去乙酰化（精选7篇）
去乙酰化 篇1
摘要：目的 观察组蛋白去乙酰化酶1 (HDAC1) 在胃癌及癌前病变组织中的表达, 探讨HDAC1在胃癌发生、发展中的作用。方法 采用免疫组织化学PV6000法分别检测20例正常胃黏膜组织, 20例萎缩性胃炎伴肠化生组织, 20例不典型增生组织及60例胃癌组织中HDAC1的表达, 并分析HDAC1与胃癌临床病理特征的关系, 同时检测60例胃癌组织中p53, p21的表达, 分析HDAC1与p53、p21表达的关系。结果 HDAC1在萎缩性胃炎伴肠化生、不典型增生及胃癌各组表达均高于正常胃黏膜组 (45.0%, 60.0%, 63.3%vs 5%, 均P<0.05) ;胃癌组中HDAC1的表达与分化程度和淋巴结转移有关 (均P<0.05) ;胃癌组织中HDAC1与p21蛋白的表达呈负相关, 而与p53蛋白的表达呈正相关 (均P<0.05) 。结论 HDAC1在胃癌及癌前病变组织中表达增高, HDAC1的表达与胃癌分化程度和淋巴结转移有关, 胃癌组织中HDAC1与p21蛋白的表达呈负相关, 而与p53蛋白的表达呈正相关, HDAC1可能通过调节癌基因与抑癌基因参与胃癌的发生、发展, 对胃癌的早期诊断及预后的判断具有一定的意义。
关键词：组蛋白去乙酰化酶1,胃癌,癌前病变,免疫组织化学
在我国, 胃癌是消化道最常见的恶性肿瘤之一, 5年生存率不足20%, 因此提高胃癌的早期检出率尤为重要。大量的研究表明, 胃癌的发生、发展是多基因、多步骤的复杂过程。早在30多年前, Affrey等已经发现核心组蛋白的N-端乙酰化能调节多种反式作用因子与核小体结合, 从而影响基因转录。此后研究不断深入, 发现组蛋白可有多种共价修饰方大式:泛素化、磷酸化、乙酰化、甲基化等, 它们单独 (协同) 调节基因转录, 在肿瘤的发生中起到重要中所用。其中组蛋白乙酰化是解除核小体抑制作用的主要机制, 组蛋白乙酰化水平受组蛋白乙酰基转移酶 (histone acetyltransferases, HATs) 和组蛋白去乙酰化酶 (histone deacetylases, HDACs) 的调控[1]。组蛋白去乙酰化酶1是1996年由美国哈佛大学的Taunton等发现的第一个哺乳动物的组蛋白去乙酰化酶, 它是多种蛋白质复合物的催化亚单位, 参与组蛋白和非组蛋白的去乙酰化[2]。近年来研究表明其在结肠癌, 肝癌, 胰腺癌, 前列腺癌中均高表达, 提示可能与肿瘤的发生发展有关。Choi[3]等研究了人胃癌细胞中HDAC1的表达, 发现68% (17/25) 的标本中有HDAC1 m RNA的高表达;61% (11/18) 的标本有HDAC1蛋白的高表达, 但关于HDAC1的表达与胃癌临床病理进程的关系的报道较少。本研究通过免疫组织化学法检测HDAC1在胃癌, 癌前病变 (萎缩性胃炎伴肠化生、不典型增生) 的表达, 探讨HDAC1在胃癌发生、发展中的作用。
1 材料与方法
1.1 材料
选取青岛大学医学院附属医院2008年8月至2010年2月存档的胃镜活检及胃癌根治术后标本蜡块120例, 其中大致正常胃黏膜组、慢性萎缩性胃炎伴肠化生组、不典型增生组各20例, 胃癌组60例。胃癌病例术前均未接受放疗及化疗, 年龄29~85 (平均60.7±15.2) 岁。实验选用与HE染色一致的蜡块制成4µm切片行免疫组织化学染色。
1.2 方法
1.2.1 免疫组织化学 (PV6000) 法
兔抗人HDAC1多克隆抗体, p21和p53单克隆抗体 (即用型) , PV6000试剂盒, 柠檬酸抗原修复缓冲液、DAB染色剂分别购自北京博奥森生物技术有限公司及北京中山金桥生物技术有限公司, 切片染色前根据抗体要求行柠檬酸缓冲液高温高压抗原修复, 余具体操作过程按试剂盒说明书完成。
1.3 结果判定
采用二级计分法, 阳性细胞计分标准为:≤5%为0分;6%~25%为1分;26%~50%为2分;51%~75%为3分;>75%为4分。染色强度分级计分标准为:无显色为0分;淡黄色为1分;黄或深黄色为2分;褐或棕褐色为3分。两者计分的乘积≥1者为阳性。
1.4 统计分析
采用SPSS17.0软件进行统计学处理, HDAC1在不同胃黏膜组织中的表达之间的关系、与胃癌的临床病理特征之间的关系及与p53和p21的关系用χ2检验和Fisher确切概率法, 以P<0.05认为有统计学差异。
2 结果
2.1 HDAC1在不同胃黏膜组织中的表达
HDAC1的表达位于细胞核中, 为棕黄色颗粒。HDAC1在萎缩性胃炎伴肠化生、不典型增生及胃癌各组表达均高于正常组 (45.0%, 60.0%, 63.3%vs 5%, 均P<0.05) , 差别有统计学意义。萎缩性胃炎伴肠化生、不典型增生、胃癌三者间差别无统计学意义 (表1) 。
注:Pa<0.05 vs正常为黏膜组
2.2 HDAC1的表达与临床病理特征的关系
胃癌组中HDAC1的表达在淋巴结转移组高于无淋巴结转移组 (χ2=8.086, P<0.05) , 高中分化组高于低分化组 (χ2=8.735, P<0.05) , 而与患者的年龄, 性别, 肿瘤的浸润程度, 临床分期及远处转移无关 (表2) 。
2.3 胃癌组中HDAC1的表达与p21、p53的关系
HDAC1阳性组中, p21的阳性表达率低于HDAC1阴性组 (χ2=6.332, P<0.05) ;而p53的阳性表达率高于HDAC1阴性组 (χ2=10.790, P<0.01) 。HDAC1与p21的表达呈负相关, 而与p53的表达呈正相关 (表3和表4) 。
3 讨论
研究表明, 组蛋白乙酰化和基因的激活或抑制密切相关, 组蛋白乙酰化由乙酰化酶和去乙酰化酶共同催化。正常状态下, 这两种酶通过对核心组蛋白尾部的赖氨酸残基进行可逆的乙酰化修饰来调控转录的起始, 并由此介导基因的激活或抑制。在细胞异常状态下, HDAC的活性明显增强, 组蛋白处于低乙酰化状态, 基因表达平衡状态被打破, 使一些影响细胞增殖、分化等的分子表达失衡, 导致肿瘤形成[4]。HDACs属于去乙酰化酶超家族, 共有Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三型。HDAC1是目前为止发现的与肿瘤关系最密切的组蛋白去乙酰化酶, 其蛋白质含有482个氨基酸, 相对分子量约为5.5万。HDAC1通过介导核小体改变和调节基因表达, 参与细胞分化和细胞周期进程, 已经发现HDAC1可介导位点特异DNA结合的转录抑制子的转录抑制作用[5]。HDAC1还可以通过线粒体转位 (Chromospmaltraslocations) 促进癌基因合成, 导致细胞凋亡抑制与分化障碍[6]。研究表明HDAC1mRNA水平和蛋白水平在乳腺癌[7]及结直肠癌[8]组织中均高表达, 并和肿瘤的TNM分期及淋巴结转移相关。本研究通过免疫组织化学方法HDAC1蛋白在不同胃黏膜 (正常, 萎缩性胃炎伴肠化生, 不典型增生, 胃癌) 的表达, 结果发现HDAC1在萎缩性胃炎伴肠化生, 不典型增生, 胃癌组的表达较正常组均明显升高, 表明HDAC1参与了胃黏膜肠上皮化生、不典型增生和恶性转化的过程, 可能是胃黏膜癌变过程中的早期分子事件。本研究虽未发现HDAC1的表达与患者的年龄, 性别, 肿瘤的浸润程度, 临床分期及远处转移存在统计学差异, 但研究结果显示, HDAC1在胃癌组织中不但呈现异常的高表达, 且HDAC1表达也随着肿瘤的分化程度的升高、肿瘤淋巴结转移的发生而增高, 这提示HDAC1可以通过促使组蛋白乙酰化, 抑制抑癌基因的转录, 从而在胃黏膜癌变后的恶性演进过程中起重要作用。
