人参皂苷提取工艺研究

人参皂苷提取工艺研究（通用9篇）

人参皂苷提取工艺研究 篇1

1 仪器与试药

53WUV/VIS型紫外分光光度计 (上海光学仪器厂) ;HHW21.Cu600型水浴恒温箱 (上海医疗器械七厂) ;WD900G型微波炉 (顺德市格兰仕微波炉电器有限公司) ;人参原药材 (湖北省襄樊市中药材公司提供, 主产地:吉林) ;人参Re对照品 (中国药品生物制品检定所, 批号110754-20018) ;香草醛 (浙江温州东升化工试剂厂, 批号920810) ;其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 空白对照溶液的制备

2.1.1空白对照溶液的制备精密量取16%香草醛醇溶液 (取16g香草醛溶于100ml乙醇溶液中) 0.5ml和5ml77%硫酸溶液, 于刻度试管中, 加0.5ml甲醇溶液, 混匀即得空白对照溶液。

2.1.2标准溶液的制备精密称取105℃干燥2h的人参皂苷Re对照品3.1mg, 用甲醇定溶于10ml容量瓶中, 使浓度为0.31mg/ml备用。

2.1.3标准曲线的建立精密吸取标准对照品溶液0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5ml分别置于10ml刻度试管中, 将试管置于冰水浴中, 分别加入0.4, 0.3, 0.2, 0.1, 10ml甲醇, 再加入0.5ml香草醛醇溶液 (16%乙醇液) 和5ml77%硫酸溶液, 摇匀混合液置60℃恒温水浴箱中10min, 立即在冰水浴中冷却15min, 并在另一刻度试管中精密加入空白对照溶液6ml, 作空白对照。在544nm波长处测定吸收度, 绘制标准曲线, 经线性回归, 得人参皂苷Re对照品。浓度Y (mg/ml) 与吸收度X之间的回归方程Y=0.031215X+0.000616, r=0.9929。表明人参皂苷Re在0.005166~0.02583mg/ml浓度范围内与吸收度X呈良好线性关系。

2.1.4供试品的制备实验提取的人参乙醇提取液, 回收乙醇后, 静置24h后, 滤过, 浓缩至浸膏, 用10倍量注射用水溶解, 洗涤容器2~3次, 合并到分液漏斗中, 加入乙醚萃取3次 (20, 10, 5ml) , 弃去乙醚层, 水层加入用水饱和的正丁醇溶液萃取4次 (30, 20, 15, 10ml) , 合并正丁醇液, 减压回收正丁醇后, 加入1/2量的注射用水, 加热浓缩至干, 残渣用甲醇溶解, 移至100ml容量瓶中, 加甲醇定容, 摇匀后做供试品溶液备用。

2.1.5人参皂苷含量测定精密吸取供试品溶液 (10, 5, 5, 5, 5, 10, 5, 10, 10ml) 分别置于50ml容量瓶中, 加甲醇至容量瓶摇匀。精密量取上述溶液0.2, 0.2, 0.2, 0.3, 0.2, 0.2, 0.3, 0.2, 0.2ml于刻度试管中, 分别加入甲醇0.3, 0.3, 0.3, 0.2, 0.3, 0.3, 0.2, 0.3, 0.3ml。按“2.1.3”方法, 在544nm处测得吸收度X, 将X值分别代入线性回归方程中计算人参皂苷含量。

2.2 人参皂苷微波提取工艺的优化

由验证实验结果与正交实验所得结果比较, 两者在同水平下其结果相近, 故说明正交实验所确定的最佳提取工艺条件可行。

3 讨论

微波提取人参皂苷是利用其穿透人参细胞组织内部使之吸收微波能量, 并转化为热能, 段时间内内部分子极化迅速升温, 达到提取效果。但在提取过程中, 因乙醇沸点较低, 加之人参皂苷具有表面活性作用, 在加热时易产生大量泡沫。故应控制好加热温度和时间, 避免浸提溶媒沸腾逸出和有效成分随乙醇蒸气带出, 从而影响人参皂苷的得率。所以应选择微波低火力作为热源。

该方法较回流法省时省力, 提取率高, 常规回流法提取人参皂苷得率为3.27%, 而按回流工艺提取可得率为8%左右。因此, 微波提取人参中人参皂苷可在质检及医院制剂生产中推广采用。

人参皂苷提取工艺研究 篇2

[关键词] 盾叶薯蓣；薯蓣皂苷元；纤维素酶；响应面分析法

[中图分类号] R931.7   [文献标识码] A   [文章编号] 2095-0616（2012）01-27-03

Optimization on cellulase assisted extraction techonology of diosgenin from dioscorea zingibersis C.H. wright

TANG Jun  GE Haitao  ZHANG Yunxia  DU Yun

[Abstract] The extraction of diosgenin from dioscorea zingibersis C.H. wright was studied.The technology was studied with the Box-Benhnken design and the response surface analysis.The result indicated that:the concentration ration of dioscorea zingibersis C.H and water was 1∶10,pH value 5.75,temperature 54 ℃,extracting time 2.5 h,cellulose amount 10.8 U/g.Then the yield of diosgenin is 1.5%.These results suggested that cellulose assisted extraction technology was the effective ways to improve the yield of diosgenin.

[Key words] Dioscorea zingibersis C.H. wright;Diosgenin;Cellulose;Response surface method

盾叶薯蓣又名黄姜、火头根，为被子植物门，单子叶植物纲，薯蓣科，薯蓣属多年生草本缠绕性植物，它是我国特有的甾体激素类药源植物。其根茎含有薯蓣皂苷（俗称皂素）、淀粉和纤维素，已被证实其中药效成份薯蓣皂苷具有增强性功能、抗衰老、治疗心血管疾病以及抑制癌细胞等功效，是合成各种避孕药和载体激素类药物的主要原料。薯蓣皂苷元提取工艺通常采用自然发酵酸水解法、分离法、酸水解法等，而这些方法的得率往往很低，且产生大量的酸水，造成严重的环境污染。

据宋发军[1]报道盾叶薯蓣中含纤维素达50%以上，因此，本试验拟采用纤维素酶法处理盾叶薯蓣中皂苷元，利用纤维素酶酶解可以破坏纤维素的β-D-葡萄糖苷联结键，从而破坏其细胞壁，在水解时能够最大限度地将薯蓣皂苷转化成薯蓣皂苷元，能够显著提高有效成分的提取收率。

响应面分析法（response surface method,RSM）[2]是一种有效的优化条件的方法，用于在加工过程中确定各因素及其交互作用对非独立变量的影响，其表述因素和响应值之间的关系最为精确，同时也是最经济的方式，对所选的实验参数可以较少的次数和较短的时间内进行全面研究，目前已广泛应用于各个领域。

本研究将主要考察纤维素酶辅助提取盾叶薯蓣中薯蓣皂

苷的提取方法，以薯蓣皂苷元收率为评价指标，采用5因素3水平的响应面分析法优化得到最优提取工艺条件。

1 材料与方法

1.1 实验材料

盾叶薯蓣药材（江苏黄河药业股份有限公司提供）；薯蓣皂苷元对照品（中国药品生物制品鉴定所提供）；纤维素酶（河南丰达生物科技有限公司，酶活力40 000 U/g）；甲醇（中国医药集团上海化学试剂公司，色谱纯）；石油醚（中国医药集团上海化学试剂公司，分析纯）。

1.2 主要仪器

电子天平（AG135，METTLER TOLEDO公司）；循环水式真空泵（SHZ-DⅡ，巩义市予华仪器厂），高效液相色谱（Waters 515 pump）；TGL-16B型台式高速离心机（湖南星科科学仪器有限公司）；2487紫外检测器。

1.3 实验方法

1.3.1 提取工艺 称取一定量盾叶薯蓣原料，加入一定比例的水以及纤维素酶，用醋酸钠-醋酸缓冲液调节pH值至一定范围，在40 ℃以上的水浴条件下搅拌提取一段时间后迅速升温至90～100 ℃，保温10 min，使酶灭活，纱布过滤得滤液，滤渣烘干后用石油醚回流提取8 h，热过滤，合并滤液静置至结晶完全，抽滤后滤饼烘干即得薯蓣皂苷元结晶。

工艺流程图如下：

1.3.2 薯蓣皂苷元提取工艺的考察 用中心组合设计法（central composite design,CCD）进行各影响因素的分析。数学模型：

（k=5） [4]

考察因素（自变量）：

X1-盾叶薯蓣与水的料液比；X2-酶解pH值；X3-纤维素酶用量（U）；X4-酶解作用时间（h）；X5-酶解温度（℃）

考察指标（因变量）：

Y1-薯蓣皂苷元得率（%）

据Box-Benhnken的中心组合实验设计原理，采用五因素三水平的响应面分析方法。实验因素水平见表1。

1.3.3 薯蓣皂苷元得率的测定方法 本研究采用反相高效液相色谱法测定薯蓣皂苷元含量。

色谱条件：色谱柱：岛津VP-ODS（150 mm×4.6 mm×5µm）；流动相为甲醇：水=95∶5（V/V）；流速：1.0 mL/min；UV检测波长为208 nm；进样量：10 µL；柱温为25 ℃。

标准品溶液制备：取薯蓣皂苷元对照品0.250 0 g，用甲醇超声溶解，并定容至100 mL，得2.50 g/L对照品溶液备用。

样品溶液制备：称取盾叶薯蓣20 g，按1.3.1提取方法进行提取，所得的薯蓣皂苷元结晶加入甲醇超声溶解，并定容至250 mL，经0.45µm微孔滤膜过滤，所得滤液按上述色谱条件进行进样检测，结果代入标准曲线方程，得到薯蓣皂苷元含量。

