b)是β-苹果酸苄基内酯的IR(KBr,cm-1)图谱,其中,1845cm-1处为内酯上的C=O特征伸缩振动峰,1743cm-1处为苄基酯上的C=O特征伸缩振动峰,1000~1300cm-1处为内酯中C-O-C的对称伸缩振动峰,与文献[12]的报道一致。
2.2 PHB聚合物的结构分析
本实验首次以苯甲酸四乙铵为引发剂引发BL开环聚合,采用FT-IR、1 H-NMR、13 C-NMR表征所得 聚合物PHB的化学结构(图4)。FT-IR(KBr,cm-1)图中,1740cm-1为C=O的特征伸缩振动峰,1186cm-1为C-O-C的特征伸缩振动峰。图4(a)是PHB的1 H-NMR(400 MHz,CDCl3)图谱,其中,δ5.07(CH,1H)为次甲基特征峰;δ2.1~2.5(CH2,2H)为亚甲基特征峰;δ1.1(CH3,3H)为甲基特征峰。图4(b)是PHB的13C-NMR(400 MHz,CDCl3)图谱,其中,δ78为溶剂CDCl3峰,4个主峰δ169、δ67.6、δ40.3和δ19.7分别对应羰基碳、次甲基碳、亚甲基碳和甲基碳的化学位移。
2.3 P(MLABe-co-BL)共聚物的聚合分析
由表1可知,聚合单体含量不同,聚合物组成有明显差别,分子量都在104以上。MLABe组分越多,聚合所需时间越短,数均分子量(Mn)和重均分子量(Mw)也逐渐增大(除c组外),表明MLABe的竞聚率可能比BL的大,反应初期形成PMLABe-PMLABe嵌段,在聚合过程中酯交换作用使各单元序列重新分布,可能形成渐变型嵌段共聚物向无规共聚物转化,最后趋向于无规共聚物,加入BL的比例越多,聚合时间就越长。图5中亚甲基、次甲基的变化也说明不同投料比聚合反应中聚合物各部分间的相互作用的变化结果。各组对比发现,当MLABe和BL的比例为75/25(物质的量比)时,聚合时间短且共聚产物分子量适中,分布宽度窄,优于文献[15]报道值。c组分子量比其他组都小、PDI较大,说明两组分投料比相当时形成的共聚物无规度最大,可能形成无规共聚物,但不易反应,聚合时间较长。
注:a:根据(nMLABe+nBL/n引 =1000,nMLABe/n总 +nBL/n总 =100%,V =m/ρ计算各物质加入的体积,ρMLABe=1.635g·mL-1,ρBL=1.056g·mL-1,MMLABe=206g·mol-1,MBL=86g·mol-1;b:聚合完成所需时间;c:GPC苯乙烯标定,THF为溶剂,35℃测定分子量和分子量分布宽度
图5是表1中各组的核磁共振氢谱。从图5中可以看出,δ7.26处氢谱吸收峰很强,是苯环和溶剂CDCl3的吸收峰,δ5.6(CH,1H)是共聚物链上次甲基特征峰,δ5.0(CH2,2H)是苄基上亚甲基峰,δ2.5~3.1(CH2,2H)是聚合物链上亚甲基峰,δ1.6(CH3,3H)是甲基特征峰,而图5(a)在1.6处没有氢化学位移,是因为MLABe和BL的比例为100/0(物质的量比),聚苹果酸苄基酯(PMLABe)不含甲基。图5(e)在δ7.26处有氢化学位移,认为是CHCl3的峰,因为MLABe和BL的比例为0/100(物质的量比),聚合形成PHB,不含苄基,在δ7.26处没有苯环峰。共聚后由于各组分间的相互作用,使得亚甲基裂分和位移有所影响,在不同组分中亚甲基的位置有很小的移动。
2.4 微观机理分析
Guillaume课题组以金属有机催化剂引发开环聚合,为阳离子引发机理[16],而本实验采用阴离子引发剂苯甲酸四乙铵,BL和MLABe发生阴离子开环聚合。聚合反应过程为:C6H5COO-对β-甲基的碳原子进行亲核进攻,发生烷-氧键开裂,阴离子增长链段和引发剂都是亲核试剂,在聚合反应中,它能不断地对β-内酯环进攻而发生开环(图6),一旦引发产生阴离子,就发生链增长,最后形成聚合物。
表1中c组PDI为1.43,大于其他任一组分,这一结果表明β-苹果酸苄基内酯与β-丁内酯共聚过程中酯交换反应剧烈。反应初期形成嵌段共聚物,酯交换作用使各单元序列重新分布,序列长度变短,没有达到完全无规化但趋向无规化,最终所得共聚物应 为无规化 共聚物。从共 聚物的羰 基13C-NMR峰(图7(a))可以看出聚合的渐变过程,从左往右分别为δ168.7(BL-BL)、δ168.3(BL-MLABe)、δ168.2(MLABe-BL)、δ168.1(MLABe-MLABe),表明此共聚物应为无规共聚,与文献 [15]报道一致。另 外,红外光谱 (图7(b))和示差扫描量热法(DSC)测试结果(图8)也支持这一结论,若红外光谱羰基裂分为两重峰和玻璃转化温度(Tg)为2个值,则说明为嵌段共聚物,但测试结果表明:FT-IR(KBr,cm-1)中羰基为1751.24cm-1无裂分,玻璃转化温度只有一个值,为Tg=27.9℃,因此红外中羰基峰的裂分情况和示差扫描量热法的测试结果也表明此共聚应为无规共聚。