p21WAF1基因是1993年被克隆出的一个新的抑癌基因, 它通过与Cylin-CDK复合物结合, 使后者激活活性丧失, 并可影响PCNA、c-myc、bcl-2的表达, 从而抑制DNA的复制, 阻断细胞周期。Shin[9]用HDAC抑制剂TSA分别干预8种胃癌细胞系, 发现HDAC抑制剂能活化全部胃癌细胞系中的p21WAF1基因, 证明组蛋白去乙酰化是胃癌细胞中p21WAF1失活的主要机制。本研究中胃癌组中HDAC1与p21WAF1的表达呈负相关, 提示HDAC1可能通过组蛋白去乙酰化的作用下调p21WAF1的表达, 导致并促进胃癌的发生发展, 这可能用来作为胃癌治疗的新靶点, 针对p21WAF1基因治疗可能为胃癌的化学治疗策略开辟一条新途径。
p53基因分为野生型和突变型, 前者是肿瘤的抑癌基因, 后者是致癌基因。在细胞中免疫组化法检测到的p53蛋白均为突变型, 具有促癌效应。研究表明肺癌中HDAC抑制剂可以减少突变型p53的表达[10]。本研究中胃癌组中HDAC1与p53的表达呈正相关, 提示HDAC1与p53在胃癌的发生过程中具有协同作用。
综上, 通过本研究我们可以明确看到HDAC1在胃癌及癌前病变组织中表达增高, HDAC1的表达与胃癌的分化程度淋巴结转移有关, 而与患者的年龄, 性别, 肿瘤的浸润程度, 临床分期及远处转移无关, 同时还发现HDAC1与p53、p21的表达具有相关性, HDAC1可能通过调节癌基因与抑癌基因参与胃癌的发生、发展, 对胃癌的早期诊断及预后的判断具有一定的意义。同时, 本研究为胃癌的分子治疗提供一定的理论依据, 提示HDAC1可以成为胃癌的治疗靶点。
参考文献
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去乙酰化 篇2
根据世界卫生卫生组织(WHO)调查的数据,2000年全世界共有恶性肿瘤患者1000万,其中男性530万,女性470万.预计到2020年,新发恶性肿瘤患者将达到1500万发展中国家肿瘤患者总数将增加73%。其中皮肤癌在我国的发病率比较低,但在白色人种中却是常见的恶性肿瘤之一。据估计凡能活到65岁的美国白人,其中有40%~50%至少患过1次皮肤癌,这可能与所处的地理位置,环境因素和人民的生活方式等有关。而前列腺癌是世界范围内最常见的一种恶性肿瘤,并且是和年龄有直接联系,除了肺癌,在男性人群中前列腺癌(PCA)是最易发的一种癌症,号称美国男人的第二大杀手。全球范围内因肿瘤疾病死亡的人数仅次于心脑血管疾病死亡人数,目前还没有疗效显著的药物。化疗药物因缺乏作用靶标的选择,很容易导致严重的毒副反应,极大地制约了临床效果的发挥。因此开发广谱低毒和具有靶向性的抗肿瘤药物已成为人们最为关注的热点。本文详细介绍了抗肿瘤药物Vorinostat的抗癌机理,合成方法以及在临床治疗上的展望。
Vorinostat(SAHA)是Merck公司开发的世界上第一个抑制组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylases,HDAC)的新型抗癌药物,该药于2006年10月6日获得美国FDA批准上市,用于其他药物治疗时或者治疗后仍不能治愈、或恶化、或病情反复情况下的转移性皮肤T淋巴细胞瘤(CTCL)和前列腺癌。两项临床实验证明了其安全性和有效性,其中包括107名接收其他药物治疗后又复发的CTCL患者。按皮肤损伤改善标准评分等级的判断,接收Vorinostat的治疗患者中30%有所改善,疗效平均持续168d。
Aton制药公司1991年注册了vorinostat及其系列化合物的美国专利(US5369108),2000年又延长专利保护期至2011年(US6087367)。Merck公司2004年收购Aton制药公司后获得了该药的专利权,并于2005年申请了vorinostat及其系列化合物用于抗HDACs抗癌疗法的美国专利(US2005-709599、US2005-733752)和世界专利(WOZoo7-022405)及其合成方法的美国专利(US2005-682875、US2005-693128)。Merck公司对于vorinostat的专利期将于2013年10月到期。
1.1 vorinostat的抗癌活性及抗癌机制
由于组蛋白去乙酰化酶抑制剂(histone deacetylases inhibitors,HDACIs)具有诱导细胞凋亡、分化和抑制增殖的活性,目前其研究涉及众多肿瘤领域,包括血液系统肿瘤、成神经细胞瘤、黑素瘤、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、卵巢癌和结肠癌等。HDACIs对多种血液系统肿瘤和实体瘤具有明显的抑制作用,并对肿瘤细胞具有高选择性和低毒的优点,因此具有非常广阔的应用前景。组蛋白去乙酰化酶抑制剂-vorinostat(SAHA)已被批准用于临床治疗皮肤T细胞淋巴瘤,FK228(或FR901228)对难治性皮肤T细胞淋巴瘤具有独特的疗效,被FDA指定用于单一疗法治疗的难治性或复发的皮肤T细胞淋巴瘤,此外尚有多种HDACIs处于临床试验阶段。除了明确的抗肿瘤活性,vorinostat还显示出免疫调节活性,体外实验表明vorinostat可抑制T淋巴细胞的活化、增殖及分泌细胞因子,利用自身免疫性疾病动物模型进行的研究也证实了其免疫抑制活性。
1999年Finnin等研究阐明HDACI(SAHA和trichostatin A)与组蛋白去乙酰化酶类似物(HDLP)的相互作用机理(如图1)。HDAC是一类锌离子酰胺酶,在催化组蛋白脱乙酰基时,锌离子跟乙酰基上氧的水合物螯合形成过渡态,抑制剂与底物竞争性地螯合HDAC上的锌离子,从而发挥其生物学作用。目前研究的HDACI尽管结构特征多种多样,但通过X射线晶体衍射结构分析及构效关系表明HDACI具有3个区域:金属结合区(metal binding),与酶活性位点的氨基酸残基形成氢键,并与锌离子螯合;连接链区(linker),占有酶的狭窄通道,其链的长度决定金属结合区与锌离子的结合状况;表面识别区(surface recognition),与酶活性位点外侧的氨基酸残基结合,决定抑制剂分子对酶的识别及结合程度,辅助金属结合区与锌离子螯合。
2 vorinostat的合成方法
合成方法大致可以分作两个部分,一种是早期的一些合成方法,主要存在反应条件要求高,产率较低等的缺陷,第二种是最新的有了较大改进的合成方案。
2.1 早期的几种合成方法
由以上可看出,合成路线A是Breslow[2]和他的同事提出的一步反应合成SAHA,不仅产率低而且副产物多难于分离。第二种路线B是由Stowell[3]等提出,尽管副产物比较容易分离但是反应时间相对太长(最高达到28小时),而且反应条件相对苛刻(温度190度),最主要的是产率还是很低。路线C有较大改进,在三步反应的基础上反应条件更温和了些,但产率仍然提不上去。
2.2 新的合成方法
