青霉素提取工艺

青霉素提取工艺（精选4篇）

青霉素提取工艺 篇1

青霉素是目前生产量最大应用最广泛的抗生素, 具有抗菌作用强、疗效高、毒性低等优点, 是治疗敏感性细菌感染的首选药物, 随着青霉素市场生产量剧增, 大有供过于求的趋势[1,2]。因此, 各青霉素生产厂家下大力量, 改革工艺, 提高技术指标, 降低成本来占领市场, 青霉素提纯工艺的进展主要集中在改进工艺、方法、设备几方面。文采用正交设计法研究青霉素钾盐提取工艺, 设计三因素三水平正交试验, 确定最佳青霉素钾盐提取工艺, 为进一步提高工业生产中青霉素钾盐收率和质量提供依据。

1 仪器和试剂

1.1 主要仪器:

磁力搅拌器、离心管、医用高速离心机等。

1.2 主要试剂:

硫酸、醋酸丁酯、纯化水等。

2 实验方法

2.1 在100ml烧杯中, 称取一定量的破乳剂加入一定量的纯化水, 用磁力搅拌器充分搅拌溶解成不同浓度的破乳剂水溶液。

2.2 取100ml的青霉素滤液放入烧杯中, 加入不同浓度的破乳剂。

2.3 取不同量的醋酸丁酯加入到滤液中, 并用磁力搅拌进行搅拌。

2.4 用一定浓度的硫酸加入到滤液中, 再搅拌下调节到不同pH值, 搅拌10分钟后离心, 分别测水相的效价和酯含量及收率。

2.5 因素水平选择

按2.1-2.4实验方法, 重点考察了pH值 (A) , 水相中醋酸丁酯的量 (B) , 破乳剂的量 (C) 三个影响收率最重要的因素, 每个因素各取三个水平 (见表1) 。

3 结果与讨论

3.1 直接比较表1可知在这9个实验结果中, 以实验5产生的水相中酯含量最少, 对应提取收率最高, 其水平组合为A2, B2, C3, 分别是各因素中影响最大的水平。

3.2 根据正交试验结果, 随着pH值的升高, 萃取收率有所降低, 但低pH条件下, 由于青霉素降解所产生的杂酸亦相对较多, 对后工序的产品质量会造成一定的影响。在pH为1.5以下, 青霉素纯度下降明显, pH高于2.0, 萃取收率收率降低较明显, 同时pH越高, 乳化层较薄, 萃取效果好, 萃取液的质量越好。

3.3 温度对青霉素的萃取收率是有一定影响的, 而滤液中蛋白含量高, 温度对其萃取率的影响更为明显, 萃取操作在5℃以下, 特别在10℃以下, 乳化严重, 需添加大量破乳剂才能操作。而在10℃以上, 特别在15℃左右一般乳化程度大大减少。

3.4 实验证明了破乳剂质量对萃取效果和收率有较大影响, 实验发现破乳剂的水中溶解度越高破乳效果越好。同时破乳剂水溶液稳定性也直接影响萃取效果, 破乳剂水溶液在室温调价下放置2小时以上, 析出物量越少, 萃取效果越好。

4 结论

本文采用正交试验方法, 研究青霉素工业钾盐提取工艺, 在实验过程中, 运用溶剂萃取理论, 结合青霉素理化性质, 分别对pH值、温度和破乳剂使用量三因素设计了三因素三水平的正交实验, 针对青霉素发酵液效价高、蛋白含量高、杂质含量多、不易分离等特点, 通过正交试验最终确定了最佳的青霉素工业钾盐的提取工艺控制条件, 萃取温度控制在14-16℃, pH在1.7-2.0, 破乳剂的量在3ml。采用此条件生产, 青霉素工业钾盐的提取过程中水相中酯含量最低、质量最好、收率最高。

实际生产验证, 采用此工艺生产的青霉素钾盐提取收率有大幅度提高, 生产成本也有较大幅度降低, 为企业带来了较大的经济效益。

参考文献

[1]苗勇等.青霉素提纯工艺生产现状和研究发展[J].中国医药工业杂志, 1999, 30 (9) .

