基因干扰（共9篇）
基因干扰 篇1
摘要：为了研究冷诱导RNA结合蛋白 (CIRP) 更深入的功能及意义, 试验通过Lipo FiterTM将黑龙江八一农垦大学动物生理生化实验室之前已构建好的5组RNA干扰重组载体及空载体分别瞬时转染到大鼠肝细胞中, 提取细胞RNA经反转录后进行荧光定量PCR试验, 获得各组干扰载体对CIRP基因干扰后CIRP基因mRNA的相对表达量, 确定效果最佳的干扰靶点。结果表明:在5组干扰试验组CIRP基因mRNA的表达量中, 264组与空白对照组的表达量差异显著 (P<0.05) , 并且干扰效率达到70%以上;阴性对照组 (空载体组) 与空白对照组的表达量基本相同, 差异不显著 (P>0.05) 。说明试验成功筛选出有效干扰靶点。
关键词：冷休克蛋白,CIRP,RNA干扰,荧光定量,冷应激
冷诱导RNA结合蛋白 (Cold inducible RNA-binding protein, CIRP) 是在哺乳动物机体中发现的第一种冷休克蛋白, 此蛋白是由172个氨基酸构建而成的, 其分子质量为18 ku, 并且具有RNA结合域, 低温时可被诱导使其大量表达, 在冷诱导的细胞生长抑制中起着重要作用。同时, 近年来的研究发现, CIRP可能参与人和动物的生殖发育、神经发育与调节、胚胎发育、肿瘤发生以及动物冬眠等生理学过程[1,2,3,4]。最近的研究发现, CIRP能够抑制由TNF-α诱导的细胞凋亡过程。由此可见, CIRP是发挥广泛生物学作用的多功能蛋白, 同时在冷应激中对冷损伤起到一定的保护作用, 开展深入研究并揭示其作用机制对开发其潜在的应用价值具有重要意义, 将来也许可以在分子水平减少冷应激对畜牧业造成的经济损失。
RNA干扰 (RNA interference, RNAi) 是一种先进的、能特异且高效地抑制目的基因表达的技术, 通过特异阻抑目的基因的mRNA表达和转录翻译, 进而沉默功能基因蛋白的表达。该技术已经成为高通量研究基因功能的有力工具[5,6,7]。RNAi不仅可以有效地研究目的基因的生物学作用机制, 而且还可以有效地了解其所参与的信号网络及下游基因的调控机制。在RNAi技术应用中, siRNA/shRNA是以往研究应用较为普遍、效率较高的干扰方式, 而近年来发现miR-NA作为一类非编码小分子RNA, 具有和siRNA相似的功能, 可以调节细胞内基因表达。针对miRNA前体分子环状结构序列而设计的靶基因干扰序列, 在生物体内经过作用后不仅可以与其对应互补的mRNA序列结合, 使mRNA降解, 还可以通过与目的mRNA靶基因的非翻译区特异性结合来阻抑mRNA的翻译。因此, 本研究使用本实验室模拟体内RNAi通路已构建好的5组携带miRNA干扰片段的载体, 通过脂质体瞬时转染大鼠肝细胞, 采用实时荧光定量PCR法在5组载体中筛选出CIRP的最佳干扰靶点, 为后续试验奠定基础。
1 材料
1.1 菌种及细胞
RNA干扰重组载体、空载体和大鼠肝细胞株, 由黑龙江八一农垦大学动物生理生化实验室提供。
1.2 主要化学试剂
TRIZol, 购自美国Invitrogen公司;反转录酶、Taq酶、DL-2 000 Marker、DL-5 000 Marker, 均购自宝生物工程 (大连) 有限公司;T4 DNA连接酶、p GEM-T Easy, 购自Promega公司;DEPC、大观霉素, 购自Sigma公司;普通琼脂糖凝胶, 购自Omega公司;Lipo FiterTM, 购自汉恒生物科技有限公司;SYBR Green荧光定量检测试剂盒, 购自美国伯乐公司;质粒小量提取试剂盒, 购自北京博大泰克公司;DMEM、小牛血清, 均购自Gibco公司;其余试剂均为进口分装或国产分析纯。引物的合成和测序均由金唯智生物技术服务有限公司完成。
2 方法
2.1 CIRP基因RNA干扰重组载体的测序验证
黑龙江八一农垦大学动物生理生化实验室已构建好的5组干扰重组载体分别为:pc DNA6.2 GW/Em GFP-131、pc DNA6.2 GW/Em GFP-264、pc D-NA6.2 GW/Em GFP-405、pc DNA6.2 GW/Em GFP-645、pc DNA6.2 GW/Em GFP-707 (以下分别写为131, 264, 405, 645, 707) , 另选空载体pc DNA6.2 GW/Em GFP-neg作为对照。将各个菌种活化后分别涂到含有大观霉素的抗性平板上, 37℃培养箱中培养12~18 h, 挑取单菌落扩增培养后, 用质粒小量提取试剂盒提取质粒, PCR初步鉴定后, 送到金唯智生物技术服务有限公司测序。
2.2 干扰质粒瞬时转染大鼠肝细胞
本试验共设7个试验组:包括5个干扰组、阴性对照组 (pc DNA6.2 GW/Em GFP-neg) 以及空白对照组, 每组3个重复。于转染前1天, 利用胰蛋白酶消化肝细胞, 按每孔1×105个细胞接入12孔板, 分别使细胞置于1 m L含DMEM+10%FBS+1%青霉素/链霉素双抗生素培养基中, 在5%CO2、37℃条件下培养, 转染前将细胞融合度调整至70%~80%。转染当天, 给细胞更换新鲜的培养基1 m L (可以含血清和抗生素) , 37℃孵育。配制转染混合物 (A管:分别取干扰载体pc DNA6.2 GW/Em GFP-miR及阴性对照pc DNA6.2 GW/Em GFP-neg与DMEM培养基混匀;B管:取不含抗生素和谷氨酰胺的DMEM溶液与Lipo FiterTM混匀) , 室温静置5 min;分别取B管溶液加入A组各管中混合, 室温孵育20 min;将上述混合液分别滴加到12孔板的大鼠肝细胞中, 轻轻摇匀细胞培养板, 37℃培养箱中孵育6 h;然后更换新鲜培养基, 转染48 h后, 用荧光显微镜观察细胞的转染效率。
2.3 CIRP mRNA相对表达量的荧光定量PCR检测