到2005年由Lalji K.Gediya[12]等提出了一种更简单,更便捷的方法,在原有反应的基础上,对反应条件(都是在室温条件下),反应时间及药品等都进行了一系列改进,是目前比较先进的合成方法。
可见,与前三种合成方法相比,在缩减了反应步骤的同时,反应条件更加温和,副产物少而且容易分离,不需柱色谱提纯的过程,产率可达79.8%。目前使用这种方法能够取得比较好的实际效果。
3 Vorinostat(SAHA)在临床治疗癌症方面的展望
一些生物学数据已经证明了vorinostat在皮肤癌,前列腺癌治疗中的有效性。而且近年研究vorinostat不仅可以单独作为肿瘤治疗药物,还可以与其它抗癌药物联合用药,减少对正常细胞的毒性,具有增效作用。可与转录调节因子(如52杂氮22′2脱氧胞苷、视黄酸、m RNA转录抑制剂flavopiridol)[51,52,53]、凋亡受体配体(如阿霉素、长春新碱、依托泊苷、多烯紫杉醇)[54,55,56]、化疗药物(如抗代谢药吉西他宾、全反式维甲酸)[57,58]以及激酶抑制剂、放射线等联合用药。近年来研究发现vorinostat还可影响到有丝分裂、DNA复制和修复以及调控非组蛋白的蛋白质乙酰化程度。但是该药用于临床治疗癌症仍然需要解决一些问题如:抑制剂对HDAC酶系的选择识别作用、选择最佳药用剂量、治疗周期以及寻找更多可以促进这种药抑制作用的物质等。毋庸置疑,随着对HDACIs抗癌机理的深入研究,vorinostat将会有广阔的应用前景。
参考文献
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去乙酰化 篇3
SIRT1去乙酰化酶属于sirtuins家族的成员, 在人体中共有7种相似的蛋白, SIRT1是其中之一。在生化分类上, SIRT1属于Ⅲ型组蛋白去乙酰化酶, 依赖能量物质NAD的激活才具有活性, 这种特性使表观遗传调节基因表达与代谢紧密地联系在一起。SIRT1是进化上十分保守的蛋白, 在低等生物如酵母、线虫、果蝇中均存在同源蛋白。SIRT1蛋白主要分布在细胞核中, 与常染色质结合在一起, 参与多种基因的表观遗传调节。除了使组蛋白去乙酰化, 参与染色质动态调节之外, SIRT1还调节多种生理功能, 如抑制细胞凋亡、调节糖类和脂类代谢、抗衰老等作用[2]。严格来说, SIRT1不仅仅是组蛋白特异的去乙酰化酶, 所以称为SIRT1去乙酰化酶比较确切。
对中老年人健康的主要危险是, 高血压、高血糖、高血脂的“三高症”明显增加, 这些过程涉及多个基因和蛋白参与作用。而SIRT1的广泛调节作用, 无疑是理想的干预分子, 可以作为药物靶标, 发展作用更为特异的新药。
糖尿病的一个严重问题是血液中葡萄糖的明显增加而导致的并发症。在人体中, 葡萄糖代谢的过程受激素和营养的严格调节。当给小鼠禁食后, SIRT1和过氧化物酶体增殖物激活受体γ协同刺激因子1α (PGC-1α) 的表达明显升高, SIRT1通过与PGC-1α形成复合体, 使后者去乙酰化而促进糖原异生作用, 从而完成禁食后的信号传递过程[3]。SIRT1激活剂RES, 在体内通过调节PGC-1α的功能, 有效地激活线粒体的活性。小鼠给RES后, 其运动时间和肌纤维氧消耗量增加, 并且能够对抗饮食导致的肥胖和胰岛素耐受[4]。
在胰腺β细胞中, SIRT1可以调节葡萄糖刺激的胰岛素分泌, 该作用通过解偶联蛋白2 (UCP2) 实现。UCP2位于线粒体内膜, 使氧化呼吸链产生的ATP解偶联。SIRT1抑制UCP2的功能, 提高跨膜线粒体的质子梯度, 促进ATP的生成[5]。此外, SIRT1能改善外周组织胰岛素抵抗作用, 在染色质水平抑制蛋白酪氨酸磷酸酶的转录, 增加外周组织对胰岛素的敏感性[6];它还能去乙酰化胰岛素受体底物-2, 进而增强胰岛素对该底物酪氨酸磷酸化的诱导, 激活下游胰岛素信号通路, 提高组织对胰岛素的敏感性。
不过, SIRT1在不同的疾病状态下作用特点完全相反, 从而有可能抵消其有益作用。例如, 在部分肿瘤细胞中, SIRT1的表达增加有利于肿瘤细胞的存活。用糖尿病大鼠模型研究表明:使用SIRT1siRNA使肝中的SIRT1蛋白表达降低, 葡萄糖的产生明显地降低, 对胰岛素的敏感性增加了25%。此过程可以检测到人叉头框蛋白O1 (FOXO1) 、信号转导与转录激活因子3 (STAT3) PGC-1α的乙酰化水平明显提高, SIRT1控制的与糖异生相关的基因丙酮酸羧基酶激酶 (PEPCK) 、果糖1, 6-二磷酸酶和葡萄糖磷酸酶的活性降低。说明抑制肝中的SIRT1活性, 可以减轻糖尿病的症状[7]。
脂类代谢紊乱也是导致代谢综合征的原因之一, SIRT1参与脂类的代谢调控。用药物诱导小鼠3T3-L1成纤维细胞分化时, SIRT1的表达明显增高, 其作用通过募集N-CoR, 抑制脂肪调节分子过氧化物酶体增殖物激活受体-γ (PPAR-γ) 的活性。在sirt1基因杂合的小鼠中, 脂肪酸的动员能力明显降低[8]。给小鼠喂养高脂肪的食物, 比较野生型小鼠和转染sirt1基因小鼠代谢状态的变化, 可以观察到较低水平的脂类引起的炎症, 以及对葡萄糖的较好耐受性, 其机制是增加抗氧化蛋白超氧化物歧化酶 (SOD) 和核呼吸因子1 (Nrf1) 的活性, 降低炎性因子如肿瘤坏死因子-α (TNF-α) 和白介素-6 (IL-6) 的活化, 说明SIRT1对高脂食物具有明显的调节作用[9]。过度饮酒引起脂肪代谢异常, 导致脂肪肝的出现。用乙醇处理大鼠肝细胞和小鼠, 均可以检测到固醇调节因子结合蛋白 (SREBP-1) 的表达增加, 乙酰化水平升高, 而增加SIRT1表达或用RES处理, 可以使SREBP-1去乙酰化而减缓脂肪肝的出现[10]。
热量限制法 (calorie restriction, CR) 又译为卡路里限制法, 是目前唯一经过广泛的科学实验验证, 抗衰老有效的方法。该方法的关键是减少热量的摄入, 但需要提供足够量的蛋白质和维生素, 而不是简单地限食。自从1935年McCay发现减少食物的供给能显著延长大鼠的寿命以来, 已经在多种生物, 如酵母、线虫、果蝇、小鼠、猕猴等证明CR的抗衰老作用, 最高可以延长50%的寿命。热量限制法的作用机制是改善代谢特性, 增加对胰岛素的敏感性, 增强抗氧化能力。虽然该方法未在人类中进行严格的大规模实验研究, 但根据在“生物圈2号”生活的人员检测, 以及自愿进行CR多年的志愿者的身体状态分析, 表明CR对人体减少慢性疾病的发生、抗衰老有明显的作用。除了作用IGF-1/AKT/FOXO3a信号通路之外, 该疗法的作用机制与调节SIRT1的活性有关。检测热量限制法饲养的小鼠, 其肝、肾、脑和脂肪组织中的SIRT1含量明显升高。用热量限制法饲养的小鼠其活动能力明显地提高, 但sirt1基因被敲除的小鼠, 其活动能力没有变化[11]。