薯蓣皂苷元得率为所得薯蓣皂苷元占盾叶薯蓣总量的百分数。

2 结果与讨论

2.1 标准曲线的建立

精密吸取标准品溶液0.4、0.8、1.0、2.0、4.0、8.0 mL，并分别定容至10 mL，浓度分别为0.10、0.20、0.25、0.50、1.00、1.50、2.00 g/L。分别经0.45 µm微孔滤膜过滤，所得滤液按上述色谱条件进行进样检测，并绘制标准曲线，薯蓣皂苷元对照品溶液色谱峰如图1所示。

图1  薯蓣皂苷元标准品色谱图

结果表明：薯蓣皂苷元在0.1～2.0 g/L之间具有良好的线性关系，拟合标准曲线，其回归方程为Y= 0.015 8X + 0.017，相关系数为r=0.998 9。

2.2 提取工艺考察实验结果及显著性分析（表2）

813 80026

方差分析结果表3显示：酶解pH（X2）与纤维素酶（U）用量（X3）对盾叶薯蓣皂苷元收率（Y1）影响统计显著（P值均小于0.005）。因此这两个因素对响应值起主导影响作用。笔者利用软件Ststistic 6.0分析得到拟合全变量二次回归方程，各变量的偏回归系数估计值及方差分析结果，得到拟合方程为：

Y1=0.997 422-0.004 44X1+0.182 364X2+0.297698X3+ 0.046 667X4-0.04X5-0.346 119X12+0.184 844X22-0.453 166X32-0.073 881X42-0.113 881X52+0.031 250X1X2+0.021 250X1X3+0.008 750X1X4-0.001 250X1X5+ 0.043 909X2X3+0.031 250X2X4+0.011 250X2X5-0.008 750X3X4-0.008 750X3X5+0.023 750X4X5

响应面是响应值对各实验因子所构成的三维空间的曲面图，从响应面分析图上形象的看出最佳参数与各参数之间的相互作用。借助软件Statistic根据回归方程以酶解pH（X4）和纤维素酶用量X3为因素，其他因素全部选择为水平2，绘出的拟合响应面曲面如图3。

由图3响应面可以看出随着纤维素酶用量（X3）的增加，收率（Y1）显著增加，在酶解pH值达到最大值的时候可得到收率的最值，而并不是在纤维素酶用量（X3）最大的时候。这是由于在一定条件下，酶浓度对酶的催化反应速度产生影响，当酶浓度较低时，酶活性中心被饱和，提取率随着酶浓度的增加而迅速增加，而后酶浓度继续增加时，反应速度增加率就比较小，当酶浓度增加至一定程度时，提取率达到一个限值，此时纵

 

图3 响应面拟合Y1（X2，X4）

使再增加酶浓度时，反应速度增加缓慢甚至减小；同时在不同pH值的条件下，可能会引起纤维素酶活的降低或升高，从本实验结果来看，盾叶薯蓣提取薯蓣皂苷元的最适pH在5.0～6.0之间。

2.4 最优水平确定及验证试验

考虑到实验最终目的是要优化得到纤维素酶辅助提取盾叶薯蓣中薯蓣皂苷的提取方法，综合各种因素的相互作用，根据二次多项回归模型方程，利用利用软件Ststistic 6.0中数学模型及快速登高法优化出高提取率的工艺条件见表4。

换算成实际工艺参数为：盾叶薯蓣与水的料液比为1∶10；酶解pH值为5.75；酶解温度为54 ℃；酶解作用时间为2.5 h；纤维素酶用量10.8 U。根据所得到的提取工艺，笔者对盾叶薯蓣进行重新提取，平行3次，所得薯蓣皂苷元的收率平均为1.53%，远优于之前盾叶薯蓣的传统提取工艺方法。

3 结论

在纤维素酶酶解法提取盾叶薯蓣中薯蓣皂苷元的试验过程中，笔者利用中心组合设计实验法及Ststistic 6.0软件响应面分析法分析功能优化得到了明显提高薯蓣皂苷提取率的提取工艺条件，结果证明了本实验设计统计方法能快速有效的实现工艺条件优化，其优化后的条件效果较为理想，在薯蓣皂苷元生产研究领域具有良好的应用前景以及指导意义。

[参考文献]

[1] 宋发军.甾体药源植物薯蓣属植物中薯蓣皂苷元的研究及生产状况[J].天然产物研究与开发，2005，14（3）：89-92.

[2] 惠尉，张东旭.响应面分析法优化盐酸丁螺环酮微球制备工艺研究[J].时珍国医国药2008，19（9）：2268-2271.

[3] Muralidhar RV，Chirumamila RR.A response surface approach for the comparison of lipase production by Candida cylindracea using two different carbon soures[J].Biochemical Engineering Journal，2001，9（1）：17.

人参皂苷提取工艺研究 篇3

随着现代医药科学的发展研究, 对人参主要活性成分人参皂苷及多糖的研究日益深入。在传统的人参有效成分提取中, 人参皂苷和多糖的提取往往是单独进行的, 本实验将提取人参皂苷后的人参渣经干燥后用于人参多糖的提取, 实现了人参原材料的充分利用。本研究通过单因素实验考察了乙醇浓度、提取时间、提取温度、液固比对人参皂苷提取率的影响;研究了提取时间、提取温度、液固比对人参多糖提取率的影响;通过响应曲面中的Box-Behnken法优化了提取工艺, 得到微波辅助提取人参皂苷及多糖的优化工艺参数。比较了水浴回流和微波辅助对人参皂苷和多糖的提取。

1 材料与方法

1.1 原料与试剂

香草醛 (批号:20120820) 、甲醇 (批号:20140926) 、乙醇 (批号:20141222) 、冰醋酸 (批号:20140422) 、高氯酸 (批号:20140428) 、葡萄糖 (批号:20120222) 、浓硫酸 (批号:20101120) 、苯酚 (批号:20140424) 均为分析纯, 人参须[武汉三九大药房, 产地东北, 经湖北中药研究院王克勤研究员鉴定为五加科植物人参 (Panax ginseng C.A.Mey.) 的干燥根], 人参皂苷Rg1对照品 (批号:MUST-12041301, 上海经科化学科技有限公司) 。

1.2 仪器与设备

AL104电子分析天平[梅特勒-托利多 (上海) 仪器有限公司], 盛搏多功能药材粉碎机 (西安康馨医疗器械有限公司) , XMTB数显恒温水浴锅 (武汉市琴台医疗器械厂) , Anke-1000高速离心机 (上海安亭科学仪器厂) , SHZ-D (Ⅲ) 循环水式真空泵 (巩义市英峪予华仪器厂) , 101-2AB型电热鼓风干燥箱 (天津市泰斯特仪器有限公司) , 真空干燥箱 (上海实验仪器有限公司) , MAS-Ⅱ微波催化合成/萃取仪 (新仪微波化学科技有限公司) , UV-2450紫外可见分光光度计 (日本岛津) 。

1.3 微波提取人参皂苷和多糖

前处理:将人参须样品置于恒温干燥箱中60℃干燥12 h, 粉碎机粉碎后过筛, 得粒径为0.15~0.25 mm的人参须粉末, 装袋备用。称取0.5 g人参粉, 以乙醇为提取剂, 按一定的固液比和提取时间在特定功率和温度下辐射提取人参皂苷, 提取液经抽滤后取清液待测。滤渣经干燥后, 称取0.5 g粉末, 以水为提取剂, 在一定实验条件下提取人参多糖, 提取液在3000 r/min条件下离心10 min, 取上清液待测。

1.4 人参皂苷及多糖的含量测定

准确移取人参皂苷待测液0.2 m L, 采用香草醛-高氯酸显色法[15]测定吸光度, 检测波长552 nm。选择人参皂苷Rg1为对照品, 所得标准曲线方程为:Y=3.8529X-0.2644, Y为吸光度值, X为人参皂苷质量 (mg) , 相关系数R=0.9964。准确移取人参多糖待测液2.0 m L, 采用苯酚-硫酸法[16]测定吸光度, 检测波长489 nm。以葡萄糖为对照品, 所得回归方程为:Y=7.5625X-0.0430, Y为吸光度值, X为葡萄糖质量 (mg) , 相关系数r=0.9983。

1.5 单因素实验

考察乙醇浓度、固液比、微波温度、微波时间对人参皂苷提取率的影响;考察微波温度、微波时间和固液比对人参多糖提取率的影响。

1.6 Box-Behnken试验设计

结合单因素实验结果, 确定自变量, 分别以人参皂苷和人参多糖的提取率为响应值, 进行响应曲面优化。数据处理采用Design Expert.V 8.0.6.1统计软件分析。

1.7 水浴回流和微波提取比较

在其他条件一致情况下分别采用水浴回流2 h和微波提取12 min, 测定人参皂苷和多糖的提取率。

2 结果

2.1 人参皂苷提取单因素实验结果

2.1.1 固液比对人参皂苷提取率的影响准确称取0.