分别收集转染48 h后各个试验组的细胞, 加入1 m L TRIZol试剂于室温静置5 min;加入200μL预冷的氯仿, 涡旋混匀后在室温下放置3~5 min;待其分层后放入4℃离心机中12 000 r/min离心15 min;将含有RNA的上层水相转移到新的EP管中, 并加入等体积的预冷异丙醇, 混匀后为增加RNA沉淀将其置于4℃静置30 min;之后置于4℃离心机中12 000 r/min离心10 min;弃上清液, 用1 m L 75%乙醇洗涤沉淀, 温和振荡, 悬浮沉淀后置于4℃离心机中8 000 r/min离心5 min;弃上清液, 收集沉淀, 室温干燥5~10 min (不可过干) ;用20μL DEPC水溶解RNA沉淀, 检测RNA浓度及纯度。将反转录获得的c DNA作为模板, 得到目的基因CIRP上游引物5'-TAAAGGACAGGGAGACTCAACG-3', 下游引物5'-CTTGCCAGCCTGGTCAACTCG-3', 扩增片段长度为534 bp;内参基因β-actin上游引物5'-TCAC-CAACTGGGACG-3', 下游引物5'-GCATACAGG-GACAACA-3', 扩增片段长度为205 bp。通过RT-PCR预试验摸索各引物的PCR扩增条件, 按荧光定量PCR试剂盒说明配制反应体系, 反应置于荧光定量PCR仪中, 设定程序:95℃30 s;95℃5 s, 60℃20 s, 72℃20 s, 共40个循环。进行荧光信号实时检测, 荧光定量PCR数据分析采用2-ΔΔCt (Ct代表循环阈值) 分析法。
3 结果
3.1 RNA干扰重组质粒测序结果
PCR初步鉴定结果见图1。将测序结果 (见267页彩图2) 与预期序列逐一进行比对, 2份序列完全相同。因此, DNA测序结果证实黑龙江八一农垦大学动物生理生化实验室之前构建并保存的RNA干扰重组载体的菌种未受到杂菌的污染, 可以进行后续试验。
M.DL-2 000 Marker;1.pcD NATM6.2-GW/EmG FP-miR-neg质粒的扩增产物;2.空白对照;3~7.靶点131, 264, 405, 645, 707。
3.2 瞬时转染结果
瞬时转染48 h后, 荧光显微镜下观察转染效率, 结果表明, 瞬时转染效率在70%左右 (见267页彩图3) , 可以进行后续试验。
3.3 筛选干扰CIRP的有效片段
在各试验组中, 只有264组的干扰效率达到70%以上, 并且与空白对照组相比差异显著 (P<0.05) , 因此, 其miRNA序列是CIRP基因RNA干扰的有效序列;同时, 阴性对照组与空白对照组表达量大体相同, 差异不显著 (P>0.05) , 见图4。
注:与空白组相比, *表示差异显著 (P<0.05) 。
4 讨论
冷应激可以对动物机体在某些生理活动方面造成不良的影响, 例如, 动物的生产性能、繁殖性能、自身免疫以及所提供的产品质量。而其中动物生产性能的变化是冷应激对动物的负面影响最直接的表现:在冷应激条件下, 动物摄入的能量从为了维持原来的生产转变为维持自身体温, 而且在适应了冷应激以后, 动物摄入的饲料量增加, 机体的基础代谢率增加, 所以能量储备会减少很多。B.J.Young等[8,9]的研究发现, 环境温度在每下降1℃的时候, 牛为了维持1 kg代谢体重对能量的摄入需要增加大约2.89 k J, 同时对饲料的摄入则需要增加30%~70%。并且冷应激较强烈时会对动物有更严重的影响:可导致动物生产性能降低, 免疫力下降, 易感染呼吸道疾病, 甚至死亡。与其他应激反应相同, 冷应激同样涉及众多内源性物质和复杂的调控机制, 而且冷应激反应是生物界中一种高度保守的适应性反应。虽然近些年的研究对冷应激在宏观角度和细胞层次都有了初步的了解, 但是在冷应激的始动、冷应激损伤的修复、冷应激的调理与适应、冷应激调控分子间相互作用、冷应激的后续效应等方面尚有许多未解的难题, 并且关于冷应激损伤的防治还未有突破性进展。经过大量的研究发现, CIRP不仅在人和动物的冷应激过程中对不同组织器官起到一定的保护作用, 而且在人和动物的生理和病理等多方面也有着重要的影响, 因此对其进行更深入的研究很有可能揭示冷应激反应的调节机制[10,11]。
RNAi是正常生物体内抑制特定基因表达的一种现象, 生物体内利用双链RNA (double stranded RNA, dsRNA) 诱导同源靶基因的mRNA发生特异性降解, 从而导致基因沉默。RNAi自1998年被发现以来, 在其作用机制研究、应用于生物基因组中特定基因功能的研究、封闭和阻断病原体基因表达等方面, 取得了重要进展, 显示出良好的应用前景。此机制广泛存在于动物、植物等各种生物体内, 在生物基础、医学、药学和植物学等领域都能看见它的身影, 是目前分子生物学领域研究的热点之一, 并且对于其在基因治疗中的潜在应用价值已引起人们的广泛关注[12]。黑龙江八一农垦大学动物生理生化实验室之前已构建出CIRP过表达载体, 并且验证了其能过量表达。而本研究筛选出CIRP有效干扰靶点是作为后期通过CIRP过表达来研究CIRP相关功能的一个印证部分, 目的在于在特定试验条件下, 将CIRP基因过表达对某个生理过程的影响与CIRP基因被沉默后对相同的生理过程的影响做对照, 可以更直接地研究CIRP的相关功能, 同时为探讨其相关作用机制奠定了基础。
黑龙江八一农垦大学动物生理生化实验室之前已经构建好的RNAi重组载体是选用Invitrogen公司设计的专用于miRNA干扰的质粒pc DNA6.2-GW/Em GFP-miR作为载体, 此载体包含具有高效和持久性启动表达特点的CMV启动子, 同时CMV启动子能够在大多数哺乳动物细胞内发挥活性, 且CMV启动子携带大观霉素和杀稻瘟菌素双抗性, 使其对原核和真核都可以进行筛选;并且质粒上还带有Em GFP绿色荧光蛋白表达基因, 有利于转染效率的观察。本试验通过脂质体瞬时转染RNAi重组载体来筛选CIRP的最佳干扰靶点, 是因为质粒稳定性好不易降解并可以大量制备, 更重要的是它可以将靶基因的特异性RNAi序列表达结构利用RNAi重组载体转入靶细胞中, 可以提高转入效率, 达到长久稳定的基因沉默效果[13], 操作简便且耗时较短, 节约资源。本试验筛选出有效干扰序列, 为后续有针对性的病毒包装以及研究CIRP功能打下了坚实的基础。
基因干扰 篇2
提取经刀豆素(ConA)诱导培养的水牛外周血淋巴细胞的总RNA,采用RT-PCR技术扩增水牛IFN-γ基因,将其克隆到pMD18-T载体上,并进行测序.序列分析结果表明,获得的IFN-γ基因全长为544个碱基,其开放阅读框(ORF)为501个碱基,编码166个氨基酸.与GenBank上已发表的水牛、乳牛的IFN-γ基因进行同源性比较,其核苷酸同源性均高于97%,氨基酸同源性均高于96%;与其他种类动物的IFN-γ的.同源性相比,随其亲缘关系的远近有所降低.