从分子网络上看, SIRT1通过影响如p53、FOXO3a、Ku70等分子的活性, 减少不可再生细胞如神经细胞的凋亡, 而具有抗氧化应激和抗衰老作用。最先研究确认SIRT1的功能是使p53蛋白去乙酰化。使用免疫沉淀法, 在体内和体外均能检测到SIRT1和p53形成蛋白复合体, 高效液相色潽法 (HPLC) 检测到p53 K382位点被去乙酰化。用200 μmol/L H2O2处理人正常成纤维IMR-90细胞24 h后, 80%的细胞发生凋亡, 而转染sirt1基因的细胞, 同样处理条件下, 70%的细胞仍能存活[12,13]。过度表达早幼粒细胞白血病蛋白 (promyelocytic leukemia protein, PML) , 引起原代培养的小鼠胚胎成纤维细胞出现衰老表型, p53蛋白被乙酰化, 转染sirt1基因能拮抗PML的致衰老作用, 间接免疫荧光法检测到SIRT1和p53共定位在PML核体中[14]。 这些研究充分表明SIRT1在抗氧化应激和DNA损伤中的重要作用。
SIRT1除了影响p53的功能外, 抑制凋亡作用还通过其他途径, 如调节Ku70、FOXO3a的活性。在细胞凋亡时, 修复蛋白Ku70 的K331、K539、K542被乙酰化, 导致与其结合的Bax释放出来, 移位到线粒体中启动凋亡通路, SIRT1使Ku70去乙酰化, 明显地减少凋亡的细胞[15]。FOXO3a的一个功能是引起细胞凋亡, 用H2O2处理293T细胞后, 可检测到FOXO3a明显地乙酰化, SIRT1和FOXO3a形成蛋白复合体, 使凋亡的细胞数减少1倍。实际上SIRT1的功能调节是复杂的反馈调节过程。用瞬时转染法比较FOXO3a启动子活性, p300乙酰化酶, SIRT1以及其信号通路的调节关系, SIRT1通过乙酰化抑制FOXO3a的转录因子活性, 降低FOXO3a的表达[16]。反过来, SIRT1的表达又受FOXO3a的调解, sirt1的启动子含有2个p53结合元件, FOXO3a与p53结合成蛋白复合体, 驱动sirt1基因的表达[17]。
近年来发现, 炎性因子的活化与衰老明显相关, 这些作用与转录因子核因子-κB (NF-κB) 的活化紧密相连。SIRT1能与NF-κB的Rel/p65亚基结合, 使K310去乙酰化而抑制NF-κB的转录活性; 使用SIRT1激活剂RES处理后, 明显增强TNF引起的HEK293细胞凋亡[18]。
值得指出的是, 除了SIRT1外, 其他蛋白如SIRT6也与衰老有一定的关系。SIRT6通过影响基因的修复功能, 而干预衰老的进程[19]。
由于SIRT1在老年性疾病和抗衰老中作用显著, 筛选调节其活性的药物成为了重要的研究方向。使用酵母的模型体系, 发现多种天然的植物多酚具有明显的激活SIRT1的活性作用, 尤其是RES最为显著。RES的作用机制广泛, 不仅可以预防肿瘤的发生, 还具有抗心脑血管疾病、抗氧化损伤、预防神经退行性疾病等作用。利用乙酰化的p53深入研究RES活化SIRT1的分子机制, SIRT1分子带有荧光基团, 荧光基团阻碍肽键与酶的紧密结合;加入RES后诱导SIRT1发生构象改变, 使SIRT1与肽底物中的荧光基团紧密结合而被活化[20]。利用改良的高通量体外荧光偏振分析法, 筛选了大量的小分子化合物库, 筛选出强活性化合物SRT1720, 激活SIRT1去乙酰化酶活性是RES的3.3倍, 而效价是RES的1000倍, 并且具有较高的特异性;对多种胰岛素抵抗及糖尿病动物模型具有明显的改善作用[21]。说明以SIRT1作为药物靶标, 可以发现作用机制新颖的药物。
去乙酰化 篇4
1 材料与方法
1.1 主要试剂和仪器
MS-275、RPMI-1640、ECL显色试剂盒购买于北京中杉公司;P21, P27, Cyclin D1鼠抗人单抗、抗CDK4多抗购自美国Santa Cruz;流式细胞仪、蛋白垂直电泳仪购买美国Bio-Rad公司;乳腺癌细胞株MCF7由徐州医学院病理生理教研室提供。
1.2 细胞培养
将MCF7细胞接种在RPMI-1640培养液 (10﹪胎牛血清, 青霉素、链霉素100U/m L) , 37℃、5%CO2孵箱内贴壁传代培养。取对数生长期的细胞处理后分组, 实验组分为0.5μmol/L MS-275、1.0μmol/L MS-275、1.5μmol/L MS-275。对照组为等浓度的二甲基亚砜 (DMSO) 。
1.3 细胞生长抑制试验MTT法检测细胞抑制率
分组:A组试验组, 分别给予0.5μmol/L MS-275、1.0μmol/L MS-275、1.5μmol/L MS-275作用, B组设计为空白对照组。
1.4 流式细胞术 (FCM) 检测MCF7细胞周期
MCF7细胞单纯用无血清的RPMI-1640培养24 h后, 依照设计分组作用24 h, PBS洗涤3次, 70%的冷乙醇4℃以下冻存固定24 h, 离心后弃乙醇 (3000 r/min, 10 min) , 再加入1 m L PBS制成细胞悬液固定后, 加入Rnase A酶 (终浓度为10μg/m L) , 常温放置30 min, 用50μg/m L的PI (碘化丙啶) 染色, 用流式细胞仪进行MCF7周期细胞检测。
1.5 Western-blotting检测P21、P27、Cyclin D1、CDK4D蛋白的表达
Western-blotting检测MCF7肿瘤细胞表面各基因的表达量。
1.6 统计学处理
采用SAS 13.1统计软件处理, 采用REGWQ法对方差分析有显著性差异的资料进行多组均数间的两两比较。设置检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 MS-275对乳腺癌MCF7细胞增殖影响
M T T比色法显示不同浓度M S-2 7 5处理M C F 7细胞2 4 h后, 与溶剂对照组相比, 0.5μmol/L MS-275组细胞的抑制率差异无统计学意义 (P>0.05) , 1.0μmol/L MS-275处理的细胞抑制率明显增加, 且随着MS-275作用浓度升高而作用加强 (P<0.05) 。见表1。
注:*与对照组比较, P<0.05;#浓度组间两两比较, P<0.05
2.2 MS-275对MCF7细胞的周期作用
0.5μmol/L MS-275、1.0μmol/L MS-275、1.5μmol/L MS-275作用MCF7细胞24 h, 与溶剂对照组相比较, 0.5μmol/L MS-275处理组细胞的周期无明显差异, 随着MS-275作用浓度的逐步升高阻滞在G1期的细胞明显增加 (P<0.05) , 见图1。
2.3 Western-blotting检测MS-275处理MCF7细胞P21, P27, Cyclin D1、CDK4D的表达变化
0.5μmol/L MS-275、1.0μmol/L MS-275、1.5μmol/L MS-275作用MCF7细胞24 h后, 与溶剂对照组比较, 0.5μmol/L MS-275处理组细胞p21, p27, CCND1、CDK4D蛋白的表达量无明显变化, 1.0μmol/L MS-275处理的细胞p21, p27, 蛋白的表达量明显增加, 且随着MS-275作用浓度的升高而升高 (P<0.05) , CCND1、CDK4D蛋白的表达量明显减少, 且随着MS-275作用浓度的升高而下降 (P<0.05) , 见图2。
3 讨论