5 g人参粉, 选择乙醇浓度70%, 微波提取时间12 min, 提取温度60℃, 微波功率500 W。分别设置固液比为1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50。

由图1a可知, 固液比对人参皂苷提取率影响不明显, 由于在固液比为1∶40时人参皂苷的提取率略高于其他比例, 因此考虑到实验可操作性, 在后续选取提取人参皂苷固液比的最优条件为1∶40。

2.1.2 乙醇浓度对人参皂苷提取率的影响

称取0.5 g人参粉, 固定实验条件为:固液比1∶40, 微波提取时间6 min, 提取温度50℃, 微波功率300 W。乙醇浓度分别为40%、50%、60%、70%、80%、90%、100% (V/V) 。

由图1b可知, 提取剂乙醇浓度对人参皂苷的溶出有较大影响。随着乙醇浓度不断增大, 人参皂苷提取率呈现先增加后降低的趋势, 当乙醇浓度为50%时, 皂苷溶出率最高。因此在Box-Behnken设计中选取乙醇浓度为30%~70%作为响应曲面考察范围。

2.1.3 提取时间对人参皂苷提取率的影响

称取0.5 g人参粉, 固定实验条件为:固液比1∶40, 乙醇浓度70%, 提取温度50℃, 微波功率300 W。微波提取时间分别为2、6、8、10、12 min。

由图1c可以看出, 在提取过程中, 随着时间的增加, 皂苷的溶出率逐渐增加, 这是因为溶剂随时间增长逐渐渗透到细胞内部, 直至皂苷达到溶解平衡。但时间过长会使得过多杂质也随之析出, 且目标产物的也容易分解, 从而影响皂苷的收率。因此, 在BoxBehnken设计中选取提取时间2~12 min作为响应曲面考察范围。

2.1.4 提取温度对人参皂苷提取率的影响

称取0.5 g样品, 固定实验条件为:固液比1∶40, 乙醇浓度70%, 微波提取时间6 min, 微波功率300 W。设定提取温度分别为:30、40、50、60、70℃。

通常情况下, 提取率会随温度的升高而增加。这是由于溶剂的表面张力和黏度会随温度的升高而有所下降, 因此溶剂对样品的溶解力和渗透力增加, 从而提高提取效率。但由图1d可看出, 提取温度也不是越高越好, 因为提取温度过高可能导致目标产物的分解。所以在Box-Behnken设计中选取提取温度30~70℃作为响应曲面考察范围。

2.2 人参皂苷响应面实验结果与分析

根据人参皂苷单因素提取结果, Box-Behnken试验设计的实验因素及水平如表1所示。所得试验数据 (表2) 经多元回归拟合, 得人参皂苷提取率 (Y) 对微波提取时间 (A) 、微波提取温度 (B) 和乙醇浓度 (C) 的二次多项回归方程:Y=12.34+0.072×A+0.47×B-1.49×C-0.35×A×B+0.78×A×C+0.91×B×C-0.37×A2-0.28×B2-1.77×C2。

对以上回归模型进行方差分析, 该模型P值为0.0074, 表明模型达到高度显著水平。失拟项P=0.9531, 表现为不显著。校正确定系数R2=0.9055, 说明该模型能解释90.55%响应值的变化, 拟合程度良好, 能够较好地反映微波提取时间, 微波提取温度和乙醇浓度与人参皂苷提取率的关系。模型响应值的变异系数CV值为6.94%, 表明实验操作重现性较好 (<10%) 。见表3。因此可用此模型对人参皂苷的提取进行分析和预测, 且各因素对人参皂苷提取率影响的大小顺序为:乙醇浓度 (C) >提取温度 (B) >提取时间 (A) 。

注:A:微波提取时间;B:微波提取温度;C:乙醇浓度

注:R2=0.9055, R2Adj=0.7841, CV=6.94%;A:微波提取时间;B:微波提取温度;C:乙醇浓度

2.3 人参皂苷响应曲面分析

响应曲面如图2所示, 组图分别显示了微波提取时间、微波提取温度、乙醇浓度各因素交互作用对人参皂苷提取率的影响。等高线的形状反映了交互效应的强弱, 椭圆形或马鞍形表示交互作用较显著[17]。在等高线图上, 在最大的椭圆上取值时, 提取率最低;反之在最小的椭圆上取值时, 提取率最高。等高线代表提取率的变化趋势。

在图2中, 等高线呈椭圆形, 表明各因素两两交互作用较显著。由图2a和图2b可以看出, 沿温度轴的等高线密度变化相对沿提取时间轴的变化大, 说明提取温度对人参皂苷提取率的影响比提取时间显著, 提取温度高有助于人参皂苷的提取, 表现为曲线较陡。图2c和图2d中, 乙醇浓度轴相对提取时间轴的等高线密度变化大, 表明乙醇浓度对人参皂苷提取率的影响比提取时间显著, 与表3的分析相符。人参皂苷的提取率随提取时间和乙醇浓度的增加呈现先增加后缓慢减少的趋势。图2e和图2f中, 沿乙醇浓度轴的等高线密度变化相对沿提取温度轴的变化大, 说明乙醇浓度比提取温度对人参皂苷提取率的影响更大, 与表3的分析相符。

2.4 验证实验

选择出最优的人参皂苷提取条件为:微波提取时间为4.12 min, 提取温度为60.08℃, 乙醇浓度为54.50%, 根据实际情况稍作调整, 即微波提取时间为4 min, 提取温度为60℃, 乙醇浓度为55.00%, 做3次平行实验, 人参皂苷平均提取率为12.71%, 与理论最大得率12.75%接近。

2.5 人参多糖单因素实验结果分析

2.5.1 提取时间对人参多糖提取率的影响

称取0.5 g提取皂苷后的干燥人参渣, 以水为提取溶剂, 固定实验条件为:固液比1∶50, 微波提取温度70℃, 微波功率300 W。设定提取时间分别为3、6、9、12、15、18 min。由图3a可知, 随着提取时间的延长, 人参多糖的提取率先逐渐升高后降低, 15 min时人参多糖提取率最高, 因此选取提取时间2~16 min作为响应曲面考察范围。

a:提取时间对人参多糖提取率的影响;b:提取温度对人参多糖提取率的影响;c:固液比对人参多糖提取率的影响

2.5.2 提取温度对人参多糖提取率的影响

称取0.5 g提取人参皂苷后的干燥粉末, 选择固液比1∶50, 微波时间6 min, 微波功率300 W。设定提取温度分别为30、40、50、60、70、80、90℃。由图3可知当温度从30℃增加到50℃时, 人参多糖提取率不断增加, 但当温度达到50℃以上时, 多糖提取率升高逐渐趋缓, 所以选取30~90℃作为响应曲面考察范围。

2.5.3 固液比对人参多糖提取率的影响

称取0.5 g提取皂苷后的干燥人参渣, 选择微波时间6 min, 提取温度80℃, 微波功率300 W。设定固液比分别为1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60。由图3c可知, 随着提取剂水用量的增大, 人参多糖的提取率也随之增加, 但在料液比大于1∶20后, 提取率趋于稳定。所以选择1∶10~1∶50作为响应曲面考察范围。

2.6 人参多糖响应面实验结果与分析

按Box-Behnken试验设计的因素及水平如表4所示, 所得试验数据 (表5) 经多元回归拟合, 得人参多糖提取率对微波时间 (A) 、微波温度 (B) 和液固比 (C) 的二次多项回归方程:Y (多糖提取率) =19.40+0.015×A+2.37×B+1.14×C+0.093×A×B-0.21×A×C+0.84×B×C+1.33×A2-1.03×B2+0.21×C2。

注:A:微波提取时间;B:微波提取温度;C:乙醇浓度

模型的方差分析结果如表6所示。模型P值为0.0061, 达到显著水平, 失拟项值为0.1080, 表现为不显著, 修正相关系数R2Adj (0.8819) 与校正确定系数R2 (0.9578) 很接近, 该模型拟合程度良好, 且能解释95.78%响应值的变化, 模型响应值的变异系数CV值为3.99%, 说明模型重现性较好。因此用此模型对人参多糖的提取进行分析和预测。且各因素对人参多糖提取率影响的大小顺序为:微波提取温度 (B) >液固比 (C) >微波提取时间 (A) 。

2.7 人参多糖响应曲面分析

响应曲面结果如图4所示。由图4a~b可以看出, 沿温度轴的等高线密度相对时间轴的变化较大, 说明提取温度对人参多糖提取率的影响比提取时间显著, 温度高有助于人参多糖的提取, 表现为曲线较陡。由图4c~d可以看出, 液固比相对时间轴的等高线密度变化大, 作用效果更显著。由图4e~f可以看出, 提取温度轴较之液固比轴, 等高线密度变化大, 影响更显著, 与表6的分析相符。

注:R2=0.9578, R2Adj=0.8819, CV=3.99%;A:微波提取时间;B:微波提取温度;C:乙醇浓度

A:微波时间;B;微波温度;C:乙醇浓度

2.8 验证实验

选择出最优的人参多糖提取条件为:微波提取时间为2 min, 提取温度为90℃, 固液比为1∶50, 在此条件下做3次平行实验, 人参多糖平均提取率为23.32%, 与理论最大得率24.37%接近。

2.9 水浴回流和微波提取比结果

两种提取方法结果显示, 微波提取较之水浴回流提取, 提取时间大大缩短, 皂苷及多糖提取率也有所提高。见表7。

3 结论

人参皂苷提取工艺研究 篇4

【关键词】人参皂苷 ；干细胞 ；增殖；免疫调节；衰老

【中图分类号】R284 【文献标识码】B【文章编号】1004-4949（2015）03-0646-01

新近研究表明，人参是祖国传统医学的“补气生血”的要药，具有抗衰老、抗氧化、提高免疫力等功能。人参皂苷是其主要的药理活性成分，研究发现人参皂苷单体Rg1分子式为C42H72O14，相对分子质量800，其分子式如（图1）。目前研究显示，Rg1具有多种细胞内相关分子蛋白质及mRNA的合成、稳定神经细胞膜、保护突触结构、抗细胞凋亡等作用，是结构、疗效都非常确切的中药有效成分。