作 者：熊毅 朱伟 徐贤坤 龙剑明 刘棋 XIONG Yi ZHU Wei XU Xian-kun LONG Jian-ming LIU Qi 作者单位：熊毅,朱伟,徐贤坤,刘棋,XIONG Yi,ZHU Wei,XU Xian-kun,LIU Qi(广西动物疫病预防控制中心,广西南宁,530001)
龙剑明,LONG Jian-ming(广西大学动物科学技术学院,广西南宁,530005)
基因干扰 篇3
在前期工作中,我们构建和筛选了针对Survivin基因的shRNA重组质粒载体,制备了能够高效转染的基因载体——壳聚糖-聚乙二醇纳米颗粒,并制备出壳聚糖-聚乙二醇纳米粒介导的Survivin RNAi基因纳米复合物。初步实验结果表明本实验所制备出的CS-PEG是低细胞毒性的,纳米颗粒的大小适合用作基因递送,具有良好的基因保护功能、长循环能力和较高的载药量、包封率(另文报道)。本实验探讨了该纳米基因载体介导RNA干扰沉默Survivin基因对大肠癌细胞增殖和凋亡的影响,为寻找大肠癌基因靶向治疗提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 材料
大肠癌HT-29细胞株购自中南大学细胞生物学教研室。Metafectene pro转染脂质体(德国Biontex公司);RPMI-1640培养基,杭州吉诺生物医疗技术有限公司;胎牛血清,天津T13D公司;胰蛋白酶,Gibco公司;Trizol试剂,美国Invitrogen公司;DNA Marker ladder 2000,大连宝生物工程公司;Western Blot检测试剂盒,美国Promega公司;碱性磷酸酶标记的羊抗兔二抗,美国Promega公司;RT-PCR试剂盒,大连宝生物工程公司;细胞凋亡检测试剂盒,武汉博士德生物工程有限公司;Survivin si RNA靶序列的设计则根据Genebank提供的基因序列,利用从Genbank中寻找Survinvin基因的m RNA序列,参照si RNA设计原则,设计针对Survivin的si RNA序列,再利用BLAST(http//www.ncbi.nih.gov/blast/Blast.cgi)分析所设计序列的特异性。以与人类基因无同源性的无关序列HK作为阴性对照。将设计的序列交上海吉凯生物公司体外合成靶向Survivin基因的si RNA(GGACCACCGCATCTCTACA)和1条阴性对照si RNA(GACTTCATAAGGCGCATGC)。
1.2 方法
1.2.1 细胞的复苏和培养
将装有人结肠癌细胞株HT-29的冻存管从液氮罐容器中取出后迅速在37℃水浴缸中摇动融化,移入无菌离心管,加入4m L含10%小牛血清的RPMI-1640培养基,37℃1000 r/min离心10 min,除去上清以除去冻存液中的二甲基亚矾(DMSO);加入含血清的培养基5 m L,混匀置入25 cm的培养瓶中,用含100 m L/L胎牛血清的RPMI-1640进行常规培养,待细胞融合度达80%,消化收集细胞。
1.2.2 RT PCR检测转染前后HT-29细胞Sur-vivin mRNA的表达
将HT-29细胞接种于培养瓶中,分为A组(转染壳聚糖-聚乙二醇纳米粒介导的Survivin shRNA的基因-纳米复合物)、B组(转染结合相同Survivin shRNA的脂质体)和C组(阴性对照shRNA)。各组细胞在不同时间用Trizol提取细胞RNA,进行RT PCR检测。
1.2.3 细胞凋亡率和细胞周期分布的检测
实验分为A组、B组和C组,每组设3个复孔,细胞培养及转染方法同前。转染后72 h,将细胞用0.25%胰酶常规消化,轻轻吹打,制成单个细胞悬液。PBS漂洗3次(离心1 000 r/min,5 min),弃上清,加入预冷的70%冰乙醇1 m L振荡混匀,-20℃内固定24 h后使用。取固定好的细胞,1 000 r/min离心5 min,去上清,PBS洗涤2遍。加入50μg/m L的RNAse,室温避光30 min,去除细胞的RNA。加入60μg/m L的碘化丙啶(PI),溶液避光染色30 min后待用。采用Beckon/Dickinson Facssort型流式细胞仪,在480 nm波长处检测,进行细胞凋亡率检测及细胞周期分析。应用相应程序软件进行资料的处理和分析;细胞增殖指数(PI)=(S+G2/M)/(G0/G1+S+G2/M)×100%。
1.2.4 MTT法检测细胞死亡率
将HT-29细胞按1×10/孔接种于96孔板,常规培养;分别于转染后第24、48和96小时弃去各孔培养基,加入MTT及无酚红RPMI-1640;继续孵育4 h后加入DMSO,振荡10min使结晶充分溶解;在酶联免疫仪上,570 nm处测定光吸收值,记录结果;按下列公式计算细胞死亡率:细胞死亡率=(1-实验组平均D值/对照组平均D值)×100%
1.3 统计学分析
采用SPSS 13.0统计软件包进行统计学处理。计数资料以均数±标准差描述,成组的计量资料采用方差分析,比较采用t检验或者最小显著差法(LSD),以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 HT-29细胞中S urvivin mRNA的表达
从图中见GAPDH的m RNA在基因转染前后的含量大致相等,说明制备的纳米载体及重组质粒均不影响GAPDH的表达,以Survivin/GAPDH比值作为Survivin m RNA的相对含量方法具有可靠性。在C对照组和B组均可见明显的Survivin目的DNA条带,B组的Survivin m RNA的表达丰度较C组有所下降,但并不明显。A组的Survivin基因m RNA水平较B、C组明显下调(附图),组间差异有统计学意义(P<0.01)。
2.2 HT-29细胞凋亡率和细胞周期分布的检测
各组细胞的凋亡率和增殖指数如表1,结果显示:A组细胞凋亡率显著高于其他各组,细胞的增殖指数明显低于其他各组;C组细胞死亡率最低,增殖指数最高。
注:1)与阳性对照组和阴性对照组比较,P<0.001;
2)与阴性对照组比较,P<0.05
2.3 CS-PEG介导RNA干扰沉默Survivin基因对HT-29细胞死亡率的影响
利用MTT法进行检测,在转染后24、48和96h,实验各组细胞死亡率如表2,用平方根反正弦转换数据进行完全随机设计方差分析,通过两两比较结果提示:转染后第24、48和96小时,A组细胞死亡率显著高于其他各组,C组细胞死亡率最低(见表2)。
3 讨论