组蛋白去乙酰化酶抑制剂主要通过控制DNA缠绕在组蛋白的松紧程度来发挥作用, 而组蛋白的乙酰化酶和去乙酰化酶主要是通过组蛋白乙酰化酶和组蛋白去乙酰化酶来实现[1,2]。抑制肿瘤细胞增殖、诱导细胞分化、凋亡的途径失控进而导致细胞发生恶变。组蛋白去乙酰化酶抑制剂可通过提高染色质特定区域组蛋白乙酰化酶, 选择性地恢复肿瘤抑制因子和其它抗癌基因的表达, 增强调控细胞凋亡、分化相关蛋白的表达和稳定性, 诱导细胞凋亡及分化, 成为一类新型的抗肿瘤药物, 研究热点。MS-275是苯甲酰氨类衍生物 (Benzamidesderivative) , 最近新合成的组蛋白脱乙酰基酶抑制剂[3,4], 已被证实对部分肿瘤有效应且已应用在临床实验中, 它能选择抑制组蛋白去乙酰化, 肿瘤细胞作用强, 在人体内稳定性好毒副作用相对较小, 且使高度酰基化的组蛋白聚集, 也能通过微生物设计合成, 实现抑制细胞分裂, 间接地抑制血管生成因子的表达, 帮助阻断对肿瘤的血液供应进而诱导肿瘤细胞分化凋亡。
本研究通过实验证实MS-275可以抑制MCF7细胞生长, 并使MCF7细胞周期停滞于G0/G1期。并且表明0.5μmol/L MS-275作用MCF7细胞对细胞生长无显著影响, 抑制率无明显差异, 1.0μmol/L MS-275作用MCF7对抑制细胞生长周期效应显著且抑制率显著增加, 表现出一定剂量相关性。p21和p27是调控细胞周期至关重要的关键基因, 位于p53基因下游的细胞周期素依赖性激酶抑制因子, p21又称WAF1/CIP1, p27蛋白是CKI中的一种, 在真核细胞的细胞周期调控中起着重要的作用, 是一种广谱的周期蛋白依赖激酶抑制剂, 主要通过抑制CDK的活性, 来阻断细胞周期中G1、S期的转换, 实现对细胞周期的负调控.同时, 被认为是细胞周期中G1期向前发展的抑制剂。介导了TGF诱导的细胞在G0/G1期的休眠且通过C端与PCNA相互作用, 阻断PCNA活化DNA聚合酶的活性达到抑制DNA的合成进一步使细胞周期停滞, 因而被认为是一种抑癌基因。p27基因还参与了细胞分化, 器官发育大小、细胞凋亡等重要信号传导途径。研究已证实细胞周期进程受到一系列Cyclin D/cdk精密调控, 而P21、P27又是这个进程中与Cyclin D/cdk形成紧密结合的关键基因。例如, P21结合了cdk就能抑制它的作用, 抑制cdk导致的Rb磷酸化, CDK激酶是细胞周期调控中的重要因素, 是细胞周期运行的引擎分子。目前发现, 至少存在12种CDK激酶, 即CDK1至DK12。主要生物学作用是使得细胞由分裂间期向分裂期转化, 分裂间期时内部的转化并以复合物形式出现[5,6,7,8,9], 同时, P27也能与Cyclin D结合调控细胞的周期变化, 其过量表达导致细胞增殖分化紊乱最终恶变, 由于组织分化程度差异致使不同肿瘤中阳性检出率表现不同, 在分化较差的肿瘤细胞中表达量较高。在本研究中我们发现1.0μmol/L浓度的MS-275对MCF7细胞有明显的抑制生长效应且具有量效关系, 1.0μmol/L浓度之上可显著阻滞MCF7细胞生长, 增强乳腺癌之p21。
摘要：目的 研究去乙酰化酶抑制剂 (MS-275) 对乳腺癌细胞 (MCF7) 周期的作用及机制。方法 0.5、1.0、1.5μmol/L MS-275作用MCF7细胞24 h, 用噻唑蓝 (MTT) 观察不同浓度MS-275对MCF7细胞的生长抑制作用;流式细胞仪检测细胞生长及周期;Westernblotting检测MS-275对乳腺癌细胞周期相关基因的表达。结果 1.0μmol/L浓度的MS-275对MCF7细胞生长有抑制作用并呈现一定的量效关系, 1.0μmol/L浓度以上明显诱导阻滞乳腺癌细胞MCF7细胞周期, 明显增加p21, p27基因的表达, 明显降低CCND1、CDK4D基因的表达。结论 一定剂量的MS-275抑制乳腺癌MCF7细胞的生长, 可通过调控多个细胞周期相关基因诱导乳腺癌细胞细胞周期阻滞, 细胞阻滞的发生与p21, p27基因表达的增加及CCND1、CDK4D基因表达的减少相关。
关键词：去乙酰化酶抑制剂,细胞周期,基因的表达,乳腺癌细胞
参考文献
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去乙酰化 篇5
1 材料与方法
1.1 材料、仪器与试剂
雄性Wistar大鼠120只, 均购自华中科技大学同济医学院动物实验中心, 年龄10~12个月, 体重250~280g;链脲菌素 (上海岩生) 、水合氯醛 (上海岩生) 、UAG (美国Bio Legend) 、b FGF (美国Sigma) 、G-CSF (美国Sigma) 、MMP-9酶联免疫试剂盒 (武汉博士德) 、VEGF酶联免疫试剂盒 (上海森林雄科) 、CD34酶联免疫试剂盒 (武汉博士德) 等;石蜡切片机 (武汉博士德) 、激光多普勒超声仪 (瑞典百灵威) 、酶标仪 (美国Bio Tek) 等。
1.2 方法
1.2.1 分组方法:
所有大鼠按体重编号, 行随机数字表法多层分组。首先分为A、B、C三组, 每组40只;随后各组划分出组1、组2, 各20例。共得A1、A2、B1、B2、C1、C2六组。
(1) 基金项目:黑龙江省教育厅科学技术研究项目, 编号:12521551。
1.2.2 造模方法:
各组1均制备糖尿病模型:禁食12h, 腹腔注射链脲菌素 (60mg/kg, 溶于我院自制柠檬酸缓冲液) 。一周后采集尾静脉血, 空腹血糖超过300mg/d L说明造模成功。所有大鼠均制备后肢缺血模型:术前禁食12h、常规进水, 戊巴比妥腹腔麻醉, 仰卧固定于恒温操作台;右侧腹股沟做切口, 至膝关节, 分离肌层;随后暴露并分离股动脉, 结扎、电灼, 切除下段及分支。
1.2.3 用药方法:
待模型建立完毕后, 间隔6h开始给药, 药物剂量:UAG隔日1次, 每次腹腔注射30μmol/kg;G-CSF首7日每日一次, 皮下注射10μg/kg;b FGF首7日隔日1次, 共4次, 缺血区肌注5μg/kg。A组予等量生理盐水, 参考上述剂量注射;B组予G-CSF联合b FGF, 按照上述计量注射;C组在B组基础上联合应用UAG。
1.2.4观察项目:
常规观察大鼠体重、毛色、大小便、后肢运动情况等;模型建立1周后, 各组取10只大鼠, 处死, 取缺血区肌肉组织2g, 分两份, 分别用于检测MMP-9及VEGF, 均采取ELISA检测法, 操作步骤严格参照试剂说明书;模型建立4周后, 行多普勒超声检测余大鼠下肢血流, 随后处死, 取缺血区组织, 固定、包埋、切片后行ELISA法检测CD34阳性血管数, 以评价大鼠微血管数量。
1.3 统计学方法
采用SPSS19.0统计学软件处理数据。肌肉血流转换为相对流量单位 (PU) ;MMP-9及VEGF统计OD值;微血管数量统计密度, 取5个观察点计算平均值。上述数据均按 (±s) 表示, 多组间对比行F检验及P检验;两组间对比行t检验, 均以P<0.05为差异具备统计学意义。
2 结果
2.1 MMP-9及VEGF表达对比
两者表达一般趋势均为:C组>B组>A组, 且各组1>各组2。A、B、C三组间MMP-9水平行q检验指出B1、C1组均明显高于A1组 (q=4.31, 4.33;P<0.05) , B2、C2均明显高于A2组 (q=3.82, 4.58;P<0.05) , C2明显高于B2 (q=4.28;P<0.05) ;A、B、C三组组内对比, A1、B1分别明显高于A2、B2组。其他项对比, 未见明显差异。VEGF表达统计学检验结果相同。见表1。
2.2 肌肉血流及微血管密度对比