[2]刘学文等.Decanter萃取机在青霉素生产中的应用[J].中国医药工业杂志, 1994, 25 (2) .

[3]邬行彦等.抗生素生产工艺学[M].北京:化学工业出版社, 1992.

春雷霉素生产发酵工艺优化的研究 篇2

关键词：春雷霉素;工艺优化

春雷霉素是1963年从国外土壤中分离得到的一种放线菌所产生的氨基糖苷类农医两用抗菌素。它具有低残留、无公害等绿色特点，现在为国内外农药发展的主要方向。因为抗生素在发酵过程中受诸多因素影响，且各种发酵因素相互制约，只要发酵过程中某个因素成为限制因素， 就会对全局产生影响。故必须掌握发酵代谢规律、微生物与其周围环境的相互关系等手段来操控代谢达到提高产生预期产物的目的。面对春雷霉素单位低下的问题，在生产过程中，我们对稳定pH控制、补料代谢分析经行了大量实验，通过分析我们发现，目前影响单位提高主要有以下几个方面：首先是碳源的选择不合理，发酵过程中以玉米油为碳源的发酵代谢水平低，通过选择新的碳源来提高代谢水平;其次是菌种在稳定的pH范围下适宜生长，有利于提高发酵单位。再次，选择新碳源后，其他发酵条件相应进行了调整，以达到生产工艺的优化。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种。春雷霉素小金色链霉菌由华北制药华胜公司提供。

1.1.2 培养基。一级种子培养基：高温黄豆饼粉、NaCl、 KH2PO4、酵母粉、饴糖、消沫剂、消后体积300L，消前调pH6.0以上，28℃培养。二级种子培养基：高温黄豆饼粉、NaCl、 KH2PO4、酵母粉、饴糖、消沫剂、，消后体积6m3，消前调pH6.0以上，28℃培养。发酵培养基：低温饼粉、NaCl、KH2PO4、玉米浆、饴糖 、消沫剂、计算体积42m3，消前调pH6.2-6.4。

1.1.3 培养基灭菌手段与灭菌温度。采用了一二级种子罐同步连消，发酵罐单独灭菌的方法。连消温度由123℃降至122℃，最大限度克服了培养基受破坏，保证了种子的质量和及时移种，缩短了初级生长期，相对延长了抗生素分泌期，对发酵水平提高起到了积极作用。

1.1.4 培养条件。一级种子培养：在700L种子罐中按配比加入培养基，灭菌温度120-121℃保温30分钟，降温至28℃接种进行一级种子培养，搅拌转速270rpm/min，通气量30m3/h，取样测量菌丝量和pH，接种到二级种子罐内。二级种子培养：在11m3种子罐中按配比加入培养基，灭菌温度121-122℃保温30分钟，降温至28℃接种进行二级种子培养，搅拌转速170rpm/min，取样测量菌丝量和pH接种到发酵罐内。发酵培养：在62m3种子罐中按配比加入培养基，灭菌温度121-123℃保温30分钟，降温至28℃接种进行发酵培养，搅拌转速140rpm/min，根据代谢情况进行。

1.1.5 接种量、接种周期的最优选择。春雷霉素采用的是三级发酵，接种量和接种周期对于发酵罐前期生长能否达到最佳状态至关重要，为此我们分别将一级种子和二级种子的生长周期和种子量进行了分批对比，从而确定最优值。春雷种子罐周期为26h，通过显微镜观察，发现种子罐种龄延长2-3小时，菌丝会染色浅、细碎、中罐放罐前甚至会自溶。

为此我们将中小罐不同接种周期在单种的情况下对发酵罐起步单位和菌丝状态进行了对比：

表1  不同种龄的起步单位单种对照表

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如表1所示，笔者从经济和质量方面考虑后确定了一级种子为26h，二级种子为24h的最佳种龄一级种子、二级种子的放罐菌丝形态，结果显示种子质量全部符合标准，达到丛网状态，适宜移种。