Survivin是近年来发现的一种凋亡抑制因子,属于凋亡抑制蛋白(IAP)家族的新成员。Survivin能抑制Fas、bax及Caspase-7诱导的细胞凋亡,而在已凋亡的细胞中,Survivin m RNA的表达显著下调。癌细胞由于Survivin对凋亡的抑制,细胞得以继续分裂,使肿瘤邻近和远隔部位转移灶形成[9]。近年来研究证明Survivin不仅抑制肿瘤细胞凋亡,还与肿瘤细胞的增殖有关,肿瘤组织中过度表达Survivin会促使肿瘤细胞不断分裂增殖,加快肿瘤生长。作为IAP家族中目前发现的唯一同时参与细胞凋亡与周期调控的分子,Survivin对维持细胞快速增殖及肿瘤细胞的“正常生理功能”具有非常重要的作用。其异常表达可能与直肠癌的恶性生物学行为有关,Survivin表达阳性的直肠癌更倾向于出现转移、血管浸润等恶性行为[10]。更重要的是,Survivin具有高度选择性地表达于胚胎发育组织和大多数肿瘤组织,而在正常成熟组织中不表达[10,12]。基于以上特性,Survivin可作为肿瘤治疗的理想靶基因,阻断其表达有特异性地防治癌症的发生发展和转移的作用。因此,应用RNAi技术沉默Survivin诱导大肠癌细胞凋亡及抑制其生长增殖,是一个新的研究热点。但是RNA干扰仍存在一个关键问题,即如何使尽量多的shRNA分子到达目的细胞并持续发挥干扰作用,目前多采用脂质体直接包裹人工合成的改性si RNA或包裹携在宿主细胞中表达si RNA的前体分子(即shRNA)进行转染。但以上两种方法的缺陷在于:基因表达时间短,表达量低,无法达到满意的效果。为了解决这一问题,本研究在前期制备出了壳聚糖-聚乙二醇纳米粒作为基因载体,并由其介导针对人Survivin的shRNA,形成基因纳米复合物。初步实验结果表明本实验所制备出的CS-PEG是低细胞毒性的,纳米颗粒的大小适合用作基因递送,具有良好的基因保护功能、长循环能力和较高的载药量、包封率。
本实验证明壳聚糖-聚乙二醇纳米粒作为基因载体介导RNA干扰沉默Survivin基因能高效转染结肠癌细胞株HT-29并使其携带的外源性基因有效表达,同时,研究结果也表明:其能够长期、高效地抑制结肠癌细胞(HT-29)中Survivin蛋白的表达,诱导癌细胞凋亡并抑制其增殖。另外,壳聚糖-聚乙二醇纳米基因载体的特性,使得该纳米粒介导的Survivin RNAi基因纳米复合物,能较长时间地抑制结肠癌细胞HT-29中的Survivin基因,且能够克服RNA干扰在肿瘤的基因治疗中作用短暂和不能持久作用的不足。
参考文献
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基因干扰 篇4
RNA干扰对离体大鼠神经干细胞NgR基因表达的影响
目的 观察RNA干扰(RNA interference,RNAi)对离体大鼠神经千细胞的Nogo-66受体(Nogo-66 reeeptor,NgR)基因表达的影响.方法 设计并合成3条大鼠NgR基因mRNA的小分子干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)转染体外培养的神经干细胞,免疫荧光及Western blot检测NgR表达.结果 siRNA可以成功的.转染神经干细胞,3条siRNA不同程度的阻断了神经干细胞的NgR基因表达,阻断效率随时间延长逐渐下降.阻断效果最好的1条siRNA在转染后第5d仍能保持(85.22±3.1)%高阻断效率.结论 应用RNAi可以高效率的使人鼠神经干细胞的NgR基因表达沉默.
作 者：王丰 朱悦 Wang Feng Zhu Yue 作者单位：中国医科大学附属第一医院骨科,沈阳,110001 刊 名：中国组织化学与细胞化学杂志 ISTIC英文刊名：CHINESE JOURNAL OF HISTOCHEMISTRY AND CYTOCHEMISTRY 年，卷(期)：2008 17(1) 分类号：Q813 关键词：RNA干扰 神经干细胞 Nogo-66受体基因干扰 篇5
1 材料与方法
1.1 试验动物
辽宁荷包猪的耳组织, 由辽宁省铁岭市某猪场提供。
1.2 质粒、菌株及主要试剂
p MD18-T载体、大肠杆菌DH5α感受态细胞、DL-2 000 Marker、EcoRⅠ、HindⅢ, 由宝生物工程 (大连) 有限公司生产;DNA胶回收试剂盒, 由上海生工生物工程技术服务有限公司生产。
1.3 引物的设计
根据Gen Bank上猪α干扰素基因组序列, 利用Primer Premier 5.0软件设计去掉信号肽序列的PCR扩增目标片段的特异性引物。引物序列:上游引物5'-TGTGACCTGCCTCAGAC-3', 下游引物5'-CTCCTTCTTCCTGAGTCTGT-3', 目标片段大小为498 bp, 引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
1.4 基因组DNA的提取
用耳扣钳从活猪耳部采集辽宁荷包猪耳组织0.275 g, 清除猪耳组织表面的猪毛及其他污物, 将组织放入装有消化缓冲液和蛋白酶K的离心管中, 用小剪子尽量将组织剪碎。具体提取方法参照王春艳等[10]的方法。
1.5 α干扰素序列的PCR扩增
以猪耳组织总DNA为模板, 采用PCR方法对α干扰素基因进行扩增。PCR反应体系 (40μL) :2×Taq PCR Green Mix 20μL, DNA模板4μL, 上游引物4μL, 下游引物4μL, dd H2O 8μL。反应条件为:94℃5 min;94℃45 s, 55℃45 s, 72℃50 s, 共30个循环;72℃10 min。PCR反应产物通过1%琼脂糖凝胶电泳进行检测。
1.6 α干扰素基因的克隆及序列分析
将PCR产物用DNA胶回收试剂盒进行胶回收, 回收产物连接p MD18-T载体, 得到p MD-IFN-α, 转化大肠杆菌DH5α感受态细胞, 涂布平板, 挑取蓝白斑筛选后的白色阳性单菌落接种到含氨苄西林 (Amp) 的LB液体培养基中, 37℃、130 r/min摇床培养16 h, 用质粒提取试剂盒抽提质粒并进行PCR鉴定及EcoRⅠ和HindⅢ双酶切鉴定, 将鉴定结果为阳性的重组质粒送上海生工生物工程技术服务有限公司测序。测序结果与Gen Bank中猪α干扰素基因进行核苷酸序列比对。
2 结果与分析
2.1 α干扰素基因PCR扩增结果
以提取的DNA为模板扩增α干扰素基因, PCR产物经过1%琼脂糖凝胶电泳和成像系统观察可见一条长度约为500 bp的条带, 与预期片段 (498 bp) 大小相符 (见图1) 。
M.DL-2 000 Marker;1.PCR产物;2.阴性对照。
2.2 α干扰素基因的克隆与酶切鉴定结果