两指标一般趋势亦为:C组>B组>A组, 且各组1>各组2。A、B、C三组间肌肉血流PU值行q检验指出C1组、B1组均明显高于A1组 (q=4.05, 4.97;P<0.05) , B2、C2均明显高于A2组 (q=3.47, 3.99;P<0.05) , C2明显高于B2 (q=4.05;P<0.05) ;A、B、C三组组内对比, A1、B1均明显高于A2、B2组。其他项对比, 未见明显差异。微血管密度统计学检验结果相同。见表2。
3 讨论
有研究表明, 骨髓间充质干细胞移植有助于促进糖尿病大鼠后肢缺血血管的新生, 这可能是因为移植的干细胞中富含内皮祖细胞, 其作为内皮细胞的前体细胞, 能够迅速分化为血管内皮, 进而使血管新生[5,6]。本研究借鉴该结论, 但试图仅通过药物注射达到相似的效果, 对照组应用的G-CSF, 能够提升循环系统中内皮祖细胞数量, 该药物为骨髓干细胞动员剂, 早期研究证实其能够作用于中性粒细胞系, 刺激粒细胞及单核巨噬细胞成熟并向外周血释放, 近期亦有研究表明其能够促进内皮祖细胞增生, 从而保证血管新生具有细胞基础[7];在此基础上, 对照组同时局部应用b FGF, 其为促有丝分裂因子[8], 亦能诱导形态发生和分化, 能够为内皮祖细胞的生长提供物质基础, 进而促进内皮祖细胞向缺血区域趋化、归巢, 能够提升靶向性, 抑制其它组织的血管再生。本例中B组仅采用上述两药物联用, 对糖尿病及非糖尿病后肢缺血模型均有一定作用, 但B组组内对比, 亦可表明, B1作用效果明显优于B2。这可能是由于糖尿病患者内皮祖细胞及早期循环内皮祖细胞动员受损所致。研究指出, 内皮祖细胞的动员与血管内皮因子及MMP-9相关[9], 前者为血管内皮细胞有丝分裂原, 与受体结合后, 能够选择性地促进血管内皮祖细胞分裂增殖, 为血管形成提供基质;后者则有助于膜结合型配体向松散型配体转化。本例A1、B1组中MMP-9及VEGF的表达均明显高于A2、B2组, 能够直接证实糖尿病患者血管新生能力明显降低, 术后4周观察肌肉血流及微血管数量, 亦证实G-CSF联合b FGF的疗效尚需提升。
本研究结果同时能证实, 在上述两类药物的基础上, 联用UAG可能达到更佳的疗效, C2组大鼠MMP-9及VEGF水平均明显高于B2组, 与之一致, 其术后4周肌肉血流及微血管数量亦明显高于B2组。这可能说明UAG有助于修复糖尿病患者EPC活化的缺陷。既往有研究指出该药物能够抑制p53及p21的表达与堆积[10], 后两者均为调节细胞衰老的主要因子, 大量堆积将导致内皮祖细胞老化、血管再生能力下降。经过输注UAG后, C1、C2组MMP-9及VEGF的表达量大体一致, 能够说明大鼠内皮祖细胞的增殖与动员能力已恢复至无糖尿病水平[11];但C1组与B1组MMP-9与VEGF的表达基本一致, 则提示在正常人群中, UAG可能无法继续修复内皮祖细胞活化的缺陷, 因此可以认为, 对UAG仅适用于糖尿病相关下肢缺血症状的治疗, 在其它下肢缺血症状中的疗效及作用机制尚需进一步探究[12]。总之, 本研究说明G-CSF联合b FGF能够实现下肢缺血症状的血管再生, 而对合并糖尿病患者, 进一步联用UAG能够显著提升疗效。
摘要：目的:研究去乙酰化胃肠激素 (UAG) 、粒细胞集落刺激因子 (G-CSF) 联合碱性成纤维细胞生长因子 (b FGF) 对糖尿病大鼠缺血后肢血管新生的促进作用及作用机制。方法:以120例Wistar大鼠为研究对象, 随机将其划分为A、B、C三组, 并将每组40例进一步划分出组1、组2, 各组1均为正常后肢缺血模型、组2均为糖尿病后肢缺血模型。A1、A2组不予药物干预;B1、B2组予G-CSF联合b FGF干预;C1、C2组予UAG、G-CSF联合b FGF干预。术后1周, 每组取10只大鼠, 检测缺血区组织基质金属蛋白酶-9 (MMP-9) 、血管内皮生长因子 (VEGF) 的表达;术后4周, 余大鼠行激光多普勒检测后肢肌肉血流后, 处死并检测缺血区组织毛细血管数量。结果:MMP-9及VEGF表达均呈现C组>B组>A组、各组1>各组2趋势, 且C组与A组、B组与A组间差异有统计学意义, 同时C2组MMP-9及VEGF表达均明显高于B2组 (P<0.05) ;组内对比, A1、B1组分别明显高于A2、B2组 (P<0.05) 。肌肉血流及毛细血管数量亦呈现C组>B组>A组、各组1>各组2趋势, 且C1组与A1组, B1组与A1组, C2、B2、A2间差异均有统计学意义 (P<0.05) ;组内对比A1、B1组分别明显高于A2、B2组 (P<0.05) 。结论:UAG联合G-CSF与b FGF可有效促进糖尿病大鼠缺血后肢血管新生, 其机制可能与促进MMP-9、VEGF的表达有关。
关键词：糖尿病,肢体缺血,血管新生,基质金属蛋白酶-9,血管内皮生长因子
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去乙酰化 篇6
关键词：二茂铁,傅克反应,乙酰二茂铁,二乙酰二茂铁,合成
一、研究背景
陕西师范大学化学实验教学中心是国家级实验示范教学中心, 近年来在实验教学改革中进行了一系列的实践探索工作, 特别是对实验教学内容的改革力度较大。为了加强学生的动手能力, 对原来的有机化学实验、无机化学实验中重复性和过于经典的合成实验进行了删减和整合, 新的实验教学大纲中集中体现了基本单元实验的新颖性 (即实验内容新、实验方法新) 。为了强化学生的基本操作技能和加强学生分析问题和解决问题的能力, 我们为大三学生开设了综合实验, 这种综合集中体现了化学学科知识的综合以及化学学科中无机化学实验、有机化学实验、分析化学实验以及物理化学实验的基本实验技能的综合, 其中的一个综合实验就是乙酰二茂铁的合成。其基本设计思路如下:
从以上框架图中不难看出, 乙酰二茂铁的合成综合了有机化学的分镏技术 (第一分步, 环戊二烯的解聚) 、无机物的制备 (硫酸亚铁的合成) 、金属有机物的合成 (第二分步, 二茂铁的合成) 、乙酰二茂铁的合成 (第三分步) 、分析化学中复杂物质的分离技术 (柱分离) 以及物质结构的鉴定等。学生要完成这个实验, 首先必须具备以上基本知识和具有以上的操作技能, 充分体现了知识点和操作技能综合性的统一。由于该实验有以上特点, 因此目前国际同类型大学都开设了此实验, 有些学校对此实验进行了改进。如美国的新奥尔良洛约拉大学化学系 (Department of Chemistry, Loyola University, New Orleans) 从2008年开始就对该实验中的乙酰化一步进行了改进, 目的是避免大量使用磷酸。我们开设乙酰二茂铁的合成, 除了该实验具有高度的综合性以外, 二茂铁及其衍生物本身具有多种用途, 如二茂铁及其衍生物可用作火箭燃料的添加剂、汽油的抗爆剂、硅树脂和硅橡胶的熟化剂及紫外线吸收剂等。二茂铁的乙烯基衍生物能发生烯键聚合反应, 得到碳链骨架的含金属的高聚物, 可作航天飞船的外层涂料。此外, 二茂铁在节油、消烟、结炭等方面具有重要作用。到现在, 由于二茂铁在有机材料合成方面展示出不寻常的固态性质, 二茂铁化学在材料科学领域也引起了高度的重视。我们选择此实验的目的就是激发学生对实验的兴趣。传统的乙酰二茂铁合成方法是以二茂铁为原料, 以乙酸酐为酰化试剂, 在大量磷酸的存在下进行乙酰化的。但目前国内乙酸酐的供应受到一定限制 (控制商品) , 同时大量的磷酸的使用也不符合环保要求, 为此我们对二茂铁乙酰化一步进行了改进, 改进后的方法是以二茂铁为原料, 以乙酰氯为酰化试剂, 在锌粉存在下, 合成乙酰二茂铁。改进后的方法通过两届学生的实践, 效果明显。现将改进的过程及改进后的结果报告如下, 以供同行商榷。