表2  不同接种量对发酵前期影响的对照表

■

由此表2可见一、二级种子罐为双种或者单种时对发酵前期影响不大。

1.2 代谢培养

1.2.1 以饴糖代替玉米油作为主要碳源。在生产中我们发现，在以玉米油作为主要碳源的代谢过程中，代谢变化不明显，而以饴糖为主要碳源，糖的代谢变化明显。发酵单位的增长情况与现有碳源代谢情况无必要关联，而与还原糖的代谢有重要关联。我们认为，以补糖代替补油是提高发酵单位的重要原因。

1.2.2 控制发酵过程中临界和最适pH值。在生产过程中，春雷霉素发酵的合适pH范围为6.3-6.8。通过通氨和补糖共同调节pH。在注意春雷霉素自身稳定性的同时有效的提高了发酵效价。以前pH在6.8左右就放罐，我们在试验中观察到，pH不超过6.7发酵是稳定的，且发酵过程中pH越稳定，发酵单位就越高，我们把pH为6.7设定为临界值，并且将pH细化在6.3-6.7范围内，将放罐各项指标进行有效控制，使发酵更加稳定。

1.2 结论

本研究结果表明：在春雷霉素發酵过程中，春雷种子罐最适周期一级种子为26h，二级种子为24h，用补料糖水代替补料油后不仅成本下降，而且发酵体积增大，发酵总亿也会相应的增加。在补充碳源的同时补加玉米油，pH控制在6.3-6.7范围内，同时设定临界pH值，将放罐各项指标进行精确控制，有效保证了发酵水平。

参考文献：

[1]邬行彦，熊宗贵，胡章助，等.抗生素生产工艺学[M].化学工业出版社，1994，34.

青霉素提取工艺 篇3

1 材料与方法

1.1 实验药品及来源:

灰黄霉素产品:由赤峰制药股份有限公司提供;试剂为分析纯, 设备仪器为实验室常规使用设备。

1.2 实验方法

1.2.1 薄层层析法考察洗脱剂的条件:

通过HPLC法测得灰黄霉素产品中去氯灰黄霉素的含量为0.3%。根据相关文献可知, 去氯灰黄霉素在丙酮和N, N-二甲基甲酰胺中具有较大的溶解度, 故分离去氯灰黄霉素的展开剂由乙酸乙酯与正己烷组成。本实验以不同配比的展开剂进行薄层层析对比分离效果, 并对比采用丙酮和N, N-二甲基甲酰胺作为溶剂的分离效果。

1.2.2 硅胶柱层析

a准备工作:取一柱长45cm, 直径约3cm的下端有沙漏和活塞的玻璃层析柱, 洗净, 凉干。取层析硅胶200克于大烧杯中, 加入配好的比例为正己烷:乙酸乙酯为1:3的展开剂至层析硅胶完全浸没, 密封, 放置24小时。

b装柱:向浸泡后的层析硅胶中加入适量展开剂, 用玻璃棒搅起硅胶沉淀, 然后将浑浊夜倒入玻璃柱中然后静止, 待硅胶沉淀完全, 放出适量展开剂, 再以同样的方法将剩下的层析硅胶装入柱内, 静置至沉淀完全, 始终保持液面高于层析硅胶上面。

c样品溶液配制:称取约30g的灰黄霉素产品于100m L锥形瓶中, 加入展开剂至100m L的刻度线处, 置于超声波仪器中超声30min, 取出静置至沉淀完全, 将上清液用滤纸过滤后收集滤液, 待用。

d层析分离:将过滤后的样品溶液加入到层析柱中, 加入样品溶液的高度约4cm, 流速每秒1-2滴, 用50m L锥形瓶接流出液, 做薄层层析, 收集带有去氯灰黄霉素斑点的流出液。