将PCR产物与p MD18-T载体连接并转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞, 筛选白色的阳性重组子抽提质粒进行PCR鉴定, 质粒PCR电泳结果与预期结果相符, 可见一条长度为500 bp左右的目的条带。将鉴定结果为阳性的质粒用EcoRⅠ和HindⅢ进行双酶切鉴定, 切出一条长度约为550 bp的目的条带, 与预期片段 (556 bp) 大小相符 (见图2) 。
M.DL-2 000 Marker;1.质粒PCR鉴定结果;2.质粒双酶切鉴定结果。
2.3 序列测定结果 (见图3) 与分析
由图3可知, 辽宁荷包猪α干扰素去信号肽基因序列全长为498 bp。运用DNAStar软件将该目的片段与国内外其他一些猪α干扰素去信号肽基因序列进行核苷酸同源性分析。辽宁荷包猪α干扰素去信号肽基因与国内外其他9株猪α干扰素去信号肽基因同源性介于97.3%~99.2%之间 (见图4) 。其中与美国 (登录号为EU364896) 、中国河北 (登录号为KF414740) 、中国铁岭克隆株α干扰素同源性最高, 为99.2%, 与中国杭州 (登录号为AY526089) 、中国哈尔滨 (登录号为EF575703) 、中国贵州 (登录号为JN381192) 克隆株α干扰素同源性最低, 为97.3%。
3 讨论
辽宁荷包猪是辽宁地方品种猪, 具有抗病力强、肉质好等优点, 具有很高的研究价值。试验在成功克隆辽宁荷包猪α干扰素基因的基础上, 将该基因序列与NCBI上已经发表的其他9株猪α干扰素基因序列进行同源性比较和序列分析, 结果表明, 辽宁荷包猪α干扰素去信号肽基因与国内外其他9株猪α干扰素去信号肽基因同源性较高, 介于97.3%~99.2%之间。图4中1~10号依次为:杭州克隆的猪α干扰素基因、法系长白猪α干扰素基因、英系大白猪α干扰素基因、哈尔滨克隆的长白猪α干扰素基因、美国克隆的猪α干扰素基因、贵州香猪α干扰素基因、河北克隆的猪α干扰素基因、辽宁铁岭克隆的长白猪α干扰素基因、辽宁荷包猪α干扰素基因、M28623猪α干扰素基因。通过上述同源性比对结果可以发现, 虽然不同品种、不同地域猪α干扰素基因同源性较高 (有的高达100%) , 但也存在一定的差异, 特别是一些地方品种之间差异相对较大, 研究克隆的辽宁荷包猪α干扰素基因与贵州香猪α干扰素基因的同源性相对较低, 为97.3%。这也可能与一些地方品种猪的生物学特性以及抗病力有一定的相关性。关于辽宁荷包猪α干扰素基因的表达以及表达产物的生物学特性还有待于进一步研究。
参考文献
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基因干扰 篇6
人工基因电路在近些年被广泛应用于微生物的细胞中, 这些基本的电路由振荡器[1]、计时器[2]、开关器件[3,4,5]、半加器[6]等基本元件组合而成。从这些基本的基因电路元件组成一个复杂的系统是基因电路设计和合成生物学的一个重大进步。基因的表达是最基本的分子生物学行为, 基因表达包含非常复杂的生物化学反应, 由于参加反应的分子数量的限制, 因此, 这些生物基因电路具有明显的随机性。随机性的来源包括内部噪声和外部噪声[7]。
本文用Kalman滤波器和H∞滤波器[8]对外部噪声和内部噪声进行滤波处理, 经仿真举例研究发现当噪声为白噪声时,Kalman滤波器和H ∞滤波器滤波效果基本一致; 当噪声为有色噪声[9],Kalman滤波器的滤波效果波动起伏较大, 而H ∞滤波器的滤波效果更稳定的,滤波效果更好。
2 受到外部噪声和内部噪声干扰下线性生物基因调控网络的Kalman滤波器和H∞ 滤波器的设计
2.1 系统模型
在择数学模型中, 化学方程式[10]是描述生物化学反应的最本质和准确的数学模型, 但是因为维数困难, 一般很难精确求解, 并且在建模过程中, 需要知道所有基本反应的细节, 对这复杂的反应系统是不可能的; 而化学速率方程[11]是常微分方程模型, 建模过程比较简单,分析和数值求解也相对容易, 因此在建模时通常会采用化学速率方程的形式。
以一个有四种物质相互转化的基因调控网络为例,当此生物基因调控网络未受到扰动时的系统模型如图1 所示:
基因调控网络[12]的化学速率方程为:
式中,x(t)表示浓度向量,N表示化学计量矩阵,其中
当此基因调控网络受到内部噪声和外部噪声时的系统模型如图2 所示。
基因调控网络的化学速率方程变为:
式中,M表示外部噪声对系统的影响。∆N1,∆N2表示系统内部噪声。ω(t) 表示外部噪声, 被假设成高斯白噪声。假设N是稳定矩阵,(3) 式中∆N1和∆N2表示对象参数的不确定性。假设其中。其中H1,H2和E为已知矩阵, 它们反应不确定参数所处的位置和变化幅度。F为未知实矩阵, 它的变化引起系统内部噪声∆N1、∆N2的变化。
其中外部噪声。
2.2 Kalman滤波器设计
系统的观测矩阵为:
式中,Z表示感兴趣的基因浓度,L是测量系统的参数。
由文献[13]连续系统的Kalman滤波方程为:
其中P满足Riccati方程:
2.3 H∞ 滤波器设计
当采用H ∞滤波器进行滤波时, 通过参考文献[14]设计H ∞滤波器。
其中X,Y满足如下Riccati方程:
3 仿真比较
下面我们通过模拟一个受到噪声干扰的生物基因调控网络来分析比较这两种滤波器的滤波能力。
假设:
我们希望滤波器精度 γ=0.1, 自由参数 δ=1, 由式(11) 和式(12) 解出:
将X,Y代入式(6) 和式(9) 得,Kalman滤波器为:
H ∞滤波器为:
通过计算, 线性生物基因调控网络的H ∞滤波器和Kalman滤波器已经设计出来了,下面通过Matlab仿真[15]分2 种情况比较这两种滤波器的滤波能力。
(1) 当w为白噪声时,Kalman滤波器和H ∞滤波器的滤波结果如图3 和图4 所示。
(2) 当w为有色噪声时,Kalman滤波器和H ∞滤波器的滤波结果如图5 和图6 所示。
4 结束语
本文通过对受到内部噪声与外部噪声干扰下的线性基因调控网络进行滤波器的设计, 并对H ∞滤波器和Kalman滤波器这两种滤波器对噪声干扰的滤波能力进行了比较。通过仿真分析得出: 在白噪声干扰下,H ∞滤波器与Kalman滤波器的效果差别不大, 都在0 附近波动。而在有色噪声干扰下,H ∞滤波器的滤波效果明显好于Kalman滤波器,H ∞滤波器的滤波效果更稳定, 波形更平滑, 波动幅度小; 而Kalman滤波器虽然仍在0 附近波动, 但其较H ∞滤波器而言, 波动幅度较大, 这说明H ∞滤波器在有色噪声干扰下有很好的抗干扰能力。
摘要：通过基因调控网络的设计,设计Kalman滤波器和H∞滤波器对受到内部噪声和外部噪声干扰的线性基因调控网络进行滤波处理,并通过仿真分析比较这两种滤波器对生物基因调控网络的滤波能力。在实际问题中,很多情况下需要考虑有色噪声干扰,本文针对在有色噪声干扰的情况下进行滤波仿真比较。