对细胞增殖分化的作用

shida Torao 等[1]发现人Rg1能够促进体外培养间充质干细胞MNCS的增殖效应。庄朋伟等[2]通过实时定量RT-PCR 分析显示人参皂苷Rg1促进体外培养的NSCs增殖，可能是通过上调Hes1基因表达实现的。一定浓度人参皂苷Rg1，可使移植到海马的NSCs向神经元分化的数量增多，这提示人参皂苷Rg1可促进NSCs向神经元细胞方向分化[3] 。单纯的Rg1作用于正常Sca-1+造血干细胞（hematopoietic stem cells，HSCs）后，细胞G1期比例下降，PI 升高； 形成造血祖细胞混合集落个数增多，提示Rg1能促进正常Sca-1 + HSC 增殖及多向分化潜能[4]。一定浓度的Rg1培养二倍体成纤维细胞，其有丝分裂活性和生长速度增加，而且Rg1还可增加分裂晚代细胞的分裂次数，使细胞的寿命延长[5]。另外研究发现，人参皂苷Rg1能促进牙髓细胞的增殖和分化[6]。王宁元等[7]用人参皂甙Rg1诱导骨髓干细胞游走分化促进家兔心肌梗死后心肌血管内皮细胞再生，发现治疗组心功能明显好转，心肌梗死面积明显缩小。提示人参皂甙Rg1通过刺激心肌局部组织分泌G-CSF而诱导骨髓细胞游走至心肌组织进而向血管内皮细胞分化。综上所述Rg1对神经细胞，造血干细胞间充质干细胞，血管内皮细胞等多种细胞的增殖分化方面都起到一定的促进作用。

免疫调节作用

Rg1对炎症性疾病具有强大的干预能力，例如抑制急性炎症反应[8]。Rg1能减少糖皮质激素所致上的副作用，增强巨噬细胞的吞噬功能，具有免疫促进作用[9]。Hong等[10]报道：人参提取物Rg1可能作为一种免疫抑制剂对人角质形成细胞具有抗炎和抗氧化作用，从而用于治疗特异性皮炎。本实验发现人参皂苷Rg1 能显著抑制角叉菜胶所致大鼠足肿胀，降低大鼠致炎症足中MDA 含量，同时升高SOD 活力。可能的机制是，人参皂苷Rg1 抑制LPS 诱导的RAW264.7 细胞NO 生成，以此使抗氧化作用和对NO 生成的抑制作用得以发挥可能是其发挥[11]。巨噬细胞是机体非特异性免疫中重要的防御细胞，在抗感染、抗肿瘤和免疫调节等方面有着非常重要的作用。在目前的报道中，针对 Rg1 对巨噬细胞的吞噬作用研究中发现，Rg1可以促进巨噬细胞的吞噬。利用流式细胞术结合流失细胞仪，采用 beads 检测，实验结果显示，Rg1 均能够抑制静息以及 LPS 刺激活化状态下的腹腔巨噬细胞的吞噬功能力。巨噬细胞能够通过其较强的吞噬功能来调节机体的抗感染作用，也可以通过抗原提呈作用来启动特异性免疫应答。Rg1 在抑制巨噬细胞吞噬功能的同时，也可能通过抑制抗原提呈作用，进而影响特异性免疫应答[12]。目前，有人在研究氢氧化铝和 Rg1 的协同作用时发现， Rg1 对 Th1 型和 Th2 型反应均有增强作用，且最大的免疫反应见于注射含有氢氧化铝和 Rg1 的卵白蛋白的小鼠，提示氫氧化铝和Rg1 能协同促进 BALB/C 小鼠对卵白蛋白的免疫反应[13]。另有报道表明，将Rg1与重组鼠弓形体抗原（SAG1）共同免疫ICR小鼠，能激发ICR小鼠产生更强的体液免疫和细胞免疫反应，使小鼠体内 SAG1 特异性抗体水平增高，并促进淋巴细胞的增殖和特异性细胞因子的产生，明显延长小鼠的存活时间， 提示 Rg1可具有调节机体免疫的功能[14]。

对干细胞衰老的保护作用

Rg1（Ginsenoside，Rg1）对MPTP诱导PD鼠黑质神经元凋亡有阻断作用，对帕金森病小鼠SN DA能神经元具有明显的保护作用[15]。 Rg1可通过下调D-半乳糖脑衰老大鼠P16INK4a、P21Cip1/Waf1mRNA 及蛋白的表达，阻止脑组织内的细胞进入衰老程序而发挥其延缓脑衰老的作用。另外，在t-BHP诱导的Sca-1+HSC 衰老中，Rg1可能通过激活端粒酶活性和减少端粒长度缩短发挥延缓t-BHP诱导的Sca-1+HSC 衰老的作用[16]。使用一定浓度的Rg1预处理的IL-1β诱导大鼠软骨细胞，其凋亡率较IL-1β诱导的模型组明显下降，MMP-13蛋白表达降低同时TIMP-1蛋白表达增加，反映软骨细胞外基质合成增加，从而证明人参皂甙Rg1有抑制软骨细胞凋亡和增进细胞外基质合成的作用[17]。人参皂苷Rg1 可能通过调制促凋亡基因和抗凋亡基因表达，稳定线粒体膜结构与功能、抑制凋亡效应分子Caspase-3 的激活等途径，对低氧-无血清培养诱导的rBMSC 凋亡起保护作用[18]。也有报道显示人参皂苷 Rg1能明显缓解剂量依赖性吗啡慢性给药引起的海马神经元细胞[Ca2+]i升高，从而防止吗啡引起细胞内的钙超载，减少海马神经元细胞凋亡或死亡[19] 。

抑制肿瘤的作用

Rg1还可能具有抗肿瘤效应，赵保胜等人研究发现人参皂苷Rg1 对体外培养的胃癌细胞（BGC-823） 细胞有较强的抑制增殖作用， 且随药物着作用时间的延长，剂量的增加，这种抑制作用增强[20]。人参皂苷Rg1可通导细胞凋亡的机制明显抑制白血病细胞（TF-1细胞）的增殖并诱导其凋亡，这可能通过下调TF-1细胞EPOR的表达水平和信号转导，进而上调Bax的表达和降低抗凋亡蛋白（Bcl-2）的表达和以及促进caspase-3激活等来实现的[21]。人参皂苷有效成分 Rg3 可能通过使 SSTR 过表达而抑制肺腺癌的癌细胞的增殖和诱导肿瘤细胞的凋亡，进而抑制抗肿瘤生长的；同时，Rg3可能通过过表达 SSTR进而下调 VEGF的 表达，抑制肿瘤血管生成，来发挥抑制肿瘤的生长和转移[22]。

近年来的新近研究，发现激动剂GdCl3和Rg1都可明显促进hUCB CD34+HSCs的增值效应，且这一效应可被CaSR阻断剂CdCl2明显阻断，hUCB CD34+HSC培养10天，Rg1不影响CaSRmRNA与蛋白表达；这提示Rg1可能是一种CaSR激动剂[23]。Rg1在环磷酰胺诱导的骨髓抑制中，可通过增加SDF-1、SCF和IL-3的细胞因子分泌，调节CaSR表达等改善造血微环境，促进造血机能恢复[24]。另外，Rg1明显促进hUCB-MNCs移植治疗放射损伤SCID小鼠造血功能的恢复，除明显提高BM和PB中多种血细胞数量外，明显缩短其恢复时间，尤其是对中性粒细胞和血小板恢复正常水平的影响更为突出。而且可浓度依赖性的增加hUCB-MNCs移植后小鼠骨髓有核细胞内游离钙水平。Rg1与CaSR激动剂GdCl3对放射损伤SCID小鼠造血功能恢复的影响相似。Rg1促进hUCB-MNCs移植放射损伤小鼠造血功能恢复的效应可能与增加小鼠骨髓有核细胞内游离钙水平有关[25]，也与增高BM和PB中HSCs和EPCs的比例有关。Rg1提供恢复程度也不失为CaSR调节剂的又一亮点。

展望

随着现代生命科学和生物技术领域的飞速发展，推动了干细胞移植在血液系统疾病，免疫性疾病等方面的蓬勃发展. 干细胞移植治疗已是许多疾病新兴的有效手段。近年大量研究表明Rg1可以诱导骨髓干细胞分化，延缓小鼠造血干细胞的衰老[26]，促进兔心肌梗死后血管内皮细胞的再生[27]。Fang等科学家研究[28]发现Rg1对阿尔茨海默症模型小鼠具有多方面神经保护作用。Du等证实在成骨细胞中人参皂苷Rg1不仅能够有效缓解急性和慢性炎症，且相比地塞米松不良反应更小[29]。吕振超等则在体外实验中发现人参皂苷Rg1抑制了软骨细胞凋亡[30]。Kim等则报道了人参的另一种有效成分可以降低炎症因子的合成发挥抗胶原诱导的骨关节炎的作用[31]。这将为人参皂苷Rg1用于提高干细胞移植的临床应用奠定理论基础和实验基础，为增加干细胞植入率，减轻免疫反应，提高干细胞移植的植活率提供广阔的发展前景。

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人参皂苷提取工艺研究 篇5

超声提取 (ultrasonic extraction) 技术主要是利用超声波的空化作用加速植物有效成分的浸出提取, 同时可以使药物组织内部的温度瞬时升高, 加速有效成分的溶解[4]。本文对几种影响超声提取的因素进行考察, 以葡萄糖为标准品, 优选出超声法提取天冬有效成分的最佳工艺。

1 材料与方法

1.1 仪器试剂

药材:天冬 (杭州正大青春宝药业有限公司) 。

试剂:去离子水;葡糖糖对照品、菝葜皂苷元 (中国药品生物制品鉴定所) 。

仪器:可见-紫外分光光度计, 超声波提取仪。

1.2 方法和结果

1.2.1 标准品液制备

精密称取于105℃干燥的葡萄糖60mg, 置于100ml的容量瓶中, 加蒸馏水溶解并稀释至刻度, 摇匀。

精密称取菝葜皂苷元对照品3mg, 置于10ml容量瓶中, 加甲醇溶解并稀释至刻度, 摇匀。

1.2.2 葡萄糖标准曲线的建立

精密称取对照品溶液1.0ml、1.5ml、2.0ml、2.5ml、3.0ml, 分别置于50ml容量瓶中。加水至刻度, 摇匀, 精密量取上述各溶液2ml, 置于试管中, 分别加4%苯酚溶液1ml, 混匀, 迅速加入硫酸7ml, 摇匀, 置于40℃水浴锅中保温30min, 取出, 置冷水浴中5min, 取出, 以相应试剂作为空白组, 用紫外分光光度法在490nm处测定吸光度, 以吸光度为纵坐标, 浓度为横坐标绘制标准曲线。