2.5 两亲性共聚物的结构分析
图9 (a)为P(MLABe-co-BL)氢化苄基 后的1 H-NMR谱,其中,δ1.1(CH3,3H)为甲基特征峰,δ3.0(CH2,2H)为亚甲基特征峰,δ5.5(CH,1H)为次甲基特征峰,δ7.1(C6H5)处没有苯环的氢化学位移,说明苄基氢化后形成了羧基,生成了两亲性的共聚P(MLA-co-BL),此共聚物悬挂基团为羧基和甲基,因此相比PMLA,其亲水性降低。图9(b)为氢化前后两种共聚物的FT-IR谱,其中,1742~1747cm-1处为羰基的特征峰,P(MLABe-co-BL)谱图中位于700~800cm-1间的苯环上的C-H弯曲振动在P(MLA-co-BL)的红外谱图中已消失,说明P(MLABe-co-BL)上的苄基已被完全脱去。
共聚物P(MLABe-co-BL)的Zeta电位(表2)为-(4.94±0.0402)mV,比PMLA的-(28.07±0.0259)mV大得多。PMLA作为药物控释载体材料、组织工程材料等,在生物材料方面有广泛的应用,但本课题组前期的工作中发现其负电性太强,不利于入胞,本实验通过对PMLA的改性,能够很好地改善PMLA负电性太强的缺点,为后续载药入胞奠定基础。
3 结论
β热处理 篇7
1 资料与方法
1.1 一般资料
选用雄性健康大鼠24只, 体质量为 (300±30) g。将动物随机分成模型组、试验组、假手术组, 每组8只。
1.2 研究方法
麻醉完毕后开胸暴露心脏, 在左冠状动脉处穿一丝线, 以结扎动脉达到固定持续缺血的效果, 30min解除结扎再灌注120min。假手术组只穿线而不行结扎操作。试验组在结扎左冠状动脉后5min注射胸腺素β4。
灌注结束后正确的制备血清和心肌匀浆, 然后分别测定血清和心肌匀浆中的SOD、MDA, 统计实验结果, 进行统计学处理。
2 结果
见表1和图1。
注:由表1, 模型组较假手术组的血清及心肌MDA含量SOD活性显著改变 (P<0.01) ;试验组和模型组有统计学差异。
3 讨论
心肌细胞为终末分化细胞, 心肌损伤后不能修复坏死心肌[4,5,6]。心脏受损致使心脏细胞死亡, 而剩余的心肌细胞不能再生替代坏死组织, 损伤区的心脏形成瘢痕[7]。影响心功能, 最终导致心力衰竭。其对心肌的保护作用机制可能有以下几种:
3.1 刺激成人心外膜干细胞分化
心脏衰竭的重要潜在病因之一是脉管功能不足而引发的缺血性损伤。胸腺素β4从心肌层中分泌, 刺激心外膜细胞的旁分泌, 促使心外膜的细胞移到心肌层, 并分化形成冠状动脉的内皮细胞和固定血管的平滑肌细胞。Smart等[8]发现胸腺素β4能刺激心外膜干细胞分化生成新的心脏血管, 胸腺素β4对冠状动脉粗管发育的各个环节都非常重要, 能显著刺激处于静止期的心外膜移植体的生长, 恢复成纤维细胞、平滑肌细胞及内皮细胞的多能性, 并诱导其分化;选择性的敲除心脏胸腺素β4基因会使剪切产物 (AcSDKP) 水平显著下降, 注射AcSDKP虽然不能使心脏恢复, 但也能显著增强成年小鼠心外膜前体细胞向内皮细胞分化, 这表明TB4和AcSDKP是有力的冠状动脉和促新牛血管生成的刺激因子。说明胸腺素β4在血管形成的血管发生、血管形成、动脉形成的这3个关键时期是必不可少的。
3.2 缺氧组织中的积极作用
缺血心肌坏死的最主要的原因是需氧与氧供应的失衡, 研究表明胸腺素β4对改善组织的缺氧有着积极地作用, 在发生局灶性脑缺血后胸腺素β4的表达量会升高, 这表明在修复和重塑未完全损伤的神经元过程中, 神经突触的延长和恢复需要胸腺素β4。缺氧过程中, 胸腺素β4在神经细胞的形成、重建以及编码基因的转录过程中都起着积极的促进作用[3]。
3.3 抗细胞凋亡
细胞凋亡是急性心肌缺血和再灌注过程中心肌细胞死亡的重要原因, 在诱发性心肌梗死啮齿类动物模型研究发现胸腺素β4对受损的心肌具有明显的保护作用。同时, 还有研究发现加入胸腺素β4后体外培养的心肌细胞能存活明显高于对照组。胸腺素β4还能保护暴露于腐蚀性物质而受损的角膜上皮细胞能阻止细胞凋亡。
3.4 抑制炎性反应
心肌损伤伴有炎症的发生, 胸腺素β4可以促进损伤愈合和降低细胞因子和趋化因子mRNA的表达, 尤其可以降低白细胞介素-1和巨噬细胞炎症反应蛋白的转录。这表明胸腺素β4降低了多形核细胞的炎症反应, 确保了炎症反应的强度, 以达到促进损伤愈合的作用。
综上所述, 胸腺素β4有较为复杂的生物学功能, 能从多种机制和途径促进伤口的愈合。研究表明胸腺素β4能通过刺激成人心外膜干细胞分化、抗细胞凋亡、抑制炎性反应、缺氧组织中的积极作用等机制对心肌缺血再灌注损伤有保护作用。
参考文献
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