基因干扰 篇7
RNA干扰(RNA interference, RNAi)是一种由双链小分子干扰RNA(small interference RNA, siRNA)引发的序列特异性基因沉默机制,是生物体经长期进化产生的一种抵抗异常基因活动(病毒核酸的复制、转座子的活动以及转基因的表达)的防御系统[2,3,4]。RNAi技术已被应用于抗SARS病毒、HCV、HBV、HIV等感染性病毒的研究中并取得了令人鼓舞的效果。目前RNAi的抗病毒研究大多集中在RNA病毒或逆转录病毒,因为RNAi对这些病毒能发挥双重的抑制效果:(1)降解病毒的基因组、前基因组或亚基因组RNA模板;(2)降解靶基因表达的mRNA。因而RNAi对这类病毒的复制能产生较好的抑制效果。然而,关于RNAi对无逆转录特性的DNA病毒是否也具有良好抑制效果的报道则相对较少。本实验以HSV-1为研究对象,探讨siRNA干扰HSV-1 UL30基因后对HSV-1繁殖的影响。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验材料:
HSV-1 F株(ATCC,VR733)、非洲绿猴肾细胞VERO(ATCC、CCL81)、质粒pEGFP-N1、重组质粒pEGFP-N1-UL30、pEGFP-N1-Fi及大肠杆菌Top10菌株均由广州暨南生物医药研究开发基地保存。
1.1.2 试剂:
转染试剂LipofectamineTM2000、Trizol试剂(Invitrogen)、逆转录酶M-MuLV RT、Oligo(dT)18(上海生工);荧光定量PCR试剂盒SYBR Green PCR Master Mix (TOYOBO);其余试剂均为国产或进口;引物均自行设计,并委托上海英骏生物技术有限公司合成。
1.1.3 仪器:
倒置荧光显微镜(Nikon ECLIPSE TE2000-S),流式细胞仪(FAStarPLUS),实时荧光定量PCR仪(MJ Chromo4)。
1.1.4 培养基:
细胞生长液为含10%胎牛血清(杭州四季青公司)的DMEM(GIBCO)培养基,细胞维持液为含2%胎牛血清的DMEM培养基。
1.2 方法
1.2.1 siRNA的设计与合成:
将实验室前期对UL30基因cDNA克隆、测序所得的序列提交Ambion公司(www.ambion.com)和Dharmacon公司(www.dharmacon.com)siRNA在线设计工具,并根据siRNA设计原则,设计出12对siRNAs(表1)。同时以已知不针对任何基因的随机序列siN.C.作为阴性对照,以已知分别针对绿色荧光蛋白基因GFP和看家基因GAPDH的siGFP、siGPADH作为siRNA系统的阳性对照(表1)。设计的siRNA序列送上海吉玛公司化学合成。
注*:siRNA5有一个核苷酸与靶序列不同,作为非特异对照)。
1.2.2 siRNA和pEGFP-N1-Fi融合表达质粒Δ[5,6,7,8,9,10]。但RNA病毒或逆转录病毒的突变率相对较高,使得这类病毒可以通过频繁的点突变逃逸RNAi的抑制作用[11,12]。而无逆转录特性的DNA病毒的基因组较稳定,突变率相对较低,这是运用RNAi抑制这类病毒复制的相对优势。本实验针对HSV-1 DNA聚合酶UL30基因的上游、中上游、中下游及下游保守序列设计了12对siRNA,通过与pEGFP-N1-Fi重组质粒进行共转染实验快速筛选出3对高效抑制UL30基因的siRNA,不仅验证了siRNA的特异性,还简化了高效siRNA的筛选工作,减少了后续研究的工作量。
在siRNA抑制HSV-1复制的实验中,作者通过CEP法简便快速地检测病变细胞培养上清液子代病毒的滴度,间接反映siRNA对HSV-1繁殖的抑制效果,通过空斑减数实验评价siRNA对病毒的直接抑制效果。作者的实验结果表明:(1)在病毒复制期间,siRNA4、siRNA10、siRNA8均有效沉默了UL30基因的表达,其中siRNA4、siRNA10的沉默效果较好,这与流式细胞术结果和空斑减数实验的结果相符;(2)siRNA4、siRNA10、siRNA8均能降低病变细胞释放到培养上清的子代病毒滴度,间接反映了siRNA对HSV-1的繁殖有一定的抑制效果;(3)在病斑刚开始形成时,siRNA4和siRNA10对病毒的繁殖有显著的抑制作用;(4)siRNA4、siRNA10及siRNA8在感染后期虽不能有效减少病斑数,但能延缓病斑的扩大和病斑数的增长,对HSV-1的繁殖有一定的抑制作用。
*: P<0.01 VS siN.C.
UL30是HSV-1的DNA聚合酶基因,在病毒基因组的复制和病毒的繁殖中起重要作用,理论上通过干扰UL30基因的表达可以有效地抑制病毒的繁殖,而本实验的空斑减数实验结果却显示siRNA最终不能减少空斑的形成,其抗病毒效果尚不尽理想,这与朱钦昌等人[13]的实验结果相似,推测其可能的原因有:
(1)siRNA的稳定性。本实验采用的是瞬时转染化学合成的siRNA,由于siRNA在细胞内的半衰期较短,3 d以后便很容易被清除,因而这种沉默效果是短暂的。这与shRNA不同,shRNA在体内由于参与了被Dicer加工的过程比化学合成的siRNA更易于进入RNAi途径。
(2)HSV-1的基因组特性。由于HSV-1是DNA病毒,其基因组的表达也无逆转录过程,这点与HBV不同。对于HSV-1, siRNA只能对UL30的mRNA产生降解作用,即只能抑制UL30的表达,但这种抑制不等于基因敲除。在病毒复制的高峰期,UL30基因的持续转录使得一部分UL30 mRNA总能躲过RNAi的降解而得以翻译出病毒DNA聚合酶,从而使病毒最终得以从繁殖抑制状态中恢复其复制周期。因此,推测RNAi对无逆转录特性的DNA病毒的抑制效果不及对RNA病毒或逆转录病毒的抑制效果。
(3)病毒对RNAi的抵抗作用。研究表明,许多植物病毒和一些人致病性病毒通过编码一些称为RNAi抑制子的蛋白质来干扰Dicer的作用和(或)siRNA靶向性,如HIV的Tat蛋白可抑制Dicer的活性[14,15,16]。此外,在病毒感染期间,病毒也可利用RNAi来调控病毒和宿主的基因表达而逃避宿主的抗病毒反应。如疱疹病毒科γ-亚科中的Epstein Barr 病毒(EBV)可通过编码EBV-miRNA降解细胞的DNA聚合酶mRNA[17]。因此,HSV-1是否也能通过类似的机制来抵抗宿主的RNAi反应?这有待进一步研究。
综上所述,对于无逆转录特性的DNA病毒,仅用化学合成的siRNA靶向单个基因的策略不一定能取得理想的抗病毒效果。因此,将筛选出的高效沉默UL30基因的siRNA序列克隆至质粒形成稳定的shRNA表达载体,并与靶向其他基因的高效siRNA序列一起,联合其他药物,或许能取得更好的抗病毒效果,这有待于进一步研究。