二、实验条件的考察:
1. 试剂与仪器:
试剂:二茂铁 (学生自己合成) , 纯度98%;乙酰氯 (AR) ;二氯甲烷 (AR) ;锌粉 (AR) ;硅胶等。仪器:CL-3型恒温加热磁力搅拌器、WXG-11t型电接点玻璃水银温度计、RE-52AA型旋转蒸发仪、X-5型显微熔点测定仪。
2. 催化剂的选择:
由于用乙酰氯替代了传统方法中的酰化试剂乙酸酐, 因此催化剂也随之替代, 本实验选用金属单质作为催化剂。实验中, 我们筛选了四种金属单质, 分别是金属铝粉 (Al) 、金属粉 (Zn) 、金属铜粉 (Cu) 、金属铁粉 (Fe) 。分别在4个100m L的单口烧瓶中分别加入5mmol二茂铁, 然后各加入20m L无水乙醚, 搅拌使其溶解, 接着在四个烧瓶中分别加入四种金属催化剂各5mmol, 最后用恒压漏斗向四个烧瓶中各加入5mmol乙酰氯 (控制滴加速度, 每秒一滴) 。滴加完后, 在室温下搅拌使其反应两小时, 在此过程中, 用薄层色谱跟踪反应的进程。待反应完成时, 反应液用常规方法处理, 产物用柱分离方法获得。具体实验结果见表1 (见上表) 。由表1可知, 只有金属锌粉作催化剂时才有目标产物生成, 因此本实验选定了金属锌粉作为催化剂。
3. 溶剂的选择:
由于无水乙醚沸点很低 (34.5℃) 且极易燃烧, 存在一定的安全隐患, 为此我们选用二氯甲烷作溶剂进行实验。仍然保持二茂:乙酰氯:锌粉=1:1:1 (摩尔比) , 溶剂为二氯甲烷。实验过程同二、2。待反应时间结束时, 处理反应液, 柱分离得到产物得到乙酰二茂铁15%。说明二氯甲烷可作为该反应的有效溶剂。
4. 温度对反应的影响:
一般来说, 加热可以提高化学反应的速率, 但在本实验中考虑到过高的温度可能会促进环戊二烯的聚合, 因此在进行最佳温度的选择时, 进行两组实验, 一组为室温, 另外一组为回流温度。具体实验如下:在两个100m L的烧瓶 (一个是单口, 另一个为三口) 中分别加入5mmol二茂铁, 接着向两个烧瓶中各加入20m L二氯甲烷, 搅拌使其溶解, 然后再分别向每个烧瓶中加入5mmol锌粉, 最后用恒压漏斗向两个烧瓶中各加入5mmol乙酰氯的混合液 (控制滴加速度, 每秒一滴) 。滴加完后, 单口烧瓶中的反应液在室温下搅拌使其反应。对于三口烧瓶的反应液, 调节温度, 使三口烧瓶中的反应液回流。为了使最终的产率能有所提高, 控制两组反应时间为4小时, 在反应过程中, 用薄层色谱跟踪反应的进程。待反应时间结束时, 处理反应液, 柱分离得到产物。实验结果证明, 室温反应所得乙酰二茂铁的收率为15%, 而回流下所得乙酰二茂铁的收率为16%, 说明该反应受温度的影响不大。
5. 物料配比对反应的影响:
为了提高产物的收率, 我们对反应底物 (二茂铁) 、酰化试剂 (乙酰氯) 和催化剂 (锌粉) 之间的比例也进行了考察。固定二茂铁为5mmol, 改变乙酰氯和锌粉的量从5mmol～50mmol, 进行十组实验。实验过程同上述操作, 实验结果如表2。
a柱分离收率
由表2可以看出, 当二茂铁:乙酰氯:锌粉=1:1:1～1:3:3 (摩尔比) 时, 该反应只得到唯一产物乙酰二茂铁, 并且随着乙酰氯和锌粉用量的增加, 产物的收率也再增加 (第1组～第3组) 。当乙酰氯和锌粉的用量为二茂铁的4倍时, 除了可顺利得到乙酰二茂铁以外, 还得到了8%收率的二乙酰二茂铁 (第4组) 。继续增加乙酰氯和锌粉的用量, 其总的转化率也不断增加, 当乙酰氯和锌粉的用量为二茂铁的8倍时, 总的转化率大到了最大值 (40%, 第8组) , 再增加乙酰氯和锌粉的用量, 总的转化率反而有所降低 (第9组～第10组) 。考虑到本实验的一个重要环节就是要使学生掌握对复杂物质的分离技术, 即柱分离技术, 本实验选择的物料比为二茂铁:乙酰氯:锌粉=1:8:8 (摩尔比) 为最佳物料比。
三、改进后的实验步骤
在一个干燥的150ml的三口烧瓶中加入1.86g二茂铁 (10mmol) 及30m L二氯甲烷, 并放入搅拌磁子, 在其中的一个瓶口上安装恒压漏斗 (内装约5.8m L, 80mmol预先蒸过的乙酰氯) , 在另一个瓶口上装上回流冷凝管组成回流装置, 开动搅拌器和加热电源, 搅拌使二茂铁快速溶解。当二茂铁溶解后, 从第三瓶口准确加入锌粉5.2g (80mmol) 于二茂铁二氯甲烷溶液中。关掉加热电源, 开启恒压漏斗旋塞, 滴加乙酰氯, 控制滴加速度 (1滴/秒) 。反应20分钟左右, 溶液变为紫红色, 随着反应的进行, 溶液的颜色继续变深。在反应中, 每30分钟用薄层色谱跟踪反应的进程, 反应约需2～4小时。待反应结束后, 整个溶液呈墨绿色。将烧瓶内的溶液转移至40mL10%的Na2CO3水溶液中, 烧瓶底部中的凝聚物用二氯甲烷洗涤三次 (3×10m L) , 洗涤液并入上述Na2CO3水溶液中, 搅拌后静置5分钟 (此时可以观察到烧杯中有大量的气泡冒出) 。最后将所有溶液一并转移至250mL的分液漏斗中, 静置后分出有机层, 向有机溶液中加入少量无水硫酸钠进行干燥, 静置约4小时以上, 过滤得干燥的有机溶液。在减压下将上述处理后得到的有机溶剂除去 (用旋转蒸发仪除去溶剂) , 残留混合物进行柱色谱分离。湿法装柱干法上样, 淋洗液为石油醚和无水乙醚的混合物 (体积比为3:1) 。色谱分离后可依次得到两个组分溶液, 即乙酰二茂铁, 二乙酰二茂铁溶液。将上述二个组分分别减压浓缩 (用旋转蒸发仪除去溶剂) , 除去有机溶剂 (要彻底蒸干) , 在约60～70℃下干燥得纯品。分别称重后计算乙酰二茂铁和二乙酰二茂铁的收率。用熔点测定仪测定两产物的熔点以作结构鉴定 (乙酰二茂铁文献值:mp85℃, 二乙酰二茂铁文献值:121-122℃) 。有条件的可进一步进行波谱分析。完成本实验约需16～20小时。
四、结果与讨论
1. 本实验建立了以锌粉做催化剂, 乙酰氯作酰化试剂, 合成乙酰二茂铁的新方法, 该方法的特点是操作简单, 实验过程中反应现象明显, 易于产物的分离与表征。重要的是本实验在合成乙酰二茂铁时选用的溶剂为二氯甲烷, 避免了大量使用无水乙醚, 成本低安全性强。
2. 当物料配比为二茂铁:乙酰氯:锌粉=1:8:8时, 除了得到正常的乙酰二茂铁外, 还能得到二乙酰二茂铁, 将二者完全分离可有效地提高学生的色谱分离技术。
3. 本实验在操作方面需要注意的是加料顺序不要颠倒, 锌粉在二茂铁完全溶解后加入, 这样可以在一定程度上减少烧瓶底部附着物的量;反应可在室温下进行, 避免较高温度下二茂铁的聚合反应的发生。
参考文献
[1]K.R.Birdwhistell, A.Nguyen, E.J.Ramos, R.Kobelja.Acylation of Ferrocene:A Greener Approach[J].Journal of Chemical Edu-cation, 2008, 85, 261-262.