经过柱层析, 灰黄霉素和去氯灰黄霉素并未成功分离, 可能是溶剂丙酮影响了展开剂的比例, 使层析效果不佳。改为N, N二甲基甲酰胺溶剂后, 分离效果理想。去氯灰黄霉素在灰黄霉素产品中含量很少, 须经多次硅胶柱层析, 将所有收集到的去氯灰黄霉素溶液合并, 进行浓缩结晶, 才能得到一定量的去氯灰黄霉素溶液。

1.2.3 浓缩与结晶:

将含有去氯灰黄霉素组分的合并洗脱液用旋转蒸发仪进行浓缩, 60℃条件下蒸馏, 将得到的剩余溶液倒入干净的锥形瓶中, 加入少量水, 即有白色晶体析出, 经过滤、洗涤、干燥, 即得去氯灰黄霉素结晶。

1.2.4 产物的纯度检查:

采用反向HPLC法, 以乙腈:水=35:65为溶剂, 以乙腈:水:冰乙酸=40:50:1为流动相。采用面积归一化法计算产品的纯度, 在相同条件下测定去氯灰黄霉素和灰黄霉素产品的色谱图。

2 结果

2.1 薄层层析法考察洗脱剂的条件

2.1.1 丙酮作为溶剂时薄层层析法结果:

各比例展开剂的薄层层析实验图如图1, 其中1为去氯灰黄霉素, 2为灰黄霉素。其中展开剂正己烷:乙酸乙酯的比例分别为:a=1:1, b=1:2, c=1:3, d=2:1, e=3:1。由图可知, 样品中物质分离且样品点展开位置比较理想的是正己烷:乙酸乙酯为1:3的展开剂。

2.1.2 N, N-二甲基甲酰胺作为溶剂时薄层层析法结果:

不同溶剂所得薄层色谱图效果如图2。其中1为去氯灰黄霉素, 2为灰黄霉素。f是以N, N二甲基甲酰胺为溶剂, g是以丙酮为溶剂。对比可知, 以N, N二甲基甲酰胺为溶剂时, 样品中物质分离较好, 且样品点展开位置比较理想。

2.2 硅胶柱层析结果

采用HPLC面积归一化法计算去氯灰黄霉素的纯度为90.5%, 保留时间为10.640, 谱图见图3。在相同条件下测定灰黄霉素产品中去氯灰黄霉素的保留时间为10.429, 谱图见图4。

3 结语

通过实验分析可知, 在展开剂中正己烷:乙酸乙酯为1:3时, 灰黄霉素和去氯灰黄霉素有较好的分离效果, 因此选择正己烷:乙酸乙酯 (1:3) 的展开剂为柱层析的洗脱剂, 以N, N二甲基甲酰胺为溶剂, 分离得到的去氯灰黄霉素, 其HPLC主峰保留时间 (t=10.640min) 与灰黄霉素产品中去氯灰黄霉素峰的保留时间 (t=10.429min) 基本一致, 说明所得产物为去氯灰黄霉素, 且纯度可达90.5%。

摘要：采用薄层色谱法和硅胶柱层析法对灰黄霉素产品中去氯灰黄霉素杂质进行分离提取。利用柱层析硅胶为固定相, 正己烷-乙酸乙酯 (1:3) 为洗脱剂, 进行单向一次性色谱分离得到去氯灰黄霉素, 用HPLC法测得其纯度为90.5%。

关键词：灰黄霉素,杂质,去氯灰黄霉素,薄层层析,硅胶柱层析。

参考文献

[1]朱育菁, 于晓杰, 潘志针, 等.灰黄霉素的研究进展[J].厦门大学学报 (自然科学版) , 2010, 49 (3) :435-438.

[2]于广成, 李相超, 李志刚, 等.氯离子对灰黄霉素发酵的影响[J].中国医药工业杂志, 2002, 33 (12) :587-588.