绘制标准曲线, 回归方程为:Y=10.986X-0.0017 (R2=0.9994)

表明葡糖糖在该范围内线性关系良好。

1.2.3 菝葜皂苷元标准曲线的建立

精密吸取对照品溶液0.6ml、0.8ml、1.0 ml、1.2 ml、1.4ml置于10ml容量瓶中, 至水浴锅中挥干甲醇, 加高氯酸至刻度, 并与65℃水浴中加热15min后, 马上置于冰水浴中10min停止反应, 摇匀, 以相应试剂作为空白组, 用紫外分光光度法在310nm处测定吸光度, 以吸光度为纵坐标, 浓度为横坐标绘制标准曲线。

绘制标准曲线, 回归方程为:

表明菝葜皂苷元在该范围内线性关系良好。

2 实验内容

2.1 单因素实验

2.1.1 料液比对多糖提取率的影响

称取天冬药材每份5g, 料液比分别为1 0∶1、2 0∶1、3 0∶1、4 0∶1、5 0∶1, 超声功率为2 5 0 W, 6 0℃下分别超声提取3 0 m i n, 考察料液比对多糖和总皂苷提取率的影响。多糖提取率分别为4.51%、7.02%、7.31%、7.44%、7.42%, 总皂苷提取率分别为2.31%、2.82%、2.98%、3.11%、3.12%。考虑到料液比过大同时会给后续处理带来麻烦。所以本实验选用10∶1、20∶1、30∶1三个梯度作为考察对象。

2.1.2 温度对多糖和总皂苷提取率的影响

称取天冬药材每份5g, 料液比为20∶1, 超声功率为250W, 与30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃下分别提取30min, 考察温度对多糖和总皂苷提取率的影响。多糖提取率分别为5.51%、6.02%、6.42%、8.1 3%、8.2 2%、8.1 5%、7.7 6%, 总皂苷提取率分别为1.85%、1.87%、2.31%、2.95%、3.12%、2.94%、2.89%, 考虑到能耗以及温度国高可能会对皂苷结构造成破坏。故本实验选用50℃、60℃、70℃三个梯度作为考察对象。

2.1.3 提取时间对多糖和总皂苷提取率的影响

称取天冬药材每份5g, 在料液比为20∶1, 超声功率为250W, 温度为60℃的条件下分别提取10min、20min、30min、40min、50min, 考察提取时间对多糖和总皂苷提取率的影响。多糖提取率分别为3.1%、5.51%、7.23%、7.35%、7.34%, 总皂苷提取率分别为2.12%、2.87%、3.1 5%、3.10%、3.22%。因此本实验选用20min、25min、30min作为考察对象。

2.1.4 超声功率对多糖和总皂苷提取率的影响

称取天冬药材每份5g, 在料液比为20∶1, 温度为60℃, 超声功率为100W、200W、300W、400W、500W、600W条件下分别提取30min, 考察超声频率对多糖和总皂苷提取率的影响, 多糖提取率分别为6.51%、7.22%、8.5%、8.5 2%、8.4 6%、8.5 4%, 总皂苷提取率分别为2.51%、2.87%、3.15%、3.10%、2.9 1%、3.0 1%, 因此本实验选取2 5 0 W、300W、350W作为考察对象。

2.2 因素水平设计

正交试验设计方案及结果。

采用L9 (34) 正交表设计实验, 纯水为提取液, 考察料液比、提取温度、提取时间、超声功率对天冬多糖和天冬总皂苷提取率的影响, 因素水平见表1, 正交试验结果及方差见表2、表3。

由表2可知提取时间极差R最大, 是影响天冬多糖提取率的关键性因子, 其次是超声频率, 料液比, 最后为提取温度。因此, 料液比A因子选A2, 较好;提取温度B因子选B3;提取时间C因子选用C3较好;超声频率D因子选用D3较好。所以天冬多糖最佳提取工艺为:A2B3C3D3, 即料液比20∶1, 提取温度70℃, 提取时间30min, 超声功率350W。

由表3可知提取时间和超声功率极差R差不多, 是影响天冬多糖提取率的关键性因子, 其次是提取温度, 最后为料液比。因此, 料液比A因子选A2, 较好;提取温度B因子选B2;提取时间C因子选用C2较好;超声频率D因子选用D3较好。所以天冬总皂苷的最佳提取工艺为:A2B2C2D3, 即料液比20∶1, 提取温度60℃, 提取时间25min, 超声功率350W。

2.3 最佳提取条件验证

取天冬药材粉末5g, 平行3份, 按照上述最佳提取条件进行超声萃取, 萃取液经减压浓缩, 通过葡萄糖标准曲线计算粗多糖含量, 计算天冬多糖的提取率平均分值为:8.47%, 远高于普通回流法的5.23%;通过菝葜皂苷元标准曲线计算总皂苷含量, 计算天冬总皂苷的提取率平均分值为:3.276%, 远高于普通回流法的1.56%。

3 结果与讨论

(1) 提取天冬多糖的最佳方法为料液比20∶1, 提取温度70℃, 提取时间30min, 超声功率350W, 提取率远高于回流法。

天冬总皂苷的最佳提取工艺为料液比20:1, 提取温度60℃, 提取时间25min, 超声功率350W。

(2) 超声波的强烈振动, 有利于溶剂渗透到药材粉末之中, 加速天冬多糖的溶出和扩散, 对天冬多糖提取率有较大的提高。

摘要：目的:研究超声法在天冬多糖和总皂苷提取工艺中的应用。方法:采用单因素实验和正交实验考察不同因素对超声法提取天冬多糖和总皂苷的影响, 优化最佳工艺参数。结果:天冬多糖最佳提取工艺为:料液比20∶1, 提取温度70℃, 提取时间30min, 超声功率350 W;天冬总皂苷的最佳提取工艺为料液比20∶1, 提取温度60℃, 提取时间25min, 超声功率350W。结论:超声法对天冬多糖和总皂苷的提取, 具有提取率高、快速有效等优点。

关键词：超声提取,天冬,多糖

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鹅不食草总皂苷提取工艺研究 篇6

1 仪器与试药

UV-1700型分光光度计(日本岛津);BP211D电子天平(德国赛多司);微波反应器;超声清洗机;烘箱;水浴锅;真空泵(以上器材均为上海亚荣生化仪器厂生产)。

鹅不食草(采于吉林长白县);齐墩果酸对照品(含量测定用,

2 方法与结果

2.1 鹅不食草总皂苷的提取

2.1.1 微波提取法

称取鹅不食草粉末150g,置2000m L圆底烧瓶中,加石油醚1 0 0 0 m L浸泡2次,每次2 h,过滤,残渣挥尽石油醚后加9 5%乙醇1000m L,置微波提取器中提取1h,滤过,残渣加入95%乙醇1000mL继续提取1h,滤过,合并2次提取液,减压回收乙醇,残渣加蒸馏水500mL溶解,溶液用水饱和正丁醇萃取3次,每次500mL,弃去水层,合并正丁醇层,将正丁醇溶液60℃减压蒸干即得鹅不食草总皂苷干品。

2.1.2 回流提取法

称取鹅不食草粉末150g,置2000m L圆底烧瓶中,加石油醚1000mL浸泡2次,每次2h,过滤,残渣挥尽石油醚后加95%乙醇1000mL,在60℃水浴中回流提取2次,合并2次提取液,减压回收95%乙醇,残渣加蒸馏水500mL溶解,溶液用水饱和正丁醇萃取3次,每次500mL,弃去水层,合并正丁醇层,将正丁醇溶液60℃减压干燥即得鹅不食草总皂苷干品。

2.1.3 超声提取法

称取鹅不食草粉末150g,置2000m L圆底烧瓶中,加石油醚1000mL浸泡2次,每次2h,过滤,残渣挥尽石油醚后加95%乙醇1000mL,超声提取1h,滤过,残渣加入95%乙醇1000mL继续超声提取1h,滤过,合并2次提取液,减压回收乙醇,残渣加蒸馏水500mL溶解,溶液用水饱和正丁醇萃取3次,每次500mL,弃去水层,合并正丁醇层,将正丁醇溶液60℃减压蒸干即得鹅不食草总皂苷干品。

2.2 鹅不食草总皂苷含量的测定[3]

2.2.1 对照品溶液的制备

精密称取齐墩果酸对照品2.3mg,置10mL的容量瓶中,加95%乙醇溶解并定容至刻度,备用。

2.2.2 样品溶液的制备

称取上述3种提取方法所得鹅不食草总皂苷干品各50mg,置100mL容量瓶中,加95%乙醇溶解并定容至刻度,备用。

2.2.3 测定波长的选择

吸取对照品溶液0.5mL于10mL具塞试管中,沸水浴中挥干,依次加入新配制的10%香草醛-冰醋酸溶液0.2mL,高氯酸0.8mL,摇匀,于70℃水浴中加热15min取出,冰水浴中冷却后加入冰醋酸5mL,混匀,以相应试剂为空白,在400~700nm波长范围内测定其吸收波长。同法测定鹅不食草总皂苷吸收波长。二者最大吸收均为550nm,故选择测定波长为550nm。

2.2.4 标准曲线的绘制

精密吸取对照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mL,置10mL具塞试管中,照2.2.3项下自“沸水浴中挥干”起,于550nm测定吸光度,以齐墩果酸溶液浓度(C)为横坐标,吸光度(A)为纵坐标,绘制标准曲线,得回归方程为:A=61.352C-0.0016,r=0.9998(n=5)。结果表明齐墩果酸在3.833~19.167µg/m L范围内与吸光度呈良好的线性关系。