[2]P.L.Pauson, T.J.Kealy, Nature[J].1951, 168:1039.
[3]高松平, 张俊祥, 李冰.乙酰基二茂铁的合成工艺的研究[J].华北工学院学报, 2004, 25 (4) :281-284.
去乙酰化 篇7
关键词：木薯淀粉,羟丙基乙酰化双淀粉己二酸酯,凝沉性,冻融稳定性
广西是全国最大的木薯淀粉产地,利用改性可以制备不同的木薯变性淀粉[1,2]。羟丙基淀粉糊液具有良好的保水性、冻融稳定性,但是其耐酸及耐剪切性较差。己二酸酯乙酰化淀粉对热、酸和剪切力的影响具有高稳定性。羟丙基乙酰化双淀粉己二酸酯可以兼具二者优点[3]。卞科军利用玉米淀粉采用微波法制备羟丙基乙酰化二淀粉己二酸酯[4]。曹镜明[5]申请了羟丙基乙酰化己二酸酯淀粉制备的专利。另外制备乙酰化己二酸酯淀粉也有报道[6,7,8,9]。本论文利用木薯淀粉制备羟丙基乙酰化二淀粉己二酸酯,为木薯淀粉的开发提供理论基础。
1实验部分
1.1试剂
木薯淀粉,广西昕阳淀粉有限公司; 乙酸酐、环氧丙烷、 己二酸等均为分析纯。
1.2试验方法
1.2.1羟丙基淀粉的制备[9]
称取干淀粉质量19% 的Na2SO4和1. 1% 的Na OH,制成30% 的淀粉乳溶液,在氮气环境中加入10% 的环氧丙烷,在18 ℃ 下反应0. 5 h,再将其移入45 ℃ 水浴锅中 ,恒温反应17 h,用3% 的盐酸调节p H值至5. 5,抽滤洗涤至无Cl-为止, 干燥测取代度为0. 1290。
1.2.2乙酰化二淀粉己二酸酯的单因素试验[7]
称取木薯淀粉配成一定浓度的乳液,加入混合酸酐,于45 ℃ 时搅拌反应,用0. 1 mol/L的氢氧化钠调节p H为7 ~ 10。反应结束后调p H至5. 0,依次用水和乙醇溶液洗涤,干燥得乙酰化二淀粉己二酸酯。
1.2.3乙酰化二淀粉己二酸酯正交试验
在影响交联酯化反应的单因素实验结果基础上,选择淀粉乳浓度(A)、p H值(B)、反应时间(C)、混合酸酐加入量(D) 作为四因素,进行四因素三水平正交试验(表1)[11,12]。
1.2.4羟丙基乙酰化二淀粉己二酸酯的制备
称取淀粉配成最佳浓度的乳液在45 ℃ 反应,在最佳p H下,称取干淀粉质量19% 的Na2SO4,在氮气环境中加入10% 的环氧丙烷,然后加入最佳的混合酸酐用量,在最佳反应时间结束反应,p H调至5. 0左右,依次用水 和乙醇溶 液洗涤, 45 ℃ 烘干得到乙酰化二淀粉己二酸酯。
1.2.5乙酰化二淀粉己二酸酯性质测定
( 1 ) 取代度的测定
参照侯成杰[7]的检测方法,基本操作为: 称取5. 00 g样品加入50 m L蒸馏水,以酚酞指示剂,用Na OH溶液滴至呈微红色,再加入Na OH溶液皂化最后用HCl标准溶液滴定至红色消失。
(2) 溶解度测定[9]
称取样品5 g加35 ℃ ~ 40 ℃ 的水溶解,用定量滤纸过滤, 将附有滤渣的定量滤纸于(105 ± 2) ℃ 干燥至恒重,计算不溶物的含量。
(3) 透明度的测定[9]
准确称取0. 5 g样品,配成1% 溶液,在搅拌下于沸水中保温20 min,冷却至室温,以蒸馏水为空白,用分光光度计测650 nm处的透光率,同一样品测三次,取其平均值。
(4) 凝沉性的测定[9]
取透明度的测定中的淀粉糊25 m L,注入25 m L具塞刻度试管中。在25 ℃ 下静置6 h、1 d、2 d、3 d、4 d、5 d、6 d、 7 d后,观察其分层情况并分别记录上清液的体积( m L) 。
(5) 冻融稳定性的测定[9]
将样品配制成3% 的淀粉糊,在搅拌下,在100 ℃ 保温20 min,冷却至室温。放入离心管中,于 - 15 ~ - 18 ℃ 静置18 h。自然解冻后离心分离上清液再称量。
2结果与讨论
2.1乙酰化二淀粉己二酸酯制备的单因素分析
2.1.1淀粉乳初始浓度对取代度(DS)的影响
由图1可知,淀粉的浓度在30% 时,取代度最大,这是因为当淀粉乳浓度过小时,分子碰撞较少,浓度过大时,反应系统因为粘稠难以接触。
2.1.2反应pH值对取代度(DS)的影响
由图2可知,在p H为8附近时淀粉的取代度最大,这是由于碱性环境具有双重作用,第一使淀粉葡萄糖上羟基变成氧负离子,利于亲核进攻; 第二是酸酐键水解使反应能力降低, 因此选择弱碱性的环境。
2.1.3反应时间对取代度(DS)的影响
由图3可知,在反应时间为90 min时,淀粉酯的取代度取得最大。这是由于开始的酸浓度很大,反应速度快。随着反应的进行,酸的浓度减小,从而使淀粉的取代度增加变慢。
2.1.4混合酸酐加入量对取代度(DS)的影响
由图4知,淀粉的取代度随着混合酸酐质量分数的增加而增加,考虑到反应成本,混合酸酐质量分数4. 5% 。
2.2乙酰化二淀粉己二酸酯制备的正交试验分析
在上述单因素实验基础上,进行正交实验,实验结果如表2。
对表2进行极差分析可知,p H对取代度的影响稍大。最佳工艺参数为: 体系淀粉 乳浓度30% ,p H值8,反应时间90 min,混合酸酐加入量4. 5% 。按最佳工艺参数制备乙酰化二淀粉己二酸酯取代度为0. 033,与正交试验结果吻合。与卞科军利用玉米淀粉采用微波法制备羟丙基乙酰化二淀粉己二酸酯相比,略低于0. 0481。
2.3羟丙基乙酰化双淀粉己二酸酯物理性质分析
2.3.1羟丙基乙酰化双淀粉己二酸酯的溶解度、透明度和冻融稳定性
由表3可知,羟丙基乙酰化双淀粉己二酸酯比木薯淀粉溶解性降低,透明度差,冻融稳定性明显提高,其原因在于在交联时,淀粉团粒完整性较好,导致溶解性降低,透明度差。另一方面,由于羟丙基乙酰化双淀粉己二酸酯的羧基使其亲水性增加,羟丙基减弱了淀粉分子间的氢键形成,从而析水率降低,冻融稳定性提高[13,14]。
2.3.2羟丙基乙酰化双淀粉己二酸酯的凝沉性
由表4可知,木薯淀粉经过酯化后,羧基的引入使淀粉糊更加稳定,从而使得凝沉稳定性增强[15]。
3结论