青霉素提取工艺 篇4

关键词：青霉素,菌株,米孢子

1 试验材料

1.1 青霉素产生菌:

产黄青霉菌08-98#。

1.2 斜面培养基:

玉米浆、琼脂粉、酵母粉、七水合硫酸镁、蛋白胨、氯化钠、磷酸二氢钾、五水合硫酸铜。

1.3 发酵培养基:

玉米浆、乳糖、豆油、苯乙酸钾、轻质碳酸钙。

1.4 小米综合培养基:

合成培养基+天然培养基﹙小米:石家庄蔚县特产品种, 适用于青霉素孢子制备﹚。

1.5 培养条件:

温度25±1℃、相对湿度45±5%。

2 考查方法及结果

2.1 固体培养

2.1.1 最佳孢龄的考查

将08-98﹟菌种接种斜面培养基, 第一天正放, 随后8天反放, 至孢子形成, 开始接种揺瓶发酵, 考查孢子生产能力, 并结合镜检, 根据菌种在固体培养基上生长情况和斜面孢子质量的控制标准, 确定最佳孢龄。

2.1.2 最佳孢子龄揺瓶发酵考查结果

由表1可知:通过对斜面孢子外观观察, 7天以前的斜面孢子颜色由白渐绿, 第7—8天之间的斜面孢子外观呈绿色, 生长均匀, 该周期孢龄的斜面孢子量多, 孢子成熟好, 镜检结果表明, 8天的孢子成熟, 适于米孢子生长, 并保证质量相对稳定, 利于冷藏, 接种揺瓶发酵考查相对效价高, 且稳定性好。

2.2 液体培养

2.2.1 最佳揺瓶种龄考查

用生长8天的斜面接种种子培养基, 培养24小时开始取样镜检;同时对28h至42h种龄的种子进行揺瓶发酵考查, 确定最佳种龄。

2.2.2 最佳种子龄揺瓶发酵考查结果

由表2可知:揺瓶种子在34—36小时适宜移种。菌浓一般为26—28%, 镜检结果表明, 种液粘稠、均匀, 菌丝粗壮、分散好。此前菌丝较年轻, 表现为结团、不均匀;此后的菌丝明显衰老, 即变细并出现空泡。由此, 34—36小时是揺瓶种子的最佳种龄。

2.3 米孢子生长周期考查

2.3.1 小米的筛选

小米经国家谷物检测中心和河北省农科院分析测定, 其淀粉含量高达70%, 蛋白质质量优于小麦、稻米和玉米, 且性质呈碱性;使用时先用20目筛子筛去碎米, 然后用放大镜挑选, 要求米粒外表圆润饱满无凹凸, 大小颜色均匀, 色泽鲜亮, 无虫无杂质, 并具有清香。

2.3.2 菌落的考查

(1) 菌落挑选

采用稀释涂布分离法, 用无菌蒸馏水作连续稀释, 为避免菌落生长过程中相互干扰, 选择最适稀释度, 使每个平皿上菌落数为3—5个。将分离后的平皿放置培养8—9天。第一天将碟子正放, 之后反放。

优良菌落的典型形态:当孢子接种于固体培养基时, 菌丝会在平面上生长并产生分枝, 当菌丝扩展形成更多分枝后, 菌落变得肉眼可见, 此时产黄青霉的菌落呈圆形, 周边由平行的生长菌丝组成, 在没有受到营养缺乏等因素制约的条件下, 菌落将以恒定的径向速度扩展。

挑选标准:主型菌落形态占绝大多数, 正面观菌落直径必须达到8—10㎜, 横切面观中间凹陷成梅花型。

(2) 菌落培养周期的考查

将菌落在培养不同时间后分别接种于斜面培养基, 培养8天后, 取斜面孢子进行揺瓶发酵考查, 确定最适菌落培养时间。最适菌落培养周期揺瓶发酵的考查结果如表3。

由上表可知:随着培养时间的增加, 效价呈先上升后下降的趋势。培养至第192小时的菌落对应的效价是最高的, 所以培养192小时的菌落最符合菌落挑选标准, 是最佳培养周期。