基因干扰 篇8
RNA干扰是由双链RNA(dsRNA)转化成小分子干扰RNA(si RNA)所介导的一种基因沉默的过程[11],在生物进化的过程中发挥着相当重要的作用,是1998年由FIRE首次发现并命名的转录后水平的基因沉默[12]现象,是目前基因治疗研究和基因的功能研究的热点之一[13]。RNA干扰技术出现以后,由于其具有高效性和严格的序列特异性,因此常常被人们应用于基因治疗和基因功能分析中[14]。由于质粒介导RNA干扰技术具有一定的局限性,即转染细胞的效率较低,抑制基因的表达作用弱,而且持续时间短,因而目前已经较少作为介导RNAi的载体。慢病毒载体是一种常见的复制缺陷型逆转录病毒载体,其具有许多优点,如其能够转染分裂期细胞甚至非分裂期细胞,将其应用于肿瘤的基因治疗中,可显著提高细胞的转染效率以及RNAi的抑制效率,为肿瘤的基因治疗研究开辟新的思路。
1 材料与方法
1.1 菌株、质粒和主要试剂
293T细胞、大肠杆菌DH5a,三质粒慢病毒系统pNL-EGFP,pVSVG,p Helper由福建师范大学生命科学院发育生物学研究室惠赠,pSilencer1.0-U6-Tie2-si RNA重组质粒由本实验室保存,所有DNA限制性内切酶,RNase A,去磷酸化酶CIAP,T4DNA连接酶均为Fermentas公司和Ta Ka Ra公司产品,质粒提取试剂盒和胶回收试剂盒购自上海天根公司。其他为国产分析纯试剂。
1.2 实验方法
1.2.1 pNL-EGFP-U6-Tie2-si R NA慢病毒转移质粒的构建
用GeneTool软件通过质粒图谱的分析确定我们前期构建的质粒载体pSilencer1.0-U6-Tie2-si RNA[15]和pNL-EGFP质粒的酶切位点为XbaI,将经过Xba I酶切后的含有U6启动子的Tie2-si RNA片段与经过XbaI酶切回收好的pNL-EGFP连接载体进行连接(可以通过末端去磷酸化减少载体的自连反应,减轻克隆筛选的工作量),将连接产物转化大肠杆菌Top10,涂布Amp+的LB平板,37℃过夜培养,挑取阳性菌落接种于3~5 m L Amp+的LB液体培养基中,37℃振荡过夜(200 r/min),使用QIAGEN-tip100质粒抽提试剂盒提取质粒,通过XbaⅠ酶切及测序鉴定(上海英俊公司及大连宝生公司),检测连接产物的正确性。正确产物分别命名为p NL-EGFP-U6-Tie2-si RNA-1和pNL-EGFP-U6-Tie2-si RNA-2。
1.2.2 慢病毒的包装(磷酸钙法)
取10×XμL(10μg)pNL-EGFP、10×YμL(7μg)pHelper、10×ZμL(6μg)pVSVG加入50 m L离心管混匀,再加入10×45μL 2.5M Ca Cl2,用TE补加到10×625μL,再一滴一滴加入10×625μL HEPES,室温下静置25 min,配成混合液。将10 cm的293T细胞每盘加入10μL氯喹,培养1 h后换液,再一滴一滴加入1250μL静置25 min的混合液,轻轻摇匀,放置培养箱培养观察,12 h后加入新的含血清的DMEM终止转染,放置培养箱培养观察,收集病毒上清液保存备用。
1.2.3 病毒滴度的测定
将病毒原液倍比稀释制备病毒浓度梯度感染293T细胞,测定病毒原液滴度。
2 结果
2.1 p NL-EGFP-U6-Tie2-siRNA载体的鉴定
由质粒pNL—EGFP图谱(图1)和pSilencer1.0-U6-Tie2-si RNA重组质粒的图谱(图2)可知它们都有XbaⅠ酶切位点。pSilencer1.0-U6-Tie2-si RNA重组质粒上有两个XbaⅠ酶切位点,恰好能将我们所需要的目的片段完整的切下,将其分成一条3 kb和一条415 bp左右的片段。将经过XbaI酶酶切的pNL-EGFP载体和U6-Tie2-si RNA片段以摩尔比1∶10混和进行连接反应,转化感受态细菌,最后将筛选的阳性克隆进行XbaI酶切鉴定,若是连接成功的pNL-EGFP-U6-Tie2-si RNA质粒,将切下415 bp的U6-Tie2-si RNA片段(图3)。筛选结果:图4中的泳道4、5、7、12-20为连接成功的pNL-EGFP-U6-Tie2-si RNA质粒,电泳时跑出2条带,泳道2、3、6、8-11为未连接成功的pNL-EGFP-U6-Tie2-si RNA质粒。为确定连接的序列与所设计的完全相符,利用pSilencer 1.0-U6上的T3位点进行测序(上海生工),测序结果(图5、6)表明连接成功,即筛选到含pNL-EGFP-U6-Tie2-si RNA质粒的菌株。
2.2 慢病毒的包装及滴度测定
筛选出的阳性重组质粒与慢病毒包装质粒、包膜质粒共转染293T细胞(图7),产生的病毒原液倍比稀释后分别感染293T细胞,在荧光显微镜下观察各孔中GFP的表达量(图8),病毒滴度值=(4个大方格内发绿色荧光的细胞总数/4)X 104 X病毒稀释倍数/3 000μL(3 000μL表示感染293T细胞时用的病毒体积量3 000μL)=病毒颗粒数/μL。本实验最终测得病毒原液滴度值为9×103/μL。
3 讨论
近年来Ang2/Tie2体系已成为恶性肿瘤中肿瘤血管生成领域的研究热点之一,Tie2基因在肿瘤的血管生成过程中发挥着重要的调节作用。利用各种技术沉默Tie2基因的表达来研究其与血管生成的关系,进而研究其与肿瘤生长的关系,是目前研究的热点。我们的前期实验研究结果表面Tie2-si RNA重组质粒能够抑制血管生成[16]。
该实验首先选用增强的绿色荧光蛋白(EGFP)作为慢病毒的标记基因,然后利用前期已经构建好的重组质粒载体p Silencer1.0-U6-Tie2-si RNA[15]来构建pEGFP-Tie2-Si RNA慢病毒转移质粒,通过电泳、测序鉴定正确后再用其构建Tie2-Si RNA慢病毒表达载体。该实验选用的EGFP荧光非常稳定、且清晰可见,在荧光显微镜下可以对活细胞定时、定位的观察,这样就可以随时的去观察三质粒转染293T细胞生成病毒的情况,使得实验更加直观、准确。
基因干扰 篇9
V型胶原在正常肌腱组织中含量很少, 但在损伤肌腱中却持续高表达52周[1]。有研究显示过多的V型胶原抑制I型胶原的自聚生长。培养抑制了V型胶原功能的纤维细胞 (Ehlers-Danlos Syndrome) , 其所产生的Ⅰ型胶原纤维直径大于正常胶原纤维[2]。损伤肌腱修复后胶原纤维直径明显变小, 而这些小直径纤维又与肌腱修复后力学性能低下相关[3,4]。所以降低V型胶原的表达可能有利于促进大直径胶原纤维的再生, 提高损伤肌腱的修复效果。