2.2.5 样品含量测定

取样品溶液,在550nm处测定吸光度,将吸光度带入标准曲线,线性回归法计算鹅不食草总皂苷含量。测定结果见表1。

2.3 正交实验优化回流提取法提取条件

2.3.1 正交试验设计

称取鹅不食草粉末500g,加石油醚3000mL浸泡2次,每次2h,过滤,残渣采用乙醇回流提取法提取总皂苷,为了寻求醇提的最佳工艺条件,我们采用4因素3水平依正交实验表L9(34)进行正交实验。考察因素为:提取溶剂、提取次数、提取时间以及溶剂用量等四因素。因素水平表见表2,实验结果和方差分析结果分别见表3和表4。

由表3实验结果分析可知,影响鹅不食草总皂苷回流提取的主次因素为C>B>A>D,提取时间与提取次数为主要影响因素,溶剂用量影响力最低,最佳提取工艺条件为A2B1 C2D3,即:80%乙醇提取2次,每次1.5h,溶剂用量为14倍量。

2.3.2 验证试验

称取鹅不食草药材3份,每份500g,石油醚脱脂后按照正交试验结果进行提取,提取物用水饱和正丁醇萃取,3份药材萃取物中总皂苷平均含量达到69.7%,折合到原药材中平均含量为2.59%。

注﹡:所测总皂苷含量为折合到500g原药材中的含量

注:F0.1(2,2)=9.00,F0.05(2,2)=19.00

3 讨论

本文采用超声、回流、微波等3种方法提取鹅不食草总皂苷,通过含量测定结果显示回流提取法优于其他两种提取方法,且该方法简便易行,对设备要求低。

在确定回流提取法后,又采用正交实验法对鹅不食草总皂苷的乙醇回流提取工艺进行了优选,文献记载[3],鹅不食草总皂苷大多以齐墩果烷型形式存在,故我们选择了以齐墩果酸为标准物测定总皂苷。并以总皂苷含量为指标对醇提工艺进行了优化,结果表明其有效部位的最佳提取工艺为:80%乙醇提取2次,每次1.5h,溶剂量为14倍量。按此结果提取鹅不食草总皂苷的提取效果最好。同时通过验证试验证明本正交试验工艺重现性好,实用性强。

本实验对鹅不食草总皂苷定量的研究,为其质量标准的建立提供方法学的参考,以控制药材质量,保证临床疗效,为进一步开发鹅不食草资源奠定基础。

摘要：目的 研究鹅不食草总皂苷的提取工艺并测定其含量。方法 对比微波、超声、回流等3种鹅不食草总皂苷提取方法,并采用正交实验优化所确定提取方法的最佳提取工艺条件,同时用分光光度法测定总皂苷含量。结果 回流提取法为鹅不食草总皂苷最佳提取方法,正交实验确定总皂苷最优提取条件:80%乙醇提取2次,每次1.5h,溶剂用量为14倍量。分光光度法测定总皂苷含量达到69.7%。结论 回流提取法提取鹅不食草总皂苷的方法可行,分光光度法测定总皂苷含量简便、灵敏。

关键词：鹅不食草,总皂苷,提取方法,正交实验,含量测定

参考文献

[1]刘宇.鹅不食草的化学成分及生物活性研究进展[J].湖北中医杂志,2005,27(5):52-53.

[2]Wu JB,Chun YT,Yutaka E,et al.Biologically Active Constituents of Centipeda minima:Sesquiterpenes of Potential Anti-allergy Activity[J].Chem Pharm Bull,1991,39(12):3272-3275.

人参皂苷提取工艺研究 篇7

我国传统医药由中医药、民间草医草药和民族医药三部分组成, 其中传统中药目前研究较为深入, 而其它许多丰富的民间、民族用药尚未得到更深入的研究利用, 其中具有潜在药用价值的创新药物资源, 值得药学工作者发掘和研究。

药用黄芪为豆科植物膜荚黄芪A s t r a-g a l u s.m e m b r a n a c e u s (F i s c h) B g e.或蒙古黄芪A s t r a g a l u s.membranaceus. (Fisch) Bge.Var.Monghoicus (Bge) Hisao的干燥根, 在我国资源分布广泛, 品种繁多。黄芪味甘、性微温, 具有补气升阳、固表止汗、利尿消肿、托毒排脓、敛疮生肌之功效。现代药理学研究表明, 黄芪可增强机体免疫功能, 具有强心降压、降血糖、利尿、抗疲劳、抗辐射、抗衰老、抗菌抗病毒、抗肿瘤以及镇静、镇痛等作用[1~6]。其化学成分众多, 主要包括皂苷类、黄酮类、多糖类以及氨基酸类等, 其中皂苷为其主要活性成分。文献报道, 黄芪皂苷类成分在生药中的含量为 (0.095~0.223) %, 目前已成为评价黄芪药材及其药物制剂质量的指标成分[7]。

本文拟对黄芪总皂苷的提取分离工艺及分析方法作如下综述。

1 黄芪中的皂苷类成分

黄芪皂苷具有降血压、镇痛和调节机体代谢等作用。根据文献报道, 至今已经从黄芪中分离鉴定出40多种黄芪皂苷, 其结构属于四环三萜或五环三萜类皂苷, 苷的糖主要有葡萄糖、半乳糖、鼠李糖等, 多与苷元3, 6位相连, 有些苷的某些羟基乙酰化。主要有:黄芪皂苷Ⅰ~Ⅷ、异黄芪皂苷Ⅰ~Ⅱ、乙酰黄芪皂苷、棉毛黄芪皂苷Ⅰ~ⅩⅥ、胡萝卜皂苷和大豆皂苷等[2,6,8,9]。

2 提取技术

2.1 溶剂提取

溶剂提取主要包括传统的浸提和回流提取、索氏提取。其中浸提法多采用水、乙醇、乙酸乙酯、石油醚、氯仿等作为提取溶剂, 不仅耗时, 费溶剂、工艺繁琐, 而且易存在溶剂残留。而回流提取与索氏提取由于提取温度高, 时间长, 因此在提取过程中常伴随分解、沉淀等反应的发生, 容易破坏对光和热不稳定的化学成分, 难以保证产品质量的稳定性。

2.1.1 水提法

刘昌福等[10]采用正交设计法, 以黄芪甲苷为检测指标, 重点考察了水量、煎煮时间、煎煮次数等因素, 得出黄芪甲苷最佳提取工艺条件为:用10倍量的水将药材煎煮两次, 每次时间为1.5h。

2.1.2 醇提法

岳显文[11]采用正交设计法, 以黄芪皂苷提取收率为检测指标, 对黄芪皂苷的醇提工艺参数进行优化。得出黄芪皂苷最佳提取工艺条件为:用80%乙醇将药材常压回流提取两次, 第一次乙醇用量10倍, 回流1.5h, 第二次用乙醇用量8倍, 回流1h。

2.2 微波萃取

微波萃取或称微波辅助萃取作为一种新型的提取分离方法, 具有良好的发展前景。由于其选择性高、提取时间短、溶剂耗费少、污染较低, 并且回收率高, 已在环境分析、化工、农业等领域得到了非常广泛的重视。

李莉等[12]采用微波辅助提取法提取黄芪甲苷, 综合考察了萃取功率、时间、乙醇浓度、PH值、溶剂用量、微波处理时间等因素对提取收率的影响, 得出黄芪甲苷的最佳微波辅助乙醇提取工艺条件为:先将黄芪药材用微波辅助提取法提取第1次, 之后用乙醇回流提取法提取第2次。微波功率为70 W/g, 微波照射20分钟, 乙醇浓度为60%, 微波预处理时间五分钟, 溶剂用量6倍, PH值为12。此法所得黄芪甲苷收率高出传统煎煮法约43%, 而且提取时间短, 节约能源消耗。

胡如桂等[13]采用微波水提法提取黄芪皂苷, 重点考察药材粒径、微波功率以及提取时间对提取工艺的影响大小, 实验得到黄芪皂苷的最佳微波水提工艺为:黄芪60目, 微波功率800W, 20倍水量提取两次, 每次十五分钟。此法所得黄芪皂苷的收率远高于传统乙醇回流法, 且提取速度显著加快水作为提取溶剂也大大降低了提取成本。

2.3 超临界CO2提取

超临界CO2萃取作为分离技术中一个最活跃的领域, 以其无需提取溶剂、“绿色”无污染著称。超临界CO2萃取临界温度低, 提取原料中的活性成分可以有效地保存而不被破坏, 特别适合热敏性和易氧化分解成分的提取。此外, 超临界CO2萃取法还具有产率高、时间短, 萃取所得产品纯度高、产量大、无有机残留物等优点。

蒙英等[14]采用超临界CO2萃取技术提取黄芪皂苷粗品时, 考察了黄芪粉碎目数、夹带剂用量和种类, 以及萃取的压力、时间、温度等对黄芪甲苷提取收率的影响。得到的最佳萃取工艺条件为:黄芪60目, 95%乙醇作为夹带剂, 用量为4m L/g, 萃取压力35MPa, 温度45℃, CO2流量为3.7L/h, 萃取2.5h, 此条件所得黄芪甲苷提取率为0.234mg/g。

2.4 柱前衍生化法

由于黄芪甲苷具有较强末端紫外吸收, 使得高效液相色谱法所使用的常规紫外检测器的实验结果精密度与准确度较低。为了提高黄芪甲苷紫外吸收的灵敏度, 加强其在非末端吸收波长处的紫外吸收, 增强抗干扰能力, 可采用柱前衍生化法对黄芪甲苷分子进行预处理。崔颖等[15]就以吡啶-苯甲酰氯为衍生化试剂, 将黄芪甲苷分子中的羟基进行了苯甲酰化, 之后结合溶剂萃取、柱层析分离纯化等手段, 实现了提取活性成分、消除干扰物质的目的。