2.3.3 生长周期的考查

由于菌种的菌丝生长慢, 孢子数量少, 因此, 加入无菌蒸馏水到正处于最佳孢龄的斜面内, 制成孢子悬液, 定量加入到含有小米综合培养基的三角瓶中, 用于制备米孢子, 接种后将三角瓶旋转摇匀, 使孢子均匀分布, 培养8—9天, 三天后翻米。将米孢子分别在不同时间接入种子培养基, 控制种子的生长周期及菌浓, 接发酵培养基, 测得最佳效价, 找出最适米孢子的生长周期。

2.3.4 米孢子生长周期揺瓶发酵考查结果

由上表3可知:周期在120小时的米孢子显少量绿色, 孢子数量少, 色浅, 不成熟, 镜检菌丝长且细。周期在192小时的米孢子, 镜检孢子生长良好, 菌丝粗壮, 孢子丰满且呈灰绿色, 孢子数在160亿/瓶以上, 最终确定米孢子的最佳生长周期为192小时。

2.4 米孢子抽干考查

2.4.1 抽干考查的原因

在08-98#菌种生长初期, 菌丝细, 孢子量少, 孢子数为60亿∕瓶。培养中的米孢子会出现大量的呼吸水;米孢子并瓶后, 放冰箱保藏也会出现大量的呼吸水, 致使米孢子重新萌发, 长出再生菌丝, 米孢子冷藏2天就不能使用, 直接影响孢子质量, 容易使菌种活力减退, 产孢子能力和合成产物能力下降, 也容易造成染菌, 影响发酵生产。针对以上问题, 根据菌种保藏原理, 缺氧可降低菌种的新陈代谢, 并在一定时间内保持菌种的特性不变, 采取进行了抽真空干燥试验。

2.4.2 不同抽干时间的米孢子揺瓶考查结果

由上表4可知:随着抽干时间的延长, 米孢子的生产能力呈先增加后降低的趋势。为了生产孢子的稳定, 选择抽干时间4.5小时的米孢子, 并瓶, 冷藏。这样冷藏期间不出现呼吸水, 质量较为稳定, 在短时间内其特性不变, 冷藏时间可以在30天以生命科学与农业科学上。随着每瓶孢子数的增加, 发酵生产用种子由15瓶/罐减至5瓶/罐。

2.5 生产种子制备工艺改进

传统的生产种子制备工艺是石英砂接米或米接米, 抽干39小时, 放置半年后进罐。

虽然选育的生产菌株是由单菌落发育而来的, 但在使用过程中不可能为绝对纯的菌株﹙米接米工艺﹚, 同批米孢子不可能一一做揺瓶考查, 为此, 对此项工艺进行了改进。按如下图所示工艺制备生产种子:

改进后的石英砂梯度稀释分离种平皿, 长出的单菌落分布均匀, 便于观察菌落形成过程中的变化, 在制备生产种子的过程中, 对每只斜面孢子进行揺瓶考查后, 选取揺瓶效价高的用于发酵生产。由此, 改进后的工艺能有效地稳定生产种子的质量, 从而起到稳定青霉素发酵生产的作用。

3 结论

通过对08-98#菌种米孢子工艺进行研究, 最终确定了菌落最佳培养周期为192h, 斜面最佳孢子龄为8天, 米孢子的最佳生长周期为192h, 揺瓶种子的最佳生长周期为34-36h, 确定了米孢子抽干工艺, 抽干时间为4.5小时, 并制定出工艺标准, 稳定提高该菌种的种子质量, 使发酵大生产的发酵水平创历史最高效价达101990u/ml, 发酵指数突破6.08亿/时·m3, 充分发挥了该菌种出色的生产能力。

参考文献

[1]陈代杰, 朱宝泉.工业微生物菌种选育与发酵控制技术[M].上海科学技术文献出版社, 1995

[2]顾觉奋, 吴明, 王高峰.微生物药品化学与分析[M].军事医学科学出版社, 1996

[3]刘颐屏, 周广邠, 贺秉坤.抗生素菌种选育的理论和技术[M].中国医药科技出版社, 1992