RNA干扰技术 (RNA interference, RNAi) 是近年兴起的一种高效、特异阻断靶m RNA表达而达到转录后基因沉默的新技术。能够有效地抑制目的基因的表达, 产生相应功能型缺失的现象, 为研究特定基因功能提供良好的工具[5,6]。
本研究设计并合成干扰V型胶原两个亚基的si RNA, 转染大鼠肌腱细胞, 在基因和蛋白水平检测抑制效率, 筛选得到有效的干扰片段, 为后续研究V型胶原的功能提供细胞水平平台和可行的试验方法。
1 材料与方法
1.1 试剂
胰蛋白酶、胎牛血清 (FBS) 、DMEM培养基 (Gibco) ;si RNA分子 (Ambion) 、Lipofectamine TM2000转染试剂;m MLV逆转录试剂 (Invitrogen) 、real time PCR试剂盒 (Ta Ka Ra) ;V型胶原一抗 (millpore) 、荧光二抗。
1.2 仪器
二氧化碳培养箱;生物安全柜;倒置荧光电子显微镜 (Olympus) ;Real-Time PCR仪 (ABI 7900 HT) 。
1.3 实验动物
Sprague-Dawley (SD) 大鼠, 雌雄不限, 体重250 g左右。
1.4 方法
1.4.1 细胞培养
取大鼠跟腱, 剥离肌腱腱膜, 将组织块剪成匀浆状, 用混合胶原酶消化后, 加入含10%FBS的DMEM, 37℃、5%CO2、饱和湿度条件下 (标准环境) 进行原代培养。4~5 d更换1次培养基。当细胞铺满培养皿底约90%时, 用胰蛋白酶消化按1:3进行传代培养。取P5以内的细胞用于后续实验。
1.4.2 si RNA序列设计
由Ambion公司设计与合成si RNA干扰序列。由于V型胶原的分子组成为COL5 (1) 2 (2) , 所以分别设计了针对COL5 1和COL5 2亚基的si RNA序列, 为实验序列, 见表1。并提供已知有效抑制GAPDH的si RNA作为阳性对照序列 (positive control, PC) , FAM绿色荧光标记的乱序si RNA为阴性对照序列 (negative control, NC) 。
1.4.3 基因转染
将处于对数生长期的大鼠肌腱细胞按5×104/孔的密度接种于12孔板中, 培养20 h后, 更换无FBS的培养基后进行转染。具体方法参照Lipofectamine TM2000转染试剂说明书。培养6 h后更换含FBS的培养基。
1.4.4实时荧光定量PCR法检测基因干扰效率
肌腱细胞转染特定的si RNA48 h后, 收集肌腱细胞, 提取RNA, 采用两步法完成反转录聚合酶链反应 (RT-PCR) (n=3) 。采用b-actin做内参, 用实时荧光定量PCR法 (real time PCR) 定量分析COL5 1和COL5 2基因的表达, 所用引物见表2。
1.4.5 免疫荧光法检测蛋白抑制效率
由于乱序的si RNA自身标记FAM绿色荧光, 不能用作阴性对照, 所以用只加转染试剂而不加任何si RNA的肌腱细胞作为对照组 (Control) (n=3) 。肌腱细胞转染72 h后, 去掉培养基, PBS润洗, 固定, 加入稀释好的一抗, 置于湿盒中4℃过夜 (为扣除背景荧光, 以不加一抗的肌腱细胞作为免疫荧光的方法学对照) 。次日, PBS润洗, 加入荧光标记的二抗, 室温避光1 h。再次用PBS润洗, 荧光电子显微镜下观察结果。
1.5 统计学处理
采用SPSS 11.5统计软件对数据进行处理, 计量资料以 (±s) 表示, 比较采用t检验, 以P<0.05为差异具有统计学意义。
2 结果
2.1 si RNA转染效率检测
体外培养肌腱细胞见图1A。转染特定的si RNA后, 用荧光显微镜观察阴性对照组肌腱细胞, 结果见图1B。肌腱细胞内充满绿色荧光, 表明FAM标记的si RNA进入肌腱细胞内, 转染效率较高。
注:体外培养大鼠肌腱细胞 (图1A) ;转染FAM荧光标记si RNA的肌腱细胞 (图1B)
2.2 靶向si RNA抑制V型胶原在m RNA水平的表达
肌腱细胞转染si RNA48 h后, 用real time PCR法检测COL5 1和COL5 2在基因表达的水平, 见图2。与阴性对照组 (乱序si RNA) 相比, 1 (V) 实验组 (si RNA196227) 有效抑制了肌腱细胞中COL5 1基因水平的表达, 2 (V) 实验组 (si RNAs136862) 有效抑制了肌腱细胞中COL5 2基因水平的表达。抑制程度约70%左右 (P<0.05) 。阳性对照组 (抑制GAPDH的si RNA) 有效抑制了GAPDH的表达 (数据未展示) 。设置阳性对照组目的为验证si RNA转染方法的有效性, 见图2。
2.3靶向si RNA抑制V型胶原在蛋白水平的表达
肌腱细胞转染si RNA72 h后, 用免疫荧光法检测肌腱细胞中V型胶原蛋白水平的表达, 见图3。1 (V) 实验组 (si RNA196227) 有效抑制了肌腱细胞中Col5 1在蛋白水平的表达 (图3A) , 2 (V) 实验组 (si RNAs136862) 有效抑制了肌腱细胞中Col5 2在蛋白水平的表达 (图3E) 。
注:1 (V) :实验组1 (大鼠肌腱细胞转染si RNA196227) ;2 (V) :实验组2 (大鼠肌腱细胞转染si RNA s136862) ;PC:阳性对照 (大鼠肌腱细胞转染干扰GAPDH的si RNA) ;NC:阴性对照 (大鼠肌腱细胞转染FAM标记的乱序si RNA) (图2A, 图2B)
注:V型胶原亚基Col5 1在蛋白水平的检测 (图3A~3C) ;V型胶原亚基Col5 2在蛋白水平的检测 (图3D~3F) ;1 (V) :实验组1 (大鼠肌腱细胞转染si RNA196227) ;2 (V) :实验组2 (大鼠肌腱细胞转染si RNA s136862) ;Control:空白对照组 (大鼠肌腱细胞只加转染试剂, 不加任何si RNA)
3 讨论
有研究表明损伤肌腱中V型胶原表达异常升高[1], 且过多的V型胶原抑制I型胶原的自聚生长。本实验在体外培养大鼠肌腱细胞, 利用RNAi法抑制肌腱细胞中V型胶原两个亚基COL5 1和COL5 2的表达。结果表明, 化学合成的si RNA分子通过脂质体转染大鼠肌腱细胞后, 有效抑制了COL5 1和COL5 2在基因水平的表达, V型胶原在蛋白水平的表达也明显降低。表明RNAi法可以有效抑制V型胶原在肌腱细胞中的表达。为后续研究V型胶原在肌腱损伤修复过程中的调节作用提供可行的试验方法。也为促进损伤肌腱再生, 达到结构和功能的完全恢复带来潜在的基因治疗手段。
参考文献
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