2.5 树脂吸附法

阎巧娟[16]等将黄芪的乙醇提取液富集浓缩后, 通过树脂柱分离皂苷粗品的方法取代了传统的正丁醇萃取法, 实验结果表明, 树脂吸附法的提取分离效果好, 而且树脂作为可再生材料, 克服了回收正丁醇耗能多的缺点, 明显优于正丁醇萃取法。所得黄芪皂苷粗品精制后, 经制备薄层色谱法分离即可得黄芪甲苷。

2.6 超滤法

20世纪60年代发展起来的超滤技术是一种膜分离技术, 主要用于分离、提纯和浓缩。袁小红等[17]将黄芪、三七等药材加水煎煮三次, 药液合并后浓缩至1:1比例, 再经两次高速离心 (20 000转/分) 处理后配液, 滤纸过滤后用超滤膜超滤, 收集超滤液即得。

3 黄芪总皂苷的分离工艺

一直以来, 中药有效成分的分离纯化都是天然产物提取分析中的重要研究课题, 也是一项相当复杂的工作。常用的分离提纯方法有溶剂萃取、结晶和蒸馏。各种色谱技术也显示出越来越重要的作用。随着人们对中国传统中药活性成分药理作用的日益重视, 新的分离和提纯方法不断涌现。

黄芪总皂苷的纯化工艺主要有大孔吸附树脂纯化[18]和大孔吸附树脂结合碱水解[19]两种工艺。

李春红等[18]通过考察大孔树脂的种类、洗脱溶媒、洗脱体积、上样流速、样品液浓度等因素, 得出大孔树脂富集纯化黄芪总皂苷的最佳条件为:采用AB-8型大孔树脂, 黄芪提取液浓度为0.1g/ml上柱, 上样量为3 BV, 流速为1.0ml/min解吸时先用4 BV蒸馏水淋洗, 再用4 BV 50%乙醇解吸, 收集50%乙醇洗脱液, 得黄芪总皂苷提取物浸膏, 黄芪总皂苷收率可达52.1%。石忠峰[19]等考察了AB-8大孔吸附树脂对黄芪总皂苷进行吸附纯化的工艺条件, 60%乙醇提取, 树脂吸附后用不同体积分数的乙醇梯度洗脱, 发现黄芪总皂苷主要集中在体积分数为40%~80%的乙醇部位。大孔吸附树脂对黄芪总皂苷的动态吸附率为10.78mg/m L;不同浓度Na OH溶液去除杂质效果也不同, 以0.1%Na OH溶液的洗脱效果较好。

4 黄芪总皂苷的分析方法

4.1 紫外分光光度法

李春红等[18]采用紫外分光光度法测定黄芪甲苷的含量。精密称取干燥的黄芪甲苷对照品3毫克, 置5毫升容量瓶中, 用甲醇溶解并稀释至刻度, 摇匀。分别精密吸取上述溶液 (0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0) 毫升置10毫升具塞试管中, 水浴挥干溶剂, 再分别精密加入0.2毫升新制的5%香草醛-冰醋酸溶液和0.8毫升高氯酸, 摇匀, 置70℃水浴中加热15min后立即放冰浴中冷却3min, 加入冰醋酸5ml, 摇匀, 放置10min后, 在30分钟内以第一管溶液作为空白对照, 于波长584 nm处测定吸光度, 根据标准曲线得出溶液中黄芪甲苷的含量。

4.2 HPLC法

赵强强等[20]采用高效液相法测定黄芪中黄芪皂苷Ⅰ、黄芪皂苷Ⅱ、乙酰黄芪皂苷Ⅰ等3种皂苷的含量, 色谱条件为:Welc C18色谱柱 (4.6mm×250mm, 5μm) , 流动相为乙腈和水, (0~13) min, 22%~32%乙腈, (13~30) min, 32%~34%乙腈, (30~55) min, 34%~60%乙腈;流速1m L/min, 柱温:30℃。三种皂苷的回归方程和相关系数如下:黄芪皂苷ⅠY=1.6601X+5.0058, r=0.9997, 线性范围为:2.24~11.20μg;黄芪皂苷ⅡY=1.646 5X+5.222, r=0.9998, 线性范围为1.74~8.72μg乙酰黄芪皂苷ⅠY=1.646 5X+4.776 1, r=0.999 6, 线性范围为: (1.86~9.32) μg。

高建等[21]建立HPLC-ELSD法测定当归补血总苷 (黄芪、当归) 中的黄芪甲苷和黄芪皂苷Ⅱ的含量。色谱条件为:Kromail C18色谱柱 (4.6mm×250mm, 5μm) ;流动相为乙腈∶水 (37.5∶62.5) , 流速0.8m L/min。ELSD参数为:漂移管温度100℃;N2流速2.60L/min。结果表明:黄芪甲苷平均回收率为98.8%, 线性范围为 (0.85~6.76) μg (r=0.999 2) , RSD为1.50%。黄芪皂苷Ⅱ平均回收率为95.7%, 线性范围为 (1.05~8.4) μg (r=0.999 4) , RSD为2.70%。

5 展望

人参皂苷提取工艺研究 篇8

1 试剂与方法

1.1 仪器

安捷伦Agilent-1260型高效液相色谱仪;KQ5200DE型超声波清洗器;CP225D型电子分析天平 (Sartorius, 德国) ;HH-6型数显恒温水浴锅 (常州谱天仪器有限公司) 。

1.2 试剂

人参皂苷Rg1对照品 (批号:110703-201128, 中国食品药品检定研究院) ;人参皂苷Re对照品 (批号:110754-201324, 中国食品药品检定研究院) ;益心舒胶囊 (贵州信邦制药股份有限公司, 批号:20131009, 规格0.4g/粒) ;乙腈 (色谱纯) ;水为超纯水;其它试剂均为分析纯。

1.3 方法

1.3.1 对照品溶液制备

精密称取人参皂苷Rg1和Re对照品, 分别加甲醇制成0.482 9mg/mL的人参皂苷Rg1和0.387 5mg/mL的人参皂苷Re对照品溶液。

1.3.2 供试品溶液制备

对照组按《中国药典》2010版提取方法[1]:取30粒益心舒胶囊粉末研细, 混匀, 精密称取4.0g, 置于索氏提取器, 加三氯甲烷和乙醚各75mL, 加热回流3h, 药渣挥去溶剂, 将药渣移入具塞锥形瓶, 加2%氢氧化钾甲醇溶液50mL, 加热回流1h, 放冷滤过, 加少量甲醇液洗涤药渣及容器, 合并洗液和滤液, 蒸干, 残渣加50mL水溶解;选用水饱和正丁醇液提取4次 (20mL、20mL、10mL、10mL) , 合并正丁醇液, 先后分别用氨试液、1%磷酸二氢钾溶液、正丁醇饱和水溶液各40mL洗涤, 弃去洗涤液, 加正丁醇液蒸干, 残渣选用甲醇溶解并转移至5mL容量瓶, 加甲醇定容, 摇匀滤过, 取续滤液即得。

实验组按文献报道方法提取[2]:取30粒益心舒胶囊粉末研细, 混匀, 取约2.0g, 置于索氏提取器, 加三氯甲烷150mL, 85℃加热回流3h, 药渣挥去三氯甲烷, 将药渣移入具塞锥形瓶, 精密加入水饱和正丁醇液50mL, 密塞, 静置过夜;超声 (功率250W, 频率50kHz) 处理30min, 滤过, 弃初滤液, 精密量取续滤液25mL, 置于分液漏斗, 采用正丁醇饱和氨试液提取3次, 每次10mL, 弃氨试液, 正丁醇液置于蒸发皿加热蒸干, 残渣加甲醇溶解并转移至5mL容量瓶, 加甲醇至刻度摇匀, 过滤, 取续滤液即得。

1.3.3 色谱条件

安捷伦C18色谱柱 (100mm×4.6mm, 3.5μm) ;流动相:0.1%磷酸溶液-乙腈 (82∶18) ;体积流量:1.0mL/min;检测波长:203nm, 柱温:30℃;进样量:10μL。

2 实验结果

2.1 对照品与样品HLPC色谱

对照品与实验样品的色谱见图1。

注:1.人参皂苷Rg1;2.人参皂苷Re。

2.2 样品测定

按《中国药典》2010版第一增补版含量测定方法[1]进行人参皂苷Rg1、Re含量测定, 结果见表1和表2。

(n=3)

(n=3)

经检测, 对照组测得Rg1含量为0.71mg/g, RSD含量为0.32%;Re含量为4.29mg/g, RSD为0.41%, Rg1和Re的总量为5.00mg/g。实验组测得人参皂苷Rg1含量为0.34mg/g, RSD为0.95%;Re含量为2.33mg/g, RSD为1.51%, Rg1和Re的总量为2.67mg/g。研究表明, 对照组Rg1、Re测定含量及总量明显高于实验组。

3 讨论

3.1 流动相选择

预实验选取配制1%磷酸二氢钾-乙腈 (80∶20) 和1%磷酸二氢钾-乙腈 (82∶18) 两种流动相, 后者条件下可较好分离人参皂苷Rg1和Re峰, 峰型对称, 且与其它杂质峰完全分离, 效果较好。因此, 该实验采用1%磷酸二氢钾-乙腈 (82∶18) 作为流动相。

3.2 不同提取方法比较

对照组采用药典规定方法, 有两次回流、七次萃取环节, 耗时长, 过程多, 较为复杂, 在萃取过程中常萃取不完全, 而且容易乳化, 尤其是用氨试液如果不是新鲜配制时, 乳化现象更加严重;实验组文献报道的方法, 有一次回流、一次超声和三次萃取, 耗时相对较短, 操作步骤相对简单, 取样量小。

4 结论

对照组采用药典方法提取较完全, 测得含量值明显高于试验组, 但该方法较繁琐, 过程多, 周期长。实验组采用文献报道方法相对简单, 过程较少, 周期较短;由于复方制剂益心舒胶囊处方组成大, 成分复杂, 提取不完全, 故含量结果偏低。因此, 改进提取方法、缩短周期、简化过程、提高提取含量测定结果将是下一步实验研究方向。

摘要：目的:比较两种不同提取方法对益心舒胶囊中人参皂苷Rg1和Re含量及总量的影响。方法:对照组按《中国药典》2010版提取方法;实验组采用三氯甲烷回流, 药渣加入水饱和正丁醇液, 密塞, 放置过夜, 超声处理并过滤, 续滤液采用正丁醇饱和氨试液提取3次, 正丁醇层液置于蒸发皿加热蒸干, 残渣加甲醇溶解并转移至容量瓶。其中人参皂苷Rg1和Re采用《中国药典》2010版含量测定方法测定。结果:经检测, 对照组人参皂苷Rg1含量为0.71mg/g, Re含量为4.29mg/g, Rg1和Re总含量为5.00mg/g;观察组人参皂苷Rg1含量为0.34mg/g, Re含量为2.33mg/g, Rg1和Re总总量为2.67mg/g。结论:研究表明, 与对照组比较, 实验组提取过程简单, 周期较短, 但人参皂苷Rg1、Re含量及总量均较低, 改进提取方法、缩短周期、简化过程、提高提取含量测定结果将是下一步实验研究的方向。

关键词：人参皂苷Rg1,人参皂苷Re,提取方法,含量测定

参考文献

[1]国家药典委员会.中国药典[S].一部.北京:中国医药科技出版社, 2010:220.

人参皂苷提取工艺研究 篇9

目前绞股蓝皂苷的提取工艺已有很多,例如常规水浴法、醇提[5]、超声波[5,6]、微波[7]、酶法提取[8]等方法,但是多数试验主要集中在对某种试验方法的单因素或多因素的正交优选方面,而对这些提取方法之间的协同作用的研究所见不多。鉴于此,作者综合酶法和超声波法提取绞股蓝总皂苷的优势,首次采用超声波协同酶法提取绞股蓝皂苷,以若干个试验参数作为考察因素,对提取的工艺进行优化。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料:

绞股蓝干叶购自广州市医药公司,产地福建南靖(2009年8月采收),试验时先行粉碎至40～60目。

1.1.2 试剂:

人参皂苷Rb1标准品购自成都曼斯特生物科技有限公司;纤维素酶购自广州齐云生物技术有限公司;甲醇为色谱纯,高氯酸、冰醋酸为分析纯,香草醛为化学纯,均为国产。

1.1.3 仪器:

FZ102微型植物粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司);UH-950B超声波细胞破碎仪(宁波新芝生物科技有限公司);电热鼓风干燥箱(重庆市永生仪器有限公司);UV-1600紫外、可见分光光度计(上海美谱达仪器有限公司);HH-4恒温水浴锅(江苏省金坛市宏华仪器厂);DT5-2台式离心机(北京时代北利离心机有限公司);BS 224S型电子天平(Sartorius);accumet AB15型pH计(美国Fisher Scientific)。

1.2 方法

1.2.1 标准曲线法[9,10]:

通过测定人参皂苷Rb1的紫外吸光值,以吸收值Y与皂苷浓度C (mg/mL)做回归处理,得标准曲线,求出回归方程为: Y =3.8433C-0.0270(浓度为0.020mg/mL～0.100mg/mL,R2=0.9997)

1.2.2 皂苷含量的测定:

取100μL样品上清液置于10mL试管中,测其吸光值A,代入回归方程可得皂苷的含量C,计算皂苷提取率η:

η=CV/1000M

式中:η-皂苷提取率,%;C-皂苷含量,mg/mL;V-提取液总体积,mL;M-绞股蓝干叶质量,g。

1.2.3 常规水浴提取:

经单因素试验和正交试验后,选用水为提取溶剂,做3次平行试验(以下方法均作3次平行处理),以料液比1:25于80℃加热浸提120min,离心取上清液,测定吸光值,计算皂苷提取率。

1.2.4 单一酶法提取的单因素试验:

称取1.000g绞股蓝干叶粉末若干份,分别以不同的酶用量、溶剂pH、酶解温度、酶解反应时间等进行酶法提取的单因素试验。固定条件为溶剂pH 5.0,料液比1∶25,酶解温度50℃,酶解反应120min,酶用量0.6%(m/m),单一变化其中一个条件进行单因素试验。

1.2.5 酶法提取的正交试验:

在单因素试验基础上,以酶用量、溶剂pH、酶解温度、酶解反应时间四个因素,各选出3个水平,进行正交试验,见表1。

1.2.6 单一超声波提取:

将样品置于冰水混合物中,保持低温环境,再分别以功率190W和285W的超声波细胞破碎仪处理不同时间后,测其吸光值并计算总皂苷提取率。

1.2.7 超声波协同酶法提取:

①超声波后酶解处理:按照1.2.6所得超声波法的最优条件处理后,再进行1.2.5所得酶法的最优条件进行处理,测其吸光值并计算总皂苷提取率。②酶解后超声波处理:按照1.2.5所述酶法的最优条件处理后,再进行1.2.6所述超声波法的最优条件进行处理,测其吸光值并计算总皂苷提取率。

2 结果与分析

2.1 常规水浴提取

按照1.2.3所述方法,称取1.000g绞股蓝干叶粉末3份,做3次平行试验,分别显色后测定吸光值,计算得绞股蓝皂苷平均提取率为4.180%。

2.2 单一酶法提取的单因素试验

2.2.1 酶用量对皂苷提取率的影响

图1可知,酶用量从0.2%至0.4%,皂苷得率显著提高,后趋于平缓,说明0.4%的酶用量已能将样品最大程度酶解。考虑到工业上生产成本问题,选用0.4%的酶用量较适宜。

2.2.2 溶剂pH对皂苷提取率的影响

由图2可见,在其余条件相同的情况下,当溶剂pH为5.0时,皂苷提取率达到最高,说明pH5.0为所用纤维素酶的最适pH。

2.2.3 酶解温度对皂苷提取率的影响

由图3可知,在其他条件相同的情况下,50℃酶解的皂苷提取率高于其他温度,说明50℃为所用纤维素酶的最适温度。

2.2.4 酶解反应时间对皂苷提取率的影响

由图4可见,当酶解时间达到120min时,分解趋于完全,皂苷大部分已溶出,随着反应时间的延续,其皂苷的提取率增加幅度不明显,因此酶解时间选择120min较合适。

2.3 酶法提取的正交试验

由表2可知,单一酶法中各因素对皂苷提取率的影响程度为:溶剂pH>酶解温度>酶解反应时间>酶用量,再结合各因素的K值,得出最佳组合为A2B2C2D3,即酶用量0.6%(m/m),酶解温度50℃,溶剂pH 5.0,酶解反应时间140min。以此最佳条件进行3次重复试验,得绞股蓝总皂苷提取率为5.577%。

2.4 单一超声波法提取

按1.2.6所述方法,在固定料液比1∶25的条件下,分别用功率为190W、285W的超声波处理不同时间,测得皂苷提取率,结果见图5。

由图5可知,用功率为190W的超声波进行处理时,随着反应时间的延长其皂苷提取率逐渐提高,当反应时间超过20min以后,提高的幅度趋于平缓;而用285W超声波进行处理时,随着时间的延长,得率下降,这可能是由于超声波强度过大会导致溶出的杂质增多,产生干扰,或者是高强度超声波对绞股蓝皂苷结构有一定的破坏作用,这与林硕等[6]的研究结果相符。有鉴于此,又考虑到超声时间长耗能增加,因此选择功率190W的超声波处理20min为最佳方案。

2.5 超声波协同酶法提取

2.5.1 超声波后酶解处理:

按照2.4中超声波法的最佳提取条件,即功率190W的超声波处理20min后,再按照2.3中酶法正交试验的最佳提取条件处理,即酶用量0.6%(m/m),酶解温度50℃,溶剂pH 5.0,酶解反应时间140min,测定吸光值,计算出绞股蓝总皂苷提取率为6.566%。

2.5.2 酶解后超声波处理:

先按照2.3中酶法正交试验的最佳提取条件处理后,再按照2.4中超声波法的最佳提取条件处理后,测定吸光值,得出皂苷提取率为7.494%。

2.6 几种提取方法的比较

表3表明,超声波和纤维素酶对总皂苷的提取都有明显的促进作用,而采用超声波协同酶法促进效果更为明显,其中酶解后超声波处理比先超声波后酶解的处理方法的绞股蓝总皂苷提取率更高,达到7.494%,分别比常规水浴法、单一酶法、单一超声波法提高了79.28%、34.37%、43.04%。

3 讨论

先酶解再用超声波处理,其提取率高于先超声波再酶解的处理方法,这是因为在纤维素酶的作用后,细胞壁上的纤维素被部分降解,有的细胞壁已经破裂,再用超声波处理时,更加有利于细胞内皂苷的溶出[11]。

本研究首次采用纤维素酶与超声波协同的方法提取绞股蓝总皂苷,其提取率明显高于常规水浴法,也高于单一酶法和单一超声波法,这与王万能[11]等运用超声波协同酶法提取豆粕异黄酮的结论一致。其中,以料液比1:25,酶用量0.6 %(m/m),溶液pH 5.0,50℃酶解140 min,灭酶15 min后,用超声波(190W,处理3s,间歇3s)于冰水混合物中处理20min为最佳的工艺条件,其皂苷得率为7.494%。